JPS60108753A - 多層化学分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野Ｊ 本発明は多層化学分析費、もに関するもので、　、ｉＴ
しくは生物液体、特に保恒剤として弗化物が含イｊされ
る血液試料（全面、血漿または血清）において弗化物に
よる被検物質の定ＩＩｉ分析の妨、す（または干渉）が
排除された多層化学分析要素に関するものである。

［従来技術］ 血液試料（以下、特にことわらない限り全面、血漿およ
び面枯いずれをも意味する）に保恒剤として弗化物、例
えば弗化ナトリウム、弗化リチウム等を添加することが
広く行われている。弗化物は検値作用としての面液凝固
防１１、作用のほかに解糖阻止作用をもイ１するので、
ことに血液中のブドウｉｌ＋含有ね１の測定に際し血液
試料への添加に適している。（金井泉　原著、金井正光
　編！Ａ「臨床検査〃：提要」改訂２９１医（金属出版
、１９８３年発行）２２８頁、　Ｒ，Ｄ、Ｈｅｎｒｙ、
　Ｄ、Ｃ，Ｃａｎｎｏｎ、　Ｊ、Ｗ、Ｗｉｎｋｅ１ｍａ
ｎ編Ｘ　ｒｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｐ
ｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　ＴｅｃｈｎｉｃｓＪ　２
ｎｄ　Ｅｄ、　（Ｈａｒｐｅｒ　＆　Ｒｏｗ、　Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｅｒｓ、　１９７４年発行）　３８５−３８８
頁等参照）保恒剤としての弗化物は、血液採取後直ちに
血液に添加するか、または弗化物を内面に塗布した採決
管に血液を採取することにより血液に添加ごれるのが一
般的である。弗化物は、例えばＮａＦの場合、血液試料
１ｍ文当り約１ｍｇから約１０ｍｇの範囲で含有される
ことが多い。近年隆盛になった酵素、特にオキシダーゼ
（例、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ等）を含む試薬系で分析する方法において、弗素
陰イオンは被検物質含有量を低値にする負誤差を与える
妨害作用（または干渉作用）を有することが判明してい
る。ことに弗化物が多肢に含有される血液試ネ：１を用
いて分析する場合、および弗化物が含有される血液試才
１を乾式陛角の多層分析要素に適用して分析する場合に
、弗７も陰イオンに起因する負誤差か著しいので、負コ
’＋Ｘの解消か屯黄な技ソート【的課題になっている。

弗化物による負誤差を解消するために、特公昭５７−２
８２７７５３に記載のグルコース定ｊｔ目１１体型多層
分析要素においては、グルコースオキシダーゼ、ペルオ
キシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび７−ヒドロ
キシ−１−十７１・−ルを含むグルコースＡ１１ｌ定試
薬Ｍｌ成物を含む試薬層に、使用条件（分析条ヂ１）ド
においてｐ　Ｈ（ｆｉを５．０ないし５．６にＭ［持す
るｐＨ緩村「Ｉ剤または有機耐として、３，３−ジメチ
ルグルタル酸、こは〈酎またはりんご酸を含有させるこ
とが提案されている。また特願昭５７−１３１７５０号
に記載の多層分析要素においては、弗化物による負誤Ｘ
−を解消するためにグルコースオキシダーゼまたはコレ
ステロールオキシダーゼ等のオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、４−アミノアンチピリン、１．７−シヒドロキ
シナフタレンを含むグルコースまたはコレステロール分
析用試薬組成物に、弗素陰イオ／との間に水に難溶性の
塩を形成しうるカルシウム陽イオン等を含む酢酸カルシ
ウム等を併用することか提案されている。ところが、こ
れらの技術を適用したグルコース定量分析用多層分析要
素において、従来から用いられていた酸化アルミニウム
またはアルミニウムの含水酸化物を含む物質で表面処理
された二酸化チタン微粉末を含有する光遮蔽層または光
反射層を設けた場合に、依然として弗化物に起因する負
誤差が生じるばかりでなく、酢酸カルシウム等を併用し
たグルコース定量分析用多層分析要素においては、弗化
物含有量が少ない範囲では弗化物に起因する正誤差が生
じ、弗化吻合４１量が多い範囲では、弗化物に起因する
負誤差が生ずるという弗化物に起因する複雑な妨害作用
（または干渉作用）が現れることが見い出された。

［発明の目的］ 本発明の目的は、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、水
素供与体（色原体）、およびカプラー（または水素供り
°体とカプラーのＭ１合せのかわりに、酸化により発色
または変色する？ロー化合物である水素供ケ１体）を含
む弔−または複数の試薬層、二酸化チタン微粉末を含む
光遮蔽層（または光反射層）、および多孔性展開層を有
する多層化学分析要素において、血液試Ｆｌに含有され
る弗化物による妨害作用（または１°渉作用）の結果と
して生ずる負誤差または１．７′ｌ差を解消して分析精
度を高めることであり、さらに多層化学分析要素内の試
薬層に代表される副層の分析条件下におけるＰＨ値を意
図した（ｆｉに維持することにより分析精度を高めるこ
とにもある。

［発明の構成］ 前記の目的は多層化パフ゛分析要素において、光遮蔽層
（または光反射層）に含有される一ｍ化チタン微粉末と
して酸化アルミニウド（アルミナ）またはアルミニウム
の含水酸化物を（アルミナ永和物等）を含む物質で表面
処理されていない二酸化チタン微粉末または表面処理さ
れていない二酸化チタン微粉末を用いることにより達成
される。

