DE69728637T2

DE69728637T2 - Visuell lesbarer Reagenzteststreifen

Info

Publication number: DE69728637T2
Application number: DE69728637T
Authority: DE
Inventors: Joel Douglas; Ernest Kiser; Michael F. Tomasco; Remedios Dato; Edward G. Rice; Deborah P. Tuohy; Mark Maxson; Zbigniew Witko; Scott Segelke
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 1996-12-31
Filing date: 1997-12-30
Publication date: 2005-03-31
Anticipated expiration: 2017-12-31
Also published as: SG74031A1; CA2226069A1; PL323889A1; PT852336E; US5843691A; HUP9702555A2; ID19333A; NO976137D0; DE69728637D1; AU4530797A; IL122601A0; HK1009180A1; HU224897B1; EP0852336B1; MY117022A; HU9702555D0; JPH10191995A; MX9709995A; ES2218647T3; AR010394A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf einen trockenen Teststreifen zur Messung der Konzentration eines Analyts in einer biologischen Flüssigkeit; insbesondere auf einen Teststreifen, der die Konzentration direkt messen kann, ohne daß ein Meßgerät benötigt wird.
Beschreibung des Standes der Technik
Viele visuelle Testvorrichtungen wurden für die Messung der Konzentration bestimmter Analyte in biologischen Flüssigkeiten entwickelt. Diese Vorrichtungen messen zum Beispiel Glukose, Cholesterol, Proteine, Ketone, Phenylalanin oder Enzyme in Blut, Urin oder Speichel.
Trockene Phase-Reagenzstreifen, die Enzym-basierte Zusammensetzungen enthalten, werden in großem Umfang in klinischen Laboratorien, Arztpraxen, Krankenhäusern und zu Hause verwendet, um Proben von biologischen Flüssigkeiten auf die Glukose-Konzentration zu testen. In der Tat sind Reagenzstreifen eine tägliche Notwendigkeit für viele der mehreren Millionen Diabetiker des Landes geworden. Da Diabetes gefährliche Anomalien in der Blutchemie verursachen kann, kann es zu Sehverlust, Nierenversagen und anderen ernsthaften medizinischen Folgen beitragen. Um die Risiken dieser Folgen zu minimieren, müssen die meisten Diabetiker sich selbst periodisch testen, dann ihre Glukosekonzentration entsprechend adjustieren, zum Beispiel durch Ernährungskontrolle und/oder mit Insulininjektionen. Einige Patienten müssen ihre Blut-Glukose-Konzentration sogar viermal täglich oder öfter testen.
Es ist besonders wichtig für Diabetiker, die ihre Ernährung kontrollieren müssen, um die Zuckeraufnahme zu regulieren und/oder Insulininjektionen zu verabreichen, und die dafür durch häufige Tests der Blut-Glukose-Konzentration geleitet werden müssen, schnelle, preiswerte und akkurate Reagenzstreifen für die Glukose-Bestimmung zu haben.
Es sind Reagenzstreifen bekannt, die einen Indikator enthalten, der in Abhängigkeit von der Konzentration der Glukose in einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgetragen wurde, zu verschiedenen Farbstufen wechselt. Obwohl einige dieser Streifen Reduktionschemie verwenden, ist es üblicher, daß sie einen oxidierbaren Farbstoff oder ein Farbstoffpaar besitzen. Einige dieser Streifen beinhalten ein Enzym, wie die Glukoseoxidase, welche fähig ist, Glukose zu Gluconsäure und Wasserstoffperoxid zu oxidieren. Sie beinhalten außerdem einen oxidierbaren Farbstoff und eine Substanz, die Peroxidaseaktivität aufweist, welche fähig ist, selektiv die Oxidation des oxidierbaren Farbstoffs in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid zu katalysieren (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5,306,623, erteilt am 26. April 1994 an Kiser et al.).
U.S.-Patent Nr. 3,964,871, erteilt am 22. Juni 1976 an Hochstrasser, offenbart einen wegwerfbaren Indikator-Streifen für die direkte Messung von Substanzen, wie Glukose, in biologischen Flüssigkeiten. Der Indikator registriert die Konzentration der Substanz dadurch, daß er zugleich ein Indikatorreagenz, welches oxidiert wird und die Farbe ändert, wenn es mit der Substanz reagiert, und einen "Antagonist" enthält, der irgendwie verhindert, daß sich der oxidierte Indikator anhäuft, ehe er vollständig verbraucht wurde.
