DE3789527T2 - Trockenes, mehrschichtiges, analytisches Element. - Google Patents

Trockenes, mehrschichtiges, analytisches Element.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein mehrschichtiges analytisches Element für die Analyse eines Analyten (die Substanz, die analysiert werden soll) des Trockentyps in einer wäßrigen flüssigen Probe, welche Hämoglobin enthält, wobei der Analyt direkt oder indirekt Wasserstoffperoxid in Anwesenheit von Oxidase bildet. Die Erfindung betrifft insbesondere ein mehrschichtiges analytisches Element des Trockentyps für die Analyse eines Analyten in einer flüssigen Probe, welches Oxidase, ein Wasserstoffperoxid-zersetzendes Enzym (H&sub2;O&sub2;-zersetzendes Enzym), ein Ferrocyanid und ein Chromogen als wesentliche Bestandteile enthält, wobei das H&sub2;O&sub2;zersetzende Enzym in eine Schicht eingearbeitet ist, die von der Schicht, die das Chromogen enthält, vom Träger des analytischen Elements aus weiter entfernt ist.
  • Bei einer klinischen chemischen Analyse ist das Verfahren, das häufig verwendet wird, das colorimetrische Verfahren, um H&sub2;O&sub2; zu bestimmen, das aus dem Analyten in einer Probe, wie Serum, unter Verwendung einer Oxidase gebildet wird, wobei das Substrat der Analyt ist, oder das unter Verwendung von Oxidase gebildet wird, wobei das Substrat eine Substanz ist, die sich von dem Analyten ableitet. Das H&sub2;O&sub2; kann üblicherweise ein Chromogen in Anwesenheit eines H&sub2;O&sub2;-zersetzenden Enzyms, wie Peroxidase (POD), oxidieren. Die Chromogene können in zwei Gruppen eingeteilt werden, d. h. Chromogene des Leucotyps, die zur Bildung von Farbstoffen aus ihnen selbst oxidiert werden, und Chromogene des Kupplungstyps, die oxidiert und dann mit dem gleichzeitig vorhandenen Kuppler unter Bildung von Farbstoffen gekuppelt werden. Das oxidierte Chromogen des Kupplungstyps besitzt selbst keine Farbe.
  • Für die Bestimmung von Analyten unter Verwendung von H&sub2;O&sub2;, das aus ihnen gebildet wurde, wurden verschiedene Reagenszusammensetzungen entwickelt, und verschiedene analytische Elemente für die Analyse des Trockentyps sind ebenfalls bekannt. Als Beispiele für Reagenszusammensetzungen, die Ferrocyanid als wesentliche Komponente für die Bestimmung von H&sub2;O&sub2; enthalten, wird in der US Patentschrift 3,886,045 (US Re 29,498) eine Reagenszusammensetzung für die Bestimmung von Glucose beschrieben, die Glucoseoxidase, POD, 4- Aminoantipyrin (4-AA), einen Kuppler, wie Phenol und Ferrocyanid enthält, und in der US Patentschrift 4,291,121 wird eine Reagenszusammensetzung für die Bestimmung von Harnsäure oder Cholesterin beschrieben, die Uricase (Harnsäureoxidase) oder Cholesterinoxidase, POD, 4-AA, einen Kuppler wie 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure oder ihr Na- oder K-Salz und Ferrocyanid enthält.
  • In diesen Patentschriften wird beschrieben, daß Ferrocyanid den Einfluß einer reduzierend wirkenden Substanz, insbesondere Bilirubin, die für die Bestimmung ein störendes Material ist, in einer Probe ausschließen kann. Die Erfinder haben jedoch gefunden, daß ein Chromogen, ausgewählt unter einer beschränkten Zahl, verwendet werden muß, da alle Komponenten coexistieren müssen, unabhängig von der üblichen chemischen Analyse oder des analytischen Elements des Trockentyps. Die verwendbaren Analysen sind weiterhin auf die obigen drei Substanzen beschränkt, und die gebildete Farbe ist im Falle eines analytischen Elements des Trockentyps instabil.
  • In der japanischen Patentpublikation KOKAI Nr. 37-5796 wird ein anderes Beispiel einer Reagenszusammensetzung für die Bestimmung der Glucose beschrieben, die Glucoseoxidase, POD, Leucofarbstoff, und Kaliumferrocynaid enthält. Alle diese Komponenten können coexistieren. In diesem Fall wird das Kaliumferrocyanid als Reduktionsmittel für die Entfärbung des Farbstoffs, der durch Oxidation von H&sub2;O&sub2;- POD gebildet wurde, zugegeben.
  • Wie oben beschrieben, werden alle Komponenten zu einer Lösung oder einer Schicht gegeben, wenn ein Analyt unter Verwendung einer Reagenszusammensetzung, die eine Oxidase, die spezifisch mit dem Analyten unter Bildung von H&sub2;O&sub2;, POD, Chromogen und Ferrocyanid reagiert, bestimmt wird. Als Folge laufen die Farbbildung und die Entfärbung parallel ab, und die Genauigkeit der Ergebnisse wird verschlechtert. Insbesondere ist dieses Phänomen ausgeprägt, wenn die Bildung von H&sub2;O&sub2; übermäßig ist, oder wenn das verwendete Chromogen ein 3-substituierter Imidazolleucofarbstoff ist. Diese Tatsache legt den Schluß nahe, daß das gleichzeitig vorhandene H&sub2;O&sub2; der Grund für die Entfärbung des gebildeten Farbstoffmaterials ist.
  • Die Reaktionsgleichung für den Fall des Cholesterins wird im folgenden aufgeführt. Cholesterin-Oxidase (in Wasser) Cholestenon Ferrocyanid-Ion Farbmaterial Chromogen (farblos)
  • Diese Reaktionsgleichung wird in der japanischen Patentpublikation KOKAI Nr. 49-50991 und von Fossati et al. ("Clinical Chemistry", 26 (2), 227-231 (1980)) vorgeschlagen. Weiterhin wird ein analytisches Element des Trockentyps, das diese vier Komponenten enthält, in der japanischen Patentpublikation KOKAI Nr. 56-155852 (entsprechend der US- A-4,291,121) vorgeschlagen. Dieses analytische Element wird aus einem Testpapier (Reagensstreifen) gebildet, das mit einer Lösung imprägniert ist, die eine Reagenszusammensetzung für die Bestimmung von Cholesterin oder Harnsäure, die die obigen vier Komponenten enthält, und das dann getrocknet wird.
  • Mehrschichtige analytische Elemente des Trockentyps sind gegenüber einem solchen Testpapier bei der Durchführung der Analyse und bei der quantitativen Bestimmung überlegen (Asaji Kondo "Bunseki (Analysis)" 1984 (7), 534). Die genannten Erfinder haben ein mehrschichtiges analytisches Element für die Bestimmung von Cholesterin, das die obigen vier Komponenten in einer Schicht enthält, gemäß dem Verfahren von D. M. Dappen et al. ("Clinical Chemistry", 28 (5), 1159 (1982)) hergestellt. Sie haben gefunden, daß im Falle dieses analytischen Elements das gefärbte Material instabil ist, und es während der Messung entfärbt wird.
