DE69623522T2

DE69623522T2 - Chemischer Zeitsetzer für einen direktablesbaren Reagenzteststreifen

Info

Publication number: DE69623522T2
Application number: DE69623522T
Authority: DE
Inventors: Ernest J. Kiser; Michael F. Tomasco
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 1995-03-27
Filing date: 1996-03-26
Publication date: 2003-05-28
Anticipated expiration: 2016-03-27
Also published as: CA2172681A1; EP0735369A1; JPH08297124A; CN1130561C; EP0735369B1; DK0735369T3; NO961218L; KR960034431A; ATE224059T1; TW450997B; DE69623522D1; ES2182945T3; AU4812696A; JP3491863B2; NO961218D0; AU706456B2; CN1143763A; PT735369E

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die ein Zeitintervall chemisch bestimmt, insbesondere ein Intervall, in dem ein Teststreifen die Konzentration eines Analyten in einer biologischen Lösung mißt.

2. Beschreibung des verwandten Stands der Technik

Viele visuelle Testvorrichtungen sind zum Messen der Konzentration von bestimmten Analyten in biologischen Lösungen entwickelt worden. Diese Vorrichtungen haben zum Beispiel Glucose, Cholesterin, Proteine, Ketone, Phenylalanin oder Enzyme in Blut, Urin oder Speichel gemessen.
Trockenphasen-Reagenzstreifen, die Zusammensetzungen auf Enzymgrundlage beinhalte, werden in großem Umfang in klinischen Laboratorien, Arztpraxen, Krankenhäusern und Privathaushalten verwendet, um Proben biologischer Flüssigkeiten auf Glucosekonzentration zu testen. In der Tat sind Reagenzstreifen eine alltägliche Notwendigkeit für viele Diabetiker der mehreren Millionen Diabetiker, die es im Lande gibt, geworden. Da Diabetes gefährliche Anomalien in der Chemie des Blutes verursachen kann, kann es zum Verlust des Augenlichts, Nierenversagen und anderen ernsthaften medizinischen Konsequenzen beitragen. Um das Risiko dieser Konsequenzen zu minimieren, müssen die meisten Diabetiker sich selbst periodisch testen, dann ihre Glucosekonzentration entsprechend anpassen, zum Beispiel durch eine Kontrolle ihrer Ernährung und/oder mit Insulininjektionen. Einige Patienten müssen ihre Blutglucosekonzentration bis zu viermal täglich oder häufiger testen.
Es ist insbesondere wichtig für Diabetika, die ihre Ernährung kontrollieren müssen, um die Zuckerauf¬ nähme zu regulieren, und/oder Insulininjektionen verabreichen müssen, und die in dieser Hinsicht durch häufige Tests der Blutglucosekonzentration geleitet werden müssen, schnelle, billige und genaue Reagenzstreifen für die Glucosebestimmung zu haben.
Es ist bekannt, daß Reagenzstreifen einen Indikator enthalten, der eine andere Färbung annimmt, ab¬ hängig von der Konzentration der Glucose in einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgebracht worden ist. Obwohl einige dieser Streifen Reduktionschemie verwenden, beinhalten sie häufiger einen oxidierbaren Farbstoff oder ein Farbstoffpaar. Einige der Streifen schließen ein Enzym, wie etwa Glucoseoxidase ein, das in der Lage ist, Glucose zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid zu oxidieren. Sie enthalten ebenso einen oxidierbaren Farbstoff und eine Substanz mit peroxidierender Aktivität, die in der Lage ist, selektiv die Oxidation des oxidierbaren Farbstoffs in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid zu katalysieren. (Siehe zum Beispiel US Pat. Nr. 5306,623.)
US Pat. Nr. 3,964,871, erteilt am 22. Juni 1976 an Hochstrasser, offenbart einen wegwerfbaren Indika¬ torstreifen zum direkten Messen von Substanzen, wie etwa Glucose, in biologischen Flüssigkeiten. Der Indikator registriert die Konzentration der Substanz, dadurch, daß er sowohl ein Indikatorreagenz beinhaltet, das oxidiert wird und seine Farbe verändert, wenn es mit der Substanz reagiert, als auch einen "Antagonisten", der auf eine bestimmte Art die Akkumulation des oxidierten Indikators verhindert, bis er vollständig aufgebraucht worden ist.
Palmer et al. offenbaren ein "digitales" quantitatives Assaysystem für Glucose und andere Analyten in der europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. 0 317 070, veröffentlicht am 24. Mai 1989 (siehe ebenso US Pat Nr. 5,036,000, erteilt am 30. Juli 1991). Dieses System mißt die Konzentration einer organischen Verbindung in einer biologischen Flüssigkeit, indem zuerst die Verbindung mit einem Substrat-spezifischen Oxidaseenzym oxidiert wird, um Wasserstoffperoxid zu erzeugen. Das System beinhaltet ein Chromogen, das ein Reduktionsmittel von Wasserstoffperoxid ist, und ein an der Luft stabiles Reduktionsmittel für Wasserstoffperoxid, das ein größeres Reduktionspotential hat. Das größere Reduktionspotential verzögert jegliche nachweisbare Farbveränderung durch das Chromogen, bis zuerst das an der Luft stabile Reduktionsmittel für Wasserstoffperoxid aufgebraucht worden ist. Daher erfolgt keine Farbveränderung, wenn das zu messende Wasserstoffperoxid weniger als eine vorbestimmte Konzentration hat, die der Konzentration des an der Luft stabilen Peroxid-Reduktionsmittels entspricht. Als ein Resultat näßt das System die Konzentration quantitativ, unabhängig von der Intensität der Farbveränderung.
Ismail et al., US Pat. Nr. 4,649,122 erteilt am 10. März 1987, offenbaren eine Brauchbarkeitstestvorrichtung, die die Brauchbarkeit einer Testzusammensetzung zum Bestimmen der bestätigt. Die Brauchbarkeit wird durch Anfeuchten der Vorrichtung gemessen. Bei Anfeuchten mit Wasser verändert der Test seine Farbe oder durchläuft eine andere Veränderung, um dem Benutzer zu bestätigen, daß der Streuen brauchbar ist.
Ob der Test zuhause, in einer Arztpraxis, einer Klinik oder einem Krankenhaus durchgeführt wird, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Glucosebestimmung sind extrem wichtig. Im Falle eines farbanzeigenden Reagenzstreifens ist es wünschenswert, daß die Farbveränderung deutlich und gegenüber Variationen hinsichtlich der in der biologischen Flüssigkeit enthaltenen Verbindungen, die nicht Glucose sind, unempfindlich ist. Im Falle eines visuell abgelesenen Reagenzstreifens ist es besonders wichtig, daß Diabetiker, die an einer Sehschwäche leiden, ein Testreagenz haben, das eine signifikante Farbveränderung, abhängig von der Gluccsekonzentration, auf weist, obwohl die Farbveränderung, wie sie sich in einer Änderung der Extinktion bei einer gegebenen Wellenlänge äußert, ebenso für die Genauigkeit von durch Meßgeräte abgelesenen Streifen ist.
Da die Farbveränderung eine Reihe an chemischen Reaktionen beinhaltet, erfolgt sie nicht sofort. Daher muß der Benutzer eine Zeitdauer warten - typischerweise eine Minute oder weniger - , damit die Reaktionen stattfinden. Wenn ein Meßgerät den Streifen abliest, kann eine Zeitschaltungstechnik ein Signal geben, das anzeigt, daß die Reaktionen abgelaufen sind. Wenn jedoch ein Streifen visuell abgelesen wird, ohne ein Meßgerät, kann der Benutzer die benötigte Zeit unterschätzen, den Strafen vorzeitig und ein unkorrektes Resultat erhalten. Alternativ kann der Benutzer das Bedürfnis empfinden, eine übermäßig lange Zeit vor dem Ablesen des Streifens abzuwarten, um sicher zu sein, daß die Reaktion abgelaufen ist, was eine unnötige Verzögerung und Unzufriedenheit beim Benutzer verursacht. Es gibt somit einen Bedarf für einen "chemischen" Zeitsetzer, d. h. ein Element auf dem Streifen, das seine Farbe verändern wird, ohne Rücksicht auf die Konzentration der Glu¬ cose (oder eines anderen interessierenden Analyten) in der Probe, dies aber nur tun wird, nachdem eine ausreichende Zeit abgelaufen ist, damit die farbbildenden Reaktionen mit der Probe ablaufen konnten.

