DE19945828A1

DE19945828A1 - Analysenelement und Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Flüssigkeit

Info

Publication number: DE19945828A1
Application number: DE19945828A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang-Reinhold Knappe; Rudolf Pachl; Otto Gaa
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-09-24
Filing date: 1999-09-24
Publication date: 2001-03-29
Anticipated expiration: 2019-09-25
Also published as: DE19945828B4; US6506575B1

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Analyseelement zur Bestimmung der Menge eines Analyten in Flüssigkeit, enthaltend eine Probenaufgabezone (1) und eine Nachweiszone (2), die in flüssigkeitsübertragendem Kontakt stehen, letztere enthaltend mindestens ein Enzym und eine Indikatorsubstanz, wobei das Enzym eine Reaktion katalysiert, an der der Analyt oder eine vom Analyt abgeleitete Substanz teilnimmt und die Indikatorsubstanz bei Anwesenheit des Analyten ein Signal bildet, das mit der Menge des Analyten korreliert, und in direktem Kontakt mit der Nachweiszone eine flüssigkeitsdurchlässige Entstörschicht (3) so angeordnet enthaltend, daß Flüssigkeit erst nach durchlaufen der Entstörschicht (3) in die Nachweiszone (2) gelangt, wobei die Entstörschicht mindestens ein Enzym enthält, das an einer Reaktion des zu bestimmenden Analyten oder einer vom Analyten abgeleiteten Substanz teilnimmt, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt oder die vom Analyt abgeleitet Substanz in der Entstörschicht enzymatisch zu Endprodukten umgesetzt wird, die nicht zur Signalbildung durch die Indikatorsubstanz beitragen können, DOLLAR A sowie ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Flüssigkeit mittels eines Analyseelementes.

Description

Die Anmeldung betrifft ein Analyseelement zur Bestimmung der Menge eines Analyten in Flüssigkeit enthaltend eine Probenaufgabezone und eine Nachweiszone, die in flüssigkeits übertragendem Kontakt stehen, letztere enthaltend mindestens ein Enzym und eine Indikator substanz, wobei das Enzym eine Reaktion katalysiert, an der der Analyt oder eine vom Analyt abgeleitete Substanz teilnimmt und die Indikatorsubstanz bei Anwesenheit des Analyten ein Signal bildet, das mit der Menge des Analyten korreliert, und in direktem Kontakt mit der Nachweiszone eine flüssigkeitsdurchlässige Entstörschicht so angeordnet enthaltend, daß Flüssigkeit erst nach Durchlaufen der Entstörschicht in die Nachweis zone gelangt, wobei die Entstörschicht mindestens ein Enzym enthält, das an einer Reaktion des zu bestimmenden Analyten oder einer vom Analyten abgeleiteten Substanz teilnimmt. Die Anmeldung betrifft außerdem ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Flüssigkeit mittels eines solchen mehrschichtigen Analyseelementes.

Bei Analysenelementen der trockenchemischen Art, die oft auch als Teststreifen bezeichnet werden, auf die undosierte Probevolumina und damit Volumina weitgehend variablen Umfanges aufgegeben werden, ergeben sich oft überhöhte, das heißt, falsch positive Ergebnisse für nachzu weisende Analyte. Außerdem ist ein Ende der Nachweisreaktion oft nicht erkennbar. Die Nach weisreaktion läuft oft über einen längeren Zeitraum langsam aus (Reaktionsschleich).

Die japanische Offenlegungsschrift Nr. Hei 5-23199 (Offenlegungstag 02.02.1993) beschreibt ein Analyseelement und eine entsprechende Analysemethode zur Analyse von Neutralfetten. Die der in der Patentanmeldung beschriebenen Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, in zu untersuchenden Proben ursprünglich bereits vorhandenes Glyzerin zu entfernen, bevor eine enzymatische Analyse der Neutralfette über Glycerin als Zwischenstufe durchgeführt wird. Dies wurde dadurch erreicht, daß Analysenelemente zur Analyse von Neutralfetten zur Verfügung gestellt wurden, die mindestens eine Reagenzschicht auf einem durchsichtigen Träger sowie darauf eine Reaktionsschicht besitzen. Die Reaktionsschicht als zuerst mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt kommende Schicht enthält Glycerindehydrogenase und NAD⁺. Die Reagenz schicht enthält ebenfalls Glycerindehydrogenase, jedoch kein Coenzym. Somit wird Glycerin in der als Entstörschicht wirkenden Reaktionsschicht zu Dihydroxyaceton und NADH umgesetzt und entfernt. Offenbar aktiviert aus der Reaktions- in die Reagenzschicht mit der Probe ein diffundierendes NAD⁺ die dort vorliegende Glycerindehydrogenase, so daß im Verlauf der analytischen Umsetzung der Neutralfette gebildetes Glycerin in der Reagenzschicht ebenfalls zu Dihydroxyaceton und NADH umgesetzt wird. Das gebildete NADH reagiert in der Reagenz schicht mit Chromogen zu einem farbigen Detektionsprodukt. Es ist zu erwarten, daß aus der Reaktions- in die Reagenzschicht im Verlauf der Analyse ein difundierendes NADH die Farb reaktion falsch positiv beeinflußt.