  • In der japanischen Patentpublikation KOKAI Nr. 61-124393 wird ein mehrschichtiges analytisches Element für den Nachweis von Wasserstoffperoxid beschrieben, das Peroxidase, einen Wasserstoffdonor, entsprechend dem Chromogen des Kupplungstyps in dem erfindungsgemäßen analytischen Element, und einen Kuppler, enthält. Bei dieser Patentschrift wird eine Trennung der Peroxidase von dem Wasserstoffdonor vorgeschlagen, um die Stabilität bei der Lagerung des analytischen Elements zu verbessern, indem die Zersetzung der Peroxidase verhindert wird. In dieser Patentschrift wird jedoch auf die Einarbeitung von Ferrocyanid nicht Bezug genommen, was ebenfalls eine Verschlechterung des analytischen Elements durch Umsetzung mit anderen Komponenten der Reagenszusammensetzung und dem Polymerbindemittel verursacht.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mehrschichtiges analytisches Element des Trockentyps für die Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe zur Verfügung zu stellen, wobei das H&sub2;O&sub2;, das in Anwesenheit von Oxidase gebildet wird, bestimmt wird, das eine hohe Verläßlichkeit und einen vielfachen Gebrauch besitzt.
  • Erfindungsgemäß soll weiterhin ein mehrschichtiges analytisches Element des Trockentyps zu Verfügung gestellt werden, durch das der Fehler, der durch die Störung des Hämoglobins in einer Blutprobe verursacht wird, beseitigt wird.
  • Erfindungsgemäß soll weiterhin ein mehrschichtiges analytisches Element des Trockentyps, das eine Farbe bildende Reagenszusammensetzung enthält, für die Bestimmung von H&sub2;O&sub2; zu Verfügung gestellt werden, mit dem H&sub2;O&sub2; mit hoher Genauigkeit bestimmt werden kann.
  • Die genannten Erfinder haben zur Lösung dieser Aufgabe geforscht und gefunden, daß wenn ein Chromogen in eine von der Oxidase, POD und Ferrocyanid getrennte Schicht eingearbeitet wird, die Entfärbung nicht stattfindet, und daß viele Vorteile erhalten werden.
  • Gegenstand der Erfindung ist somit ein mehrschichtiges analytisches Element des Trockentyps, das eine farbbildende Reagenszusammensetzung, mit der ein Analyt in einer wäßrigen Probe, die Hämoglobin enthält, bestimmt werden kann, indem das Wasserstoffperoxid, das in Anwesenheit von Oxidase gebildet wird, bestimmt wird, und einen lichtdurchlässigen wasserundurchlässigen Träger umfaßt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die farbbildende Reagenszusammensetzung, die Oxidase, die mit dem Analyt spezifisch reagiert, oder ein Material, das sich von dem Analyt unter Bildung von Wasserstoffperoxid ableitet, ein Wasserstoffperoxid-zersetzendes Enzym, ein Ferrocyanid und ein Chromogen als wesentliche Bestandteile enthält, wobei die Schicht, die das Chromogen enthält, von der Schicht, die das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym enthält, getrennt ist, und näher als die Schicht, die das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym enthält, zu dem Träger angeordnet ist, wobei die Schicht, die das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym enthält, die Oxidase und das Ferrocyanid enthält.
  • In den Fig. 1 bis 3 sind schematisch Querschnitte von dem erfindungsgemäßen mehrschichtigen analytischen Element des Trockentyps dargestellt.
  • Einige typische Ausführungsformen der erfindungsgemäßen analytischen Elemente werden in den Fig. 1 bis 3 erläutert.
  • Das analytische Element der Fig. 1 besitzt eine Grundstruktur, und umfaßt einen lichtdurchlässigen wasserimpermeablen Träger 10, eine Chromogen-enthaltende Schicht 20, die auf dem Träger angeordnet ist, und eine poröse Ausspreitungsschicht 52, die Reagentien, wie POD und ein Alkalisalz von Ferrocyanid enthält (Reagens-enthaltende Ausspreitungsschicht). Eine Flüssigkeitsprobe S wird auf die Ausspreitungsschicht 52 als Flecken aufgetragen, und die sich entwickelnde Verfärbung in der Chromogen-enthaltenden Schicht 20 wird von der Seite des Trägers 10 durch Reflexionsphotometrie gemessen. L zeigt eine Lichtquelle an, und V zeigt das reflektierte Licht für die Messungen an. Beispielsweise wird im Falle des analytischen Elements für die Bestimmung von Cholesterin in einer Serumprobe ein Chromogen des Leucotyps verwendet, und die Reagens-enthaltende Ausspreitungsschicht 52 besitzt eine Struktur, wie sie in der USP 3,992,158, USP 4,292,272 und der japanischen Patentschrift KOKAI Nr. 57-94658 beschrieben wird und enthält POD, Ferrocyanid, ein Ragens, das mit Cholesterin unter Bildung von H&sub2;O&sub2; reagieren kann, Hilfsmittel, ein lichtreflektierendes Material, wie BaSO&sub4;-Teilchen oder TiO&sub2;-Teilchen und ähnliches. Diese Reagens-enthaltende Ausspreitungsschicht wirkt als Reagensschicht, als Lichtreflexionsschicht und als Probenausbreitungsschicht.
  • Eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen analytischen Elements ist in Fig. 2 dargestellt. Dieses analytische Element besteht aus einem lichtdurchlässigen wasserimpermeablen Träger 10, einer Chromogen-enthaltenden Schicht 20, die auf dem Träger angeordnet ist, einer Lichtreflexionsschicht 40, die Titandioxidteilchen enthält, und auf der Chromogen-enthaltenden Schicht angeordnet ist, und eine Reagens-enthaltende Ausspreitungsschicht 52, die aus einem gewebten Textilmaterial hergestellt ist, und eine H&sub2;O&sub2;-bildende Reagenszusammensetzung enthält, welche POD, Ferrocyanid und Cholesterinoxidase und ein Hilfsmittel enthält. Die Chromogen-enthaltende Schicht 20 ist um mehrere um von der Reagensausspreitungsschicht 52 durch die Zwischenanordnung der Lichtreflexionsschicht 40 getrennt.
  • Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen analytischen Elements ist in Fig. 3 dargestellt. Dieses analytische Element ist ein mehrschichtiges analytisches Element für die Bestimmung von Glucose, wobei die Glucosekonzentration in einer Plasmakomponente einer Gesamtblutprobe bestimmt wird, und es besteht aus einem lichtdurchlässigen wasserimpermeablen Träger 10, einer Chromogen-enthaltenden Schicht, die ein Chromogen des Kupplungstyps (4-AA und ein Naphtholderivat) enthält, und darauf angeordnet vorhanden ist, eine Schicht 30, die ein Wasserstoffperoxid-zersetzendes Enzym enthält, und die POD, Ferrocyanid, Glucoseoxidase und Hilfsmittel enthält und darauf angeordnet ist, eine Lichtreflexionsschicht 40, die ebenfalls als Farbblockierungsschicht wirkt, welche Titandioxidteilchen enthält, und darauf angeordnet ist und einer gewebten Ausspreitungsschicht 50 aus einem Flächengebilde oder Textilmaterial zum Ausbreiten der Gesamtblutprobe, die darauf als Flecken aufgetragen wird, und die auf der Schicht 40 aufgebracht ist.