Zusammenfassung der Erfindung

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung macht ein chemischer Zeitsetzer für einen direkt ablesbaren Reagenzteststreifen zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit es einem Benutzer des Reagenzteststreifens möglich, sicher zu sein, daß er oder sie lange genug gewartet hat, um einen richtigen Meßwert zu bekommen, ohne daß erforderliche wäre, daß der Benutzer eine außerordentlich lange Zeit wartet. Der Zeitsetzer umfaßt eine trockene Beschichtung aus
a) einer Indikatorzusammensetzung,
b) einem Reagenz, das in hydratisiertem Zustand in der Lage ist, mit Glucose zu reagieren, um die Farbe des Indikators zu verändern,
c) einem Inhibitor, um die Farbveränderung des Indikators zu inhibieren, und
d) Glucose,
wobei die Inhibitor- und Glucose-Konzentrationen in der trockenen Beschichtung so ausgewählt sind, daß die Glucose über eine vorher bestimmte Zeit, nachdem die biologische Flüssigkeitsprobe auf den Streifen aufgebracht worden ist, mit dem Reagenz reagiert, um die Farbe des Indikators zu verändern.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Herstellen eines chemischen Zeitsetzeis für einen direkt ablesbaren Reagenzteststreifen zum Messen der Konzentration eines Ana¬ lyten in einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgebracht wird, die Schritte
a) Auftragen einer Lösung eines Reagenz, das in hydratisierten Zustand in der Lage ist, mit Glucose zu reagieren, auf eine poröse Membran,
b) Trocknen der Beschichtung, um eine aste Schicht zu bilden,
c) Aufträgen, auf die eiste Schicht, einer zweiten Schicht, die enthält,
(i) Glucose,
(ii) einen Indikator, der mit dem Reaktionsprodukt des Reagenz und der Glucose reagieren kann, um eine Farbveränderung zu verursachen, und
(iii) einen Inhibitor, um die Falbveränderung des Indikators zu inhibieren.
Beim Betrieb umfaßt ein Verfehlen zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit die Schritte
(a) Aufbringen da Flüssigkeit auf einen Teststreifen, der umfaßt
(i) eine Vielzahl von Ergebnissegmenten, von denen jedes seine Farbe verändert, wenn es mit einer Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, die wenigstens eine vorbestimmte Menge Analyt enthält, welche von der Menge Analyt unterschiedlich ist, die eine Farbveränderung der anderen Segmente verursacht, und
(ii) ein Zeitsetzersegment, das seine Farbe nach einer Zeit verändert, deren Dauer im wesentlichen unabhängig von der Menge Analyt in der Flüssigkeit ist, und
(b) Beobachten des Ergebnissegments, das als letztes seine Farbe verändert hat, wem das Zeitserzersegment seine Farbe verändert.
Der Streuen, ist von dem Typ, der einen sichtbaren Hinweis auf die Konzentration eines Analyten liefert, der in einer biologischen Flüssigkeit enthalten ist, die auf eine, "Probenseite" des Streifens aufgetragen wird. Die sichtbare Anzeige erscheint auf der gegenüberliegenden (oder "Test-") Seite des Streifens. Es gibt im allgemeinen eine Verzögerung zwischen der Zeit, warn die Flüssigkeitsprobe auf die Probenseite aufgetragen wird und wenn ein entsprechender sichtbarer Hinweis - typischerweise eine Farbveränderung - auf der Testseite erscheint. Deshalb kann, wenn der Benutzer nicht für wenigstens eine minimale Zeitlänge vor dem Ablesen wartet, das Ablesen einen nicht-korrekten Wert geben. Darüberhinaus kann die geeignete minimale Verzögerungszeit durch Veränderungen in der Umgebung oder der Streifenchemie beeinflußt werden, zum Beispiel Umgebungstemperaturen oder Alterungseffekte. Der chemische Zeitsetzer der vorliegenden Erfindung liefert dem Benutzer einen sichtbaren Hinweis darauf, wenn genügend Zeit seit dem Zeitpunkt verstrichen ist, zudem eine Flüssigkeitsprobe auf den Streifen aufgetragen wurde.
Die chemische Zusammensetzung des Teststreifens hängt natürlich von dem zu messenden Anaryten/biologischen Flüssigkeit ab. Die Teststreifen können so angelegt sein, daß sie Analyte, wie Glucose oder andere Zucker, Cholesterin, Proteine, Ketone, Harnsäure, Phenylalanin oder Enzyme in biologischen Flüssigkeiten wie Blut, Urin und Speichel sowie Wasser, nachweisen. Ein chemischer Zeitsetzer für einen Reagenzteststreifen ist im allgemeinen dafür angepaßt, auf dieselbe Kombination Analyt/biologische Flüssigkeit wie der Reagenzteststreifen selbst zu antworten, muß dies aber rächt. Die chemische Zeitsetzerzusammensetzung muß in trockener Form stabil sein, und jegliche Alterung der Zeitsetzerchemie würde mit der Alterung des Reagenz und der Indikatorchemie gleich laufen. Der Einfachheit und Kürze halber weisen der Zeitsetzer und die Reagenzteststreifen, die in den größten Einzelheiten in dieser Beschreibung offenbart worden sind, Glucose im Blut nach. Ein Durchschnittsfachmann kann die Information in dieser Offenbarung in leichter Weise zum Nachweis von anderen Kombinationen Analyt/biologische Flüssigkeit anpassen.
Ein Indikatorstreifen der vorliegenden Erfindung stellt eine relativ einfache und schnelle Bestimmung der Glucosekonzentration in einer nicht-ausgemessenen Probe von Blut zur Verfügung. Der Streifen umfaßt eine poröse Matrix mit einer Probenseite und einer Testseite. Die Matrix ist im allgemeinen eine Membran, iird die beiden Begriffe werden in der vorliegenden Beschreibung und den angehängten Ansprüchen miteinander austauschbar verwendet. Ein Testreagenz wird auf die Matrix aufgetragen und wird, zu einem größeren oder geringeren Ausmaß in die Poren der Matrix imprägniert. Der Einfachheit beschreiben wir in dieser Beschreibung und in den angehängten Ansprüchen das Reagenz auf der Matrix als eine "Beschichtung", in der Erkenntnis, daß die Reagenzbeschichtung die Matrix zu einem gewissen Grad durchdringt. Die Matrix ist dazu angepaßt, eine ncht-ausgemessene Probe von Vollblut aufzunehmen, enthaltend rote Blutkörperchen und Glucose, die auf die Probenseite abgetragen worden ist. Die Porosität der Matrix erlaubt es der Flüssigkeit, von der Probenseite zur Testseite zum Beispiel aufgrund von Kapillarwirkung zu fließen. Daher kann das Testreagenz mit der Glucose im Blut reagieren, um eine Farbveränderung auf oder nahe der Testseite zu verursachen. Da die stark gefärbten roten Blutkörperchen es schwieriger machen können, die Farbveränderung nachzuweisen, kann die Matrix Poren haben mit Größen, die von großen Poren auf der Probenseite zu kleineren Poren auf der Testseite abgestuft sind, um die roten Blutkörperchen von der Testseite wegzuhalten. Eine Vielzahl von Materialien kann für die verschiedenen Bestandteile des Indikatorstreifens und des Zeitsetzers dieser Erfindung verwendet werden. Einige dieser Materialien werden in US Pat. Nr. 5,306,623, erteilt am 26. April 1994 an Kiser et al., offenbart.