Im Hinblick auf diesen Stand der Technik wurde es als Aufgabe angesehen, Analysenelemente zur Verfügung zu stellen, die auch mit undosierten Proben richtige Ergebnisse liefern, das heißt Ergebnisse, die mit jeweiligen Referenzmethoden erzielten übereinstimmen. Außerdem soll das Ergebnis nach kurzer Zeit vorliegen. Das Ende der Nachweisreaktion soll deutlich dadurch erkennbar sein, daß ein Signal, das zur Bestimmung eines Analyten herangezogen wird, keine wesentliche weitere Veränderung mehr erfährt.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch den in den Patentansprüchen näher charakterisierten Gegenstand gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Analyseelement zur Bestimmung der Menge eines Analyten in Flüssigkeit enthaltend eine Probenaufgabezone und eine Nachweiszone, die in flüssigkeitsübertragendem Kontakt stehen, letztere enthaltend mindestens ein Enzym und eine Indikatorsubstanz, wobei das Enzym eine Reaktion katalysiert, an der der Analyt oder eine vom Analyt abgeleitete Substanz teilnimmt und die Indikatorsubstanz bei Anwesenheit des Analyten ein Signal bildet, das mit der Menge des Analyten korreliert, und in direktem Kontakt mit der Nachweiszone eine flüssigkeitsdurchlässige Entstörschicht so angeordnet enthaltend, daß Flüssigkeit erst nach Durchlaufen der Entstörschicht in die Nach weiszone gelangt, wobei die Entstörschicht mindestens ein Enzym enthält, das an einer Reaktion des zu bestimmenden Analyten oder einer vom Analyten abgeleiteten Substanz teilnimmt, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt oder die vom Analyt abgeleitete Substanz in der Entstörschicht enzymatisch zu Endprodukten umgesetzt wird, die nicht zur Signalbildung durch die Indikatorsubstanz beitragen können.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Flüssigkeit mittels eines wie vorstehend beschriebenen Analysenelementes, dadurch gekenn zeichnet, daß Flüssigkeit undosiert auf die Probenaufgabezone aufgegeben wird, Flüssigkeit durch die Entstörschicht in die Nachweiszone gelangt und dort die Menge an Analyt in der Flüssigkeit bestimmt wird, wobei die Nachweiszone mit Flüssigkeit gefüllt ist und überschüssige Flüssigkeit in der Entstörschicht und gegebenenfalls in der Probenaufgabezone verbleibt.

Speziell ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung einer Schicht in einem mehrschichtigen Analysenelement, die einen zu bestimmenden Analyt oder eine hiervon abgeleitete Substanz zu Produkten umsetzt, die nicht zur Signalbildung in diesem mehrschichtigen Analysenelement zur Bestimmung dieses Analyten beitragen, zur Verhinderung der Nachdiffusion von Analyt aus anderen Zonen in die Zone des Analysen elementes, in der der Nachweis des Analyten stattfinden soll, wenn die Nachweiszone mit Flüssigkeit gefüllt ist.

Ein erfindungsgemäßes Analysenelement enthält ein Matrixmaterial, das eine Probenaufgabe zone und eine Nachweiszone enthält. Es können auch mehrere Matrixmaterialien vorliegen, wobei das eine Probenaufgabenzone und das andere die Nachweiszone trägt. Als Matrix materialien kommen grundsätzlich alle saug- oder quellfähigen Materialien in Frage, die Flüssigkeit aufnehmen können. Es können dies faserige, wie Vliese, Gewebe oder Gewirke oder nicht faserige Materialien, wie poröse oder nicht-poröse Filme oder Membranen sein.

In einem erfindungsgemäßen Analysenelement befinden sich die Probenaufgabezone und die Nachweiszone in einem Flüssigkeitsübergang ermöglichenden Kontakt. Die Probenaufgabezone kann die Nachweiszone berühren. Beide Zonen können jedoch auch getrennt sein, so lange Flüssigkeit, die auf die Probenaufgabezone aufgegeben wird, im Analysenelement in die Nach weiszone gelangen kann.

Zur besseren Handhabung des Analysenelementes können die Probenaufgabezone und die Nach weiszone auf einem inerten, steifen Trägermaterial angeordnet sein. Für ein solches Träger material bieten sich alle inerten, ausreichend steifen Materialien, wie beispielsweise Glas, hydrophobierter Karton oder Polymermaterialien an. Bevorzugt werden steife Polymerfolien, die beispielsweise aus Metacrylat/Acrylat, Polystyrol oder Polycarbonat bestehen eingesetzt. Das Trägermaterial kann im übrigen transparent oder lichtundurchlässig sein.

In einem erfindungsgemäßen Analyseelement können Probenaufgabe- und Nachweiszone nebeneinander oder auch übereinander angeordnet sein.

Als Probenaufgabezone wird der Bereich des erfindungsgemäßen Analyseelementes bezeichnet, auf den die flüssige Probe aufgegeben wird. Als Nachweiszone des erfindungsgemäßen Analyse elementes wird der Bereich verstanden, in dem in Anwesenheit des Analyts ein Signal gebildet wird, das mit der Menge des Analyten korreliert.

Die für die Bestimmung der Menge eines Analyten erforderlichen Reagenzien können in der Nachweiszone auf mehrere Schichten aufgeteilt vorliegen. Dies erweist sich insbesondere dann als vorteilhaft, wenn bestimmte Reagenzien miteinander unverträglich sind und so nicht inner halb einer Schicht untergebracht sein können. Die Nachweiszone enthält mindestens ein Enzym und eine Indikatorsubstanz, welche wie vorstehend ausgeführt beide innerhalb oder auf einer Schicht vorliegen können oder sich in oder auf verschiedenen Schichten befinden können. Als Enzym wird hierbei ein Protein verstanden, das zusammen mit einer prostetischen Gruppe oder einem Coenzym eine Reaktion katalysiert, an der der Analyt oder eine vom Analyt abgeleitete Substanz teilnimmt. Beim Nachweis von Glucose kann das Enzym beispielsweise Glucose oxidase sein. Beim Nachweis von Triglyceriden kann dieses Enzym beispielsweise auch Glycerinkinase sein, welches eine Reaktion der vom Analyt Triglycerid abgeleiteten Substanz Glycerin katalysiert. Vom Analyt abgeleitete Substanzen sind in der Regel solche, die durch enzymatische oder nicht-enzymatische Reaktion aus der zu bestimmenden Substanz gebildet wurden und deren Menge mit der Menge des Analyten korreliert werden kann.