  • Wie aus diesen Zeichnungen hervorgeht, wird das Chromogen von den anderen wesentlichen Komponenten der Reagenszusammensetzung für die Bestimmung des Analyten getrennt, und die Chromogen-enthaltende Schicht ist zwischen dem Träger und der Schicht, die das Wasserstoffperoxidzersetzungsenzym enthält, welche Oxidase, POD und Ferrocyanid enthält, zwischengelegt. Diese analytischen Elemente sind bevorzugt integrale mehrschichtige analytische Elemente, wobei die entsprechenden Schichten integral auf dem Träger laminiert sind.
  • Das Prinzip der Bestimmung wird im Falle der Ausführungsform von Fig. 2 erläutert. Eine Serumprobe, welche Cholesterin enthält, wird als Flecken auf der Reagens-enthaltenden Ausspreitungsschicht 52 aufgetragen und breitet sich dann schnell in der Reagens-enthaltenden Ausspreitungsschicht proportional zu dem aufgetragenen Volumen aus. Das Cholesterin in dem Serum wird in Anwesenheit von Cholesterinoxidase, die in die Reagens-enthaltende Ausspreitungsschicht eingearbeitet ist, unter Bildung von H&sub2;O&sub2; oxidiert. Das H&sub2;O&sub2; oxidiert Ferrocyanidionen, die in dieser Schicht gleichzeitig vorliegen, zu Ferricyanidionen. Die Ferricyanidionen gehen durch die Lichtreflexionsschicht 40 hindurch, und erreichen die Chromogen-enthaltende Schicht 20. In dieser Schicht oxidieren die Ferricyanidionen das Chromogen unter Bildung eines Farbstoffs. Die gebildete Menge des Farbstoffs steht mit der Menge des Cholesterins in dem Serum in Zusammenhang. Ein solches erfindungsgemäßes analytisches Element besitzt verschiedene Vorteile.
  • Erstens ist der für die Reaktion erforderliche Sauerstoff leicht verfügbar, da die Oxidase, die den Analyt oxidiert, in die Außenschicht oder in ihre Nachbarschaft eingearbeitet ist. Dementsprechend verläuft die Oxidationsreaktion glatt und schnell.
  • Zweitens wird das Chromogen in eine Schicht außer der H&sub2;O&sub2; Bildungsstelle durch die Analyt-Oxidase-Reaktion eingearbeitet und das Chromogen wird unter intermediärer Bildung des Farbstoffs, wie H&sub2;O&sub2;-Ferrocyanidion-Ferricyanidion oxidiert. Dementsprechend kommt der Farbstoff kaum in Kontakt mit H&sub2;O&sub2;, und eine Entfärbung findet kaum statt. Dies ist besonders wirksam im Fall, wenn der Gehalt des Analyten in der Probe abnorm hoch ist, d. h. wenn die Bildung von H&sub2;O&sub2; übermäßig ist.
  • Drittens, da das Chromogen, welches praktisch instabil ist, in eine Innenschicht eingearbeitet ist, die kaum in Kontakt mit Luft kommt, wird die Stabilität des analytischen Elements während seiner Herstellung, Lagerung und Verwendung verbessert.
  • Viertens, im Falle der bekannten analytischen Elemente, die die Reagenszusammensetzung enthalten, welche Oxidase, POD, ein Ferrocyanid und Chromogen enthält, ist das Chromogen auf ein Chromogen des Kupplungstyps (Entwicklertyp) beschränkt, und der Analyt ist ebenfalls auf Glucose, Cholesterin und Harnsäure beschränkt. Bei dem erfindungsgemäßen analytischen Element können jedoch Chromogene des Leucofarbstofftyps auch verwendet werden, und irgendein Analyt, der ein Substrat für eine Oxidase sein kann, kann analysiert werden.
  • Schließlich kann ein lipophiler Analyt, wie Cholesterin, leicht oxidiert werden, obgleich er kaum in einer hydrophilen Bindemittelschicht wandert, da die Oxidase in die Außenschicht oder in ihre Nachbarschaft eingearbeitet ist. Als Folge werden die Analyten, welche mit dem erfindungsgemäßen analytischen Element analysiert werden können, ausgedehnt.
  • Als wasserundurchlässiger lichtdurchlässiger Träger kann ein bekannter Träger, der bei den üblichen mehrschichtigen analytischen Elementen verwendet wird, verwendet werden. Ein solcher Träger ist eine Folie oder ein Blatt oder ein Film mit einer Dicke im Bereich von etwa 50 um bis etwa 1 mm, bevorzugt von etwa 80 um bis etwa 0,3 mm, und er ist transparent, d. h. er kann mindestens einen Teil des Lichts mit einer Wellenlänge im Bereich von nahen Ultraviolettbereichen bis nahen Infrarotbereichen durchlassen. Eine solche Folie bzw. Blatt oder Film kann aus einem Polyester (beispielsweise Polyethylenterephthalat oder Polycarbonat von Bisphenol A), ein Celluloseester (beispielsweise Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat oder Celluloseacetatpropionat) oder Polystyrol hergestellt sein. Eine bekannte Unterschicht oder eine bekannte Klebstoffschicht kann auf der Oberfläche des Trägers vorgesehen sein, um die Adhäsion des Trägers an die daraufliegende Schicht, wie eine Wasserabsorptionsschicht, oder die Chromogen-enthaltende Schicht sicherzustellen.