Palmer et al. offenbaren ein "digitales" quantitatives Testsystem für Glukose und andere Analyte in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 317 070, veröffentlicht am 24. Mai 1989 (siehe auch U.S.-Patent Nr. 5,036,000, erteilt am 30. Juli 1991). Dieses System mißt die Konzentration einer organischen Verbindung in einer biologischen Flüssigkeit durch erstens Oxidieren der Verbindung mit einem Substrat-spezifischen Oxidase-Enzym, um Wasserstoffperoxid herzustellen. Das System beinhaltet ein Chromogen, das ein Reduktant von Wasserstoffperoxid ist, und einen Luft-stabilen Wasserstoffperoxid-Reduktant, der ein größeres Reduktionspotential hat. Das größere Reduktionspotential verzögert jeden detektierbaren Farbwechsel des Chromogens, bis der Luft-stabile Wasserstoffperoxid-Reduktant verbraucht ist. Daher ergibt sich kein Farbwechsel, wenn das zu messende Wasserstoffperoxid weniger als ein vorgegebener Spiegel ist, der mit der Konzentration des Luft-stabilen Peroxid-Reduktanten korrespondiert. Im Ergebnis mißt das System die Konzentration quantitativ, unabhängig von der Farbwechselintensität.
Englemann, U.S.-Patent Nr. 4,738,823, erteilt am 19. April 1988, offenbart einen Teststreifen zur Analytbestimmung, der ein Trägermitglied hat, welches ein absorbierendes Material zur Entfernung von überflüssiger Probe hat, die auf den Streifen aufgetragen wird. Der Streifen kann auch eine Hülle beinhalten, welche eine Öffnung beinhaltet, durch welche die Probe aufgegeben werden kann.
Burkhardt et al., U.S.-Patent Nr. 4,810,470, erteilt am 7. März 1998, offenbart eine Vorrichtung zur Messung von Analytkonzentrationen in flüssigen Proben. Die Vorrichtung beinhaltet eine oder mehrere Feuchtigkeits-aufsaugende Matrizen, die von einem Feuchtigkeits-undurchlässigen Überzug oder Film abgedeckt sind. Die Probe wird auf einen Teil einer Feuchtigkeits-aufsaugenden Matrix aufgetragen und wird in die Matrix chromatographisch dosiert. Durch Dochtwirkung bewegt sich die Probe zu einer Testregion, die ein Testreagenz für den Analyt enthält.
Daffern et al., U.S.-Patent Nr. 4,994,238, erteilt am 19. Februar 1991, offenbart eine chemische Analyse-Test-Vorrichtung, die eine absorbierende Schicht, eine wasserundurchlässige Barriereschicht und eine Reagenzschicht, die ein determiniertes Volumen hat, umfaßt. Die Probe wird auf die Reagenzschicht durch ausgerichtete Löcher in den überlagernden absorbierenden und Barriereschichten aufgetragen.
Ob nun der Test zu Hause, in der Arztpraxis, Klinik oder einem Krankenhaus durchgeführt wird, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit einer Glukosebestimmung sind äußerst wichtig. Im Fall eines Farb-einzeigenden Reagenzstreifens ist es wünschenswert, daß der Farbwechsel ausgeprägt und unsensibel gegenüber Variationen der Komponenten der biologischen Flüssigkeit neben der Glukose ist. Im Fall eines visuell lesbaren Reagenzstreifens ist es besonders wichtig, daß Diabetiker, die eine eingeschränkte Sehfähigkeit haben können, einen Streifen haben, der einen signifikanten Farbwechsel in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration zeigt, obwohl der Farbwechsel durch einen Wechsel in der Absorption einer gegebenen Wellenlänge angezeigt wird, ist es auch bedeutend für die Genauigkeit von Meßgerät-lesbaren Streifen.