Als Indikatorsubstanzen werden solche Materialien bezeichnet, die mit einer vom Analyt abgeleiteten Substanz ein Signal bilden, das mit der Menge des Analyten korreliert. Als Indikatorsubstanzen können erfindungsgemäß insbesondere solche Erfindungen eingesetzt werden, die eine Farbe bilden, ihre Farbe verlieren oder ihre Farbe ändern oder die bei Einsatz des erfindungsgemäßen Analyseelementes in Anwesenheit des Analyten Fluoreszenz verlieren oder Fluoreszenz bilden. Solche Indikatorsubstanzen sind erfindungsgemäß jedoch bevorzugt, die eine Farbe bilden, ihre Farbe verlieren oder ihre Farbe ändern. Solche Substanzen werden auch als chromogen bezeichnet.

Das erfindungsgemäße Analyseelement enthält eine flüssigkeitsdurchlässige Entstörschicht in direktem Kontakt mit der Nachweiszone. Die Entstörschicht ist so angeordnet, daß Flüssigkeit erst nach Durchlaufen der Entstörschicht in die Nachweiszone gelangt. Entstörschicht und Nachweiszone können hierbei nebeneinander oder übereinander angeordnet sein. Die Entstör schicht kann die Probenaufgabezone darstellen, wenn flüssige Probe direkt auf die Entstörschicht aufgegeben wird. Entstörschicht und Probenaufgabezone können jedoch voneinander auch räumlich getrennt sein. So können Probenaufgabezone und Entstörschicht ebenfalls stapelartig übereinander oder nebeneinander angeordnet sein, wenn Probenaufgabezone und Entstörschicht nicht identisch sind.

Erfindungsgemäß enthält die Entstörschicht mindestens ein Enzym, das eine Reaktion des zu bestimmenden Analyten oder einer vom Analyten abgeleiteten Substanz katalysiert und wobei Endprodukte erhalten werden, die nicht zur Signalbildung durch die Indikatorsubstanz beitragen können. Erfindungsgemäß werden folglich in der Entstörschicht aus dem Analyt oder einer vom Analyt abgeleiteten Substanz am Ende der enzymatischen Entstörreaktion solche Endprodukte erhalten, die mit der Indikatorsubstanz keine Signalbildung ergeben können. Wenn die Indikator substanz beispielsweise mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase einen Farbstoff bildet, wird in der Entstörschicht Analyt oder vom Analyt abgeleitete Substanz enzymatisch so umgesetzt werden müssen, daß letztendlich kein Wasserstoffperoxid in der Entstörschicht verbleibt. Sollte in der Entstörschicht enzymatisch Wasserstoffperoxid gebildet werden, muß dieses in der Entstörschicht enzymatisch weiter umgesetzt werden, so daß Wasserstoffperoxid nicht als Endprodukt in der Entstörschicht verbleibt. Beispielsweise kann eine Wasserstoff peroxid produzierende Reaktion mit einer Wasserstoffperoxid verbrauchenden Reaktion gekoppelt werden. Katalase oder Peroxidase bieten sich als Wasserstoffperoxid zersetzende Proteine hierfür an.

Wird in der Nachweiszone eine Indikatorsubstanz eingesetzt, die statt Sauerstoff als Elektronen aufnehmende Substanz von Redoxenzymen, wie beispielsweise Oxidasen akzeptiert wird, ist es möglich, in der Entstörschicht ein Wasserstoffperoxid produzierendes Reaktionssystem unter zubringen. Substanzen, die an Stelle von Sauerstoff als Elektronen aufnehmende Substanzen von Redoxenzymen akzeptiert werden, sind beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung 0 354 441 beschrieben. Solche Substanzen werden durch Wasserstoffperoxid nicht weiter beeinflußt.

Falls als Indikatorsubstanz ein Chromogen eingesetzt wird, versteht es sich von selbst, daß in der Entstörschicht solche Endprodukte gebildet werden, die mit der Farbbildung oder Farbverän derung der Indikatorsubstanz nicht interferieren. Bei einer Farbbildung der Indikatorsubstanz in Anwesenheit des Analyten ist es vorteilhaft, wenn die in der Entstörschicht gebildeten Endpro dukte farblos sind.

Wird in der enzymhaltigen Schicht der Nachweiszone ein Coenzym abhängiges Enzym einge setzt, befindet sich in dem erfindungsgemäßen Analyseelement das erforderliche Coenzym bevorzugt ebenfalls in der selben Schicht der Nachweiszone.

Während in der Nachweiszone die für die Bestimmung des Analyts erforderlichen Reagenzien auf mehrere Schichten, wie vorstehend ausgeführt, aufgetrennt sein können, hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn in dem erfindungsgemäßen Analyseelement die Entstör schicht und eine Enzym- und Indikatorsubstanz enthaltende Schicht der Nachweiszone in direktem Kontakt miteinander angeordnet sind. Unter Umständen ist es sogar möglich, daß für die Bestimmung von Analyt erforderliche Substanzen, die nicht in der gleichen Schicht der Nachweiszone, die Enzym und/oder Indikatorsubstanz enthält, untergebracht sind, sich ebenfalls in der Entstörschicht befinden.