  • Bei dem analytischen erfindungsgemäßen Element kann eine Wasserabsorptionsschicht auf dem Träger vorhanden sein. Die Wasserabsorptionsschicht kann aus einem hydrophilen Polymeren, das unter Quellung Wasser absorbiert, als Hauptkomponente gebildet sein, und diese Schicht absorbiert das Wasser, das die Oberfläche dieser Schicht erreicht. Im Falle einer Gesamtblutprobe beschleunigt sie die Permeation der Plasmakomponente in die Chromogen-enthaltende Schicht. Das Quellverhältnis des hydrophilen Polymeren liegt im Bereich von etwa 150% bis etwa 2000%, bevorzugt etwa 250% bis etwa 1500%, bei einer Wasserabsorption bei 30ºC. Beispiele für das hydrophile Polymere sind Gelatine, einschließlich mit Säure behandelter Gelatine und entionisierter Gelatine, Gelatinederivate, wie Gelatine, die mit Phthalsäure oder ihren Derivaten umgesetzt ist, und mit Hydroxyalkylacrylat gepfropfte Gelatine, Agarose, Pullulan, Pullulanderivate, Polyacrylamide, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Sie werden in der EP-A-0,119,86 und der EP-A-0,142,849 beschrieben. Bevorzugte hydrophile Polymere sind üblicherweise Gelatine und Gelatinederivate. Polyacrylamide und Polyvinylalkohol sind ebenfalls bevorzugt. Die Dicke der Wasserabsorptionsschicht beträgt üblicherweise etwa 1 um bis etwa 100 um in trockenem Zustand, und der Bereich von etwa 3 um bis etwa 30 um ist bevorzugt. Die Beschichtungsmenge dieser Schicht beträgt etwa 1 g/m² bis etwa 100 g/m², bevorzugt etwa 3 g/m² bis etwa 30 g/m². Die Wasserabsorptionsschicht kann einen bekannten pH-Puffer, eine organische Carbonsäure, ein saures Polymeres oder ein basisches Polymeres enthalten, um den pH dieser Schicht zum Zeitpunkt des analytischen Vorgangs einzustellen. Die Wasserabsorptionsschicht kann ebenfalls ein bekanntes Beizmittel, ein Polymerbeizmittel oder ein ähnliches Mittel enthalten. Es ist bevorzugt, daß diese Schicht im wesentlichen transparent ist.
  • Die Chromogen-enthaltende Schicht ist eine wasserabsorptionsfähige und wasserpermeable Schicht, in der ein Chromogen einheitlich in einem hydrophilen Polymeren Bindemittel eingearbeitet ist, oder eine poröse Schicht, in die ein Chromogen einheitlich eingearbeitet ist. Das hydrophile polymere Bindemittel kann ausgewählt werden unter den oben beschriebenen hydrophilen Polymeren. Die Dicke der Chromogen-enthaltenden Schicht beträgt üblicherweise etwa 3 um bis etwa 50 um in trockenem Zustand, und der Bereich von etwa 5 um bis etwa 30 um ist bevorzugt. Die Beschichtungsmenge dieser Schicht beträgt etwa 3 g/m² bis etwa 50 g/m², bevorzugt etwa 5 g/m² bis etwa 30 g/m². Die Chromogen-enthaltende Schicht kann einen bekannten pH-Puffer, eine organische Carbonsäure, ein saures Polymeres oder ein basisches Polymeres zur Einstellung des pHs dieser Schicht zum Zeitpunkt des analytischen Vorgangs enthalten. Die Chromogen-enthaltende Schicht kann ebenfalls ein bekanntes Beizmittel, ein polymeres Beizmittel oder ein ähnliches Mittel enthalten. Es ist bevorzugt, daß diese Schicht im wesentlichen klar ist, jedoch kann diese Schicht eine geringe Menge von Titandioxidteilchen, Bariumsulfatteilchen, Ruß oder ähnliches Material enthalten, um seine optische Eigenschaft zu kontrollieren. Die Chromogen-enthaltende Schicht kann eine poröse Schicht sein, die ein Chromogen enthält (zusammen mit einem Kuppler im Falle eines Chromogens des Kupplungstyps) die nach dem Verfahren, wie es in der EP-A-0 166 365 beschrieben wurde, gebildet wurde.
  • Die das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym enthaltende Schicht enthält das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym, und sie enthält ebenfalls Oxidase und Ferrocyanid für die Einführung eines Analyts in das Farbreaktionssystem. In diese Schicht wird der Analyt oder ein Material, das sich von dem Analyten ableitet, durch Sauerstoffin der Atmosphäre in der Anwesenheit von Oxidase oxidiert, wobei Wasserstoffperoxid gebildet wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert Ferrocyanidion in Anwesenheit des Wasserstoffperoxid-zersetzenden Enzyms, wie POD, unter Bildung von Ferricyanidionen. Die gebildeten Ferricyanidionen diffundieren in die Chromogen-enthaltende Schicht und oxidieren das Chromogen unter Bildung eines Farbstoffs bzw. gefärbten Materials. Die das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym enthaltende Schicht kann eine Komponente für die Bildung eines Substrats für das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzyms aus dem Analyten, beispielsweise Cholesterinesterase oder eine Enzymzusammensetzung, die Cholesterinesteraseaktivität für Cholesterinester aufweist, enthalten.
  • Die das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym-enthaltende Schicht ist eine poröse Schicht, welche Wasserstoffperoxid-zersetzendes Enzym, Oxidase und Ferrocyanid einheitlich enthält, oder es ist eine wasserabsorptionsfähige wasserpermeable Schicht, die die obigen Komponenten in einem hydrophilen polymeren Bindemittel einheitlich enthält. Im Falle der porösen Schicht ist diese Schicht bevorzugt eine poröse Ausspreitungsschicht (Reagens-enthaltende Ausspreitungsschicht). Die Dicke der Reagens-enthaltenden Ausspreitungsschicht kann gleich sein, wie die der porösen Ausspreitungsschicht, die die obigen Komponenten nicht enthält. Im Falle der hydrophilen polymeren Bindemittelschicht kann diese Schicht eine nicht-poröse Schicht oder eine poröse Schicht, die Teilchen enthält, wie in EP-A-0 114 403 beschrieben, sein. Die Dicke oder Beschichtungsmenge des hydrophilen polymeren Bindemittels kann gleich sein, wie bei der Chromogen-enthaltenden Schicht, wie zuvor beschrieben.
  • Die poröse Ausspreitungsschicht umfaßt Ausspreitungsschichten aus gewebtem Flächengebilde, wie sie in der US Patentschrift 4,292,272 und GB-A-2,087,074 beschrieben werden, wie einfachere gewebte Materialien, einschließlich feinem Wollstoff und Popelin, Ausspreitungsschichten aus gestricktem bzw. gewirktem Flächenmaterial, wie in der EP- A-A-0,162,302 beschrieben, wie Trikotstoff, doppelter Trikotstoff und Mailänder Stoff, Ausspreitungsschichten aus Papier, welches faserförmige Pulpe aus einem organischen Polymeren enthält, wie in der japanischen Patentpublikation KOKAI Nr. 57-148250 beschrieben, Membranfilter (trübe Polymerschicht), wie in der US Patentschrift 3,992,158 beschrieben, kontinuierliche Mikrozwischenräumeenthaltende poröse Schichten, bei denen kleine Polymerteilchen, kleine Glasteilchen oder Diatomeenerde in einem hydrophilen polymeren Bindemittel dispergiert sind, poröse Schichten mit kontinuierlichen Mikrozwischenräumen, bei denen kleine Polymerteilchen, kleine Glasteilchen usw. so miteinander verbunden sind, daß sie miteinander im Kontakt sind, an einer Stelle unter Verwendung des Polymerklebstoffs, der in Wasser nicht quillt (dreidimensionale Gitterstrukturschicht), wie in der US Patentschrift 4,258,001 beschrieben. Wenn die Farbreagenszusammensetzung in die Ausspreitungsschicht eingearbeitet wird, sind bevorzugte Ausspreitungsschichten faserförmige Ausspreitungsschichten, die die Ausspreitzungsschichten aus gewebtem Flächengebilde und die Ausspreitungsschichten aus gestricktem bzw. gewirktem Flächengebilde.