Da der Farbwechsel eine Reihe von chemischen Reaktionen einschließt, geschieht er nicht unmittelbar. Daher muß der Anwender eine Zeitdauer – von typischerweise einer Minute oder weniger – abwarten, damit die Reaktionen stattfinden können. Wenn ein Meßgerät den Streifen liest, kann ein Zeitschaltkreis ein Signal geben, das angibt, daß die Reaktionen vollständig sind. Wenn jedoch ein Streifen visuell ohne ein Meßgerät abgelesen wird, könnte der Anwender die benötigte Zeit unterschätzen, den Streifen frühzeitig ablesen und ein nicht korrektes Ergebnis erhalten. Alternativ dazu könnte der Anwender den Zwang dazu spüren, eine überzogene Zeit zu warten, ehe er den Streifen abliest, um sicher zu sein, daß die Reaktion vollständig ist, und dadurch eine unnötige Verzögerung und Anwender-Unzufriedenheit hervorrufen. Daher gibt es Bedarf für einen "chemischen" Timer, d. h. ein Element auf dem Streifen, das seine Farbe unabhängig von der Konzentration der Glukose (oder eines anderen Analyts von Interesse), in der Probe ändern wird, aber dies nur tun wird, wenn eine ausreichende Zeit vergangen ist, um die Farb-bildenden Reaktionen mit der Probe abzuschließen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein verlängerter mehrlagiger Reagenzteststreifen und eine Methode zum Messen der Konzentration von Analyt in einer Probe von biologischer Flüssigkeit zur Verfügung gestellt, wie in den anhängenden Ansprüchen definiert.
Der Streifen ist von der Art, daß er eine sichtbare Anzeige der Konzentration eines Analyts, das in einer biologischen Flüssigkeit enthalten ist, die auf eine "Probenseite" des Streifens aufgetragen wird, zur Verfügung stellt. Die sichtbare Anzeige erscheint auf der entgegengesetzten (oder der "Test"-)Seite des Streifens.
Die chemische Zusammensetzung des Teststreifens hängt natürlich von dem Analyt/der biologischen Flüssigkeit ab, die gemessen werden. Teststreifen können so angelegt sein, das sie Analyte, wie zum Beispiel Glukose oder andere Zucker, Alkohol, Cholesterol, Proteine, Ketone, Harnsäure, Phenylalanin oder Enzyme, in biologischen Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Blut, Urin und Speichel sowie Wasser, detektieren. Um der Bequemlichkeit und der Kürze Willen detektieren die Reagenzteststreifen, die am detailliertesten in dieser Beschreibung offenbart werden, Glukose im Blut. Ein Durchschnittsfachmann könnte einfach die Informationen in dieser Beschreibung auf die Detektion anderer Analyt/biologische Flüssigkeits-Kombinationen adaptieren.
Ein Teststreifen der vorliegenden Erfindung stellt eine relativ einfache und schnelle Bestimmung der Glukosekonzentration in einer ungemessenen Blutprobe zur Verfügung. Der Streifen umfaßt eine untere Lage mit einem durchgängigen Loch, in welchem eine Probe an die der Probenseite auf einer porösen Matrix herangeführt werden kann, deren entgegengesetzte Seite die Testseite ist. Die Matrix ist normalerweise eine Membran und beide Begriffe werden auswechselbar in der vorliegenden Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen verwendet. Ein Testreagenz wird auf die Matrix aufgetragen und wird zu einem größeren oder geringeren Ausmaß innerhalb der Poren der Matrix imprägniert. Der Einfachheit halber bezeichnen wir das Reagenz auf der Matrix in dieser Beschreibung und in den anhängenden Ansprüchen als eine "Beschichtung", und erkennen damit an, daß die Reagenzbeschichtung die Matrix penetriert.
Eine Zwischenlage liegt zwischen der unteren Lage und der Matrix. In einer Ausführung sind Ausschnitte in der Zwischenlage mit nicht-Feuchtigkeits-aufsaugenden Gebieten der Membran abgestimmt, um die Probe zu einer Reihe von Feuchtigkeits-aufsaugenden Testgebieten zu leiten, die entlang des Streifens angeordnet sind (wie in dieser Beschreibung und den angefügten Ansprüchen verwendet, soll "Feuchtigkeits-aufsaugend" absorbierend bedeuten). Eine Reihe von Aussparungen in der Zwischenlage umgeben die Räume um und über den Testgebieten, um den Fluß der Probe zu diesen Gebieten einzuschränken. In einer anderen Ausführungsform leitet ein verlängernder, hauptsächlich rechteckiger Schlitz in der Zwischenlage die Probe zu einer Reihe von Feuchtigkeits-aufsaugenden Gebieten, die durch eine nicht-Feuchtigkeits-aufsaugende Region voneinander separiert sind.