Wie bereits zuvor ausgeführt, kann die Entstörschicht die Probenaufgabezone darstellen, wenn flüssige Probe direkt auf die Entstörschicht aufgegeben wird. Es kann sich jedoch auch als zweckmäßig erweisen, daß die zu bestimmende Probe nicht direkt auf die Entstörschicht aufge geben wird, sondern auf eine vor der Entstörschicht angeordnete Probenaufgabezone. Dies kann sich insbesondere dann als vorteilhaft erweisen, wenn beispielsweise partikelhaltige Flüssig keiten untersucht werden sollen, wie beispielsweise Blut. In solchen Fällen hat es sich als bevorzugt erwiesen, wenn die in der Flüssigkeit enthaltenen Partikel, beispielsweise Blutzellen, wie Erythrozyten, in der Probenaufgabezone abgetrennt und zurückgehalten werden, bevor die verbleibende Flüssigkeit in die Entstörschicht gelangt. Für solche Fälle hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn als Probenaufgabezone faserige Matrixmaterialien, insbesondere Vliese, ganz bevorzugt Glasfaservliese, wie sie beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung 0 045 476 beschrieben sind, eingesetzt werden.

In einem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren wird ein wie vorstehend beschriebenes Analyseelement verwendet. Hierbei wird vorteilhafterweise Flüssigkeit undosiert auf die Probenaufgabezone aufgegeben. Dies ist dann möglich, wenn als Nachweiszone ein solches Matrixmaterial verwendet wird, das genau definierte Flüssigkeitsvolumina aufzunehmen in der Lage ist. Solche Materialien sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise sind Membranen käuflich erhältlich, die diese Bedingung erfüllen. Es können aber auch Filme eingesetzt werden, wie sie beispielsweise aus der europäischen Patentanmeldung 0 016 387 bekannt sind.

Von der Probenaufgabezone gelangt Flüssigkeit durch die Entstörschicht in die Nachweiszone, wo die Indikatorsubstanz bei Anwesenheit des Analyten ein Signal bildet, das mit der Menge des Analyten korreliert. Das Signal kann apparativ gemessen werden. Im Falle einer Farbbildung, Farbverminderung oder Farbänderung kann das Signal apparativ, beispielsweise reflektro metrisch aber auch visuell festgestellt bzw. vermessen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Flüssigkeit mittels eines erfindungsgemäßen Analyseelementes läßt sich vor allem dann vorteilhaft durchführen, wenn so viel Flüssigkeit auf die Probenaufgabezone des Analysenelementes aufgegeben wurde, daß überschüssige Flüssigkeit in der Entstörschicht und gegebenenfalls in der Probenaufgabezone verbleibt. In solchen Fällen werden mit Analysenelementen des Standes der Technik oft falsch positive Resultate erhalten oder ein Ende der signalbildenden Reaktion ist nicht klar erkennbar, weil Analyt aus der überstehenden Flüssigkeit in die Nachweiszone nachdifundiert. Demgegen über sind das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Analyseelement besonders deshalb bei der Verwendung undosierter Flüssigkeitsproben vorteilhaft einsetzbar, weil keine überhöhten Ergebnisse gefunden werden und das Ende der Nachweisreaktion deutlich dadurch erkennbar ist, daß ab einem bestimmten Zeitpunkt keine wesentliche weitere Signalveränderung mehr eintritt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und erfindungsgemäßen Analyseelement werden Resultate erzielt, die mit denen der naßchemischen Standardverfahren gut korrelieren. Dies trifft insbesondere zu für die Bestimmung von Triglyceriden und Glucose.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Analyseelementes und des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vor allem dadurch erzielt, daß eine Schicht in einem mehrschichtigen Analysenelement verwendet wird, die einen zu bestimmenden Analyt oder eine hiervon abgeleitete Substanz zu Produkten umsetzt, die nicht zur Signalbildung in dem mehrschichtigen Analysenelement beitragen. Hierdurch wird ein Nachdiffundieren von Analyt aus anderen Zonen in die Zone des Analysenelementes, in der der Nachweis des Analyten stattfinden soll, verhindert. Dieser Effekt tritt insbesondere dann ein, wenn die Nachweiszone mit Flüssigkeit gefüllt ist, überschüssige Flüssigkeit sich jedoch noch in anderen Zonen des Analysenelementes befindet.

Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Analysenelementes sind in Fig. 1-5 dargestellt. In Fig. 6 ist der Reaktionsverlauf (gemessen in % Reflexion gegen die Zeit in Sekunden) in verschiedenen Analysenelementen in einem Graph gezeigt.

Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Analysenelement, in dem Probenaufgabezone (1) und Nachweiszone (2) übereinander, stapelartig angeordnet sind. In der Probenaufgabezone (1) befindet sich die Entstörschicht (3). In der Nachweiszone (2) befindet sich die Indikatorsubstanz enthaltende Schicht (4).

In Fig. 2 ist ein erfindungsgemäßes Analysenelement dargestellt, bei dem Probenaufgabezone (1) und Nachweiszone (2) nebeneinander angeordnet sind. Auch hier befindet sich die Entstör schicht (3) in der Probenaufgabezone (1). Die Indikatorsubstanz enthaltende Schicht (4) befindet sich in der Nachweiszone (2). In dem Analysenelement gemäß Fig. 2 stehen die Entstörschicht (3) und die Indikatorsubstanz enthaltende Schicht (4) über ihre Kanten miteinander in Kontakt. Um einen Flüssigkeitsübergang zwischen den beiden Schichten zu gewährleisten ist es auch möglich, die Schichten leicht überlappen zu lassen.