  • Zur Erhöhung der Adhäsionskraft kann die obige faserförmige poröse Ausspreitungsschicht, wie gewebtes Flächengebilde, gestricktes bzw. gewirktes Flächengebilde und Papier durch physikalische Aktivierungsbehandlung, wie Glimmentladung oder Coronaentladung, wie es in der GB-A- 2,087,074 beschrieben wird, durch chemische Behandlung, wie Waschen, Entfetten und Eintauchen in eine hydrophile Polymerlösung, wie in der US Patentschrift 4,292,272 und der GB-A-2,087,074 beschrieben, oder durch eine Kombination davon in hydrophilen Zustand überführt werden.
  • Eine Farbblockierungsschicht oder eine Lichtreflexionsschicht kann zwischen der Reagensschicht oder der Wasserabsorptionsschicht und der porösen Ausspreitungsschicht vorgesehen sein. Die Farbblockierungsschicht oder die Lichtreflexionsschicht besteht aus einem hydrophilen polymeren Bindemittel, wie Gelatine, in dem farblose Teilchen, wie Titandioxidteilchen oder Bariumsulfatteilchen einheitlich suspendiert sind. Die Dicke dieser Schicht beträgt etwa 2 um bis etwa 20 um in trockenem Zustand.
  • Eine Klebstoffschicht kann vorgesehen werden, um die Adhäsionskraft an die Ausspreitungsschicht zu verstärken. Diese Schicht besteht aus dem zuvor erwähnten hydrophilen Polymeren, wie Gelatine, und ihre Trockendicke beträgt etwa 0,5 um bis etwa 5 um.
  • Ein grenzflächenaktives Mittel, wie ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel kann in die Reagensschicht, die Wasserabsorptionsschicht, die Farbblockierungsschicht, die Lichtreflexionsschicht, die Klebstoffschicht oder die Ausspreitungsschicht eingearbeitet werden. Beispiele für das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel sind p-Octylphenoxypolyethoxyethanol, p-Nonylphenoxypolyethoxyethanol, Polyoxyethylenoleylether, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, p-Nonylphenoxypolyglycidol (Nonylphenylpolyglycidylether), Octylglucosid und ähnliche Verbindungen. Die Ausbreitungswirkung (Dosierwirkung) der Ausspreitungsschicht wird durch Einarbeitung eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels in die Ausspreitungsschicht verbessert. Wenn ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel in die Reagensschicht oder die Wasserabsorptionsschicht eingearbeitet wird, absorbieren diese Schichten das Wasser in einer wäßrigen Probe einheitlich und leicht. Außerdem dringt die Flüssigkeit in der Ausspreitungsschicht schnell und einheitlich in diese Schichten. Der Gehalt an nicht-ionischem grenzflächenaktiven Mittel beträgt üblicherweise etwa 20 mg bis etwa 15 g, bevorzugt etwa 50 mg bis etwa 10 g, für jede Schicht, in die es eingearbeitet werden kann.
  • Die Oxidase katalysiert die Oxidation des Analyten oder eines Materials, das sich von dem Analyten ableitet. Eine solche Oxidase wird in Abhängigkeit von dem Analyten ausgewählt und umfaßt Oxidasen der Glucose, Cholesterin, Urat, Lactat, Glycerin, Cholin, Polyaminen, organischen Säuren, Alkoholen, Phenolen oder Aminosäuren und Oxidasen der Materialien, die sich von Glycerophosphat, Sacosin, Pyruvat, Cholin, Glycollat oder Acylcoenzym A ableiten.
  • Diese Oxidasen werden in "Koso (Enzyme) Handbook" (herausgegeben von Maruo, Tamiya et al., Asakura Shoten, Tokyo, 1982), "Rinsho Koso (Clinical Enzyme) Handbook" (herausgegeben von Baba, Wada, Kitamura und Okuda, Kodansha, Tokyo, 1982), "Enzymes 3. Aufl." herausgegeben von M. Dikxon und E. C. Webb, Longman, London, 1979) und "Methods of Enzymatic Analysis 3. Aufl." (herausgegeben von H. U. Bergmeyer et al., Weinheim, Verlag Chemie, 1983-1986). Diese Oxidasen umfassen ebenfalls an Antigen, Hapten oder Antikörper als Markierungssubstanz gebundene Oxidase, die bei einem Immunoassay verwendet wird, und Oxidase, die bei einer immunologischen Reaktion freigesetzt wird. Der Gehalt der Oxidase beträgt üblicherweise etwa 100 E bis etwa 100 000 E, bevorzugt etwa 300 E bis etwa 60 000 E pro 1 m² analytischem Element.
  • Das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym umfaßt Peroxidase (POD), Katalase und verschiedene Enzyme, die Wasserstoffperoxid-zersetzende Aktivität aufweist und in einer biologischen Flüssigkeit, wie Blut, wie in den zuvor beschriebenen Büchern beschrieben, vorhanden sind. POD ist das populärste Enzym.
  • Die Peroxidase (EC 1.11.1.7) kann pflanzlichen Ursprungs oder tierischen Ursprungs sein, wie es in den zuvor erwähnten Büchern, der US Patentschrift 3,983,005 oder der japanischen Patentpublikation KOKOKU Nr. 57-5520 beschrieben wird, oder sie kann mikrobiellen Ursprungs sein, wie es in der japanischen Patentpublikation KOKOKU Nr. 58-5035 beschrieben wird. Bevorzugte Peroxidasen sind nicht-spezifische Peroxidasen pflanzlichen Ursprungs oder von mikrobiellem Ursprung, wie Meerrettichperoxidase, japanische Rettichperoxidase, Peroxidase, die durch einen Mikroorganismus der Gattung Cochliobolus gebildet wird, und die Peroxidase, die durch einen Mikroorganismus der Gattung Curvularia gebildet wird. Der Gehalt der Peroxidase beträgt bevorzugt 2000 E bis etwa 60 000 E pro 1 m² analytischem Element. Ein bekannter pH-Puffer kann in die Schicht, welche Peroxidase enthält, oder eine benachbarte Schicht eingearbeitet werden, um den pH bei 5,0 bis 8,0, bevorzugt bei 6,0 bis 7,0, zum Zeitpunkt des analytischen Verfahrens zu halten.
  • Das Ferrocyanid ist eine Verbindung, die Ferrocyanidionen (Fe(CN)&sup4;&sub6;&supmin;) enthält oder freisetzen kann. Ein solches Ferrocyanid umfaßt verschiedene Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze und Gemische davon. Beispiele für Ferrocyanide sind Natriumferrocyanid, Kaliumferrocyanid, Lithiumferrocyanid, Magnesiumferrocyanid und Calciumferrocyanid. Unter diesen sind Natriumferrocyanid und Kaliumferrocyanid bevorzugt. Der Gehalt an Ferrocyanid beträgt etwa 0,1 mmol bis etwa 10 mmol, bevorzugt etwa 0,5 mmol bis etwa 5 mmol pro m² an analytischem Element.