本発明は、水不透過性光透過性支持体の上に試薬層、光
遮蔽層、および多孔性展開層がこの順に設けられてなる
多層化学分析要素において、ＩＭｆ記光遮光遮蔽層化ア
ルミニウムまたはアルミニウムの含水酸化物を含む物質
による表面処理がなされていない−ｍ化チタン微粉末ま
たは表面処理されていない二酸化チタン微粉末が含有さ
れている多層化学分析要素である。

本発明に用いることができろ水不浸透性光透過性支持体
としては、特公昭５３−２１６７７号、特開昭５５−１
６４３５６号等の明細書に記載の多層分４ｆｒ要Ｊの支
持体に用いられているものから適宜に選択して用いるこ
とができる。支持体の具体例としては、酢酸セルロース
、酢酸酩酊セルロース、ポリ（エチレンテレフタレート
）、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレートなどの親水性にとぼしい
かまたは疎水性のポリマーで、約５０ＪＬｍから約１ｍ
ｍ、好ましくは約８０１Ｌｍから約４００ｇｍの範囲の
厚さの透明なフィルムまたはシート、および厚さ約１０
０ｇｍから約２ｍｍ、＆／ましくは約１５０ｇｍから約
１ｍｍの範囲の透明なカラス板などをあげることができ
る。支持体の表面は必要により公知の物理化学的処理（
例、紫外線！＋（！射、コロナ放電処理、グロー放電処
理等）を実施して試薬層重との接１１力を高めるか、あ
るいは物理化学的処理を施して（または、施さずに）親
水性ポリマーであるゼラチン等のド塗り層を設けて試薬
層等との接７１力を高めることができる。

試薬層はペルオキシダーゼと過酷化水素との存在下で検
出ＩＩＴ能な変化を生ずる過酸化水素指示薬、ペルオキ
シダーゼ、およびオキシダーゼが親水性の被膜形成ｆ市
を有するポリマーバインターの中に分散または溶解して
含有される層である。後述するように、オキシダーゼ層
を別個の層として設け、そこにオキシダーゼを含有させ
ることもできるほか、試薬層とオキシダーゼ層の両層に
オキシダーゼを含有させることもできる。過酸化水素指
示薬としては、ｒＡｎｎａｌｅｓ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ　、６．２４−２７（１
９８９）、米国４１ｆａ第３９９２１５８号、特公昭５
５−２５８４０号、特公昭５６−４５５９９号、特公昭
５８−１８６２８号、特願昭５７−１６５２３３号等に
記載の水素供ケ一体（色原体）とフェノールまたはナフ
トール系カプラーとの組合せ、特公昭５７−５５１９号
、特願昭５８−６８００９号等に記載のトリアリールイ
ミダツール系ロイコ色素、特公昭５６−４５５９９号、
特公昭５８−１８６２８号等に記載の単一の化合物でペ
ルオキシダーゼと過酸化水素との存在ｒで自己カプリン
グ等により発色または変色する色素前駆体化合物等を用
いることができる。好ましい過酸化水素指示薬の例とし
て次の化合物がある。

水素供与体（色原体）とカプラーとの組合せ：［水素供
与体］４−アミノアンチピリン、４−アミノ−２−メチ
ル−３−フェニル−１−（２゜４．６−）リクロロフェ
ニル）−３−ピラゾリン−５−オン等の４−アミンアン
チピリンホモログまたは誘導体 ［カプラー］　１．７−シヒドロキシナフタレン、■−
ヒドロキシナフタレンー２−スルホン酸ナトリウム（ま
たはカリウム）等の１−ヒドロキシナフタレン誘導体 トリアリールイミダゾール系ロイコ色素：４．５−ビス
［４−（ジメチルアミノ）フェニル］　−２−（４−ヒ
ドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾール
、４−（ジメチルアミノ）フェニル−２−（４−ヒドロ
キシ−３，５−ジメトキシフェニル）−５−フェネチル
イミダゾール等 色素前駆体化合物；ジアニシジン、４−７トキシー１−
ナフトール等 ペルオキシダーゼとしては特公昭５６−４５５９９号、
特公昭５７−５５２０　ｋ：等に記載の植物起源および
動物起源のペルオキシダーゼ（ＥＣ１，１１，１，７）
、特公昭５８−５０３５号等に記載の微生物起源のペル
オキシダーゼ（ＥＣ１，１１，１，７）を用いることが
できる。これらのうちでは植物起源または微生物起源の
非特異的ペルオキシダーゼが好ましい。好ましいベルオ
ギシターゼの例として、西洋わさびペルオキシダーゼ（
最適ｐＨ約７　、０）　、だいこんペルオキシダーゼ、
Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ　ｍ１ｙａｂｅａｎｕｓペル
オキシダーゼ（最適ｐＨ５、０〜５　、３）　、Ｐｅ１
ｌｉｃｕｌａｒｉａ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｓａペルオキ
シダーゼ（最１ａｐＨ４，７〜４．９）等がある。

オキシダーゼは、被検物質を酸素（０２）により酸化し
てＨ２Ｏ２を生成させるオキシダーゼであればよい。オ
キシダーゼは被検物質に応じて選択することができる。

本発明において用いることかできるオキシダーゼの具体
例としては次のものがある。

グルコースオキシダーゼ （ＥＣＩ　、　ｌ　、３．４；最適ｐＨ約５．６）コレ
ステロールオキシダーゼ （ＥＣ１，１，３，６，最適ｐＨ約５．８）ウリカーセ
゛ （ＥＣ１，７，３，３；最ｉｉ！ｐＨ約７．５〜８．０
）サルコシンオキシダーゼ （ＥＣ１，５，３，１，最適ｐＨ約７．０〜８．０）ラ
クテートオキシダーゼ、ピルヘートオキシターゼ、グル
タメートオキシグーゼ、グリセロールオキシダーゼ、ビ
リルピンオキシダーゼ、等。