Während ein Analysenelement gemäß Fig. 1 vorteilhafterweise von der Nachweiszone her, das heißt, von der der Probenaufgabeseite gegenüberliegenden Seite vermessen wird, ist es in einem Analysenelement gemäß Fig. 2 grundsätzlich möglich, eine Signalbildung in der Nachweiszone von der gleichen Seite wie die Probenaufgabeseite oder von der der Probenaufgabeseite gegen überliegenden Seite der Nachweiszone zu messen. In letzterem Fall ist dies dann, wenn die Schichten (3, 4) zur besseren Handhabung auf einem inerten Trägermaterial befestigt sind nur dann möglich, wenn das inerte Trägermaterial zumindest im Bereich der Nachweiszone trans parent ist oder eine Öffnung aufweist, so daß die Indikatorsubstanz enthaltende Schicht (4) frei sichtbar ist.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Analysenelement ist in Fig. 3 dargestellt. In diesem Analysenelement ist ein mehrschichtiger stapelartiger Aufbau beispielsweise mittels Schmelz kleber (7) auf einem Trägermaterial (5) befestigt. Auf dem Trägermaterial (5), das sowohl transparent als auch nicht für Licht durchlässig sein kann, ist eine Folie (6) angeordnet, die lichtdurchlässig sein soll. Hierfür eignet sich beispielsweise eine transparente Polycarbonatfolie. Auf dieser Folie (6) ist eine Indikatorsubstanz enthaltende Schicht (4), darüber eine Entstör schicht (3) und als oberste Schicht eine Partikel zurückhaltende Schicht (8) angeordnet. Die transparente Folie (6) und die darüberliegende Indikatorsubstanz enthaltende Schicht (4) ist durch eine Öffnung in dem Trägermaterial (5) sichtbar.

Der Aufbau eines solchen Analysenelementes ist besonders für die Bestimmung eines Analyten in Vollblut geeignet. Damit Erythrozyten als in Vollblut enthaltene Partikel in Schicht (8) zurückgehalten werden, hat sich dort eine faserige Schicht, insbesondere ein Glasfaservlies, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 045 476 beschrieben als vorteilhaft herausgestellt. Für die Entstörschicht (3) haben sich multifile Gewebe oder Vliese als besonders bevorzugt erwiesen, beispielsweise Papier oder auch Seidengewebe. Für die darunter liegende, Indikator substanz enthaltende Schicht (4), ist eine poröse Membran gut geeignet. Als besonders vorteil haft haben sich jedoch Filme erwiesen, wie sie beispielsweise in der europäischen Patentan meldung Nr. 0 016 387 beschrieben sind, die die Indikatorsubstanz sowie weitere erforderliche Reagenzien, wie das notwendige Enzym, inkorperiert enthalten. Solche Filme können direkt auf einer transparenten Folie, wie beispielsweise einer Polycarbonatfolie, die als Folie (6) in dem bevorzugten erfindungsgemäßen Analyseelement verwendet wird, erzeugt werden. Die Entstör schicht (4) kann im Falle eines multifilen Gewebes oder Vlieses die notwendigen Substanzen besonders vorteilhaft imprägniert enthalten. Alternativ ist es jedoch auch möglich, daß auf eine Folie (6) ein Film als Indikatorsubstanz enthaltende Schicht (4) wie vorstehend beschrieben aufgebracht wird und darauf ein weiterer Film als Entstörschicht (3) in einem weiteren Beschich tungsverfahren aufgebracht wird.

Ein Analysenelement, wie es in Fig. 3 dargestellt ist, eignet sich gut zur Bestimmung der Menge von Triglycerid in Blut, wobei folgende enzymatische Reaktionen durchlaufen werden:

In der Indikatorsubstanz enthaltenden Schicht (4) befindet sich ein Chromogen, das in Gegenwart von Peroxidase und H₂O₂ einen Farbstoff bildet. Als Chromogen können hierfür beispielsweise Diarylimidazole eingesetzt werden, wie sie aus der europäischen Patentanmeldung 0 161 436 bekannt sind. Glycerinkinase und Glycerinphosphatoxidase befinden sich neben ATP ebenfalls in der Indikatorsubstanz enthaltenden Schicht (4) und sorgen für die enzymatische Umsetzung von Glycerin in Gegenwart von Luftsauerstoff zu H₂O₂, welches dann mit dem Chromogen ein Farbsignal bildet. Glycerin ist eine von dem zu bestimmenden Analyt Triglycerid abgeleitete Substanz, die durch Esterase aus Triglycerid erzeugt wird. Die Menge an Glycerin und letzt endlich die Menge an H₂O₂ korreliert mit der Menge an ursprünglich anwesendem Triglycerid in der Probe. In Blutproben, die auf Triglycerid hin untersucht werden sollen, befindet sich jedoch auch freies Glycerin. Wird ein undosiertes Blutvolumen auf das Analyseelement gemäß Fig. 3 auf die partikelzurückhaltende Schicht (8) so aufgegeben, daß die Indikator enthaltende Schicht (4) mit Flüssigkeit gesättigt ist und ein Überschuß an Flüssigkeit in den darüber liegen den Schichten verbleibt, so bestünde die Gefahr, daß dort vorliegendes, freies Glycerin im Verlauf der für das Bestimmungsverfahren erforderlichen Zeit in die Indikatorsubstanz enthal tende Schicht (4) nachdifundiert und dort ebenfalls über die beschriebenen enzymatischen Reaktionen zu einem Farbsignal führt, das letztendlich einen höheren Wert an Triglycerid vortäuscht, als tatsächlich vorliegt. Diese Nachdiffusion freien Glycerins aus über der Indikator substanz enthaltenden Schicht (4) angeordneten Schichten wird dadurch verhindert, daß in der Entstörschicht (3) die Enzym Glycerinkinase, Glycerinphosphatoxidase, Peroxidase und ATP untergebracht sind, die Glycerin über Dihydroxyaceton und H₂O₂ zu Dihydroxyaceton und Wasser abbauen. Damit werden Substanzen erzeugt, die nicht zur Signalbildung durch die Indikatorsubstanz beitragen können. Die Triglyceridwerte, die so erhalten werden, stimmen sehr gut mit Referenzmethoden überein.