  • Das Chromogen kann entweder dem Leucofarbstofftyp (selbstentwickelnder Typ) oder dem Kupplungstyp (Entwicklertyp) angehören. Das Chromogen des Leucofarbstofftyps umfaßt Verbindungen des Benzidintyps, Verbindungen des Diphenylamintyps, Verbindungen des Triarylmethantyps, Verbindungen des 3-substituierten Imidazoltyps und ähnliche Verbindungen. Beispiele für das Chromogen des Leucofarbstofftyps sind Triarylimidazolleucofarbstoffe, wie 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis[4-(dimethylamino)phenyl]imidazol, das in der US Patentschrift 4,089,747 beschrieben wird, Diarylimidazolleucofarbstoffe, wie 2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4-[4-(dimethylamino)phenyl]-5- phenethylimidazol, das in der EP 0 122 641A beschrieben wird, Diarylimidazolleucofarbstoffe, wie 2-(3,5-Dimethoxy- 4-hydroxyphenyl)-4-[4-(dimethylamino)phenyl]-5-methylimidazol und 2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4-[4-(dimethylamino)phenyl]-5-(4-hydroxybutyl)imidazol, das in der USP 4,665,023 beschrieben wird und Diarylmonoheteroarylimidazolleucofarbstoffe, wie 2-(2-Phenyl-3-indolyl)-4,5- di[4-(dimethylamino)phenyl]imidazol, das in der EP-A-0 122 641 beschrieben wird. Das Chromogen des Kupplungstyps umfaßt Verbindungen des Antipyrin(Phenazon)typs, Verbindungen des Benzothiazolinonhydragontyps, und ähnliche. Beispiele für Chromogene des Kupplungstyps sind 4-Aminoantipyrin 4-Aminophenazon, 1-Phenyl-2,3-dimethyl-4-amino-3- pyrazolin-5-on), wie in Ann. Clin. Biochem., 6, 24-27 (1969) beschrieben wird und 4-Aminoantipyrin-Analoge, wie 1-Di- oder Tri-substituierte Phenyl-2,3-dimethyl-4-amino- 3-pyrazolin-5-one, wie 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on und 1-(3,5-dichlorphenyl)- 2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on, wie in der EP 0 103 901A beschrieben, und 1-Phenyl-2,3-dimethylamino-3-pyrazolin-5-on und ähnliche, wie in der japanischen Patentpublikation KOKAI Nr. 49-50991 beschrieben. Bevorzugte Chromogene des Kupplungstyps sind 4-Aminoantipyrin, 1-(2,4,6- Trichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on und 1-(3,5-dichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5- on. Der Kuppler, der mit dem Chromogen des Kupplungstyps kombiniert wird, umfaßt Verbindungen des Phenoltyps, Verbindungen des Naphtholtyps, Verbindungen des Anilintyps und Primaquin. Beispiele für Kuppler sind Phenol, Phenolsulfonsäuren (einschließlich ihrer Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze), wie 2-Hydroxy-1-benzolsulfonsäure, 4-Hydroxy-1-benzolsulfonsäure, 3,5-Dichlor-2-hydroxy-1- benzolsulfonsäure und 2-Hydroxy-2-methoxy-1-benzolsulfonsäure, 1-Naphthol, 2-Naphthol, Dihydroxynaphthaline, wie 1,7-Dihydroxynaphthalin, Naphtholsulfonsäuren (einschließlich ihrer Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze) wie 1-Hydroxy-2-Naphthalinsulfonsäure und 1- Hydroxy-4-naphthalinsulfonsäure und andere Phenol- oder Naphtholderivate. Sie werden in Ann. Chin. Biochem., 6, 24-27 (1969), USP 3,983,005, USP 4,042,335, USP 4,350,762 und der japanischen Patentpublikation KOKAI Nrn. 49-50991, 55-164356 und 56-155852 beschrieben. Bevorzugte Kuppler sind 1,7-Dihydroxynaphthalin, 1-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure, 3,5-Dichlor-2-hydroxy-1-benzolsulfonsäure und 2- Hydroxy-3-methoxy-1-benzo1su1fonsäure. Die obigen Benzolsulfonsäuren umfassen ihre Na-Salze, K-Salze und Li-Salze. Der Gehalt an Chromogen beträgt bevorzugt etwa 0,5 mmol bis etwa 10 mmol, bevorzugt etwa 1 mmol bis etwa 5 mmol, unabhängig von dem Leucofarbstofftypchromogen (Selbstentwicklungstyp) und dem Chromogen des Kupplungstyps. Der Gehalt an Kuppler, der mit dem Chromogen des Kupplungstyps kombiniert wird, beträgt etwa 0,5 mmol bis etwa 40 mmol, bevorzugt etwa 1 mmol bis etwa 20 mmol.
  • Ein bekannter pH-Puffer kann in das erfindungsgemäße analytische Element eingearbeitet werden, um den Reaktions-pH auf den optimalen pH zum Zeitpunkt des analytischen Vorgangs einzustellen. Geeignete pH-Puffer werden beschrieben in "Kagaku Benran (Chemical Handbook) Kiso Hen (Fundamental Volume)" Seiten 1312-1320, (herausgegeben von The Chemical Society of Japan, Maruzen, Tokyo, 1966), "Data for Biochemical Research 2. Aufl." Seiten 476-508 (herausgegeben von R. M. C. Dawson et al., Oxford, Clarendon Press, 1969), "Biochemistry" 5 467-477 (1966) und "Analytical Biochemistry" 104, 300-310 (1980). Ein Beispiel für den pH-Puffer sind Puffer, welche Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) enthalten, Puffer, welche Phosphat enthalten, Puffer, welche Borat enthalten, Puffer, welche Zitronensäure oder Zitrat enthalten, und Puffer, welche Glycin enthalten. Bevorzugte Puffer sind Kaliumdihydrogenphosphat-Dinatriumhydrogenphosphat, Trisnatriumborat, Trisnatriumborat-EDTA. 2Na, Triszitronensäure, Essigsäure- Natriumacetat und zitronensäure-Natriumdihydrogenphosphat.
  • Das erfindungsgemäße analytische Element kann nach den bekannten Verfahren, wie sie in den zuvor beschriebenen Patentpublikationen beschrieben werden, hergestellt werden.
  • Das erfindungsgemäße integrale mehrschichtige analytische Element wird bevorzugt in Quadrate oder runde Stücke mit einer Seite oder einem Durchmesser von etwa 15 mm bis etwa 30 mm geschnitten, und in einen Diarahmen gegeben, wie in der USP 4,169,751, der japanischen Patentpublikation KOKAI Nr. 57-63452, der USP 4,387,990 und dem japanischen Gebrauchsmuster KOKAI Nr. 58-32350, der USP 4,169,751, der USP 4,387,990, der PCT Anmeldung WO 83/00391 etc. beschrieben, wenn es verwendet wird. Das analytische Element kann auch in Form eines langen Bands, das in einer Kassette oder einem Magazin verpackt ist, oder in Form von kleinen Stücken, die auf eine Karte geklebt oder gegeben sind, mit einer Öffnung, verwendet werden.