この他にも特開昭５３−２４８９３吟、特公昭５６−４
５５９９号、特開Ｉｔ／１５７−２０８９９８号、特願
昭５７−１６５２３３弓等に記４乱のオキシダーゼまた
はオキシダーゼを含む複数種の酵素の組合せを用いるこ
とができる。必要に応じてオキシダーゼとともに補因子
および／または補酵素を組合せて用いることができる。

試薬層に用いられる親木性ポリマーバインダーとしては
特公昭５３−２１６７７吟、特公昭５６−４５５９９号
、特公昭５７−５５１９号、特開昭５５−１６４３５６
号、特開昭５７−２０８９９７号等に記載の多層分析要
素の試薬層の親木性ポリマーバインダーとして用いられ
ている公知の親木性ポリマーから適宜に選択して用いる
ことができる。親水性ポリマーの例としてはゼラチン（
例、酸処理ゼラチン、脱イオン化ゼラチンＴ）、ゼラチ
ン、誘導体（例、フタル化ゼラチン。

ヒドロキシメチルアクリレートグラフト化ゼラチン等）
、プルラン、プルラン誘導体、アガロ〜ス、ボリビこル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミ
ド等がある。これらのうちではゼラチンか一般的で、か
つ好ましい。

試薬層の乾燥厚さは約５＃Ｌｍから約６０ｊＬｍ、好ま
しくは約１０ＪＬｍから約３０ｐＬｍの範囲である。ペ
ルオキシダーゼの試薬層における含有、ｒｉｊ、は約５
千Ｕ／　ｍＩから約ｌＯ万Ｕ／ｍ″、好ましくは約１刀
Ｕ　／　ｍ′から約６万Ｕ／ｒｒｉ’の範囲である。試
薬層におけるオキシダーゼの含有量はオキシダーゼの種
類により異なるが、概して約１千０／ｍ’から約１０万
Ｕ　／　ｍ’、好ましくは約３千Ｕ／ｒｎ’から約５万
ｔＪ／ｒｎ’の範囲である。グルコースオキシダーゼの
場合には含＊量は約２千０　／　ｍ”から約４万Ｕ／　
ｍｅ、好ましくは約４千Ｕ　／　ｍ”から約３万ＴＪ　
／　ｍ’の範囲である。過酸化水素指示薬の指示薬層に
おける含有量は水性液体試料に含有される被検成分の予
想される含有量に応じて適宜定めることができる。

本発明の態様として、試薬層に過酸化水素指示薬とペル
オキシダーゼを含有させ、試薬層の」：側（試薬層に関
して支持体とは反対側、すなわち支持体から遠い側）に
オキシダーゼを含有するオキシダーゼ層を設けたｍ；様
、およびオキシダーゼを、後述する多孔性ＩＪ（間層、
定面積多孔性層、接着層、光遮蔽層のいずれかに含イ１
させる居、様がある。特開昭５７−２０８９９７１；公
報に記・１配されているように、オキシダーゼを過酸化
水素指示薬とペルオキシダーゼを含む試薬層（以下、こ
の層を特に指示する場合には、指示薬層という）より上
側の層に含有させる態様は、オキシダーゼが触媒する基
質の反応に必要な空気中の酩素のオキシダーゼへの効率
的な拡散による輸送等により、オキシダーゼが触媒する
酸化反応の進行が円滑・迅速に進行して、発色の高効イ
ｌ化、または分析時間の短縮化がもたされるので、本発
明の好ましい態様の一つである。オキシダーゼを試薬層
の」−側の層に含有させる場合のオキシダーゼの含有値
は前述の含有ダと同じでよい、オキシダーゼ層は指示薬
層の」−に直接または後述の中間層を介して設けること
ができる。

試薬層にはオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの最適
ｐＨの近傍のＰＨ値、または少なくとも両酵素の活性が
実質に阻害されず、かつ過酸化水素指示薬の発色（また
は変色）反応が円滑に速やかに進行する範囲のｐＨ値、
すなわち分析条件下において試薬層のｐＨ値を約４．０
から７．５、好ましくは約４．５から約７．０の範囲に
維持するｐＨ緩衝剤を含有させることができる。オキシ
ダーゼ層を試薬層の上側に設けるか、またはオキシダー
ゼを試薬層の上側のいずれかの層に含有させる場合には
、オキシダーゼ層またはオキシダーゼを含有する層にオ
キシダーゼの最適ＰＨ値またはその近傍の値に維持する
緩衝剤を含有させ、指示薬層には、ペルオキシダーゼの
最適ＰＨ値またはその近傍の値に維持するかまたは少な
くともペルオキシダーゼの活性が実質的に阻害されず、
かつ過酸化水素指示薬の発色（または変色）反応が円滑
に速かに進行するｐＨ値に維持するｐＨＨ衝剤を含有さ
せることができる。ｐＨ緩衝剤としては、ｒＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙＪ　、５（２）、４Ｂ？−４７７（＋９
１（６）、Ｒ。

Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、編ｒＤａｔａ　ｆ
ｏｒ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＪ第２
版（Ｏｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ
　ＰｒｅＳＳ、ｌ９６８年発行）４７Ｇ−５０８ｊ：ｆ
、、ｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙＪ　、　１０４．３００−３１０（１９８０）、口木
化学会編「化学便覧基礎編」　（東京、丸善、１８６６
年発行）１３１２−１３２０頁、日本生花゛ｌ：会編［
生化学データブックＩＪ　（東京化学同人、１９７９年
発行）　１７−２４頁、特公昭５７−２８２７７号等に
記載の公知のｐＨ緩衝剤から適宜に選択して用いること
ができる。