Ein erfindungsgemäßes Analyseelement, wie es in Fig. 3 dargestellt ist, kann auch sehr gut zur Bestimmung von Glucose in Blut verwendet werden. Hierbei befinden sich in der die Indikator substanz enthaltenden Schicht (4) Glucoseoxidase und eine Substanz, die statt Sauerstoff Elek tronen von dem Redoxenzym auf eine ebenfalls in Schicht (4) befindliche Indikatorsubstanz zu übertragen vermag. Solche Reaktionssysteme sind beispielsweise aus der europäischen Patent anmeldung Nr. 0 431 456 bekannt. In einer über Schicht (4) befindlichen Entstörschicht kann sich beispielsweise Glucoseoxidase befinden. So wird dann, wenn die Schicht (4) mit Flüssigkeit gefüllt ist in der darüber befindlichen Flüssigkeit Glucose mittels Glucoseoxidase zu H₂O₂ umgesetzt, das nicht mehr mit dem Indikatorsystem, das sich in der darunterliegenden Schicht (4) befindet, interferiert. So kann beispielsweise ein Analyseelement zur Bestimmung von Glucose hergestellt werden, daß innerhalb kurzer Zeit zu einem Reaktionsende kommt und keinen Reak tionsschleich aufweist.

Fig. 4 zeigt ein erfindungsgemäßes Analysenelement, bei dem im Vergleich zu dem Element gemäß Fig. 3 die Abfolge der Schichten (8) und (3) vertauscht ist. Probe gelangt hier zuerst auf die Entstörschicht (3) und geht dort entsprechende Reaktionen ein, bevor die durch die Schichten wandernde Flüssigkeit auf und in die Partikel zurückhaltende Schicht (8) gelangt.

In Fig. 5 ist ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Analysenelement dargestellt. Dieses Analysenelement kommt im Vergleich zu den Analysenelementen gemäß Fig. 3 und 4 ohne eine extra Schicht (8) aus, die Partikel, wie beispielsweise Erythrozyten, aus der Probe zurück hält. Hier übernimmt die Entstörschicht (3) zusätzlich diese Aufgabe der Erythrozytenab trennung.

Entstörschicht (3) und Indikatorsubstanz enthaltende Schicht (4) können als aufeinander beschichtete Filme gestaltet sein, wie sie beispielsweise aus EP-A 0 821 234 bekannt sind. In den folgenden Beispielen wird die Erfindung noch näher erläutert.

Beispiel 1 Analyseelement zur Bestimmung von Triglycerid gemäß Fig. 3 Indikatorsubstanz enthaltende Schicht

Eine Reagenzienmasse, bestehend aus
67,0 g Wasser
0,14 g Kaliumdihydrogenphosphat
1,15 g di-Natriumhydrogenphosphat-dihydrat
2,0 g Copolymer aus Methylvinylether und Maleinsäure (Gantrez S 97)
4,5 g Natriumhydroxid
0,8 g Netzmittel (Triton® X 100)
0,5 g Netzmittel (Dioctylnatriumsulfosuccinat) in 2,1 g Aceton
1,7 g Titandioxid
15,0 g Kieselgur
6,6 g 50%ige Polyvinylpropionat-Dispersion (Propiofan 70D der BASF, Ludwigshafen, Deutschland)
0,6 g Magnesiumsulfat-heptahydrat
0,7 g 2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4(5)-(4-dimethylaminophenyl)-5(4)-methyl- (1H)-imidazol-dihydrochlorid (EP-A-0 161 436)
9,5 kU Peroxidase (aus Meerrettich)
13,0 kU Cholesterinesterase
15,0 kU Glycerinkinase
6,2 kU Glycerinphosphatoxidase
10 mg 1-(4-Methylphenyl)-semicarbazid in 0,25 g 1-Methoxy-2-propanol
wird in einer Dicke von 0,2 mm auf eine Polycarbonatfolie (Schicht (6) gemäß Fig. 3) beschichtet und 40 Minuten bei 50°C getrocknet. Hieraus werden Streifen von 6 mm Breite geschnitten und als Reagenzienfilm (Indikatorsubstanz enthaltende Schicht (4)) in Teststreifen gemäß Fig. 3 eingebaut.

Entstörschicht

Mit einer Tränklösung aus
2500,0 g Wasser
0,95 g Kaliumdihydrogenphosphat
37,4 g di-Natriumhydrogenphosphat-dihydrat
26,0 g di-Natriumadenosin-5'-triphosphat-trihydrat
26,0 g Magnesiumsulfat-heptahydrat
1,6 MU Glycerinkinase
1,2 MU Glycerinphosphatoxidase
21,0 MU Peroxidase
wird Seidengewebe (Typ 541 der Fa. Spinnhütte, Celle, Deutschland) bzw. Schablonenpapier (15 g/m² der Fa. Schöller, Deutschland) imprägniert und 30 Minuten bei 50°C getrocknet.

Hieraus werden Streifen von 6 mm Breite geschnitten und als Entstörschicht (3) in Teststreifen der Fig. 3 eingebaut.

Als Trägerfolie (Schicht (5) gemäß Fig. 3) diente weißpigmentierte Polyesterfolie von 0,35 mm Stärke der Firma Pütz-Folien, Taunusstein-Wehen, Deutschland.