Ein feststehendes Volumen der Probe – typischerweise Vollblut, das rote Blutkörperchen und Glukose enthält – wird daher zur Probenseite der Membran auf jede der Reihen der Testgebiete geleitet. Die Porosität der Matrix erlaubt der Flüssigkeit von der Probenseite zur Testseite hin zu passieren, zum Beispiel durch Kapillarfluß. Somit kann das Testreagenz mit der Glukose im Blut reagieren, um einen Farbwechsel an oder nahe der Testseite hervorzurufen. Da die stark gefärbten roten Blutzellen es schwierig machen können, den Farbwechsel zu detektieren, ist die Matrix bevorzugt anisotropisch mit Porengrößen, die von großen Poren auf der Probenseite zu kleineren Poren auf der Testseite abgestuft sind, um die roten Blutkörperchen von der Testseite wegzufangen. Eine Vielzahl von Materialien kann für die verschiedenen Komponenten des Teststreifens und des Zeitmessers dieser Erfindung verwendet werden. Einige dieser Materialien werden in den U.S.-Patenten 5,306,623 und 5,418,148, erteilt am 26. April 1994 bzw. 23. Mai 1995 an Kiser et al., offenbart.
Das Testreagenz umfaßt eine Komponente, die Glukose in Wasserstoffperoxid umwandelt, wie zum Beispiel Glukoseoxidase; eine oder mehrere Komponenten für die Detektion von Wasserstoffperoxid, das aus der Glukose, die in der Probe vorhanden ist, hergestellt wird; und einen Inhibitor. Die Komponenten für die Detektion von Wasserstoffperoxid können eine Peroxidase, bevorzugt Meerrettichperoxidase, zusammen mit einem "Indikator" sein, der die Farbe im Laufe der Reaktion wechselt. Der Indikator kann ein oxidierbarer Farbstoff oder ein Farbstoffpaar sein. Die Peroxidase katalysiert die Oxidation des Indikators in der Anwesenheit von Wasserstoffperoxid. Das letzte Element des Reagenzes ist ein Inhibitor, der die farbwechselnde Oxidation des Indikators verzögert.
Der Streifen ist entlang seiner Länge in solch einer Art und Weise segmentiert, daß benachbarte Membransegmente verschiedene Inhibitorkonzentrationen haben. Jedes Segment hat ein Feuchtigkeits-aufsaugendes Testgebiet, das seine Farbe nur ändert, wenn genügend Glukose anwesend ist, um erstens zu verursachen, daß der gesamte Inhibitor verbraucht und danach der Indikator oxidiert wird und dabei den charakteristischen Farbwechsel hervorruft. Daher beweist ein Farbwechsel in einem bestimmten Gebiet eine Schwellen-Glukose-Konzentration in der Original-Blutprobe. Entlang des Streifens hat in einer bestimmten Richtung jedes sukzessive Segment eine stufenweise größere Inhibitor-Konzentration, die mit einem stufenweisen Anstieg in der Schwellen-Glukose-Konzentration korrespondiert. Die Indikator-Konzentration ist die gleiche für alle Segmente. Im Prinzip sind andere variierende Inhibitor/Indikator-Gleichgewichte auch möglich.
Wenn die Segmente Inhibitor-Konzentrationen in einem geeigneten Bereich für eine bestimmte Testprobe haben, reagieren benachbarte Testgebiete mit dem Analyt, so daß ein Gebiet gefärbt ist und ein benachbartes Gebiet nicht. Das Ergebnis indiziert, daß die GlukoseKonzentration in der Probe mindestens gleich der Schwellenkonzentration ist, die benötigt wird, um die Farbe in dem einen Gebiet zu ändern, aber nicht so groß ist, wie benötigt würde, um die Farbe in dem benachbarten Gebiet zu ändern.