Das Testreagenz umfaßt einen Bestandteil zum Umwandeln von Glucose zu Wasserstoffperoxid, wie etwa Glucoseoxidase, und einen oder mehrere Bestandteile zum Nachweis des Wasserstoffperoxids, das aus der in der Probe vorhandenen Glucose erzeugt wird. Die Bestandteile zum Nachweisen von Wasserstoffperoxid können eine Peroxidase, bevorzugt Meerrettich-Peroxidase, zusammen mit einem, "Indikator" sein, der im Verlauf der Reaktion seine Farbe verändert. Der Indikator kann ein oxidierbarer Farbstoff oder ein Farbstoffpaar sein. Die Peroxidase katalysiert die Oxidation des Indikators in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid. Das letzte Element der Reagenzteststreifenbeschichtung ist ein Inhibitor, der die farbverändemde Oxidation des Indikators verzögert.
In der bevorzugten Ausführungsform ist der Indikatorstreifen entlang seiner Länge auf ehe solche Wei¬ se segmentiert, daß aneinander angrenzende Segmente verschiedene Gleichgewichte zwischen Indikator/Inhibitor haben. Wir bezeichnen diese Segmente als "Ergebnissegmente". Ein einzelnes Ergebnissegment verändert nur seine Farbe, wenn überhaupt und wenn genügend Glucose vorhanden ist, um zu bewirken, daß zunächst der gesamte Inhibitor aufgebraucht wird, und um dann den Indikator zu oxidieren und dadurch die charakteristische Farbveränderung zu verursachen. Daher weist eine Farbveränderung in einem einzelnen Ergebnissegment auf eine Schwellenglucosekonzentration in der ursprünglichen Blutprobe hin. Entlang dem Strei¬ fen in einer bestimmten Richtung hat jedes aufeinanderfolgende Ergebnissegment ein Gleichgewicht Inhibitor/Indikator, das einem schrittweisen Anwachsen der Glucoseschwellenkonzentration entspricht. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, wenn die Indikatorkonzentration dieselbe für alle Segmente ist und jedes aufeinanderfolgende Segment eine schrittweise größere Inhitorkonzentration als das vorhergehende hat. Natürlich sind ebenso andere Gleichgewichte Inhibitor/Indikator möglich.
Wenn die Ergebnissegmente Inhibitor/Indikator-Konzentrationen im geeigneten Bereich für eine einzelne Testprobe haben, reagieren aneinandergrenzende Segmente mit dem Analyten so, daß ein Ergebnissegment gefärbt wird und ein daran angrenzendes nicht gefärbt wird. Dieses Resultat zeigt an, daß die Glucosekon¬ zentration in der Probe wenigstens gleich der Schwellenkonzentration ist, die erforderlich ist, um die Farbe des einen Segments zu verändern, nicht jedoch so groß wie diejenige ist, die erforderlich ist, um die Farbe des angrenzenden Segments zu verändern. Zum Überwachen der Blutglucose umfaßt die Zeitsetzerelementbeschich¬ tung die Elemente des Indikatorstreifens - eine poröse Matrix mit einem Testreagenz, darauf geschichtet, - und zusätzlich Glucose. Im trockenen Zustand wird die Reagenzchemie durch die Glucose nicht aktiviert, wenn aber eine Probe auf den Streifen aufgetragen wird, wird die Zeitsetzerbeschichtung hydratisiert, und die Glucose in der Beschichtung bewirkt nach einer vorher bestimmten Zeit, daß der Indikator seine Farbe verändert. Bevorzugt ist die Glucose in dem Zeitsetzer in einer Menge vorhanden, die deutlich im Überschuß zu derjenigen ist, die erforderlich ist, um den Inhibitor zu überwinden. In diesem Fall ist die erforderliche Zeit länger oder kürzer, abhängig davon, ob mehr oder weniger Inhibitor vorhanden ist Farbveränderungen in dem Streifen und in den Zeitsetzer können entweder direkt mit dem Auge oder mit einem optischen Instrument beobachtet weiden, das Veränderungen hinsichtlich des Reflektionsvermögens nachweist.
Die für das Erscheinen des Zeitsetzerhinweises erforderliche Zeit wird ebenso durch Parameter des Streifens beeinflußt, die in ärmlicher Weise die Zeit beeinflussen, die erforderlich ist, damit ein sichtbarer Hinweis auf die Glucosekonzentration erscheint Daher, wenn niedrige Umgebungstemperatur oder eine Alterung der Streifenbestandteile die für eine gültige Messung der Glucosekonzentration benötigte Zeit verlängert, verlängert dies ebenso die Zeit für den Hinweis des chemischen Zeitsetzers. Schließlich, wenn unsachgemäßer Gebrauch des Streifens - zum Beispiel Aussetzen gegenüber Feuchtigkeit - die Farbveränderung bewirkt, die den Abschluß der stattzufindenden chemischen Zeitsetzerreaktion markiert, bevor ein Streifen verwendet werden soll, wird der Benutzer auf die Tatsache, daß der Streifen ungenau gemacht wurde, aufmerksam gemacht und wird insofern wissen, ihn nicht zu benutzen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht der Matrix eines direkt ablesbaren Reagenzteststreifens der vor¬ liegenden Erfindung.
Fig. 2 ist eine Flächenansicht der Testseite eines direkt ablesbaren Reagenzteststreifens der vorliegenden Erfindung.
Fig. 3 ist eine Flächenansicht der Probenseite des Streifens aus Fig. 2.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ein Zeitsetzer der vorliegenden Erfindung mißt ein vorher bestimmtes Zeitintervall auf chemische Wei¬ se. Er ist besonders zum Einschluß eines direkt ablesbaren Reagenzteststreifens zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit angepaßt. Ein solcher Teststreifen umfaßt eine poröse Matrix, die ein Testreagenz beinhaltet, das eine Farbveränderung in Antwort auf den Analyten in einer biologischen Flüssigkeitsprobe, die auf den Streifen aufgetragen wird, durchläuft.