  • Die Messung erfolgt beispielsweise nach den Verfahren, wie sie in den obigen Patentpublikationen beschrieben wurden. Etwa 5 ul bis etwa 30 ul, bevorzugt etwa 8 ul bis etwa 15 ul, einer wäßrigen Probe werden als Fleck auf die Ausspreitungsschicht aufgetragen, und dann wird bei einer definierten Temperatur im Bereich von etwa 20ºC bis etwa 45ºC während 1 bis 10 Minuten inkubiert. Danach wird eine nachweisbare Änderung, wie eine Farbänderung oder eine Farbbildung, in dem mehrschichtigen analytischen Element von der Seite des Trägers durch Reflexionsphotometrie gemessen, und die gewünschte Komponente in der Probe wird gemäß den Prinzipien der Colorimetrie bestimmt. Wenn diese Messung unter Verwendung der chemischen-analytischen Vorrichtung, die in der USP 4,488,810 und USP 4,424,191 beschrieben wird, durchgeführt wird, können durch einen einfachen Vorgang sehr akkurate Ergebnisse erhalten werden.
    • BEISPIELE Beispiel 1
  • Der verwendete Träger war ein farbloser transparenter Polyethylenterephthalat(PET)film mit einer Dicke von 180 um, auf den Gelatine durch Beschichten aufgebracht wurde. Die wäßrigen Lösungen der folgenden Schichten wurden nacheinander unter Bildung eines Laminats aufgebracht und getrocknet.
  • Chromogen-enthaltende Schicht:
  • Alkali-behandelte Gelatine 23 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidylether 1, 0 g/m² (welche 10 Glycidyleinheiten durchschnittlich enthält)
  • 1,7-Dihydroxynaphthalin 230 mg/m²
  • 4-Aminoantipyrin 960 mg/m²
  • Bis(vinylsulfonylmethyl)ether 250 mg/m²
  • Lichtblockierungsschicht:
  • Alkali-behandelte Gelatine 3,8 g/m²
  • Titandioxidteilchen des Rutiltyps 40 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidylether 1,3 g/m² (der im Durchschnitt 10 Glycidyleinheiten enthält)
  • Klebstoffschicht:
  • Alkali-behandelte Gelatine 6,7 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidylether 260 mg/m² (der im Durchschnitt 10 Glycidyleinheiten enthält)
  • Die Klebstoffschicht wurde einheitlich mit 30 g/m² Wasser befeuchtet, und ein PET-Trikotflächengebildetuch wurde leicht als Ausspreitungsschicht darauf unter Laminierung aufgepreßt. Dieses Trikotflächengebildetuch wurde durch Verstricken bzw. Verwirken von 50D PET gesponnenem Garn unter Verwendung von 36 Gauge hergestellt, und seine Dicke betrug etwa 250 um. Danach wurde die folgende wäßrige Farbe bildende Reagenszusammensetzungslösung für die Bestimmung des Cholesterins auf die Ausspreitungsschicht angewendet, und dann wurde getrocknet, wobei ein integrales mehrschichtiges analytisches Element für die Bestimmung von Cholesterin erhalten wurde.
  • Die farbbildende Reagenszusammensetzung für die Bestimmung von Cholesterin:
  • Nonylphenoxypolyethoxyethanol 160 mg/m² (welches durchschnittlich 9 bis 10 Hydroxyethyleneinheiten enthält)
  • Monokaliumdihydrogenphosphat 45 mg/m²
  • Dikaliummonohydrogenphosphat 80 mg/m²
  • Cholesterinesterase 4500 E/m²
  • Cholesterinoxidase 800 E/m²
  • Peroxidase 4000 E/m²
  • Kaliumferrocyanid 130 mg/m²
  • Polyvinylpyrrolidon 2,7 g/m²
  • (mittleres Molekulargewicht; 360 000)
  • Das so erhaltene analytische mehrschichtige Element für die Bestimmung des Cholesterins wurde in quadratische Stücke mit einer Seite von 15 mm geschnitten, und in einen Diarahmen, wie er in dem japanischen Patent KOKAI Nr. 58- 32350 beschrieben wird, gelegt.
    • Vergleichsbeispiel 1
  • Ein mehrschichtiges analytisches Vergleichselement für die Bestimmung von Cholesterin wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, ausgenommen, daß Kaliumferrocyanid und Peroxidase nicht zu der Farbe bildenden Reagenszusammensetzung für die Bestimmung des Cholesterins zugegeben wurden, und daß anstelle der Chromogenenthaltenden Schicht die folgende farbbildende Reagensschicht vorgesehen wurde.
  • Farbbildende Reagensschicht:
  • Alkali-behandelte Gelatine 2,3 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidylether 1,0 g/m 2 (welcher durchschnittlich 10 Glycidyleinheiten enthält)
  • Peroxidase 4000 E/m²
  • 1,7-Dihydroxynaphthalin 230 mg/m²
  • 4-Aminoantipyrin 960 mg/m 2
  • Bis(vinylsulfonylmethyl)ether 250 mg/m²
  • Dieses mehrschichtige analytische Vergleichselement wurde ebenfalls in quadratische Stücke geschnitten und in einen Diarahmen auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gelegt.
    • Vergleichsbeispiel 2
  • Ein weiteres mehrschichtiges analytisches Vergleichselement für die Bestimmung des Cholesterins wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, ausgenommen daß die Peroxidase nicht zu der farbbildenden Reagenszusammensetzung für die Bestimmung des Cholesterins zugegeben wurde, und daß die gleiche farbbildende Reagensschicht wie oben anstelle der Chromogen-enthaltenden Schicht verwendet wurde. Dieses mehrschichtige analytische Vergleichselement wurde ebenfalls in quadratische Stücke geschnitten und in einen Diarahmen auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gegeben.
    • Beispiel 2
  • Die obigen drei analytischen Elemente wurden wie folgt geprüft.
  • Zur Herstellung einer Eichkurve wurden fünf humane Plasmen mit unterschiedlichen Cholesteringehalten hergestellt, und die entsprechenden Cholesterinkonzentrationen wurden gemäß dem Verfahren von C. C. Allain, das in Clinical Chemistry, 20 (4), 470-475 (1974) beschrieben wird, bestimmt. Je 10 ul dieser fünf humanen Plasmen wurden auf die Ausspreitungsschicht von jedem analytischen Element, das in einen Diarahmen montiert war, gegeben und dann wurde bei 37ºC während 6 Minuten inkubiert. Unmittelbar danach wurde die optische Reflexionsdichte der Chromogen-enthaltenden Schicht oder der farbbildenden Reagensschicht von der Seite des Trägers durch Reflexionsphotometrie unter Verwendung von sichtbarem Licht mit einer zentralen Wellenlänge von 640 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Cholesterinkonzentration mg/dl Optische Reflexionsdichte Beispiel Vergleichsbeispiel 1
  • Danach wurden drei Kontrollseren aus Serum hergestellt, welches 110 mg/dl Cholesterin und kein Hämoglobin enthielt, indem Hämoglobin in Hämoglobinkonzentrationen von 0 mg/dl (keine Zugabe), 250 mg/dl und 500 mg/dl zugegeben wurden. Je 10 ul der Kontrollseren wurde auf die Ausspreitungsschicht von jedem analytischen Element, das auf einem Diarahmen montiert war, gegeben, inkubiert, und dann wurde die optische Reflexionsdichte auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Hämoglobinkonzentration mg/dl Optische Reflexionsdichte (% Fehler) Beispiel 1 Vergleichsbeispiel 1
  • Wie aus der Tabelle folgt, ist der Fehler, der durch die Störung von Hämoglobin verursacht wird, sehr klein.