試薬層（またはオキシダーゼ層）の−１−に酸素透過性
蛋白質不透過性光遮蔽層（以下、巾に光遮蔽層というこ
とがある。）が、没けられる。酸素透過性蛋白質不透過
性とは、分析条件下に、すなわち水性液体試料または血
液試料の溶媒である水がこの層に侵透してこの層が混用
または膨潤しているときに、この層を空気中の酸素（ｏ
２）は実質的に通過可能であり、一方正白質は実質的に
通過不【＋７能であることを意味する。またここでいう
蛋白質とは分子−ｒ、）約５千以上の適冷の意味での蛋
白質であり、特にはヘモグロビン（分子に約６万５丁）
に代表されるヘム蛋白質、カタラーゼ（分子、°、：約
２５万）等の過醜化水素分解活性を有する複合蛋白質で
ある。酸素透過性蛋白質不透過性光遮蔽層は、光遮蔽性
および光反射性を有する二酸化チタン微粉末が少酸の被
膜形成能を有する親水性（または弱親水性）ポリマーバ
インダーに分散保持されている実質的に非孔性の層であ
る。光遮蔽層は、試薬層における発色または変色を光透
過性支持体側から反射測光する際に後述する展開層に点
着された血液試料の色、特に全血の場合のヘモグロビン
による赤色等を遮蔽し同時に光反射層および背景層とし
ても機能する。

光遮蔽層に用いられる二酸化チタン微粉末は酸化アルミ
ニウム（アルミナ、Ａ４１２０ｇ）またはアルミニウム
の含水酸化物（例、アルミナ水和物Ａ文２０３ＩＩＨ２
０、Ａ立２０３・３）１２０等）笠の三価アルミニウム
と酎、シ、を含むアルミニウム化合物、または云モ価ア
ルミニウムと他の元、Ｖ。

（例、四価Ｆ１素）と酸ふを含む物質を用いた表面処理
（主として被ｖａ）がなされていない−酸化チタン微粉
末、または表面処理されていない二酸化チタン微粉末（
未明細、りではこれらの総称としてり１にアルミナ処理
なしの二酸化チタン微粉末という）である。二酸化チタ
ン微粉末はアナターゼ（Ａｎａｔａｓｅ）型、ルチル（
Ｒｕｔｉｌｅ）型、またはプルカイト（Ｂｒｏｏｋｉｔ
ｅ）型いずれの結晶型でもよい。

微粉末の平均粒子サイズは市販品として人ｒ−＋ｒ（能
な約０．１μｍから約１．ＯＩＬｍ、ｔｌ（ましく　ｊ
ｉ約０．１５７ｚｍから約０．５μｍの範囲である。ア
ルミナ処理なしの二酸化チタン微粉末のＪＬ体例として
、表面処理されていない一’［化チタン依粉末、水酸化
チタンで表面処理した一１醇化チタン微粉末、シリカ（
二酸化珪素）で表面処理した二酸化チタン微粉末等があ
り、これらのうちで表面処理されていない二酸化チタン
微粉末が好ましい。

被膜形成能を有する親木性（または弱親水性）ポリマー
バインダーとしてはゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱
イオン化ゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化
ゼラチン、ヒドロキシメチルアクリレートグラフト化ゼ
ラチン等）、ポリビニルアルコール、再生セルロース、
セルロースアセテート（例、セルロースジアセテート）
等があり、これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体
等が好ましい。ゼラチン、ゼラチン誘導体は公知の硬化
剤（架橋剤）とともに用いることができる。なお、後述
する接着層にこれらのポリマーを用いる場合には光遮蔽
層のポリマーバインダーとしては指示薬層に用いるのと
同様に広範囲の親木性ポリマーから選釈して用いること
ができる。

光遮蔽層におけるアルミナ処理なしの二酸化チタン微粉
末とポリマーバインダー（乾燥時）との比は、光遮蔽層
の酸素透過性が保たれ、かつ同時に蛋白不透過性が保た
れる程度に非孔性である（これは多孔性展開層における
展開作用またはメータリング作用が現れる平均孔サイズ
よりも小さく、展開作用またはメータリング作用を有し
ない程度の微孔＋１をも包含する。）範囲で用いること
ができる。これは具体的には屯Ｉ１１比でアルミナ処理
なしの二酸化チタン微粉末１ｏに対しポリマー／へイン
グー（乾燥屯！１；）約０．６から約１８゜好ましくは
約０．８から約１．５の範囲である。

光遮蔽層の乾爆厚さは約３ｐｍから約３０　ｐｍ。

好ましくは約５μｍから約２０μｍの範囲である。

試薬層と光遮蔽層との間、またはオキシダーゼ層が設け
られる場合には試薬層とオキシダーゼ層との間、オキシ
ダーゼ層と光遮蔽層との間には必要に応じて中間層を設
けることができる。中間層としては試薬層に用いるのと
同様な被膜形成能を有する親木性ポリマーの層を用いる
ことができる。中間層の厚さは約０．２＃１．ｍから約
１ｏｐＬｍ、好ましくは約０．５μｍから約７μｍの範
囲である。光遮蔽層と後述する多孔性展開層との間には
必要に応じて接着層を設けることができる。

接着層としては試薬層に用いるのと同様な被膜形成能を
有し、水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤し
ているときに多孔性展開層を接着し・体化できる親水Ｐ
１ポリマーを用いることができる。接ｒｉ層の厚さは約
０．５μｍから約２０ａｍ、Ｄｆましくは約１μｍから
約ｌＯμｍの範囲である。中間層および接着層に用いら
れる代表的でＩｌ’ｆましい親水性ポリマーはゼラチン
、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルア
ルコール１−がある。

