DE3783851T2

DE3783851T2 - Integrales, mehrschichtiges element fuer analyse.

Info

Publication number: DE3783851T2
Application number: DE8787114791T
Authority: DE
Inventors: C O Fuji Photo Film Co Lt Arai; C O Fuji Photo Film Mitsutoshi; C O Fuji Photo Film Co Takeshi
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1986-10-09
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1993-06-17
Anticipated expiration: 2007-10-10
Also published as: EP0264079B1; DE3783851D1; US5063153A; EP0264079A3; EP0264079A2

Description

Die Erfindung betrifft ein trockenes integrales mehrschichtiges analytisches Element, das ein oxidiertes Coenzym enthält.
Die Reaktionen, an denen Dehydrogenase und ein Coenzym beteiligt sind, haben bereits eine breite Anwendung bei klinischen chemischen Analysen gefunden. Beispielsweise werden verschiedene Reaktionssysteme, an denen eine Dehydrogenase, wie Glycerin-Dehydrogenase, Cholesterin-Dehydrogenase, Lactat-Dehydrogenase, Alkohol-Dehydrogenase, Glutamat-Dehydrogenase, Aldehyd-Dehydrogenase, α-Glycerophosphat-Dehydrogenase oder Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, teilnimmt, für die quantitative Bestimmung eines Substrats, wie Triglycerid, Glycerin, Cholesterin, Milchsäure, Glutamat, Glycerin-3-phosphorsäure oder Glucose-6-phosphorsäure und eines Enzym, wie Asparaginsäure- Aminotransferase (AST), Lactat-Dehydrogenase (LDH), Amylase oder Creatinkinase (CK), eingesetzt. Durch die Reaktion kann die quantitative Analyse direkt durch Messen der Zunahme oder Abnahme der Menge eines reduzierten Coenzyms vorgenommen wer den. Jedoch besitzt das herkömmlich verwendete NADH (d. h. Nicotinamiddadenin-Dinucleotid) oder NADPH (d. h. Nicotinamidadenin-Dinucleotidphosphat), seinen maximalen Absorptionspeak bei ca. 340 nm, und darum erfordert die photometrische Messung ein teures Photometer für die Messung von Licht im ultravioletten Bereich. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß eine solche Messung von Licht im ultravioletten Bereich leicht von einer Vielzahl nebeneinander vorliegender Verbindungen beeinflußt wird.
Ein alternatives photometrisches analytisches Verfahren , das eine Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet und einen Elektronentransmitter (d. h. Träger) für die Bildung eines Farbstoffes mit einem Absorptionspeak im sichtbaren Lichtbereich bei Kontakt mit dem gebildeten NADH in Kombination verwendet, wurde als Ersatz für das oben beschriebene Verfahren der direkten Messung des gebildeten NADHs (oder NADPHs) vorgeschlagen. Bei diesem Verfahren tritt jedoch das Problem auf, daß die Reagenszusammensetzung, die das oxidierte Coenzym, die Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, und die Elektronentransmitterverbindung enthält, sich leicht zersetzt, wobei eine Erniedrigung der Reaktionsempfindlichkeit auftritt, wenn ein analytisches Element, das eine solche Zusammensetzung enthält, für eine lange Zeit aufbewahrt wird. Dieses Problem wird insbesondere in dem Falle oft beobachtet, wenn eine solche Zusammensetzung in ein trockenes integriertes mehrschichtiges analytisches Element, wie in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 53(1978)-21677 und der japanischen vorläufigen Patentveröffentlichung Nr. 55(1980)- 164356 und Nr. 60(1985)-222769 beschrieben, eingearbeitet ist.
Die japanische vorläufige Patentveröffentlichung Nr. 49(1974)- 11395 schlägt ein mehrschichtiges analytisches Element vor, bei dem die Elektronentransportverbindung unter den oben erwähnten drei Komponenten in einer von der Schicht, die die restlichen zwei Komponenten enthält, verschiedenen Schicht angeordnet ist. Die japanische vorläufige Patentveröffentlichung Nr. 59(1984)-44658 beschreibt ein Verfahren zur Dispersion einer hydrophoben Substanz in einem hydrophilen Medium, wobei der Elektronentransmitter im wesentlichen nicht mit dem Farbbildungsmaterial reagiert. Des weiteren schlägt die japanische vorläufige Patentveröffentlichung Nr. 59(1984)-88096 zwei Verfahren vor, nämlich ein Verfahren, bei dem die Elektronentransportverbindung und eine Elektronenakzeptor-Farbstoff-Vorstufe (d. h. eine Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet) in getrennten Schichten auf dieselbe Weise wie in der oben erwähnten vorläufigen japanischen Patentveröffentlichung Nr. 49(1974)-11395 beschrieben, angeordnet werden und ein Verfahren, bei dem die zwei Komponenten in derselben Schicht in Form getrennter Teilchen angeordnet werden, so daß die zwei Komponenten im wesentlichen nicht miteinander reagieren. Jedoch verringert sich in diesen Fällen (in Fällen einer Trennung der Elektronentransportverbindung von den restlichen zwei Verbindungen) die Reaktionsgeschwindigkeit, weil das Fortschreiten der Reaktion überwiegend durch die Diffusionsgeschwindigkeit der getrennt vorliegenden Reagentien (insbesondere der Elektronentransportverbindung) bestimmt wird und sich daher die Detektionsempfindlichkeit verschlechtert.
Es wurde gefunden, daß wenn eine Zusammensetzung für die Detektion des oben erwähnten NADHs (oder NADPHs) in einer Reagensschicht eines trockenen integralen mehrschichtigen analytischen Elementes (z. B. eines mehrschichtigen analytischen Elements für die automatische chemische Analyse, wie in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 53(1978)-21677 und den japanischen vorläufigen Patentveröffentlichungen Nr. 55 (1980)- 164356 und Nr. 60(1985)-222769 beschrieben) verwendet wird, die Farbbildungsgeschwindigkeit der Zusammensetzung nach Aufbewahrung bei Raumtemperatur sich im Laufe einiger Wochen auf weniger als die Hälfte der Ausgangsgeschwindigkeit verringert. Es wurde bestätigt, daß die Abnahme der Geschwindigkeit hauptsächlich durch die Zersetzung des NADH-Coenzyms (oder NADP- Coenzyms) verursacht wird und nicht durch die Zersetzung der Elektronenakzeptorverbindung, was in der japanischen vorläufigen Patentveröffentlichung Nr. 57(1982)-132061 beschrieben wird. Zur Verhinderung einer solchen Zersetzung des Coenzyms in einer Pufferlösung wird in der japanischen vorläufigen Patentveröffentlichung Nr. 59(1984)-82398 eine Maßnahme für die Einarbeitung eines Chelatisierungsmittels zusammen mit einem Azid beschrieben. Jedoch ist die Verwendung des Azids mit explosiven Eigenschaften und Giftigkeit hinsichtlich der Sicherheit und Umweltverschmutzung von Nachteil.
Bekanntlich weist die Reagensschicht, die NAD-Coenzym oder NADP-Coenzym enthält, an allen Stellen einschließlich eines Überzugs, vorzugsweise einen pH-Wert nahe des neutralen Bereiches auf, um die Zersetzung des Coenzyms während der Lagerung zu vermeiden. Bekanntlich verliert auch Diaphorase ihre Aktivität, wenn sie bei einem pH-Zustand von weniger als etwa 6,0 vorliegt. Andererseits besitzt das Reaktionssystem bekanntlich vorzugsweise einen alkalischen pH-Wert, wenn Dehydrogenase an der Reaktion teilnimmt. Jedoch ist noch kein trockenes Analytisches Element vorgeschlagen worden, das gleichzeitig dem oben erwähnten Konflikt zwischen den geeigneten pH-Bedingungen gerecht wird.
Demgemäß ist es Aufgabe der Erfindung, ein trockenes mehrschichtiges analytisches Element, das Dehydrogenase, ein oxidiertes Nikotinamid-Coenzym, eine Elektronentransportverbindung (Elektronentransmitterverbindung) und eine Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, als Reagens-Komponenten enthält, das eine ausreichend hohe analytische Reaktionsgeschwindigkeit ohne Abnahme seiner analytischen Genauigkeit zeigt, bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird ein trockenes mehrschichtiges analytisches Element, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen lichtdurchlässigen, wasserundurchlässigen Träger und Reagenzschichten, die auf dem Träger vorgesehen sind, umfaßt, wobei die Reagenzschichten Dehydrogenase, oxidiertes Nikotinamid-Coenzym, eine Elektronentransportverbindung und eine Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, enthalten, worin ein Alkalimittel oder ein alkalischer Puffer in der Reagenzschicht, die sich von der Reagenzschicht unterscheidet, die die genannte Dehydrogenase, das oxidierte Nikotinamid-Coenzym und die Elektronenakzeptorverbindung, die den Farbstoff bildet, enthält, enthalten ist, wobei das genannte Alkalimittel oder der alkalische Puffer eine pH-Einstellungsfunktion besitzen, um den pH-Wert in den Reagenzschichten innerhalb des Bereiches von pH 7,5 und pH 10,0 einzustellen, nachdem in die Reagenzschichten eine flüssige Probe eingebracht worden ist,, bereitgestellt.
Erfindungsgemäß kann das oxidierte Nicotinamid-Coenzym in dem analytischen Element auch unter solchen Bedingungen, daß das oxidierte Nicotinamid-Coenzym, die Elektronentransportverbindung und die Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, in eine einzige Schicht ohne gegenseitige Trennung dieser Komponenten voneinander eingearbeitet sind, stabil gelagert werden.