Die Matrix kann aus einer einheitlichen Zusammensetzungen sein, oder sie kann ein beschichtetes Sub¬ strat sein und kann entweder isotrop oder anisotrop sein. Sie hat eine Probenseite, auf die die Probe aufgetragen wird, und eine Testseite, wo die Farbveränderung beobachtet wird. Bevorzugt ist die Matrix eine anisotrope Membran, bevorzugter eine anisotrope Membran mit einem weiten Bereich an Porengrößen. Zum Beispiel kann sich ein Gradient an Porengrößen von ungefähr 0,1 Mikrometer bis ungefähr 150 Mikrometer durch die Matrix erstrecken. Am großen Porenende Hegt die Porengröße bevorzugter im Bereich von ungefähr 30 Mikrometer bis ungefähr 40 Mikrometer. Am Ende der Matrix, wo die Poren am kleinsten sind, ist das Hohlraum¬ volumen relativ klein, und das Matrial der Membran ist im allgemeinen ziemlich dicht, in einer Schicht, die bis zu 10%-20% der Dicke der Membran ausmachen kann. Innerhalb dieser Schicht Hegt die Porengröße bevorzugt im Bereich von ungefähr 0,1 bis ungefähr 0,8 Mikrometer mit einer nominellen Porengröße von bevorzugt ungefähr 0,3 Mikrometer. Wenn die biologische Flüssigkeit auf die Probenseite aufgetragen wird, trifft die Probe zunehmend kleinere Poren, während sie die Membran durchdringt. Schließlich erreichen Feststoffe, wie etwa rote Blutkörperchen, eine Position in der Membran, an der sie nicht weiter durchdringen können. Der Rest der Probe, der immer noch die aufgelöste Glocose enthält, dringt durch bis zur Testseite. Die anisotrope Natur der Membran und/oder die Verwendung eines tarnenden Bestandteils (unten diskutiert) in der Matrix, erlaubt relativ rasche Flußraten durch die Membran, sogar während eine Filtration der Feststoffe stattfindet.
Während die Probe durch die Matrix läuft, verursacht eine Reaktion mit dem Reagenz, daß ein lichtab¬ sorbierender Farbstoff gebildet oder im Hohlraumvolumen nahe der Testseite abgebaut wird, wodurch im wesentlichen das Reflektionsvermögen von der Matrix beeinflußt wird.
Polysulfone und Polyamide (Nylons) sind Beispiele geeigneter Matrixmaterialien. Andere Polymere mit vergleichbaren Eigenschaften können ebenso verwendet werden. Die Polymere können modifiziert werden, um andere funktionelle Gruppe einzuführen, die geladene Strukturen bereitstellen, so daß die Oberflächen der Matrix neutral, positiv oder negativ sein können.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Herstellen des porösen Materials, das die Matrix bildet, ist, das Polymer ohne einen unterstützenden Kern zu gießen. Eine solche Matrix ist zum Beispiel die anisotrope Polysulfonmembran, erhältlich von Memtec, Inc., Timonium, MD. Eine Matrix von weniger als ungefähr 200 Mikrometer Dicke wird gewöhnlich verwendet, wobei ungefähr 115 bis 155 Mikrometer bevorzugt werden. Eine Dicke von ungefähr 130 bis 140 Mikrometer ist am bevorzugtesten, insbesondere wenn die Matrix Nylon oder anisotropes Polysulfon ist. Man kann die Matrix fakultativ an einem Träger anheften, um ihr physikalische Form und Festig¬ keit zu verleihen, obwohl dies nicht wesentlich ist. Bevorzugt wird eine Unterstützung bereitgestellt, indem man die Matrix zwischen thermoplastischen Lagen einbringt (sandwiching the matrix between thermoplastic sheets). Die Lage auf der Probenseite schließt eine Öffnung ein, durch die eine Probe eingeführt werden kann. Die Lage auf der Testseite erlaubt das Sichten der Farbe der Testseite der Matrix.
Die Membran kann mit Testreagenz behandelt weiden, indem sie m eine Mischung der Bestandteile getaucht wird, wodurch die Membranmatrix gesättigt wird. Überflüssiges Reagenz kann durch mechanische Mittel, wie zum Beispiel ein Schabemesser oder einen Glasstab entfernt werden. Die Membran wird dann getrocknet.
Das Testreagenz umfaßt (i) einen Bestandteil zum Umwandeln von Glucosse in Wasserstoffperoxid, (ii) einen Bestandteil zum Nachweis von Wasserstoffperoxid und (iii) einen Bestandteil zum Inhibieren des Bestandteils, der das Wasserstoffperoxid nachweist. Das Reagenz kann fakultativ weiterhin einen trennenden Bestandteil umfassen, der bewirkt, daß Feststoffe, wie etwa rote Blutköperchen an die Matrix angehängt oder in ihr gelängen werden, wodurch im Ergebnis die Feststoffe aus der biologischen Flüssigkeit entfernt werden. Zusätztiche Bestandteile können ebenso eingeschlossen werden, wie hierin unten und in den Beispielen beschreiben.
Bevorzugte Bestandteile zum Umwandeln von Glucose zu Wasserstoffperoxid schließen Glucoseoxidase ein, ein Enzym, das gewöhnlich aus Aspergillus niger oder Penicillium erhalten wird. Glucoseoxidase rea¬ giert mit Glucose und Sauerstoff um Gluconolacton und Wasserstoffperoxid zu erzeugen. Die optimale Glucoseoxidasekonzentration hängt von der Zusammensetzung des Indikatorsystems ab. Zum Beispiel ist, wenn das Indikatorsystem MBTHSB-ANS (das unten beschrieben wird) ist, dann ist Glucoseoxidase im bereich von ungefähr 500-10.000 U./ml geeignet, bevorzugter ungefähr 700 bis 2.000 U./ml und am bevorzugtesten ungefähr 1.000 U./ml. Im allgemeinen bewirken höhere Konzentrationen an Glocoseoxidase, daß die Reaktion schneller abläuft, und umgekehrt.
Das so hergestellte Wasserstoffperoxid reagiert mit dem Bestandteil zum Nachweis des Wasserstoffperoxids, der eine Peroxidase umfaßt, die selektiv eine Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und einem Indikator katalysiert. Die Peroxidase verwendet Wasserstoffperoxid als ein Oxidationsmittel, das in der Lage ist, Wasserstoffatome aus verschiedenen Substraten zu entfernen. Eine geeignete Peroxidase kann Ferriprotoporphyrin enthalten, ein rotes Hämin, das aus Pflanzen erraten wird. Peroxidasen, die aus Tieren erhalten werden, zum Beispiel aus den Schilddrüsen von Tieren, sind ebenso geeignet Meerrettich-Peroxidase (HRPO) ist besonders bevorzugt als ein Element des Bestandteils zum Nachweisen Wasserstoffperoxid.
Das Wasserstoffperoxid, bevorzugt durch eine Peroxidase katalysiert, reagiert, um entweder direkt oder indirekt einen Indikatorfarbstoff zu bilden oder abzubauen, der Licht in einem vorherbestimmten Wellenlängenbereich absorbiert. Bevorzugt absorbiert der Indikatorfarbstoff stark bei einer Wellenlänge, die unterschiedlich von derjenigen ist, bei der das Testreagenz stark absorbiert. Die oxiderte Form des Indikators kann das farbige, schwachfarbige oder farblose Endprodukt sein, das den Nachweis für eine Veränderung in der Farbe der Testseite der Matrix liefet. Das heißt, das Testreagenz kann auf das Vorhandensein eines Analyten in einer Probe hinweisen, indem eine farbige Fläche ausgebleicht wird oder, alternativ, indem eine farblose Fläche eine Farbe entwickelt.