試薬層、光遮蔽層、中間層、接着層、オキシダーゼ層が
設けられる場合にはオキシダーゼ層、および指示薬層に
は必要に応じて界面活性剤を含有させることができる。

界面活性剤としてはノニオン界面活性剤、とくにオキシ
エチレンまたはオキシプロピレンツ、（が８〜１５個連
なった鎖状構造を含むノニオン界面活性剤が好ましい。

これらの層にはこの他に必要に応じて硬化剤（架橋剤）
、柔軟化剤または可塑剤等の公知の添加剤を含有させる
ことができる。

光遮蔽層の上に、直接または接着層を介して、多孔性展
開層または定面積多孔性層（パッチ）が設けられる。多
孔性１１４開層（以下、中に展開層ともいう。）として
は特公昭５３−２１６７７号。

特開昭５５−ｃ＋ｏｇ５ｃｚン−１特開昭５８−１２３
４５８号等に記載の非出Ｍ、笠方的多孔性媒体層、特開
昭５５−１６４３５６号、特開昭５７−６６３５９号等
に記載の織物１１Ｇ開層、特開昭５７＝１４８２５０号
に記載のポリオレフィンポリマーフィラメントパルプを
含む紙からなる層などを用いることができる。定面積多
孔性層としては実開昭５７−４２９５１号等に記・１１
（の多孔性素材がある。これらのうちでは１）（間層が
好ましく、またｌ５ｆｃ開層としてはメンブランフィル
タ一層（プランシュポリマー層）、ポリマービーズを水
で１彰潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着してな
る三次元格子粒状構造物層、織物ＩＪＧ開層間層ましい
。Ｉｊ？開層間層面積多孔性層は前述の品持、Ｍ″ｖに
記載の方法に従って３９けることができる。

多孔性展開層には必要に応じて界面活性剤、好ましくは
前述のノニオン界面活性剤を含イ■させることができる
。さらに多孔性１１Ｇ開層には特公昭５５−４５５９９
号に記載のごとくコレステロールエステラーゼ等の酵素
を含む試薬の一部やｐＨ緩衝剤を含イ１させることがで
きる。また、多孔性１＋４開層にもアルミナ処理なしの
二酸化チタン微粉末を分散含有させることができる。

本発明の多層分析要素には、少なくとも試薬層または試
薬層より」−側の（すなわち試薬層から見て支持体から
遠い側）いずれか一つの層（多孔性分く諸層または定面
積多孔性層をも含める）に、弗素陰イオンとの間に水に
難溶性の１ｉ１（以下、難溶性Ｆ　ｑ４という）を形成
しうる陽イオンを含む化合物（以Ｆ、難溶性Ｆ塩形成化
合物という）を含有させることができる。ここで、水に
難溶性とは２５℃における木１００ｇに対する溶解度が
０゜２ｇ以下であることを意味する。難溶性Ｆ塩形成性
化合物としては特願昭５７−１３１７５０号明細占に記
載の難溶性Ｆ塩形成性化合物を用いることができる。難
溶性Ｆ塩形成性化合物に含まれる陽イオンとしてはＣａ
′およびＭｇ２＋はオキシダーゼやペルオキシダーゼ等
の酵素の安定化作用をも有するので好ましい陽イ才／で
ある。対陰イオンとしては低級脂肪族モノカルボン醇陰
イオン。

低級脂肪族ジカルホン酸陰イオン、ヒドロキシカルボン
酸陰イオン、ハロゲン陰イオン、燐耐陰イオン等がｌ＋
ｒましい。難溶ＭＦ１１！形成に１化合物としては酢酸
力ルシウＪ・が好ましい。難溶＋ｌ　Ｆ塩形成性化合物
は、多孔性展開層、定面積多孔Ｐｉ層、接着層、光遮蔽
層、試薬層、オキシダーゼ層が設けられる場合にはオキ
シダーゼ層、中間層等のうちの少なくともいずれか−・
層に含有させることができ、接着層、光遮蔽層、オキシ
ダーゼ層のいずれか一層または複数の層に含有させるこ
とか好ましい。難溶性Ｆ　ＩＩ形成性化合物の含有１１
１は多層分析要素１ｒｒｆにつき０．１ｍｅｑからｌｅ
ｑ、好ましくは０．２ｍｅ　ｑから０．５ｅｑの範囲で
ある。

特願昭５７−１３１７５０−；明細−７に記載の方法に
従って、難溶性Ｆ塩形成性化合物を特定の層の塗布液に
溶解または分散させて塗布するか、あるいは接着層に多
孔性展開層を積層する際に接着層に供給する湿し木に難
溶性Ｆ　ｊ１形成性化合物を溶解させ、その湿し水を接
着層に供給することにより多層化’７分析材料に難溶性
Ｆ塩形成性化合物を含イ夏させることがせきる。

難溶＋ｌ：　’Ｆ　塩形成Ｐ１化合物を含有させた本発
明の多層化学分析材料においては、血液試料の弗化物の
含イｊ　：Ｈ：（Ｎ　ａ　Ｆに換算してＯから約ｔ５ｍ
ｇ／ｍｌ血液試料の範囲）にかかわりなく、弗化物不含
の面液試ネ゛ｌの場合と実質的に同じ被検物質測定イｆ
ｉが得られるほどに弗化物による妨害（または干渉）作
用がＤ１除されるので、難溶性Ｆ塩形成性化合物を含イ
１する態様は本発明の極めて好ましい態様の−・つであ
る。