Über der Entstörschicht wurde als Erythrozyten zurückhaltende Schicht (8) ein 6 mm breites Glasfaservlies, wie es in den Beispielen der EP-A 0 045 476 beschrieben ist, befestigt. Im folgenden wurde auf 4 Teststreifenaufbauten EDTA-Venenblut (nativer TG-Gehalt 93 mg/dl, nativer Glyceringehalt unbekannt), das sukzessive um 2, 4, 8 und 16 mg Glycerin/dl aufgestockt wurde, gegeben:

a) Analyseelement mit obiger Nachweisrezeptur ohne Entstörschicht: Bereits ein Zusatz von 2 mg Glycerin/dl bewirkt eine falsch positive Anzeige um 74% (der zu erwartende Anstieg von 2 mg Glycerin = 17 mg Triglycerid (TG) wurde berücksichtigt). Weiterer Glycerinzusatz verstärkt die falsch positive Anzeige; die Abnahme bei Zusatz von 16 mg Glycerin/dl kommt durch das Ende des Meßbereichs des NW-TG-Streifens zustande (der Teststreifen ist "austitriert").
b) Teststreifen mit obiger Nachweisrezeptur mit Entstörschicht Schablonenpapier (Pufferpapier), das nur mit Puffer getränkt worden war: Gleicher Effekt wie ohne dieses Papier. Teststreifen, in die mit Puffer getränkte Seide eingelegt wurde, zeigen ebenfalls den gleichen Effekt.)
c) Teststreifen mit obiger Nachweisrezeptur mit Entstörschicht Schablonenpapier (Enzympapier), das mit obiger Tränklösung imprägniert worden war: Hier führen die Glycerinzusätze nur zu falschpositiven Anzeigen von 11 bis 33%. (Eine gleiche Entstörung wurde mit einem imprägniertem Papier beobachtet, das statt POD Katalase enthielt).
d) Teststreifen mit obiger Nachweisrezeptur mit Entstörschicht Seide (Enzymseide), die mit obiger Tränklösung imprägniert worden war: Hier führen die Glycerinzusätze nur zu falsch positiven Anzeigen von 4 bis 29%. (Auch hier wurde eine gleiche Entstörung mit einer imprägnierten Seide beobachtet, die statt POD Katalase enthielt).

Tabelle 1

Die relativen Abweichungen beziehen sich auf einen berechneten Sollwert, der sich aus der Addition der gemessenen Triglyceridkonzentration bei 0 Glycerinzusatz und den Triglycerid(TG)-Äquivalenten des Glycerinzusatzes ergibt. Für 4 mg/dl Glycerinzusatz ergibt sich so für das Enzympapier folgende Berechnung der relativen Abweichung:

(143-{94 + 34}) : (94 + 34) = 12 %

Beispiel 2 Nachdiffusion von Glycerin in Analyseelementen zur Bestimmung von Triglycerid

Um nachzuweisen, daß die Nachdiffusion des Glycerins die Ursache für falsch positive Reaktion ist, wurden folgende Teststreifenaufbauten

a) Teststreifen Nr. 1 mit obiger Nachweisrezeptur gemäß Beispiel 1 und Fig. 3 ohne Entstörschicht
b) Teststreifen Nr. 2 analog Fig. 3 und Beispiel 1, jedoch ohne Entstörschicht und ohne Glasfaservlies
c) Teststreifen Nr. 3 mit Nachweisrezeptur gemäß Beispiel 1 und Fig. 3 mit Entstörschicht Seide, die mit Tränklösung, wie in Beispiel 1 beschrieben, imprägniert worden war

mit Humanserum der Triglyceridkonzentrationen von 5 und 150 mg/dl ohne und mit Glycerin aufstockung um 5 mg/dl getüpfelt (20 µl) und nach 2 min in einem Reflexionsphotometer ver messen. Der Teststreifen Nr. 2 ohne Entstörschicht und ohne Glasfaservlies wurde 5 Sekunden nach dem Tüpfeln mit einem Baumwollvlies trockengetupft. Durch Umrechnung mit einer Funktionskurve wurden die in folgender Tabelle zusammengestellten Triglyceridkonzentrationen (1 mg Glycerin entspricht 9,62 mg Triolein) gefunden:

Aus diesen Werten ist folgendes ersichtlich:

- Der Teststreifen Nr. 1 ohne Entstörschicht mißt bei Glycerinzusatz falsch positiv und zwar bei niedriger Triglyceridkonzentration stärker falsch positiv: + 126% bei 5 mg TG/dl, + 21% bei 198 mg TG/dl.
- Der Teststreifen Nr. 2 zeigt geringe falsch negative Abweichung.
- Der Teststreifen Nr. 3 mit Entstörschicht mißt korrekt.

Fazit: In Teststreifen Nr. 1 diffundiert aus der überstehenden Probe Glycerin nach und führt zu falsch positiven Werten. Bei Teststreifen Nr. 2 ist kein Überstand mehr vorhanden; die geringen falsch negativen Abweichungen sind dadurch zu erklären, daß der Reaktionsfilm sich bis zum Trockentupfen noch nicht völlig vollgesogen hat. Bei Teststreifen Nr. 3 wird das Glycerin des Überstandes im unmittelbar über dem Reaktionsfilm liegenden Seidengewebe enzymatisch umgesetzt und kann daher nicht in den Reaktionsfilm eindiffundieren.

Alle Teststreifen messen die Summe von Triglycerid und Glycerin, wie dies auch bei den üblichen Referenzmethoden der klinischen Chemie der Fall ist.

Beispiel 3 Analyseelement zur Bestimmung von Glucose

Eine Reagenzienmasse, bestehend aus
1500 g 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 6,2
46,0 g Polyvinylpyrrolidon 25000
16,0 g Tetraethylammoniumchlorid
11,2 g Polyxanthangummi (Keltrol F der Fa. Kelco International, Hamburg, Deutschland), gelöst in 780 g Wasser
15,3 g N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat
72,0 g Natrium-2,18-phosphormolybdat in 108 g Wasser
116,1 g 50%ige Polyvinylpropionat-Dispersion (Propiofan 70 D der BASF, Ludwigshafen, Deutschland)
2,5 g 4-Bis-(2-hydroxyethyl)-amino-nitrosobenzol-hydrochlorid (EP-A-0 354 441) in 75 g Wasser
8,8 MU Glucoseoxidase in 235 g Wasser,
wird in einer Dicke von 0,12 mm auf eine Polycarbonatfolie beschichtet und 20 Minuten bei 50°C getrocknet.