Die Erfindung kann auf eine Vielzahl bekannter trockener analytischer Elemente angewendet werden. Insbesondere wird die Erfindung vorteilhaft auf ein Element, das eine flüssigkeitsdurchlässige Schicht, durch die jede Dehydrogenase, eine reduzierte Coenzymdetektorzusammensetzung und eine flüssige Probe hindurchtreten können, enthält, angewendet. Das erfindungsgemäße analytische Element besitzt mindestens zwei Reagensschichten, die auf dem Träger vorgesehen sind. Das analytische Element kann weitere funktionelle Schichten, wie eine Lichtreflektierungsschicht, eine poröse Flüssigkeitsausbreitungschicht, eine Lichtblockierungsschicht, eine Filtrationsschicht, eine Registrierungsschicht, eine Wasserabsorbierungsschicht und eine Bodenüberzugsschicht enthalten. Die Reagensschicht und eine weitere funktionelle Schicht können so gestaltet sein, daß sie eine einzige Schicht bilden. Beispielsweise kann die poröse Ausbreitungsschicht ein Reagens oder eine Reagenszusammensetzung unter Bildung einer Reagensschicht enthalten.
Verschiedene mehrschichtige analytische Elemente werden beispielsweise ausführlicher in den amerikanischen Patentschriften Nr. 3,992,158 und 4,042,335 und den japanischen vorläufigen Patentveröffentlichungen Nr. 51(1976)-40191, Nr. 55(1980)-164356 und Nr. 60(1985)-222769 beschrieben.
Bevorzugte Ausführungsformen für den Bau der analytischen Elemente sind unten aufgeführt.
(1) Element, umfassend zwei oder mehr Reagensschichten, die auf dem Träger angeordnet sind;
(2) Element, umfassend eine Ausbreitungsschicht, die als Reagensschicht dient und eine weitere Reagensschicht, die auf dem Träger angeordnet ist;
(3) Element, umfassend eine Ausbreitungsschicht und zwei oder mehr Reagensschichten, die auf dem Träger angeordnet sind;
(4) Element, umfassend eine Ausbreitungsschicht, zwei oder mehr Reagens schichten und eine Wasserabsorbierungsschicht, die geordnet auf dem Träger angeordnet sind;
(5) Element, umfassend eine Ausbreitungsschicht, eine Reflexionsschicht (oder Filtrationsschicht) und zwei oder mehr Reagensschichten, die auf dem Träger in dieser Reihenfolge angeordnet sind; und
(6) Element, umfassend eine Ausbreitungsschicht, eine Filtrationsschicht, zwei oder mehr Reagensschichten und eine Wasserabsorbierungsschicht, die auf dem Träger in dieser Reihenfolge angeordnet sind.
In dem erfindungsgemäßen analytischen Element enthält mindestens eine Reagensschicht ein oxidiertes Nicotinamid-Coenzym. Das oxidierte Nicotinamid-Coenzym bedeutet NAD&spplus; (oxidiertes Nicotinamidadenin-Dinukleotid) oder NADP&spplus; (oxidiertes Nicotinamidadenin-Dinukleotidphosphat). Die Verwendung entweder von NAD&spplus; oder NADP&spplus; kann gemäß der Art eines Oxidations-Reduktionsenzyms, das als Analyt oder als an der Reaktion teilnehmendes Reagens verwendet wird, bestimmt werden.
Das erfindungsgemäße trockene analytische Element enthält eine Elektronenüberträgerverbindung (d. h. Elektronenträger) in mindestens einer Reagensschicht.
Die Elektronenüberträgerverbindung dient dazu, ein Elektron von einem reduzierten Nicotinamid-Coenzym (d. h. einen Elektronendonator), das durch die Reaktion des Analyten gebildet worden ist, aufzunehmen und dann eine Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, zu reduzieren. Beispiele für Elektronenüberträgerverbindungen schließen N-Methylphenazinmethylsulfate, wie 5-Methylphena-zinium-methylsulfat und 1-Methoxy-5-methylphenazinium-methyl-sulfat sowie Diaphorase (Dihydrolipoamid-Reduktase, EG 1.6. 4.3) ein.
Das erfindungsgemäße trockene analytische Element enthält weiterhin eine Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, als einen der Reagensbestandteile.
Die Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, wird durch die Elektronenüberträgerverbindung unter Bildung einer Verbindung (d. h. eines Farbstoffes), die im sichtbaren Strahlungsbereich photometrisch detektierbar ist, reduziert. Die vorzugsweise erfindungsgemäß eingesetzte Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, ist ein Tetrazoliumsalz. Beispiele für Tetrazoliumsalze schließen 3,3'- (3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis(2-(p-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumchlorid) (= NBT); 3-(p-Indophenyl)-2-(p-nitro-phenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (= INT); 3-(4,5-Dimethyl- 2-thiazolyl)-2H-tetrazoliumbromid (= MTT); 3,3'-(4,4'-Biphenylen)-bis(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid); 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis-(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid); und 3,3'-(3,3'-Bis-(2,5-bis(p-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumchlorid) ein.
Das Reaktionssystem, an dem das oxidierte Nicotinamid-Coenzym, die Elektronenüberträgerverbindung und die Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, beteiligt sind, wird ausführlicher in A. L. Babson, et al., Clinica Chimica Acta, 12 (1965), 210-215, R.J.Gay, et al., Clinical Chemistry, 14, Nr. 8 (1968), 740-753 und R.D. Gapps II, et al., Clinical Chemistry 12 Nr. 7 (1966), 406-413 beschrieben.
Bei dem erfindungsgemäßen analytischen Element ist das Oxidations-Reduktionsenzym für den Analyten in mindestens eine Schicht eingearbeitet, wobei die Konzentration oder der Gehalt eines Analyten (zu testende Substanz) in einer flüssigen Probe bestimmt werden kann. Das erfindungsgemäße analytische Element kann zur Messung der Konzentration oder des Gehaltes irgendeines Analyten verwendet werden, mit der Maßgabe, daß der Analyt mit dem Oxidations-Reduktionsenzym (Dehydrogenase) und das oxidierte Nicotinamid-Coenzym als Elektronenakzeptorverbindung dienen kann. Beispielsweise ist Glycerin-Dehydrogenase in dem Falle, daß die Konzentration von Neutralfett, wie Glycerin, gemessen wird, eingearbeitet. Lactat-Dehydrogenase ist in dem Falle, daß die Konzentration von Lactat (oder Milchsäure) gemessen wird, eingearbeitet.
Das bei dem erfindungsgemäßen trockenen analytischen Element eingesetzte Reaktionssystem kann auch bei der Bestimmung von Aktivitäten verschiedener Oxidations-Reduktionsenzyme, die in einer flüssigen Probe enthalten sind, verwendet werden. Genauer gesagt kann das erfindungsgemäße trockene analytische Element für die Aktivitätsbestimmung irgendeines Oxidations- Reduktionsenzyms (Dehydrogenase) in dem Falle, daß oxidiertes Nicotinamid-Coenzym als Elektronenakzeptor dient, verwendet werden. Wenn das erfindungsgemäße analytische Element für die Bestimmung der Aktivität eines Oxidations-Reduktionsenzyms verwendet wird, wird in das Reaktionssystem weiterhin ein Substrat für eine Oxidationsreaktion (Dehydrierungsreaktion), bei der das Oxidations-Reduktionsenzym als Katalysator fungiert, eingearbeitet. Beispielsweise ist außerdem Milchsäure in dem Falle, daß das analytische erfindungsgemäße Element für die Bestimmung der Lactat-Dehydrogenaseaktivität verwendet wird, als Substrat in das Reaktionssystem eingearbeitet. In dem Falle der Bestimmung der Aktivität von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, ist ferner Glucose-6-phosphorsäure in das Reaktionssystem als Substrat eingearbeitet.
Das Material des Trägers des erfindungsgemäßen analytischen Elementes ist vorzugsweise ein lichtdurchlässiger, wasserundurchlässiger Träger.
Beispiele für wasserundurchlässige, lichtdurchlässige Träger schließen transparente Träger in Form eines Films oder einer Folie aus einem Polymeren, wie Polyethylenterephthalat, Polycarbonat von Bisphenol-A, Polystyrol und Celluloseester (z. B. Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Celluloseacetatpropionat etc.) ein. Die Dicke des Trägers liegt im allgemeinen im Bereich von ca. 50 um bis ca. 1 mm, vorzugsweise von ca. 80 um bis ca. 300 um.
Ein hydrophiles Polymeres kann zur Bildung einer Wasserabsorptionsschicht, einer Reagensschicht, einer Filtrationsschicht und einer Lichtreflexionsschicht bei dem erfindungsgemäßen analytischen Element verwendet werden. Das hydrophile Polymere ist ein natürliches oder synthetisches Polymeres mit einem Quellverhältnis von im allgemeinen ca. 1,5 bis 20, vorzugsweise 2,5 bis 15, bei 30ºC im Falle der Wasserabsorption.
Beispiele für die hydrophilen Polymere schließen Gelatine (z. B. Alkali-behandeltes Gelatine, säurebehandeltes Gelatine und deionisiertes Gelatine), Gelatinederivate (z. B. mit Phthalsäureverbindungen umgesetztes Gelatine), Agarose, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon ein. Wenn nötig, kann zu dem hydrophilen Polymeren weiterhin ein oberflächenaktives Mittel (kationisches , amphoteres oder nichtionisches oberflächenaktives Mittel) gegeben werden.