前述の諸層を積層一体化して調製された一体型多層化学
分析要素は適宜なサイズに裁断され、特開昭５４−１５
６０７９号、実開昭５６−１４２４５４号、特開昭５７
−６３４５２号、特表昭５８−５０１１４’４号、実開
昭５８−３２３５０号等に記載のスライド枠に収容して
分析スライドとして用いるのが便利である。この他に多
層分析要素は長テープ状や裁断片をアパーチュアカード
等に貼（ツまたははめこんで用いることもできる。

なお、ここまでの説明ではすべての層が接着されている
一体型多層化学分析質素について説明したが、本発明は
これに限定されることなく、いずれかの層が接着されて
いがい多層化学分析要素にも適用することができる。

本発明の多層分析要素を用いてｍＩ述の品持訂。

およびｒｃＩｉｎｉｃａｌ　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　、
　２４（８）　、＋３３５−１３４２（＋！３７！］）
ｌ’＄に記載の方１ノ、により主として比色分析／、ｌ
：の原理により水性液体試才ｌ中の被検物質の定量分析
を実施できる。

本発明の多層化学分析要素には酵素が含有されるので、
分析を実施するに当っては２５°Ｃから４５°Ｃ１好ま
しくは３０°Ｃから４０’Ｃの範囲の温度で３分から３
０分、好ましくは４分から１５分間インクベーションし
た後に比色分析する方Ｊノ。

（ｅｎｄ　ｐｏｉｎｔ法）か５才たはインクヘーパ／ヨ
ン温度は同じで反応の誘導期が経過した後に一定の時間
間隔で２回以」ニル色測定する方ｉ１Ｊ：（ｒａｔｅ法
）のいずれの方法でも実施することができる。

以下の実施例により本発明を具体的に説明する。

［参考例１］ （Ａ）Ａ見２０３で表面処理した二酸化チタン微粉末、
（Ｂ）Ａ文２０３・５ｉ０２の混合酸化物で表面処理し
た二酸化チタン微粉末、および（Ｃ）表面処理されてい
ない二酸化チタン微粉末のそれぞれ５ｇを水４０ｍ１に
分散した後、それぞれにＮａＦを１ｇ加えてさらにポリ
テトラフルオロエチレン被Ｙｇシた攪拌林で攪拌し、つ
いで１時間数ｔしたときの分散液のｐ　、Ｈ値を測定し
たところ、第１表の結果かえられた。なお、ブランクと
して二酸化チタン微粉末を加えないで同じ操作を実施し
た。

１ノ、（：：ｒ＜　白 第１表 Ｔ　ｉ　Ｏ２微　アナターゼ　ルチル　加えず粉末結晶
型（０，１５〜　（０２０〜　（ブラ（粒子径）　０．
２５ｋｍ　）　０．３５壓ｍ）　ンク）表面処理　ＡＣ
ＡＢ　− ｐＨ値　１１．５　８．４　１１．７　１１．３　８．
０第１表の結果から、Ａ立２０３、Ａ文２０３・Ｓ　ｉ
　Ｏ２いずれかで表面処理された二酸化チタン微粉末水
分散液のｐＨ値は著しく高くなるが、表面処理なしの二
酸化チタン微粉末水分散液のｐＨ値はブランクとあまり
変らないｐＨ値に留まっていることが明らかである。

［参考例２］ ＡＪｌｚＯａ　（アルミナ）表面処理二酸化チタン微粒
子（アナターゼ型１粒イサイズ０．１５〜０．２５μｍ
）および表面処理なし二酸化チタン微粒子（アナターゼ
型１粒子サイズ０．１５〜０．２５ｇｍ）それぞれ１０
重量部、ゼラチン１屯ｊ一部、および水２０重量部を混
合、分散して調製した分散液をゼラチン下塗りが施され
た厚さ１８０ＩＬｍのポリエチレンテレフタレー）　（
ＰＥＴ）フィルムの」二に乾燥層厚が５ＪＬｍになるよ
うに塗布し乾燥して２種の二酸化チタン／ゼラチン塗布
Ｉｌりを調製した。それぞれの塗布膜の上に第２表に示
すＮａＦ含有含有水溶液およびＮａＦ不含の木（ブラン
ク）の１ＯＪＬ文ずつを点着して塗布膜に吸収させ、密
閉箱中で２５℃で５分放置し。

直ちに表面ｐＨ測定用電極（東亜電波工業■製：Ｇ５−
１６５Ｆ）を塗布膜におしあてて湿潤している塗布膜の
表面のｐＨ値を測定し、第２表に示す結果を得た。

以下余白 第２表 湿潤塗布１１りの表面のｐＨイｆ１ 水溶液（７）ＮａＦ　Ｏ５１０１５２０含有１ｉｊ（ブ
ランク） （ｍｇ／ｌ水） アルミナ表面 処理ＴｉＯ２７，４８，０８，７９，２９，８表面処理
なし ＴｉＯ２７，４７，４７，４７，５７，８表面処理なし
の二酸化チタン微粉末／ゼラチン塗布膜においてはＮａ
Ｆ水溶液のＮａＦ含有ｊｌＶの増加につれての塗布膜の
ｐＨ値の］ニガはわずかであり、特に血液試料に−・競
゛的に加えられる範囲であるＮａＦ含イｆｉ、ｊＯ−１
０ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌの範囲内ではｐＨ値の変化は見ら
れないという特徴がある。

一方、アルミナ表面処理二酪化チタン／ゼラチン塗／Ｉ
ｔ　ｌりではＮａＦ含有ｔｉ１．の増加につれて塗布膜
のｐＨイｆｉ　（１）　Ｉ：　′ｊ／が勇しく、ＮａＦ
含右含有〜１０ｍ　ｇ　／　ｍ文の範囲内でのｐＨ値の
」ニガが著しい。