Indikatoren, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ein: (a) 3-Methyl-2- benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid (MBTH), kombiniert mit 3,3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB); (b) MBTH, kombiniert mit 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzol-sulfonsäure (DCHBS); (c) 4-Aminoantipyren (4- AAP) (in 4 mg/ml) und 5-Oxo-1-(p-sulfophenyl)-2-pyrazolin-3-carbonsäure (OPSP); (d) 4-AAP (in 4 mg/ml) und N-(m-tolyl)-diethanolamin (NDA); (e) 2,2'-Azrino-di(3-ethylbenzthiazolin)sulfonsäure (ABTS); (f) 4AAP (in 4 mg/ml) und 4-Methoxynaphthol; (g) Pyrogallolrot (PGR); (h) Brompyrogallolrot (BPR); (i) Arid Green 25 (AG); oder (j) [3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon]-N-Sulfonylbenzolsulfonatmononatrium (MBTHSB), kombiniert mit 8-Anilino-1-naphthalensulfonsäureammonium (ANS). MBTHSB-ANS wird bevorzugt Zusätzliche Informationen in Hinblick auf MBTHSB-ANS wird in PCT/US95/12091 offenbart.
Der inhibierende Bestandteil verzögert die Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und dem Farbstoff oder dem Farbstoffvorläufer, zum Beispiel durch Reduzieren des Wasserstoffperoxids oder durch Reduzieren des oxidierten Farbstoffs. Grundsätzlich gibt es zwei unterschiedliche Betriebsarten für einen Inhibitor. Als erstes könnte der Inhibitor mit dem Indikator in Wettbewerb treten und dadurch die Geschwindigkeit verringern, in der die Farbveränderung in dem Indikator stattfindet. Alternativ könnte der Inhibitor nicht-kompetitiv sein, so daß im wesentlichen der gesamte Inhibitor verbraucht wird, bevor irgendeine wesentliche Falbveränderung in dem Indikator stattfindet. Bevorzugt funktionieren die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung mittels des letzteren Mechanismus.
Zu geeigneten Inhibitoren zählen 2,3,4-Trihydroxybenzoesäure, Propylgallat; 3,4-Dihydroxyzimtsäure, 3,4-Dihydroxybenzaldehyd; Gallussäure; 5,6-Diaminouracil; Ascorbinsäure und Isoascorbinsäure. Ascorbinsäure wird bevorzugt; jedoch oxidiert Ascorbinsäure in Lösung und muß stabilisiert werden, um zu ermöglichen, daß das Reagenz aufgetragen wird. Bevorzugte Stabilisatoren sind primäre Alkohole, wie etwa Ethyl-, Methyl- oder Propylalkohol. Ethylalkohol wird bevorzugt, insbesondere konzentrierte Lösungen, d. h. Lösungen von 50% oder mehr Ethanol.
Obwohl die anisotrope Membran, die die bevorzugte Matrix ist, rote Blutkörperchen herausfiltert und sie von der Testseite zurückhält, kann fakultativ das Testreagenz ebenso einen trennenden Bestandteil enthalten. Der trennende Bestandteil sollte in der Lage sein, eine relativ klare farblose Flüssigkeit aus einer rote Blutkörperchen enthaltenden Flüssigkeit zu erzeugen, z. B. Vollblut, indem er rote Blutkörperchen in der Matrix abfangt Trennende Bestandteile zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Polyethylenglycol, Poly(methylvinylether/Maleinsäure)-anhydrid, Polypropylenglycol, Polystyrolsulfonsäure, Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol und Polyvinylsulfonsäure bei einem pH von zwischen ungefähr 4,0-8,0. Solche trennenden Bestandteile sind in der Matrix in Mengen vorhanden, die abhängig von ihrer Ladung und Molekulargewicht, den anderen Bestandteilen, die in die Matrix eingebettet sind, dem Matrix-pH und der Porengröße und der Restfeuchtigkeit der Matrix nach dem Trocknen variieren werden. Solche Parameter sind vom Fachmann leicht zu bestimmen. Zum Beispiel wenn Polypropylenglycol als der tarnende Bestandteil verwendet wird (z. B. PPG410 von BASF, Wyandotte, MI), ist es bevorzugt in ungefähr 2-30 Gew.-% pro Volumen (w/v) vorhanden und bevorzugter 8-10% w/v. Andere trennende Bestandteile können ebenso in einer Konzentration von ungefähr 2-30% (w/v) verwendet werden. Die polymeren trennenden Bestandteile können imprägniert oder in die Matrix eingebettet sein Einige wasserlösliche Salze können ebenso eine solche Trennung durchführen. Unter den Salzen, die zum Trennen von Blutbestandteilen geeignet sind, sind Citrate, Formiate und Sulfate sowie bestimmte Säuren, wie etwa Aminosäuren, Zitronensäure, Phytinsäure und Äpfelsäure. (Siehe z. B. US Pat. 3,552,928, erteilt am 5. Januar 1971 an M. C. Fetter.) Ein Vorteil, den trennenden Bestandteil einzuschließen, ist es, daß bei Feststoffen, wie etwa roten Blutkörperchen, die im wesentlichen aus der biologischen Flüssigkeit entfernt worden sind, es weniger Hintergrundsfarbe an der Teststelle gibt, die eine Färbungsveränderung, erzeugt durch das Testreagenz, verschleiern könnte.
Andere Bestandteile können in die Matrix eingebettet sein, um die Färbung und Lesbarkeit der Reagenzstreifen zu verbessern und die Einheitlichkeit und Integrität der Matrix zu bewahren. Zum Beispiel kam da Testreagenz Salze und/oder Puffer enthalten, um bei der Trennung des Farbstoffs in der Matrix zu helfen. Solche Puffer können zum Beispiel Zitronensäure enthalten, die in der Lösung in ungefähr 0,01 M bis ungefähr 1,0 M und bevorzugt ungefähr 0,1 M vorhanden ist. Andere saure Puffer können ebenso Verwendet werden.
Verbindungen, die die Matrix hydrophil machen, oder Verbindungen, die als Stabilisatoren wirken können, wie etwa hydrolysierte Proteine, können ebenso verwendet werden. Solche Vabindungen schließen ein, sind aber rächt beschränkt auf zum Beispiel bovines Serumalbumin, Potypeptide und das niedrigmolekulargewichtige Protein, erhältlich als Crotein SPA (CRODA, Inc. New York, N.Y.). Solche Verbindungen werden in Konzentrationen von zum Beispiel ungefähr 1,0 mg/ml bis ungefähr 100,0 mg/ml verwendet. Im Falle von Crotein werden ungefähr 20 mg/ml bevorzugt.