    • Beispiel 3
  • Als Träger wird ein farbloser transparenter Polyethylenterephthalat(PET)film mit einer Dicke von 180 um, auf den ein Überzug aus Gelatine aufgebracht wird, verwendet. Die wäßrigen Lösungen der folgenden Schichten wurden nacheinander aufgetragen, und dann wurde unter Laminatbildung getrocknet.
  • Chromogen-enthaltende Schicht:
  • Alkali-behandelte Gelatine 23 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidylether 1, 0 g/m 2 (welcher 10 Glycidyleinheiten durchschnittlich enthält)
  • 1,7-Dihydroxynaphthalin 230 mg/m²
  • 4-Aminoantipyrin 960 mg/m²
  • Bis(vinylsulfonylmethyl)ether 250 mg/m²
  • Lichtblockierungsschicht:
  • Alkali-behandelte Gelatine 3,8 g/m²
  • Titandioxidteilchen des Rutiltyps 40 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidy1ether 1,3 g/m 2 (der im Durchschnitt 10 Glycidyleinheiten enthält)
  • Klebstoffschicht, die Peroxidase enthält:
  • Alkali-behandelte Gelatine 6,7 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidylether 1,0 mg/m² (der im Durchschnitt 10 Glycidyleinheiten enthält)
  • Kaliumferrocyanid 0,5 g/m²
  • Peroxidase 1600 E/m²
  • Glucoseoxidase 600 E/m²
  • Die Klebstoffschicht wurde einheitlich mit 30 g/m² Wasser befeuchtet, und ein einfaches gewebtes bzw. gewirktes Flächengebilde aus 100% Baumwolle wurde leicht auf das Laminat als Ausspreitungsschicht gepreßt, und dann wurde getrocknet, wobei ein integrales mehrschichtiges analytisches Element für die Bestimmung der Glucose erhalten wurde. Dieses einfache gewebte bzw. gewirkte Flächengebilde wurde mit 100-zweifachem Garn erhalten und seine Dicke betrug etwa 140 um. Dieses Element wurde geschnitten und in den Diarahmen, ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben, gelegt.
    • Vergleichsbeispiel 3
  • Als Träger wurde ein farbloser transparenter Polyethylenterephthalat(PET)film mit einer Dicke von 180 um, auf den ein Überzug aus Gelatine aufgebracht worden war, verwendet. Die wäßrigen Lösungen der folgenden Schichten wurden nacheinander aufgetragen und unter Laminatbildung getrocknet.
  • Farbe bildende Reagensschicht:
  • Alkali-behandelte Gelatine 20 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidylether 900 g/m² (der im Durchschnitt 10 Glycidyleinheiten enthält)
  • 1,7-Dihydroxynaphthalin 200 mg/m²
  • 4-Aminoantipyrin 850 mg/m²
  • Glucoseoxidase 4000 E/m²
  • Peroxidase
  • Bis(vinylsulfonylmethyl)ether 220 mg/m²
  • Lichtblockierungsschicht:
  • Alkali-behandelte Gelatine 3,8 g/m²
  • Titandioxidteilchen des Rutiltyps 40 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidylether 1,3 g/m 2 (der im Durchschnitt 10 Glycidyleinheiten enthält)
  • Klebstoffschicht:
  • Alkali-behandelte Gelatine 6,7 g/m²
  • Nonylphenylpolyglycidylether 260 mg/m 2 (der durchschnittlich 10 Glycidyleinheiten enthält).
  • Ein mehrschichtiges analytisches Vergleichselement für die Bestimmung der Glucose wurde so auf gleiche Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, ausgenommen der obigen Änderungen, hergestellt.
    • Beispiel 4
  • Die beiden analytischen Elemente, hergestellt gemäß Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 3 wurden wie folgt bewertet.
  • Zur Herstellung der jeweiligen Eichkurve wurden sechs humane Plasmen mit unterschiedlichen Glucosekonzentrationen hergestellt, und die jeweiligen Glucosekonzentrationen wurden gemäß dem Hexokinase-G-6-PDH-Verfahren bestimmt. Danach wurden je 10 ul des gleichen Plasmas auf die Ausspreitungsschicht von jedem analytischen Element, das auf einen Diarahmen montiert war, als Flecken aufgetragen, und dann wurde bei 37ºC während 6 Minuten inkubiert. Unmittelbar danach wurde die optische Reflexionsdichte der Chromogen-enthaltenden Schicht oder der farbbildenden Schicht von der Seite des Trägers durch Reflexionsphotometrie unter Verwendung von sichtbarem Licht mit einer zentralen Wellenlänge von 540 nm gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Glucosekonzentration mg/dl Optische Reflexionsdichte Beispiel 3 Vergleichsbeispiel 3
  • Aus der Tabelle 3 folgt, daß die Ergebnisse sehr genau sind, da die Neigung der Eichkurve in einem großen Bereich in dem erfindungsgemäßen analytischen Element groß ist.

Claims (2)

1. Mehrschichtiges analytisches Element des Trokkentyps, das eine farbbildende Reagenszusammensetzung enthält, die für die Bestimmung eines Analyten in einer wäßrigen flüssigen Probe, welche Hämoglobin enthält, durch Bestimmung des Wasserstoffperoxids, das in Anwesenheit einer Oxidase gebildet wird, verwendet werden kann, und das einen lichtdurchlässigen wasserimpermeablen Träger enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die farbbildende Reagenszusammensetzung die Oxidase, die spezifisch mit dem Analyten oder einem Material, das sich von dem Analyten ableitet, unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagiert, ein Wasserstoffperoxid-zersetzendes Enzym, ein Ferrocyanid und ein Chromogen als wesentliche Komponenten enthält, wobei die Schicht, die das genannte Chromogen enthält, von der Schicht, die das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym enthält, getrennt ist und näher an dem Träger angebracht ist als die Schicht, die das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym enthält, wobei die Schicht, die das Wasserstoffperoxid-zersetzende Enzym enthält, ebenfalls die genannte Oxidase und das genannte Ferrocyanid enthält.
2. Mehrschichtiges analytisches Element des Trokkentyps nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Schichten integral auf dem Träger laminiert sind.
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