Die Lichtblockierungsschicht ist eine wasserdurchlässige Schicht, in der lichtblockierende (oder lichtreflektierende) feine Teilchen in einer kleinen Menge eines hydrophilen polymeren Bindemittels, das einen Film bildet, dispergiert sind. Die Lichtblockierungsschicht kann als Lichtreflexionsschicht oder Hintergrundschicht sowie als Blockierungsschicht für die Farbe einer wäßrigen, auf die Ausbreitungsschicht aufgetüpfelten Flüssigkeit, wie das Rot von Hämoglobin in einer Vollblutprobe fungieren, wenn in der Wasserabsorptionsschicht auf der Seite des transparenten Trägers durch Reflexionsphotometrie eine detektierbare Änderung (eine Farbänderung oder eine Farbentwicklung etc.) gemessen wird.
Bevorzugte Beispiele für lichtblockierende und lichtreflektierende Teilchen sind feine Titandioxidteilchen und feine Bariumsulfatteilchen. Gemäß der Erfindung können die lichtblockierenden Teilchen, wenn gewünscht, in die Ausbreitungsschicht eingearbeitet sein.
Auf der Wasserabsorptionsschicht kann eine Klebeschicht vorgesehen sein oder gegebenenfalls können weitere Schichten (z. B. eine Lichtblockierungsschicht, Filtrationsschicht und Reagensschicht) hinzugefügt werden, um die Adhäsion der Ausbreitungsschicht zu verstärken.
Die Klebeschicht besteht vorzugsweise aus einem hydrophilen Polymeren, das die Ausbreitungsschicht mit der anderen Schicht verkleben kann, so daß alle Schichten in eine integrierte Form gebracht werden, wenn das Polymere mit Wasser benetzt oder gequollen wird. Beispiele für das hydrophile Polymere schließen die Polymeren, die in der Wasserabsorptionsschicht verwendbar sind, ein. Am meisten bevorzugt sind Gelatine, Gelatinederivate und Polyacrylamid. Die Trockendicke der Klebeschicht liegt im allgemeinen im Bereich von ca. 0,5 um bis ca. 20 um, vorzugsweise von ca. 1 um bis ca. 10 um.
Die Klebeschicht kann auf den anderen Schichten ebenso wie auf der Wasserabsorptionsschicht vorgesehen sein. Die Klebeschicht kann so hergestellt sein, daß eine Lösung eines hydrophilen Polymeren und eines gegebenenfalls zugegebenen weiteren Mittels, wie eines oberflächenaktiven Mittels, auf die Wasserabsorptionsschicht oder eine andere Schicht aufgebracht ist.
Der Ausdruck "Ausbreitungsschicht", der hier verwendet wird, steht für eine Schicht, die in der Lage ist, eine flüssige Probe zu dosieren. Diese Funktion kann in Form einer Schicht angegeben werden, die eine Funktion besitzt, die das Ausbreiten einer aufgebrachten Flüssigkeit in einer solchen Weise ermöglicht, daß sich die Ausbreitungsfläche der Flüssigkeit in etwa im Verhältnis zu der Menge der Flüssigkeit bildet, wenn die Flüssigkeit darauf aufgebracht wird.
Die Ausbreitungsschicht kann aus Filterpapier, nichtgewebtem Stoff, gewebtem Stoff (z. B. glatt gewebten Stoffen, wie Breitgeweben und Popelin), gestrickten Stoffen (z. B. Tricotware, Doppeltricotware und gestrickter Milaneseware), einem Glasfaserfilter, Membranfilter oder einer dreidimensionalen Gitterstruktur aus polymeren Mikroperlen als matrixbildendes Material hergestellt sein. Bevorzugt sind hinsichtlich der Zeitdauer, während der die Reagentien haltbar sind, gewebte Stoffe und gestrickte Stoffe.
Werden gewebte Stoffe oder gestrickte Stoffe als Material für die Ausbreitungsschicht eines integralen mehrschichtigen analytischen Elementes verwendet, so wird der Stoff vorzugsweise bearbeitet, um hydrophil zu werden, um die Adhäsion an die darunter liegende Schicht zu verstärken. Beispiele eines solchen Verfahrens, um dem Stoff Hydrophilie zu verleihen, schließen ein physikalisches Aktivierungsverfahren (vorzugsweise ein Glimmentladungsverfahren oder Coronaentladungsverfahren), beschrieben in der japanischen vorläufigen Patentveröffentlichung Nr. 57(1982)-66359 und ein Durchdringungsverfahren mit einem hydrophilen Polymeren, beschrieben in den japanischen vorläufigen Patentveröffentlichungen Nr. 55 (1980)- 164356 und Nr. 57(1982)-66359, ein.
Die aus gewebtem Stoff oder gestricktem Stoff bestehende Ausbreitungsschicht kann auf eine Wasserabsorptionsschicht oder eine Klebeschicht, gemäß dem in den japanischen vorläufigen Patentveröffentlichungen Nr. 55(1980)-164356 und Nr. 57 (1982)- 66359 beschriebenen Verfahren, auf laminiert sein. Das Verfahren verläuft so, daß der gewebte Stoff oder der gestrickte Stoff unter einem im wesentlichen einheitlichen schwachen Druck auf die nasse oder aufquellende Pufferschicht oder Klebeschicht, die sich nach dem Aufbringen noch in einem nassen Zustand befunden hat, oder nach dem Trocknen mit Wasser (oder Wasser mit einer kleinen Menge eines oberflächenaktiven Mittels) versehen worden ist, auflaminiert wird.
Die Ausbreitungsschicht, die aus einem im Bürsten-Streich-Verfahren aufgetragenen Polymeren oder einem Membranfilter besteht, kann gemäß des in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 53(1978)-21677 beschriebenen Verfahrens bereitgestellt werden, die Ausbreitungsschicht mit einer dreidimensionalen Gitterstruktur, die aus polymeren Mikroperlen besteht, kann gemäß des in der vorläufigen japanischen Patentveröffentlichung Nr. 55(1980)-90859 beschriebenen Verfahrens bereitgestellt werden, und die Reagensfolie bzw. das -blatt oder die Ausbreitungsschicht, die aus Filterpapier oder nichtgewebtem Stoff besteht, kann gemäß des in der japanischen vorläufigen Patentveröffentlichung Nr. 57(1982)-148250 beschriebenen Verfahrens bereitgestellt werden.
Die Ausbreitungsschicht des analytischen Elementes kann ein hydrophiles Polymeres und/oder ein oberflächenaktives Mittel zur Einstellung seiner Dosierungseigenschaft enthalten.
Beispiele für die hydrophilen Polymeren schließen Cellulosederivate, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol und Polyacrylamid ein.
Als Beispiel für das oberflächenaktive Mittel kann ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel genannt werden. Beispiele für nichtionische oberflächenaktive Mittel schließen p-Octylphenoxypolyethoxyethanol, p-Nonylphenoxypolyethoxyethanol, Polyoxyethylenoleylether, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, p- Nonylphenoxypolyglycidol und Octylglucosid ein.
Wird ein Analyt verwendet, der eine einheitlich aufgebrachte Schicht aus dem polymeren Bindemittel kaum durchdringt (d. h. im Falle der Verwendung eines hydrophoben Analyten oder eines hochmolekularen Analyten), wie ein Neutralfett, beispielsweise Glycerin, so ist in die poröse Ausbreitungsschicht vorzugsweise ein Teil der Reagensbestandteile, insbesondere ein sich zersetzendes Enzym, wie Lipoproteinlipase, eingearbeitet.
Erfindungsgemäß ist ein Alkalimittel oder ein alkalischer Puffer in eine Schicht des analytischen Elementes, die sich von einer oder mehreren Schichten, enthaltend das oxidierte Nicotinamid-Coenzym und die Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, unterscheidet, eingearbeitet. Das Alkalimittel oder der alkalische Puffer ist vorzugsweise in eine Schicht, die auf der Schicht oder den Schichten, enthaltend das Coenzym und die farbstoffbildenden Verbindung, angeordnet ist, insbesondere in eine poröse Ausbreitungsschicht, eingearbeitet.
Beispiele für den alkalischen Puffer oder das Alkalimittel schließen 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol, 2-Amino-2-ethyl- 1,3-propandiol, Diethanolamin, Ethanolamin, 2-Amino-2-methyl- 1-propandiol, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und Trimethylamin ein. Als weitere Beispiele für das Alkalimittel oder den alkalischen Puffer, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können pH-Puffermittel, beschrieben beispielsweise in "Chemical Handbook, Fundamental Edition", 1312-1320 von Chemical Society of Japan (Maruzen, Tokyo 1966), "Data for Biochemical Research", 2. Ausg., 476-508, von R.M.C. Dawson et al., (Oxford at the Clarendom Press, 1969); "Biochemistry", 5, 467-, (1966); und "Analytical Biochemistry", 104, 300-310, (1980) genannt werden.
Die Schicht, die das Alkalimittel oder den alkalischen Puffer enthält, wird vorzugsweise unter solchen Bedingungen hergestellt, daß die Reagensschicht des analytischen Elementes einen pH-Wert innerhalb der Bereiches von pH 7,5 bis pH 10,0 (insbesondere von pH 8,0 bis 10,0 für ein analytisches Element für die quantitative Analyse von Lactat, das als Dehydrogenase Lactat-Dehydrogenase verwendet oder für ein analytisches Element für die quantitative Analyse von Neutralfett, das als Dehydrogenase Glycerin-Dehydrogenase oder Glycerin-3-phosphat- Dehydrogenase verwendet) zeigen, nachdem die Schicht eine flüssige Probe, die einen Analyten enthält, aufgenommen hat.
Wie oben erwähnt, ist das Alkalimittel oder der alkalische Puffer vorzugsweise in eine poröse Ausbreitungsschicht eingearbeitet.
In die poröse Ausbreitungsschicht ist vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres und/oder ein oberflächenaktives Mittel zum Zweck der Kontrolle einer übermäßigen Ausbreitung einer flüssigen Probe, die in die Schicht eingebracht worden ist, eingearbeitet.