Andere Stabilisatoren und Konservierungsmittel körnen ebenso beim Beschichten für die Matrix ein¬ geschlossen sein. Zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsaure (DTPA) und verwandte Vabindungen können verwendet weiden, zum Beispiel in Konzentration von ungefähr 0,01 mg/ml bis ungefähr 10,0 mg/ml. Zu den Zwecken der Konservierungsmittel zählt es, den Inhibitor zu stabilisieren.
Einige der Indikatoren (z. B. BPR) haben eine unerwünschte Tendenz, in der Matrix zu wandern. Wenn ein solcher Indikator verwendet wird, wird ein ionenpaarendes Mittel eingeschlossen, um eine solche Migration zu verhindern. Zum Beispiel sind die Polyethylenglycolderivate, die als Polyquart® (H) (Henkel, Inc., Ambler, PA) kommerziell erhältlich sind, besonders nützlich aufgrund ihrer Fähigkeit die Ionenpaarung zwischen dem Indikator und anderen Matrixsubstituenten zu erleichtern.
Wenn das Vorhandensein eines Analyten durch Farbbildung angezeigt wird (z. B. MBTHSB-ANS), können Tenside zugegeben werden, um die Farbe aufzuhellen und den Kontrast mit der nicht-gefärbten Umgebung zu verbessern.
Organische Lösungsmittel können ebenso bei der Ausübung dieser Erfindung verwendet wenden und können in der Formulierung des Testreagenz für die Matrix eingeschlossen weiden, vorausgesetzt natürlich, daß sie mit der Matrix und den Testreagenzzusammensetzungen kompatibel sind. Potentiell geeignete organische Lösungsmittel schließen Chloroform, Aceton, Alkohole, Methylenchlorid, Diethyl- und Petroleumether, Acetonitrile und Mischungen davon ein. Bei der Ausübung der vorlegenden Erfindung wird 70% Ethanol in Wasser besonders bevorzugt.
Das Testreagenz, das auf die Matrix aufgetragen oder in sie imprägniert wird, ist nicht einheitlich über die Oberfläche des Teststreifen. Stattdessen wird das Reagenz bevorzugt auf die Matrix in einer Reihe paralleler Streifen oder "Ergebnissegmenten" aufgetragen, in denen die Zusammensetzung in aneinander angrenzenden Ergebnissegmenten anwächst, schrittweise im Hinblick auf die Inhibitorkonzentration. Daher erfordert jedes aufeinanderfolgende Segment schrittweise eine größere Glucosekonzentration in der Probe, um das Segment dazu zu bringen, seine Farbe zu verändern.
Das Zeitsetzersegment der Matrix ist beschichtet oder imprägniert einer Zusammensetzung, die aus dem Testreagenz und zusätzlich Glucose besteht. Da der Zweck des Testreagenz es ist, seine Farbe in Antwort auf Glucose zu verändern, erfordert die Kombination der beiden, ohne daß die Farbveränderung bewirkt wird, eine gewisse Sorgfalt. Eine Menge an Inhibitor, die über diejenige hinausgeht, die für die Zeitsetzerfunktion erforderlich ist, muß vorhanden sein, um diesen Effekt zu kompensieren. Die Geschwindigkeit, in der das Zeitsetzersegment getrocknet wird, nachdem die Glucose-enthaltende Lösung aufgetragen wird, wird kontroliert. In der Praxis wird die Membran zuerst mit einer Lösung, enthaltend Puffer, Stabilisatoren und Enzyme, beschichtet, und diese Beschichtung wird getrocknet, um eine erste Schicht zu bilden. Dann wird in einem zweiten Beschichtungsgang eine Lösung aufgetragen, die Indikator, Inhibitor und Glucose enthält, um eine zweite Schicht zu bilden. Parameter, wie etwa Gewebegeschwindigkert, Ofentemperatur und Luftstrom, und Menge der abgesetzten Beschichtungslösungen werden zuvor festgelegt und geeignete Einstellungen an den Inhibitor- und/oder Glucose-Konzentrationen gemacht worden sein. Anstelle, daß die zweite Schicht als eine Beschichtung aufgetragen wird, beinhaltet eine weniger bevorzugte Alternative, daß die zweite Beschichtung auf einem separatem Gewebe gemacht wird und dann über der ersten Schicht laminiert wird.
Wenn eine Probe auf den Streifen aufgetragen wird, ermöglicht die Hydratisierung der Zeitsetzersegmentzusammensetzung, daß die farbbildende Reaktion fortschreitet. Die Zeit, die benötigt wird, daß das Zeitsetzersegment seine Farbe verändert, wird dann durch die Temperatur und die Eigenschaften des Testreagenz, insbesondere der Inhibitorkonzentration, der Menge an Glucose und der Hydratisierungs- und Sauerstoffdiffusionsgeschwindigkeiten bestimmt.
Die Zeitsetzer-Farbveränderungszeit kann dazu gebracht werden, daß sie von der Glucosekonzentration in der Probe abhängt oder alternativ von dieser Konzentration unabhängig ist. Durch Einbau eines großen Überschusses an Glucose in dem Zeitsetzer ist die Zeit im wesentlichen unabhägig der Glucosekonzentration der Probe. Durch Einbau von weniger Glucose in dem Zeitsetzer kann die Zeit dazu gebracht werden, daß sie von der Glucose in der Probe abhängt: D. h. der Zeitsetzer wird seine Farbe schneller verändern, wenn die Glucosekonzentration in der Probe größer ist. Bevorzugt ist die Glucosekonzentration in dem Zeitsetzer größer als ungefähr 1.500 mg/dl, was den Zeitsetzer im wesentlichen unabhängig von der Probenglucosenkonzentration im Bereich von ungefähr 40-400 mg/dl macht. Die Zeitsetzersegmentzusammensetzung beinhaltet eine Über¬ schußmenge an Bestandteil (wie etwa Glucoseoxidase), der Glucose zu Wasserstoffperoxid umwandelt, sowie an Glucose. Die Zeitsetzerzusammensetzung sollte dann wenigstens so viel oder mehr Inhibitor enthalten, ab Ergebnissegment, das die höchste Inhibitorkonzentration hat (was dem höchsten Glucosemeßwert entspricht).
Der Zeitsetzer dient ebenso einer wichtigen Qualitätskontrollfunktion, indem er offensichtlich macht, wenn ein Teststreifen durch Aussetzen gegenüber Feuchtigkeit kontaminiert worden ist. Der Teststreifen muß trocken bleiben bis zu der Zeit, zu der er verwendet werden soll, weil Bestandteile, die Glucose zu Wasserstoffperoxid umwandeln (im allgemeinen Enzyme), dazu tendieren, bei Aussetzen gegenüber Feuchtigkeit abgebaut zu werden Daher, wenn der Streifen vorzeitig gegenüber Feuchtigkeit ausgesetzt wird, wird er kontaminiert und unbrauchbar werden. Aber die Kontaminierung des Teststreifens ist für einen Benutzer nicht offensichtlich, der deshalb einen solchen Streifen möglicherweise verwendet und ein fehlerhaftes Resultat erhalten kann. Wenn jedoch der Streuen ein Zeitsetzersegment enthält, verursacht ein Aussetzen gegenüber Feuchtigkeit, daß der Zeitsetzer seine Farbe verändert, was den Benutzer auf die Tatsache aufmerksam macht, daß der Streifen kontaminiert wunde.