Danach wird diese beschichtete Folie mit folgender Reagenzienmasse, bestehend aus
1645 g 0,05 M Natriumcitratpuffer pH 6,2
116,0 g Titandioxid
29,7 g Polyvinylpyrrolidon 25000
10,2 g Tetraethylammoniumchlorid
13,1 g Polyxanthangummi (Keltrol F der Fa. Kelco International, Hamburg, Deutschland), gelöst in 760 g Wasser
9,9 g N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propansulfonat
46,4 g Natrium-2,18-phosphormolybdat in 93 g Wasser
74,7 g 50%ige Polyvinylpropionat-Dispersion (Propiofan 70 D der BASF, Ludwigshafen, Deutschland)
5,3 MU Glucoseoxidase in 150 g Wasser,
in einer Dicke von 0,12 mm zweitbeschichtet und 30 min bei 50°C getrocknet.

Hieraus werden Streifen von 6 mm Breite geschnitten und als Indikatorsubstanz enthaltender Reagenzienfilm in Teststreifen gemäß Fig. 3, der allerdings keine Entstörschicht enthält, eingebaut. Über dem Film wird als Erythrozyten zurückhaltende Schicht ein 6 mm breites Glasfaservlies, wie es in den Beispielen der EP-A 0 045 476 beschrieben ist, befestigt.

Es ergibt sich nach Aufgabe einer Glucose-enthaltenden Lösung, wie in Fig. 6 gezeigt, daß die Reaktionszeit dieses Glucoseteststreifens, der keine Entstörschicht enthält, für Vollblut auch nach 90 Sekunden noch nicht beendet ist.

Daher wurde entsprechend Fig. 3 ein Seidengewebe, (Typ 541 der Fa. Spinnhütte, Celle, Deutschland), in den Teststreifen zwischen Glasfaservlies und Indikatorsubstanz enthaltenden Film eingebaut, das mit einer Tränklösung aus
50 g 0,1 M Natriumcitratpuffer pH 6,0
130 kU Glucoseoxidase
imprägniert war und 30 Minuten bei 50°C getrocknet.

Nach Aufgabe einer Glucose-enthaltenden Lösung ist die Farbentwicklung in diesem Teststreifen jetzt nach 30 Sekunden abgeschlossen (siehe Fig. 6).

Claims

1. Analyseelement zur Bestimmung der Menge eines Analyten in Flüssigkeit enthaltend eine Probenaufgabezone (1) und eine Nachweiszone (2), die in flüssigkeitsüber tragendem Kontakt stehen, letztere enthaltend mindestens ein Enzym und eine Indikator substanz, wobei das Enzym eine Reaktion katalysiert, an der der Analyt oder eine vom Analyt abgeleitete Substanz teilnimmt und die Indikatorsubstanz bei Anwesenheit des Analyten ein Signal bildet, das mit der Menge des Analyten korreliert, und in direktem Kontakt mit der Nachweiszone eine flüssigkeitsdurchlässige Entstör schicht (3) so angeordnet enthaltend, daß Flüssigkeit erst nach Durchlaufen der Entstör schicht (3) in die Nachweiszone (2) gelangt, wobei die Entstörschicht mindestens ein Enzym enthält, das an einer Reaktion des zu bestimmenden Analyten oder einer vom Analyten abgeleiteten Substanz teilnimmt, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt oder die vom Analyt abgeleitete Substanz in der Entstörschicht enzymatisch zu Endprodukten umgesetzt wird, die nicht zur Signalbildung durch die Indikatorsubstanz beitragen können.

2. Analysenelement gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das von der Indi katorsubstanz in Anwesenheit des Analyten gebildete Signal eine Farbänderung ist.

3. Analysenelement gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Entstörschicht und Nachweiszone übereinander angeordnet sind.

4. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ent störschicht und die Enzym und Indikatorsubstanz enthaltende Schicht der Nachweiszone in direktem Kontakt miteinander angeordnet sind.

5. Analysenelement gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der Probenaufgabezone eine Schicht (8) angeordnet ist, die in der Flüssigkeit enthal tene Partikel zurückhält.

6. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Entstörschicht die Probenaufgabezone ist.

7. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß in der Entstörschicht gebildetes Endprodukt farblos ist.

8. Analysenelement gemäß einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymhaltige Schicht der Nachweiszone das erforderliche Coenzym enthält, wenn das Enzym der Nachweisschicht coenzymabhängig ist.

9. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Flüssigkeit mittels eines mehrschichtigen Analysenelementes gemäß einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß Flüssig keit undosiert auf die Probenaufgabezone (1) aufgegeben wird, Flüssigkeit durch die Ent störschicht (3) in die Nachweiszone (2) gelangt und dort die Menge an Analyt in der Flüssigkeit bestimmt wird, wobei die Nachweiszone (2) mit Flüssigkeit gefüllt ist und überschüssige Flüssigkeit in der Entstörschicht (3) und gegebenenfalls in der Probenbauf gabezone (1) verbleibt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Entstörschicht (3) zumindest teilweise von der zu untersuchenden Flüssigkeit durchlaufen wird, bevor das Enzym der Entstörschicht (3) zu wirken beginnt.

11. Verwendung einer Schicht in einem mehrschichtigen Analysenelement, die einen zu be stimmenden Analyt oder eine hiervon abgeleitete Substanz zu Produkten umsetzt, die nicht zur Signalbildung in diesem mehrschichtigen Analysenelement zur Bestimmung dieses Analyten beitragen, zur Verhinderung der Nachdiffusion von Analyt aus anderen Zonen in die Zone des Analysenelementes, in der der Nachweis des Analyten stattfinden soll, wenn die Nach weiszone mit Flüssigkeit gefüllt ist.