Beispiele für die hydrophilen Polymere, die in die Ausbreitungsschicht eingearbeitet werden können, schließen Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid, Polyacrylsäure und hydrophile Cellulosederivate ein. Die hydrophilen Cellulosederivate sind Celluloseester, die durch Veretherung eines Teils oder der Gesamtheit einer Hydroxygruppe mit einer Niedrigalkylgruppe, die 1-3 Kohlenstoffatome aufweist, oder einer Niedrigalkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, die mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, hergestellt werden. Beispiele für die Celluloseether schließen wasserlösliche Methylcellulose, wasserlösliche Ethylcellulose, wasserlösliche Hydroxyethylcellulose, wasserlösliche Hydroxypropylmethylcellulose und wasserlösliche Hydroxybutylmethylcellulose ein. Bevorzugte hydrophile Polymere sind Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol und wasserlösliche Celluloseester. Diesen hydrophilen Polymere können in Kombination verwendet werden. Das hydrophile Polymere kann in einer Menge im Bereich von etwa 0,5 bis 15 g/m², vorzugsweise etwa 0,7 bis 10 g/m² in die Ausbreitungsschicht des analytischen Elementes eingearbeitet sein.
Das oberflächenaktive Mittel, das in die Ausbreitungsschicht eingearbeitet werden soll, kann zweckdienlich aus nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln, kationischen oberflächenaktiven Mitteln und amphoteren oberflächenaktiven Mitteln ausgewählt sein. Bevorzugt ist ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel. Beispiele für die nichtionischen oberflächenaktiven Mittel schließen Polyalkoholester-Ethylenoxidaddukte (Kondensationsprodukte), Polyethylenglykolmonoester, Polyethylenglykoldiester, Addukte aus einem höheren Alkohol und Ethylenoxid (Kondensationsprodukte), Alkylphenolethylenoxidaddukte (Kondensationsprodukte) und höhere Fettsäuren ein. Gemäß der Erfindung können zwei oder mehrere dieser nichtionischen oberflächenaktiven Mittel in Kombination verwendet werden. Wenn das nichtionische oberflächenaktive Mittel in Kombination mit dem hydrophilen Cellulosederivat verwendet wird, ist ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel mit eine HLB-Wert von nicht weniger als 10 bevorzugt. Das nichtionische oberflächenaktive Mittel kann in einer Menge im Bereich von etwa 0,1 bis 3 g/m², vorzugsweise etwa 0,2 bis 2 g/m², in die Ausbreitungsschicht des analytischen Elementes eingearbeitet sein. Die Herstellung des erfindungsgemäßen mehrschichtigen analytischen Elementes dient nur der Erläuterung und liegt außerhalb des Umfangs der Erfindung.
Das erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Element kann vorzugsweise durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Stufen
Bildung einer Reagensschicht, die mindestens das genannte oxidierte Nicotinamid-Coenzym und die Elektronenakzeptorverbindung, die den Farbstoff bildet, dispergiert in einem hydrophilen Polymeren enthält, auf dem genannten Träger;
Bildung einer flüssigen Ausbreitungsschicht mit Dosierungswirkung;
Aufbringen einer Lösung oder Dispersion, die mindestens das genannte Alkalimittel oder den alkalischen Puffer in einem organischen Lösungsmittel, das im wesentlichen kein Quellen des hydrophilen Polymeren in der darunter liegenden Reagensschicht verursacht, enthält, auf die Ausbreitungsschicht; und Trocknung der Überzugsschichten umfaßt.
Alternativ kann das erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Element vorzugsweise durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Stufen
Bildung einer Reagensschicht, die mindestens das genannte oxidierte Nicotinamid-Coenzym und die Elektronenakzeptorverbindung, die den Farbstoff bildet, dispergiert in einem hydrophilen Polymeren, enthält, auf dem genannten Träger;
Aufbringen einer Lösung oder Dispersion, die mindestens das genannte Alkalimittel oder den alkalischen Puffer in einem organischen Lösungsmittel, das im wesentlichen kein Quellen des hydrophilen Polymeren in der darunter liegenden Reagensschicht verursacht, enthalten, auf die darunter liegende Reagensschicht; und
Trocknung der Überzugsschichten umfaßt.
Hinsichtlich des bei dem Verfahren verwendbaren Lösungsmittels gibt es keine spezielle Begrenzung, solange das Lösungsmittel die oben erwähnten Bedingungen erfüllt, jedoch wird vorzugsweise ein polares Lösungsmittel mit einem Siedepunkt von nicht höher als 100ºC verwendet. Beispiele solcher polaren Lösungsmittel schließen niedrige Fettalkohole (z. B. Methanol-, Ethanol, Propanol, Butanol und Isopropylalkohol), Dialkylketone (z. B. Aceton), Dialkylether (z. B. Dimethylether) und cyclische Fettether (z. B. Tetrahydrofuran und Dioxan) ein. Bevorzugt wird ein Fettalkohol. Hinsichtlich der Arbeitsumgebung etc. werden insbesondere Alkohole, die für den menschlichen Körper weniger toxisch sind, wie Ethanol, Propanol, Butanol und Isopropylalkohol, verwendet. Die Konzentration der Lösung oder Dispersion ist zweckmäßigerweise so hoch wie möglich, mit der Maßgabe, daß die Lösung oder Dispersion ihren Inhalt leicht faßt und die poröse Ausbreitungsschicht homogen durchdringt. Obwohl die Konzentration der Lösung oder Dispersion von den Arten des Pyruvates und anderer gegebenenfalls einarbeitbarer Komponenten, wie einem pH-Puffermittel und einem hydrophilen Polymeren, abhängt, bewegt sich deren Konzentration im allgemeinen im Bereich von ca. 0,2 bis 10 %, vorzugsweise im Bereich von ca. 0,3 bis 7 %. Die Lösung oder Dispersion kann gemäß eines bekannten Verfahrens hergestellt werden. Das organische Lösungsmittel kann Wasser enthalten, mit der Maßgabe, daß die Einarbeitung von Wasser im wesentlichen keine Wanderung der Reagenszusammensetzung der darunterliegenden Schicht in die oberer Schicht verursacht.
Wenn in die Ausbreitungsschicht ein alkalischer Puffer oder ein Alkalimittel und ein oberflächenaktives Mittel eingearbeitet wird, so kann das oberflächenaktive Mittel in die Schicht in Form eines Lösungsmittelgemisches, das sowohl den alkalischen Puffer oder das Alkalimittel (und gegebenenfalls ein hydrophiles Polymeres) als auch das oberflächenaktive Mittel enthält, oder in Form einer anderen Lösung eingearbeitet werden.
Die Einarbeitung des Alkalimittels oder des alkalischen Puffers in die poröse Ausbreitungsschicht erfolgt vorzugsweise nach der Auflaminierung der Ausbreitungsschicht auf die darunter liegende Reagensschicht. Wenn die Ausbreitungsschicht aus einem Mikrofilter, einem gestrickten Stoff oder einem gewebtem Stoff besteht, kann das Alkalimittel in die Ausbreitungsschicht vor der Auflaminierung der Schicht eingearbeitet werden. In diesem Fall jedoch ist es schwierig, den Gehalt an Alkalimittel oder alkalischem Puffer in der porösen Ausbreitungsschicht zu kontrollieren. Dementsprechend ist es hinsichtlich der analytischen Genauigkeit und der Herstellungskosten vorteilhaft, das Alkalimittel oder den alkalischen Puffer nach Bereitstellen der Ausbreitungsschicht auf der zuvor gebildeten Reagensschicht (direkt oder indirekt über eine Klebeschicht) einzuarbeiten. Das Alkalimittel oder der alkalische Puffer kann beispielsweise in die Ausbreitungsschicht durch Überziehen in gleichmäßiger Form oder Aufsprühen des Mittels auf die Oberfläche der Ausbreitungsschicht gemäß eines bekannten Verfahrens eingearbeitet werden. Das aufgezogene oder aufgesprühte Puffermittel kann luftgetrocknet oder unter reduziertem Druck getrocknet werden.
Hinsichtlich der Herstellung, des Verpackens, des Transportes, der Konservierung und des Meßvorgangs ist es bevorzugt, daß das erfindungsgemäße integrierte mehrschichtige analytische Element in rechteckige oder kreisförmige Stücke von etwa 15 bis 30 mm Kantenlänge oder etwa 15 bis 30 mm Durchmesser zurechtgeschnitten wird und in einen Objektträgerrahmen gegeben wird, um einen analytischen Objektträger zu ergeben, wie in den vorläufigen japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 57(1982)-63452 und 54(1979)-156079, den japanischen vorläufigen Gebrauchsmusterveröffentlichungen Nr. 56(1981)-142454 und 58(1983)-32350 und der japanischen vorläufigen Patentveröffentlichung Nr. 58(1983)-501144 beschrieben.
Etwa 5 bis etwa 30 ul, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 15 ul einer wäßrigen flüssigen Probe werden auf die poröse Ausbreitungsschicht des analytischen Elementes aufgegeben (aufgetüpfelt) und, wenn nötig, wird das analytische Element bei einer im wesentlichen konstanten Temperatur von etwa 20 bis 45ºC inkubiert. Eine detektierbare Veränderung, wie eine Farbän-derung oder eine Farbbildung, in dem Element wird durch Re-flexionsphotometrie gemessen (auf der Seite des lichtdurchlässigen Trägers), um durch den Analyten in der flüssigen Probe kolorimetrisch zu analysieren.
Beispiele der Erfindung und Vergleichsbeispiele sind unten angegeben.