Die Erfindung wird jetzt weiter unter Bezug auf die Figuren beschrieben werden.
Fig. 1 zeigt eine Matrix 10 der vorliegenden Erfindung zum Messen der Menge eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit. Obwohl in einer gebogenen Position gezeigt, ist die Matrix 10 flexibel und liegt im allgemeinen beim Gebrauch in einer flachen Ebene. Die Matrix enthält eine Probenseite 12, auf die die biologischen Flüssigkeitsprobe aufgetragen wird, und eine Testseite 14, auf oder nahe der eine Veränderung in der Farbe auf die Anwesenheit des Analyten hinweist. Die Farbveränderung resultiert aus der Wechselwirkung des Analyten mit dem Reagenz, das in den Poren 16 imprägniert ist. Bevorzugt sind zum Messen der Konzentration von Glucose im Blut die Porengrößen relativ groß nahe der Probenseite 12 und nehmen in ihrer Größe ab, wenn man sich der Testseite 14 nähert. Der Porengrößengradient dient dazu, rote Blutkörperchen nahe der Probenseite 12 einzufangen, so daß ihre Farbe nicht die Fähigkeit stört, die Farbveränderung zu sehen, die auf das Vorhandensein des Analyten hinweist.
Vier Ergebnissegmente, a, b, c und d werden schematisch gezeigt. Jedes aufeinanderfolgende Segment hat schrittweise mehr Inhibitor als das jeweilige vorher. Daher, wenn zum Beispiel eine Probe bewirkt, daß Segmente a, b und c ihre Farbe verändern, während d dies nicht tut (wie in Fig. 1 gezeigt), bedeutet dies, daß die Glucosekonzentration in dieser Probe wenigstens so groß wie diejenige ist, die benötigt wird, um die Konzentration an Inhibitor in Segment c zu verbrauchen, daß sie aber nicht ausreicht, um den Inhibitor in Segment d zu überwinden. Wenn die Ergebnissegmente kalibriert sind, ergibt dieses Ergebnis ein quantitatives Maß für die Glucosekonzentration. Segment t, der Zeitsetzer, beinhaltet eine hohe Konzentration an Glucose, zusätzlich zu dem Testreagenz, das in den Ergebnissegmenten imprägniert ist. Der Inhibitor in Segment t ist wenigstens so groß wie in den Ergebnissegmenten, und die Zeit, die erforderlich ist, um den Inhibitor in Segment t aufzubrau¬ chen, ist wenigstens so groß wie diejenige, die erforderlich ist, um den Inhibitor in den andern Segmenten aufzubrauchen. Daher ist wenn Segment t eine Farbveränderung durchläuft (wie in Fig. 1 gezeigt), genügend Zeit verstrichen, um die Farbveränderung in all den Ergebnissegmenten zu verursachen, deren Inhibitorkonzentration niedrig genug ist, daß sie durch die Glucosekonzentration in der Probe aufgebraucht wird, und eine korrekte Messung kann ohne weitere Verzögerung gemacht werden.
Bei einem tatsächlichen Teststreifen liegt die Membranmatrix aus Fig. 1 zwischen zwei Deckschichten, die aus jedem geeigneten thermoplastischen Film sein können, der auf dem Gebiet gut bekannt ist Fig. 2 und 3 sind Flächenansichten der Probenseite 22 bzw. Testseite 24 eines Teststreifens 22. Bei der Verwendung wird eine Blutprobe auf die Öffnung 26 auf der Probenseite 22 aufgetragen. Die Probe bratet sich mittels Kapillarwirkung in Längsrichtung auf das obere und untere Ende des Streifens aus und durchdringt die Matrix in Richtung auf die Testseite 24. Fakultative Belüftungslöcher 28 erleichtern die Ausbreitung der Probe entlang des Streifens. Das Erscheinen der Probe durch ein fakultativ transparentes Fenster 30 bestätigt, daß aus reichend Probe für eine Messung zur Verfügung gestellt worden ist Indikatorkreise auf der Testseite 24 lassend den Zutritt von Sauerstoff zu, der für die Farbbildungsreaktion benötigt wird, und sind markiert, um die Blutglucosekonzentration anzuzeigen. Während der Test fortschreitet, verändern Indikatorkreise auf der Testseite 24 aufeinanderfolgend ihre Farbe wenn die Blutglucosekonzentration in der Probe mit der Menge, die diesem Kreis entspricht, übereinstimmt oder diese übertrifft. Daher zeigt das in Fig. 3 dargestellte Ergebnis an, daß die Probenglucosekonzetration wenigstens 120 mg/dl beträgt, aber weniger als 150 mg/dl. Der Meßwert kann zu jeder Zeit genommen werden, nachdem der Zeitsetzerkreis 32 seine Farbe verändert. Es ist zu beachte, daß in den Figuren die durch die Reaktion mit Glucose verursachte Farbveränderung von weiß zu farbig verläuft. Das System könnte jedoch alternativ mit einem Indikatorfarbstoff ablaufen, der durch die Glucose-induzierte Oxidation zerstört wird, mit einer entsprechenden Falbveränderung von farbig zu weiß.
Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung machen die folgenden Beispiele verschiedene Ausführungsformen der Erfindung deutlicher. Die Beispiele sollen in keiner Weise als begrenzend aufgefaßt werden. BEISPIEL 1-BPR-INDIKATOR
Eine Memtec® BTSH 55-Membran wurde in dieser Lösung immersionsbeschichtet, und der Überschuß mit Glasstäben abgestrichen. Die beschichtete Membran wurde in einem Flotationstrockner bei 180 F unter mäßigem Luftzug getrocknet, so daß das Gewebe innerhalb von 20 Sekunden im wesentlichen trocken war. Das Gewebe wurde in Vorbereitung der zweiten Beschichtung, unten beschrieben, aufgewickelt. Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:
* Die Glucoselösung ist eine 16.000 mg/dl Lösung aus Glucose in Wasser, die man für 24 Stunden mutarotieren hat lassen, die dann gekühlt gelagert wird.
Die folgenden Verdünnungen der Stammlösung wurden hergestellt:
0,0405 : 1, 0,108 : 1, 0,236 : 1, 0369 : 1, 0,569 : 1, 1,260 : 1. Diese schrittweise Zunahme an Inhibitorkonzentration entspricht der schrittweise größeren Glucosekonzentration, die die Ergebniskreise anzeigen. Diese Lösungen, zusammen mit der Zeitsetzerlösung, wurden Seite-an-Seite auf die großporige Seite der Enzym-beladenen Membran geschichtet, um näherungsweise 1,15 · 10&supmin;&sup4; ml pro Quadratmillimeter Membran niederzulegen. Die Membran war näherungsweise fünfzehn Sekunden naß, bevor sie dieselben Trocknungsbedinungen erfuhr, wie sie für den Enzymbeschichtungsschritt oben beschreiben wurden. Die Ergebnisse zeigen, daß der Zeitsetzer in ungefähr 70 Sekunden reagiert, wobei ungefähr 95% der Ergebnisse zwischen 64 und 79 Sekunden feilen.