［実施例１］ ゼラチン下塗りが施されている厚さ１８０ｇｍの無色透
明ポリエチレンテレフタレー）　（ＰＥＴ）（ｉ屑フイ
ルムの上に下記組成のグルコース測定用試薬層を乾燥層
厚が約１５１Ｌｍになるようにり、て水溶液を用いて塗
布し乾燥して設けた。

ペルオキシダーゼ　２５０００ＩＵ グルコースオキシダーゼ　１００ＯＯＩＵ１．７−シヒ
ドロキシナフタレン　５ｇ４−アミノアンチピリン　５
ｇ ゼラチン　２００ｇ ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　２ｇ グルコース測定用試薬層の上に下記組成の酸素透過性蛋
白質不透過性光遮蔽層を乾燥厚さが約７ｐｍになるよう
にして水分散液を用いて塗布し乾燥して設けた。

表面処理なしの二煎化チタン微粉末　１００ｇ（アナタ
ーゼ型１粒子サイズ ０．１５〜０．２５ｇｍ） ゼラチン　ｌｏｇ 光遮蔽層の上に下記ｔＡ成の接着層を乾燥層厚が約２μ
ｍになるようにして水溶液を塗布し乾燥して設けた。

ゼラチン　４ｇ ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　Ｏ，１ｇ 次に接着層に約３ｏｇ／ｍ’の割合で水を全面に供給し
て湿潤させた、のち、綿１００％のブロード織物（１０
０双ブロード）を軒く圧力をかけてラミネートし、乾燥
させてグルコース定♀、用一体型多層化学分析要素を調
製した。

［比較例１］ 光遮蔽層に用いる二癩化チタン微粉末としてＡｌ２Ｏ３
・Ｓ＋０２表面処理二酸化チタン微粉末（ルチル型１粒
子サイズ０．２０−０．３５ｇｍ）を用いたほかは実施
例１と同様にして比較用のグルコース定星用一体型多層
化学分析要素を調製した。

このようにして得られた本発明の、および比較用のグル
コース定着用一体型多層化学分析要素のそれぞれの展開
層に、第３表に示すＮａＦ含有量の異なるヒト血ｇ１１
０ｐ１を点着し、密閉容器の中に３７℃で１０分放置（
インクベーション）し、直ちに１５！潤している展開層
表面のＰＨ値をＧ５−１６５Ｆ表面ＰＨ電極を用いて測
定し、第３表に示す結果を得た。

以下余白 第３表 湿潤展開層の表面のｐＨ値 ヒト血漿の　０　５　＋０　１５　２ＯＮａＦ含右；１
１（ブランク） （ｍｇ／ｍｌ水） 実施例１の 多層分析要素　５．７６５．９０　５．！３０　５．９
５　６．０５（本発明） 比較例１の 多層分析要素　５．？ｆｌ　８．７５　７．＋５　７．
４２　７．７３表面処理なしの二Ｍ化チタン微粉末を含
む光遮蔽層を有する本発明のグルコース定♀、用多層分
析要素においては、血漿のＮａＦ含有星の増加につれて
の展開層のｐＨ値のＪ：　′ｊｌが少なく、特に血液試
料に加えられる範囲のＮａＦ含有星である０〜１０　ｍ
　ｇ　／　ｍ文血漿の範囲内の場合の展開層のｐ　Ｈ（
ｆｔの１−’；Ｉはわずかである。一方、Ａ交２０３・
５ｉ０２表面処理二酸化チタン微粉末を含む光遮蔽層を
４１する比較例１のグルコース足動用多層分析要素にお
いては、血漿のＮａＦ含有量増加につれてのＩｓ＜間層
のｐＨ値の上昇が著しく、特にＮａＦ含有星Ｏ〜１０ｍ
ｇ／ｍ文血漿の範囲内において！＋＜間層のｐＨ値の」
ニガが著しく大きい。

［実施例２］ 接着層の組成として下記の組成を採用したほかは実施例
１と同様にしてグルコース定ダ用一体型多層分析黄素を
調製した。

ゼラチン　４ｇ 酎耐耐ルシウム　１．８ｇ ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　０．１ｇ ［比較例２］ 光遮蔽層に用いる二酸化チタン微粉末としてＡ１２０３
・５ｉ０２表面処理二酸化チタン微粉末（ルチル型、粒
子サイズ０．２０−０．３５μｍ）を用い、接着層の組
成を実施例２の接着層の組成と同じものを用いたほかは
実施例工と同様にして比較用グルコース定；ｌ！用一体
型多層化学分析要素を調製した。

このようにして調製した２種の要素をそれぞれ１５ｍｍ
Ｘ　１５ｍｍの正方形のチップに裁断し、特開昭５７−
６３４５２号−に開示のプラスチ、ンクマウントに収め
てグルコース定ｒｔ用化学分析スライド（それぞれ本発
明の化学分析スライド、比較用化学分析スライドと名づ
ける）を調製した。

２種の化学分析スライＩＳそれぞれの展開層に１４表に
示すＮａＦ含イ〕星の異なるヒト血漿１０ＪＬ文を点着
し、密閉容器の中に３７°Ｃで６分放置（インクベーシ
ョン）シ、直ちに、湿潤している展開層の表面のｐＨ値
をＧ５−１６５Ｆ表面ｐＨ電極を用いて測定し、第４表
に示す結果を得た。

また同じ血漿ＬＯＩｉ、ｌを点着した２種の化学分析ス
ライドについて３７℃６分のインクベーションがなされ
る化学分析装置を用い、ＰＥＴフィルム側から中心波長
５００ｎｍのＩｔ丁視光で反射測光し、比色法により血
漿のグルコース含有Ｊａを測定して第４表に示す結果を
得た。