Beispiel 1

Eine Überzugslösung für eine Reagensschicht der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt. In die Überzugslösung wurde eine 1N-Natriumhydroxidlösung zur Einstellung der Überzugslösung auf einen pH von 6,8 eingetropft. Die Überzugslösung wurde auf die Oberfläche eines transparenten Polyethylenterephthalat- (PET)- Films (Träger) von 180 um Dicke, die mit Gelatine unterlegt worden war, aufgezogen und die Überzugsschicht wurde unter Bildung einer farbbildenden Reagensschicht, für die Detektion von Neutralfett, auf dem Träger getrocknet.

Zusammensetzung der Überzugslösung für die Reagensschicht

Alkali-behandeltes Gelatine 17 g/m² Nonylphenoxypolyethoxyethanol (durchschnittlicher Gehalt der
Oxyethyleneinheit: 15) 75 mg/m²
ATP 1,5 g/m²
Magnesiumsulfat 1,2 g/m²
NAD 280 mg/m²
3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen) - bis [2- (p-nitrophenyl)-2H-tetrazolium] - dichlorid 550 mg/m²
Natriumcitrat 3,7 g/m²
Diaphorase (EG 1.6.4.3) 6000 U/m²
Glycerinkinase (EG 2.7.1.30) 1800 U/m²
Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (EG 1.1.99.5) 10000 U/m²
Auf die Oberfläche der erhaltenen Reagensschicht wurde eine Überzugslösung mit der folgenden Zusammensetzung unter Bildung einer Lichtblockierungsschicht auf der Reagensschicht aufgezogen.

Zusammensetzung der Überzugslösung für die Lichtblockierungsschicht

Alkali-behandeltes Gelatine 5,0 g/m²
Titandioxid vom Rutiltyp 28 g/m² Nonylphenoxypolyethoxyethanol (durchschnittlicher Gehalt der Oxyethyleneinheit: 15) 100 mg/m²
Auf die Oberfläche der erhaltenen Lichtblockierungsschicht wurde eine Überzugslösung der folgenden Zusammensetzung unter Bildung einer Klebeschicht auf der Lichtblockierungsschicht aufgezogen.

Zusammensetzung der Überzugslösung für die Klebeschicht

mit Alkali behandeltes Gelatine 2,7 g/m² Nonylphenoxypolyethoxyethanol (durchschnittlicher Oxyethyleneinheitengehalt: 15) 270 mg/m²
Unabhängig davon wurde ein gestrickter Stoff (durchschnittliche Dicke 250 um), bestehend aus gesponnenem Polyethylenterephthalatgarn (50 Deniers) einer Glimmentladungsbehandlung unterzogen, um ihn hydrophil zu machen. Anschließend wurde die Oberfläche der Klebeschicht in einer Menge von 30 g/m² zum Quellen mit Wasser benetzt und dann wurde darauf der wie oben behandelte gestrickte Stoff durch ein Drucklaminierungsverfahren unter Bildung einer Ausbreitungsschicht auf der Klebeschicht aufgebracht.
Auf die Oberfläche der Ausbreitungsschicht wurde eine Ethanoldispersion des Alkalimittels mit der folgenden Zusammentsetzung in einer Menge von 200 ml/m² unter Bildung einer Schicht aus der Ethanoldispersion, die das Alkalimittel enthält, auf der Ausbreitungsschicht aufgezogen.