BEISPIEL 2-MBTHSB-ANS-INDIKATOR

Die folgende Lösung wurde hergestellt:
HPLC-Wasser 1500 ml
Zitronensäure 16,92 g
Natriumcitrat 20,88g
Mannitol 15g
Dinatrium-EDTA 1,26g
Gantrez S95 6,75 g
Crotein SPA 36 g
Glocoseoxidase 1,69 MU
HRPO 1,5 MU
Carbopol910* 75 ml
Dinatriumcitrat** 225 ml
* 11% Lösung in Acetonitril
** 0,1 M, pH5,0
Die Memtec BTS 35-Membran wurde in einer Warme beschichtet, so daß die großporige Oberfläche mit der Beschichtungslösung in Kontakt kam; überschüssige Lösung wurde mit Glasstäben entfernt, wie zuvor. Die Membran wurde getrocknet und wie in Beispiel 1 aufgewickelt. Die folgenden Lösungen wurden gemacht:
Für jede Inhibitorlösung wurde das Volumen der Lösung A auf 263 ml fixiert. Für die verschiedenen Ergebniskreise wurde das Verhältnis von 70% EtOH : Lösung C von 58,9 bis 0,200 variiert, so daß das Volumen 70% EtOH + Lösung C, zugegeben zu Lösung A, 87,5 ml für alle Inhibitorlösungen betrug. Dies veränderte im Ergebnis nur die Konzentration an Inhibitor in jeder Lösung. Die Lösungen, die die schrittweise ansteigende Inhibitorkonzentration und die Zeitsetzerlösung (Lösung D) enthielten, wurden Seite-an-Seite auf die großporige Seite der Membran beschichtet. Die Beschichtungsgeschwindgkeit wurde so eingestellt, daß man ~8 · 10&supmin;&sup5; ml Inhibitor pro Quadratmillimeter Membran erhielt. Die Membran wurde wie oben getrocknet, außer daß die Pause zwischen Beschichtung und Trocknung ungefähr 1,6 Minuten betrug. Die Resultate zeigten, daß der Zeitsetzer in ungefähr 60 Sekunden mit einem geringen Effekt vom Blut-Hämatokrit von 30 bis 55% oder Glucose von 78 bis 420 mg/dl reagierte.
Es wild Fachleute War sein, daß die vorbeigehende Beschreibung und die Bespiele die Ausübung der vorliegenden Erfindung veranschaulichen, aber in keiner Weise beschränkend sind. Variationen der hierin dargestellten Einzelheiten können durchgeführt werden, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Chemischer Zeitsetzer für einen direkt ablesbaren Reagenzteststreifen zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgebracht wird, wobei der Zeitsetzer eine trockene Beschichtung umfaßt aus

a) einer Indikatorzusammensetzung,

b) einem Reagenz, das in hydratisiertem Zustand in der Lage ist, mit Glucose zu reagieren, um die Farbe des Indikators zu verändern,

c) einem Inhibitor, um die Farbveränderung des Indikators zu inhibieren, und

d) Glucose,

wobei die Inhibitor- und Glucose-Konzentiationen in der trockenen Beschichtung so ausgewählt sind, daß die Glucose über eine vorherbestimmte Zeit, nachdem die biologische Flüssigkeit auf den Streifen aufgetragen worden ist, mit dem Reagenz reagiert, um die Farbe des Indikators zu verändern.

2. Zeitsetzer nach Anspruch 1, bei dem der Analyt Glucose ist.

3. Zeitsetzer nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die biologischer Flüssigkeit Blut ist.

4. Zeitsetzer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Indikator: (a) 3-Methyl-2- benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid (MBTH), kombiniert mit 3,3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB); (b) MBTH, kombiniert mit 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure (DCHBS); (c) 4- Aminoantpyren (4-AAP) und 5-Oxo-1-(p-sulfophenyl)-2-pyrazolin-3-carbonsäure (OPSP); (d) 4-AAP und N-(m-tolyl)-diethanolamin (NDA); (e) 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)sulfonsäure (ABTS); (f) 4- AAP und 4-Methoxynaphthol; (g) Pyrogallorot (PGR); (h) Brompyrogallolrot (BPR); (i) Acid Green 25 (AG); oder (j) [3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon]-mononatrium-N-Sulfonylbenzolsulfonat (MBTHSB), kombiniert mit 8-Anilino-1-naphthalensulfonsäureammonium (ANS) ist, und bevorzugt MBTHSB-ANS ist.

5. Zeitsetzer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Reagenz ein Qxidaseenzym, wie Glucoseoxidase, umfaßt.

6. Zeitsetzer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem der Inhibitor Ascorbinsäure umfaßt.

7. Direkt ablesbarer Reagenzteststreifen zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgebracht wird, umfassend den chemischen Zeitsetzer nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Verfahren zum Herstellen eines chemischen Zeitsetzers für einen direkt ablesbaren Reagenzteststreifen zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgebracht wird, umfassend die Schritte:

a) Auftragen einer Lösung eines Reagenz, das in hydratisiertem Zustand in daläge ist, mit Glucose zu reagieren, auf eine poröse Membran,

b) Trocknen der Beschichtung, um eine erste Schicht zu bilden,

c) Aufbringen, auf die erste Schicht, die enthält,

i) Glucose,

ii) einen Indikator, der mit dem Reaktionsprodukt des Reagenz und der Glucose reagieren kann, um eine Farbveränderung zu verursachen, und

iii) einen Inhibitor, um die Farbveränderung des Indikators zu inhibieren.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Analyt Glucose ist, und das Reagenz Glucoseoxidase umfaßt.

10. Verfahren zum Messen der Konzentration eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit, umfassend die Schritte:

a) Aufbringen der Flüssigkeit auf einen Teststreifen, der umfaßt

i) eine Vielzahl von Ergebnissegmenten, von denen jedes seine Farbe verändert, wenn es mit einer Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, die wenigstens eine vorbestimmte Menge Analyt enthält, welche von der Menge Analyt unterschiedlich ist, die eine Farbveränderung der anderen Segmente verursacht, und

ii) ein Zeitsetzersegment, das seine Farbe nach einer Zeit verändert, deren Dauer im wesentlichen unabhängig von der Menge Analyt in der Flüssigkeit ist, und

b) Beobachten des Ergebnissegments, das als letztes seine Farbe verändert hat, wenn das Zeitsetzersegment seine Farbe verändert.