第４表 ヒ　ト　血　＋１梵　の　０　５　１０　１５８ａＦ含
有ｌｉｔ、　（ブランク） （ｍｇ／ｍｌ血漿） 本発明の化学 ノ）枦スライド Ｊｌ（間層のｐＨ値　６．４０　８．４２　ｆｌ、３９
　ｆｌ、４１グルコ一スｌ＝度 測定値（ｍｇ／ｄｌ）　＋０１　１０１　１００　！比
較用の化学 ノ）析スライド 展開層のｐＨ値　Ｂ、４０　８．４９　７．３２　７．
７１グルコ一ス濃度 測定イ〆ｎ（ＩＩｇ／ｄｌ）　１０２　１０！ｌｉ　ｔ
ａｌｌ　１１２表面処理なしの二酸化チタン微粉末含有
光遮蔽層を有する本発明のグルコース足Ｈ，１用化学分
析スライドの場合には、血漿に含イ１されるＮａＦへｉ
にかかわりなく実質的に同じグルコース含イｆ　：ｊ　
（Ａ１１ｌ定価）が１１ｔられる。一方、Ａ文２０３φ
Ｓ　ｉ　Ｏ２表面処理二酸化チタン微粉末含有光遮蔽層
を右する比較用グルコース定ｔ、１用化学分析スライド
の場合には血漿中のＮａＦに起因する［浮（妨−ｉ、０
が現れ、特にＮａＦ含有１墨ｉが５　ｍ　ｇ　／　ｍ交
血漿をこえる範囲で干渉（妨害）か茗しい。

［実施例３］ ゼラチン下塗りが施されているＪｌさ１８０μｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）平滑フィル
ムの−にに下記組成の指示薬層を乾燥層厚が約１５ｐＬ
ｍになるようにして水溶液を用いて塗布し乾燥して設け
た。

ペルオキシダーゼ　２５０００ＩＵ １．７−シヒドロキシナフタレン　５ｇ４−アミノアン
チピリン　５ｇ ゼラチン　２００ｇ ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　２ｇ 指小薬層の」−に下記組成のグルコースオキシターゼ層
を乾燥層厚が約２ルｍになるようにして水溶液を用いて
塗布し乾燥して設けた。

セラチン　４．６ｇ グルコースオキシダーゼ　４０００ＩＵ３．３−ジメチ
ルグルタル酸　０：１ｇポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　０．１ｇ グルコースオキシダーゼ層の上に下記組成の醜素透過性
蛋白質不透過性光遮蔽層を乾燥厚さが約７ｇｍになるよ
うにして水分散液を用いて塗４１シ乾繰して設けた。

表面処理なしの二酸化チタン微　１００ｇ粉末（アナタ
ーゼ型、粒子サ イズ０．１５〜０．２５ＡＬｍ） ゼラチン　１０ｇ 光遮蔽層のにに下記組成の接着層を乾燥層厚が約２ｇｍ
なるようにして水溶液を塗布し乾燥して設けた。

ゼラチン　Ｊｏｇ 酢酎カルシウム　５ｇ ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　０．１ｇ 次に接着層に約３０　ｇ　／　ｍ’の割合で水を仝而に
供給して湿潤させたのち、＋％５ｉ１００％のブロード
織物（１００双ブロード）をφＶ＜正方をかけてラミネ
ートし、乾燥させてグルコース定：＋１−．　Ｊｌｌ一
体型多層化学分析要素を調製した。

このようにして調製したグルコース定ｊ番；用一体型多
層化学分析要素を用い、実施例２と同様のＮａＦ含有含
有光なるヒト血漿および全血を用いてグルコース含有１
．１を測定したところ、実施例２と同様に血漿または全
血中に含有されるＮａＦにかかわりなく実質的に同じグ
ルコース含有’＋ｉ：　（Ａｌｌ定植）が得られた。

［実施例４］ 光遮蔽層に加える二酸化チタン微粉末を表面処理なしの
ルチル型二酸化チタン微粉末（粒７−０２０〜０．３５
ｐｍ）を用いたほかはそれぞれ実施例２および３と同様
にしてグルコース定量用一体型多層化学分析要素を調製
し、それぞれを実施例２と同様のＮａＦ含有量の異なる
ヒト血漿を用いてグルコース含有量を測定したところ、
血漿中に含イＩされるＮ　ａ　Ｆ　量にかかわりなく実
質的に同しグルコース含有量（測定値）が得られた。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）水不浸透性光透過性支持体の上に試薬層、光遮蔽
   層、および多孔性展開層がこの順に設けられてなる多層
   化学分析要素において、前記光遮蔽層に醇化アルミニウ
   ムまたはアルミニウムの含水酸化物を含む物質による表
   面処理がなされていない二酸化チタン微粉末または表面
   処理されていない二酸化チタン微粉末が含有されている
   ことを４￥徴とする多層化学分析要素。
2. （２）前記試薬層または前記試薬層より上側のいずれか
   一つの層にオキシダーゼが含有されている特許請求の範
   囲１に記載の多層化学分析要素。
3. （３）前記試薬層にペルオキシダーゼと過醋化水素との
   存在下で検出可能な変化を生ずる過酸化水素指示薬、お
   よびペルオキシダーゼが含有されている特許請求のａ１
   ７１１１１または２に記載の多層化・γ・分析要ま。
4. （４）前記試薬層または前記試薬層よりＩ−側のいずれ
   か一つの層に、弗素陰イオンとの間に水に難溶性の塩を
   形成しうる陽イオンを含む化合物が含有されている４Ｎ
   訂請求の範囲１．２または３に記載の多層化学分析要素
   。