Zusammensetzung der Ethanoldispersion des Alkalimittels

Ethanol 500 ml
Polyvinylpyrrolidon (durchschnittliches Molekulargewicht 360000) 20 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (durchschnittlicher Gehalt der Oxyethyleneinheit: 40) 5 g/m²
2-Amino-1-methyl-1,3-propandiol 9 g/m²
Die erhaltene mehrschichtige Folie bzw. das Blatt wurde dann getrocknet, um ein integrales mehrschichtiges analytisches Element für die erfindungsgemäße quantitative Bestimmung von Neutralfett herzustellen.

Vergleichsbeispiel 1

Die Verfahrensweise aus Beispiel 1 wurde wiederholt, außer daß die wäßrige Lösung des Alkalimittels nicht verwendet wurde, sondern anstelle von Ethanol Wasser in derselben Menge verwendet wurde, um ein analytisches Element zu Vergleichszwecken herzustellen.

Vergleichsbeispiel 2

Die Verfahrensweise aus Beispiel wurde wiederholt, außer daß 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol nicht in die Ethanoldispersion des Alkalimittels zur Herstellung eines analytischen Elementes zu Vergleichszwecken, eingearbeitet wurde.
Jedes der analytischen Elemente, die in den obigen Beispielen erhalten worden waren, wurde zu einem quadratischen Stück (1,5 mm · 1,5 mm) zugeschnitten und die Stücke wurden jeweils auf einem Kunststoffrahmen, offenbart in der vorläufigen japanischen Patentpublikation Nr. 57(1982)-63452, angeordnet, um einen chemischen analytischen Objektträger für die erfindungsgemäße quantitative Bestimmung von Neutralfett und chemische analytische Objektträger für die quantitative Bestimmung von Neutralfett zu Vergleichszwecken herzustellen.
Jede der drei Arten von Objektträgern wurde bei Temperaturen von -25ºC und +45ºC unter trockenen Bedingungen eine Woche stehengelassen und danach wurde auf die Objektträger jeweils 10 ul verschiedener menschlicher Seren mit unterschiedlichen Konzentrationen an Neutralfett aufgetüpfelt und bei 37ºC 6 Minuten lang inkubiert. Dann wurde für die Objektträger jeweils die optische Reflexionsdichte auf der PET-Trägerseite bei einem Licht von 540 nm (zentrale Wellenlänge) gemessen.
Getrennt davon wurden für die oben beschriebenen Seren die Konzentrationen an Neutralfett gemäß eines Verfahrens mit Glycerin-3-phosphat-Oxidase bestimmt, und eine Kalibrierungskurve wurde auf der Grundlage der bestimmten Konzentrationen des Neutralfettes hergestellt, um diese mit den Werten der Vergleichsbeispiele zu vergleichen.
Die Messung der optischen Dichte des Objektträgers im Falle, daß die Konzentration an Neutralfett 0 war, erfolgte durch Auftüpfeln einer 7%igen menschlichen Albuminlösung auf den Objektträger.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Konzentration Neutralfett (mg/dl) Beispiel 1 (-25ºC/45ºC) Vergleichsbeispiel 1
In dem integralen mehrschichtigen analytischen Element für die erfindungsgemäße quantitative Bestimmung von Neutralfett war die Zunahme der optischen Dichte als Hintergrundanfärbung sehr gering, auch dann nachdem das Element für eine Woche bei 45ºC stehengelassen worden war. Des weiteren nahm die optische Dichte in dem weiten Bereich, bezogen auf die Menge an Neutralfett (d. h. Bereich bis ca. 3,3 Mal so viel wie die obere Grenze seines normalen Wertes) kaum ab, und es wurde eine Kalibrierungskurve mit einer steilen Steigung erhalten. Daher wurde bestätigt, daß das erfindungsgemäße analytische Element eine hohe Genauigkeit für die quantitative Bestimmung besitzt.

Beispiel 2

Auf die Oberfläche eines farblosen transparenten Polyethylenterphthalat- (PET)-Films (Träger) von 180 um Dicke, der mit Gelatine unterlegt worden war, wurde die folgende Masse in Form einer wäßrigen Lösung aufgezogen, und die Überzugsschicht wurde unter Bildung einer farbbildenden Reagensschicht zur Detektion von Lactat getrocknet.

Zusammensetzung der farbbildenden Reagensschicht

mit Alkali behandelte Gelatine 10 g/m²
Nonylphenoxypolyglycidylether (durchschnittlicher Glycidyleinheitengehalt: 10) 200 mg/m²
Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.27, Herkunft: Schweineherz) 12000 U/m²
Diaphorase (EG 1.6.4.3, Herkunft: Mikroorganismus) 5600 U/m²
NAD+ 600 mg/m²
3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)bis-[2-(p-nitrophenyl)-2H-tetrazolium)dichlorid 400 mg/m²
Natriumcitrat 6,0 g/m²
Unabhängig davon wurde ein gestrickter Stoff (durchschnittliche Dicke 200 um), bestehend aus gesponnenem Polyethylenterephthalatgarn (50 Deniers) einer Glimmentladungsbehandlung unterzogen, um ihn hydrophil zu machen. Anschließend wurde die Oberfläche der Reagensschicht in einer Menge von 30 g/m² zum Quellen mit Wasser benetzt und dann darauf der gestrickte Stoff, der wie oben behandelt worden war, durch ein Drucklaminierungsverfahren unter Bildung einer Ausbreitungsschicht auf der Klebeschicht aufgebracht.
Auf die Oberfläche der Ausbreitungsschicht wurde eine Ethanollösung der folgenden Zusammensetzung in einer Menge von 200 ml/m² unter Bildung einer Schicht aus der Ethanollösung, die das Alkalimittel enthält, auf der Ausbreitungsschicht aufgebracht.

Zusammensetzung der Ethanoldispersion des Alkalimittels

Ethylalkohol 500 ml
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (durchschnittlicher Gehalt der Oxyethyleneinheit: 9-10 5 g
2-Amino-1-methyl-1,3-propandiol 9 g
Polyvinylpyrrolidon (durchschnittliches Molekulargewicht: 360000) 16 g/m²
Die erhaltene mehrschichtige Folie bzw. das Blatt wurde dann zur Herstellung eines integralen mehrschichtigen analytischen Elementes, für die quantitative Bestimmung von Lactat, getrocknet.
Das analytische Element wurde zu quadratischen Stücken (1,5 mm · 1,5 mm) zurechtgeschnitten und die Stücke wurden jeweils auf einem Kunststoffrahmen, offenbart in der japanischen vorläufigen Patentveröffentlichung Nr. 57(1982)-63452, angeordnet, um einen chemischen analytischen Objektträger zur quantitativen Bestimmung von Lactat herzustellen.
Auf die Objektträger wurden jeweils 10 ul verschiedener wäßriger Lactatlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Lactat (0, 1, 5, 10, 15 und 20 mg/dl, und bei 37ºC 6 Minuten lang inkubiert) aufgetüpfelt. Dann wurden die Objektträger jeweils auf die optische Reflexionsdichte hin auf der PET-Trägerseite bei Licht von 540 nm (zentrale Wellenlänge) gemessen, um eine Kalibrierungskurve anzufertigen. Die erhaltene Kalibrierungskurve ist in Tabelle 2 numerisch dargestellt. Tabelle 2 Menge an Lactat (mg/dl)

Beispiel 3

Derselbe Objektträger, wie in Beispiel 2 hergestellt, wurde zur Bestimmung des Störeinflusses von Bilirubin getestet.
Eine Lösung der in Tabelle 3 aufgezeigten Zusammensetzung wurde unter Verwendung des Kontrollserums mit erhöhtem Bilirubingehalt von OMEGA Chemistry (gemessener Wert des Bilirubingehaltes 30 mg/dl) und eines Kontrollserums, gemessener Gehalt an Lactat (ausgedrückt als Milchsäure): 8 mg/dl) hergestellt. Diese Lösung wurde auf den Objektträger aufgetragen und zur Bewertung des Einflusses von Bilirubin auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 weiter bearbeitet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgezeigt. Tabelle 3 Gehalt der Lösung (Volumenteil) Nr. 1 Serum Bilirubinlösung Wasser Optische Dichte
Anmerkung: Der Standardwert war eine optische Reflexionsdichte, die durch die Messung mit einem Objektträgers unter Verwendung der Bilirubinlösung oder einer Probelösung ohne Hämoglobin, erhalten worden war.
Die in Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße analytische Element für die quantitative Analyse von Lactat bei einem Gehalt von 4 mg/dl (untere Grenze des Normalwertes ) in wesentlichen ohne Fehler (Fehler: innerhalb von ±0, 65%), verursacht durch die Gegenwart von Bilirubin in einem breiten Bereich, der von der Abwesenheit von Bilirubin bis zu 15 mg/dl (abnormal hoher Bilirubingehalt entsprechend einem 15 mal so hohen Wert als der Normalwert) reicht, einsetzbar ist.

Beispiel 4

Derselbe Objektträger, wie in Beispiel 2 hergestellt, wurde zur Bestimmung des Störeinflusses von Hämoglobin getestet.
Eine Lösung der in Tabelle 4 aufgezeigten Zusammensetzung wurde unter Verwendung eines Kontrollserums (gemessener Wert des Hämoglobingehaltes: 1400 mg/dl) und eines weiteren Kontrollserums (gemessener Wert an Lactat (ausgedrückt als Milchsäure: 8 mg/dl) hergestellt. Diese Lösung wurde auf den Objektträger aufgetragen und auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 zur Bewertung des Einflusses von Hämoglobin weiterverarbeitet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgezeigt. Tabelle 4 Gehalt der Lösung (Volumenteil) Nr. 1 Serum Hämoglobinlösung Wasser Optische Dichte
Die in Tabelle 4 aufgezeigten Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße analytische Element für die quantitative Analyse von Lactat bei einem Gehalt von 4 mg/dl (untere Grenze des Normalwertes) im wesentlichen ohne Fehler (Fehler innerhalb ± 1,90 %), verursacht durch die Gegenwart von Hämoglobin in einem weiten Bereich, der von der Abwesenheit von Hämoglobin bis zu 15 mg/dl (abnormal hoher Hämoglobingehalt entsprechend dem von homolysiertem Gesamtblut hämolysiertem Plasma oder hämolysiertem Serum) reicht, verwendbar ist.

Beispiel 5

Derselbe Objektträger wie in Beispiel 2 hergestellt verblieb 4 Wochen in einem versiegelten dunklen Reaktionsgefäß, in dem er auf 30ºC gehalten und mittels Silicagel getrocknet wurde, um durch Reflexionsphotometrie eine Hintergrundfärbung (Schleier) zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Vergleichsbeispiel 3

Derselbe Objektträger wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 hergestellt, außer daß das Alkalimittel in die darunter liegende Reagensschicht statt in die Ausbreitungsschicht eingearbeitet wurde. Der erhaltene Objektträger verblieb 4 Wochen lang in einem abgeschlossenen dunklen Reaktionsgefäß, in dem er auf 30ºC gehalten und mittels Silicagel getrocknet wurde, um durch Reflexionsphotometrie eine Hintergrundfärbung (Schleier) zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgezeigt. Tabelle 5 Aufbewahrungszeitraum 0 Tage Beispiel 5 Vergleichsbeispiel 3
Die in Tabelle 5 aufgezeigten Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße analytische Element, das das Alkalimittel in der Ausbreitungsschicht enthält, stabiler ist und eine stärker verringerte Schleierbildung aufweist als das analytische Vergleichselement, das das Alkalimittel in der Reagensschicht in Kombination mit weiteren farbbildenden Reagentien enthält.

Beispiel 6

Eine Überzugslösung für eine Reagensschicht der folgenden Zusammensetzung wurde hergestellt. Auf der Oberfläche eines transparenten Polyethylenterephthat- (PET) Films (Träger) von 180 um Dicke, der mit Gelatine unterlegt worden war, wurde die Überzugslösung aufgebracht und die Überzugsschicht wurde unter Bildung einer farbbildenden Reagensschicht, für die Detektion von Neutralfett, auf dem Träger getrocknet.

Zusammensetzung der Überzugsschicht für die Reagensschicht

Alkali-behandelte Gelatine 22 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (durchschnittlicher Gehalt der Oxyethyleneinheit: 15) 100 mg/m²
ATP 1,9 g/m²
Magnesiumsulfat 1,6 g/m²
NAD 360 mg/m²
3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'- biphenylen)-bis-[2-(p-nitrophenyl)- 2H-tetrazolium)-dichlorid 720 mg/m²
Diaphorase (EG 1.6.4.3) 7700 U/m²
Glycerinkinase (EG 2.7.1.30) 2500 U/m²
Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (EG 1.1.99.5) 15000 U/m²
Auf die erhaltene Reagensschicht wurde eine Überzugslösung der folgenden Zusammensetzung unter Bildung einer Lichtblockierungsschicht auf der Reagensschicht aufgezogen.

Zusammensetzung der Überzugslösung für die Lichtblokkierungsschicht

Alkali-behandelte Gelatine 3,2 g/m²
Titandioxid vom Rutiltyp 28 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (durchschnittlicher Gehalt der Oxyethyleneinheit: 15) 100 mg/m²
Auf die Oberfläche der erhaltenen Lichtblockierungsschicht wurde eine Überzugslösung der folgenden Zusammensetzung unter Bildung einer Klebeschicht auf der Lichtblockierungsschicht aufgezogen.

Zusammensetzung der Überzugslösung für die Klebeschicht

Alkali-behandelte Gelatine 2,7 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (durchschnittlicher Gehalt der Oxyethyleneinheit: 15) 200 mg/m²
Unabhängig davon wurde ein gestrickter Stoff (durchschnittliche Dicke: 250 um), bestehend aus gesponnenem Polyethylenterephthalatgarn (50 Deniers) einer Glimmentladungsbehandlung unterzogen, um ihn hydrophil zu machen. Anschließend wurde die Oberfläche der Klebeschicht in einer Menge von 30 g/m² zum Aufquellen mit Wasser benetzt und dann darauf der wie oben behandelte gestrickte Stoff mittels eines Drucklaminierungsverfahrens angebracht.
Auf die Oberfläche der Ausbreitungsschicht wurde eine Ethanoldispersion eines Alkalimittels der folgenden Zusammensetzung in einer Menge von 200 ml/m² unter Bildung einer Schicht aus der Ethanoldispersion, die das Alkalimittel auf der Ausbreitungsschicht enthält, aufgebracht.

Zusammensetzung der Ethanoldispersion des Alkalimittels

Ethanol 500 ml
Polyvinylpyrrolidon (durchschnittliches Molekulargewicht: 360000) 20 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (durchschnittlicher Gehalt der Oxyethyleneinheit: 40) 5 g/m²
2-Amino-1-methyl-1,3-propandiol 9 g/m²
(zu der Zusammensetzung wurde eine Lösung von 11400 U Lipoproteinlipase in 5 ml Wasser gegeben).
Die erhaltene mehrschichtige Folie bzw. das Blatt wurde dann getrocknet, um ein integrales mehrschichtiges analytisches Element für die erfindungsgemäße quantitative Bestimmung von Neutralfett herzustellen.

Vergleichsbeispiel 4

Die Verfahrensweise aus Beispiel 6 wurde wiederholt, außer daß die wäßrige Lösung des Alkalimittels nicht verwendet wurde, sondern anstelle von Ethanol Wasser in derselben Menge verwendet wurde, um ein analytisches Vergleichselement herzustellen.

Vergleichsbeispiel 5

Die Verfahrensweise aus Beispiel 6 wurde wiederholt, außer daß 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol (3,6 g/m²) und Lipoproteinlipase (4500 U/m²) statt in die Ausbreitungsschicht in die Klebeschicht eingearbeitet wurden, um ein analytisches Vergleichselement herzustellen.
Die in den obigen Beispielen erhaltenen analytischen Elemente wurden jeweils zu quadratischen Stücken (1,5 mm · 1,5 mm) zurechtgeschnitten und jedes Stück wurde auf einem Kunststoffrahmen angeordnet, um einen chemischen analytischen Objektträger für die erfindungsgemäße quantitative Bestimmung von Neutralfett und chemische analytische Objektträger für die quantitative Bestimmung von Neutralfett zu Vergleichszwecken herzustellen.
Die drei verschiedenen Arten von Objektträgern wurden jeweils eine Woche lang bei Temperaturen von -25ºC und +45ºC unter trockenen Bedingungen stehengelassen und danach wurde auf die Objektträger 10 ul verschiedener menschlicher Seren unterschiedlicher Konzentrationen an Neutralfett aufgetüpfelt und bei 37ºC 6 Minuten lang inkubiert. Dann wurden die Objektträger jeweils hinsichtlich der optischen Refelxionsdichte auf der PET-Trägerseite bei einem Licht von 540 nm (zentrale Wellenlänge) gemessen.
Getrennt davon wurden die oben beschriebenen Seren hinsichtlich ihrer Konzentrationen an Neutralfett gemäß dem Glycerin-3-phosphat-Oxidaseverfahrens geprüft, und es wurde auf der Grundlage der bestimmten Konzentrationen an Neutralfett eine Kalibrierungskurve erstellt, um jene mit der in den Vergleichsbeispielen zu vergleichen.
Die Messung der optischen Dichte der Objektträger, im Falle daß die Konzentration an Neutralfett 0 betrug, wurde vorgenommen, indem eine 7%ige menschliche Albuminlösung auf den Objektträger aufgetüpfelt wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Konzentration an Neutralfett (mg/dl) Beispiel 6 (-25ºC/45ºC) Vergleichsbeispiel 4
Bei dem integralen mehrschichtigen analytischen Element für die erfindungsgemäße quantitative Bestimmung von Neutralfett war die Zunahme der optischen Dichte als Hintergrundfärbung sehr gering, auch wenn das Element eine Woche lang bei 45ºC stehengelassen wurde. Des weiteren nahm die optische Dichte in einem weiten Bereich, bezogen auf die Menge des Neutralfettes (d. h. ein Bereich, der ca. 3,3 mal so groß wie die obere Grenze seines normalen Wertes war) kaum ab, und es wurde eine Kalibrierungskurve mit einer steilen Steigung erhalten. Daher wurde bestätigt, daß das erfindungsgemäße analytische Element für die quantitative Bestimmung eine hohe Genauigkeit besitzt.

Beispiel 7

Derselbe Objektträger wie in Beispiel 6 für die quantitative Bestimmung von Neutralfett wurde hergestellt.
Auf die Objektträger wurden jeweils 10 ul einer unterschiedlichen menschlichen Vollblutlösung (gewonnen in Gegenwart von Heparin) mit verschiedenen Konzentrationen an Neutralfett (0, 62, 167, 238, 383 und 527 mg/dl, und inkubiert 6 Minuten lang bei 37ºC) aufgetüpfelt. Dann wurden die Objektträger jeweils hinsichtlich der optischen Reflexionsdichte auf der PET-Trägerseite bei einem Licht von 540 nm (zentrale Wellenlänge) gemessen, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen. Die erhaltene Kalibrierungskurve ist in Tabelle 7 numerisch dargestellt. Tabelle 7 Gehalt an Neutralfett (mg/dl)
Die Ergebnisse, die in Tabelle 7 dargestellt sind, zeigen daß das erfindungsgemäße analytische Element eine steile Kalibrierungskurve ergibt und sich darum analytische Ergebnisse von hoher Genauigkeit ergeben.

Beispiel 8

Derselbe Objektträger, wie in Beispiel 6 hergestellt, wurde zur Bestimmung des Störeinflusses von Bilirubin getestet.
Drei Arten von Lösungen der in Tabelle 3 aufgezeigten Zusammensetzung wurden unter Verwendung des Serums mit erhöhtem Bilirubingehalt von OMEGA Chemistry (gemessener Gehalt an Bilirubin 30 mg/dl) eines Serums, das Neutralfett enthält (gemessener Wert an Neutralfett 690 mg/dl) und einer physiologischen Salzlösung hergestellt. Diese Lösung wurden auf den Objektträger aufgetragen und in derselben Weise wie in Beispiel 7 zur Bewertung des Bilirubin-Störeinflusses weiterverarbeitet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 aufgezeigt. Tabelle 8 Gehalt der Lösung (Volumenteil) Nr. 1 Serum Kontrollserum Salzlösung Neutralfett (Analyt) Bilirubin (Störsubstanz) Optische Dichte
Die in Tabelle 8 aufgezeigten Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße analytische Element für die quantitative Analyse von Neutralfett bei einem Gehalt an 345 mg/dl (einem Wert von ca. doppelt soviel wie der normale Wert) im wesentlichen ohne Fehler (Fehler innerhalb ± 0,62 %), verursacht durch die Gegenwart von Bilirubin in einem weiten Bereich, der von der Abwesenheit von Bilirubin bis zu 50 mg/dl (abnormal hoher Bilirubingehalt, der einem Wert entspricht, der 15mal so hoch wie der Normalwert ist) reicht, einsetzbar ist.

Beispiel 9

Derselbe Objektträger, wie in Beispiel 6 hergestellt, wurde für die Bestimmung des Störeinflusses durch Hämoglobin getestet.
Drei Arten von Lösungen der in Tabelle 9 aufgezeigten Zusammensetzung wurden unter Verwendung eines Kontrollserums (gemessener Wert des Hämoglobingehaltes: 1000 mg/dl) und eines Serums (gemessener Wert an Neutralfett: 690 mg/dl) sowie einer physiologischen Salzlösung hergestellt. Diese Lösung wurde auf den Objektträger aufgetragen und auf dieselbe Weise wie in Beispiel 6 zur Bewertung des Störeinflusses von Hämoglobin weiterverarbeitet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Gehalt der Lösung (Volumenteil) Nr. 1 Serum Kontrollserum Salzlösung Neutralfett (Analyt) Bilirubin (Störsubstanz) Optische Dichte
Die in Tabelle 9 aufgezeigten Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße analytische Element für die quantitative Analyse von Neutralfett bei einem Gehalt von 345 mg/dl (einem Wert, der ca. doppelt so groß ist wie der Normalwert) im wesentlichen ohne Fehler (Fehler innerhalb von +0,73 %), verursacht durch die Gegenwart von Hämoglobin in einem weiten Bereich, der von der Abwesenheit von Hämoglobin bis zu 500 mg/dl (abnormal hoher Hämoglobingehalt, der dem von homolysiertem Vollblut, hämolysiertem Plasma oder hämolysiertem Serum entspricht) reicht, verwendbar ist.

Claims

1. Trockenes, integrales, mehrschichtiges, analytisches Element, dadurch gekennzeichnet, daß es einen lichtdurchlässigen, wasserundurchlässigen Träger und Reagensschichten, die auf dem Träger vorgesehen sind, umfaßt, wobei die Reagens schichten Dehydrogenase, oxidiertes Nikotinamid-Coenzym, eine Elektronentransportverbindung und eine Elektronenakzeptorverbindung, die einen Farbstoff bildet, enthalten, wobei ein alkalisches Mittel oder ein alkalischer Puffer in der Reagensschicht, die sich von der Reagensschicht, die die genannte Dehydrogenase, das oxidierte Nikotinamid-Coenzym und die Elektronenakzeptorverbindung, die den Farbstoff bildet, enthält, unterscheidet, enthalten ist, wobei das genannte alkalische Mittel oder der alkalische Puffer eine pH-Einstellungsfunktion besitzen, um den pH-Wert in den Reagensschichten innerhalb des Bereiches von pH 7,5 und pH 10,0 einzustellen, nachdem in die Reagensschichten eine flüssige Probe eingebracht worden ist.

2. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht, die das alkalische Mittel oder den alkalischen Puffer enthält, auf der Schicht, die die Dehydrogenase, das oxidierte Nikotinamid- Coenzym und die Elektronenakzeptorverbindung, die den Farbstoff bildet, enthält, angeordnet ist.

3. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das alkalische Mittel oder der alkalische Puffer in der Schicht unter der Bedingung enthalten ist, daß das alkalische Mittel oder der alkalische Puffer in einem hydrophilen Polymeren dispergiert ist.

4. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht, die das alkalische Mittel oder den alkalischen Puffer enthält, in Form einer porösen Flüssigkeitsausbreitungsschicht, die eine Dosierungsfunktion besitzt, vorliegt.

5. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht, die das alkalische Mittel oder den alkalischen Puffer enthält, in Form einer porösen Flüssigkeitsausbreitungsschicht aus einem gewebten oder gestrickten Stoff, der eine Dosierungsfunktion besitzt, vorliegt.

6. Analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektronentransportverbindung in der Reagensschicht, die die Dehydrogenase, das oxidierte Nikotinamid-Coenzym und die Elektronenakzeptorverbindung, die den Farbstoff bildet, enthält, enthalten ist.