Für Blut-Glukose-Monitoring umfaßt eine optionale Timer-Segment-Beschichtung die Elemente des Indikatorstreifens – eine poröse Matrix, die ein Testreagenz darauf beschichtet hat – und zusätzlich Glukose. Im trockenen Zustand wird die Reagenzchemie durch Glukose nicht aktiviert. Aber wenn eine Probe auf den Streifen aufgetragen wird, wird die Timer-Beschichtung hydriert und die Glukose in der Beschichtung verursacht nach einer vorbestimmten Zeit, daß der Indikator die Farbe wechselt. Bevorzugterweise ist Glukose im Timer in einer Menge anwesend, die sich in großem Überschuß über der Menge befindet, die benötigt wird, um den Inhibitor zu überwinden. In diesem Falle ist die benötigte Zeit länger oder kürzer in Abhängigkeit davon, ob mehr oder weniger Inhibitor anwesend ist. Die Farbwechsel in dem Streifen und in dem Timer können entweder direkt mit dem Auge oder mit einem optischen Instrument, das Wechsel in der Reflexion detektiert, beobachtet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
2 ist ein Ausschnitt der Unteransicht der Probenseite eines direkt-ablesbaren Reagenzteststreifens aus dem Stand der Technik.
3 ist eine vergrößerte fragmentarische, perspektivische Ansicht des Innenraums des Teststreifens von 2, partieller Ausschnitt.
4 ist ein Querschnitt des Streifens von 2, genommen entlang der Linie 4-4.
5 ist eine Unteransicht des Teststreifens von 2.
6 ist eine Draufsicht, die Testseite des Teststreifens von 5 zeigend.
7 ist der Streifen von 6 nachdem eine Probe darauf aufgetragen wurde.
8 ist ein Ausschnitt der perspektivischen Ansicht eines Teststreifens gemäß der vorliegenden Erfindung, gleichartig zum Teststreifen von 2.
9 ist eine Unteransicht des Teststreifens von 8.
10 ist eine Draufsicht des Teststreifens von 8.
11 ist ein Querschnitt des Streifens von 10, genommen entlang der Linie 11-11.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist ein direkt ablesbarer Reagenzteststreifen für die Messung der Konzentration eines Analyts in einer biologischen Flüssigkeit. Das Schlüsselelement eines solchen Teststreifens ist eine poröse Matrix, die ein Testreagenz beinhaltet, das einen Farbwechsel als Antwort auf den Analyt in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgetragen wird, eingeht.
Die Matrix kann eine einheitliche Zusammensetzung oder ein beschichtetes Substrat sein und kann entweder isotropisch oder anisotropisch sein. Sie hat eine Probenseite, auf welcher die Probe aufgetragen wird, und eine Testseite, auf der der Farbwechsel beobachtet wird. Bevorzugterweise ist die Matrix eine anisotropische Membran; mehr bevorzugt eine anistropische Membran, die einen breiten Bereich von Porengrößen hat. Zum Beispiel kann sich ein Gradient von Porengrößen von ungefähr 0,1 Mikrometer bis ungefähr 150 Mikrometer durch die Membran erstrecken. Auf der Seite der großen Poren ist die Porengröße bevorzugterweise im Bereich von 30 Mikrometer bis ungefähr 40 Mikrometer. Auf der Seite der Membran, wo die Poren am kleinsten sind, ist das Leervolumen relativ klein und das Material der Membran ist normalerweise ziemlich dicht innerhalb einer Schicht, die typischerweise bis zu 20% der Membrandicke ausmachen kann. Innerhalb dieser Schicht ist die Porengröße bevorzugterweise im Bereich von 0,1 bis ungefähr 0,8 Mikrometer, mit einer nominalen Porengröße von bevorzugt 0,3 Mikrometern. Wenn die biologische Flüssigkeit auf der Probenseite aufgetragen wird, trifft die Probe zunehmend kleinere Poren an, während sie die Membran penetriert. Letzten Endes erreichen Festkörper, wie zum Beispiel rote Blutkörperchen, eine Position in der Membran, wo sie nicht weiter penetrieren können. Der Rest der Probe, der immer noch die gelöste Glukose enthält, penetriert durch die Testseite. Die anisotropische Natur der Membran und/oder die Verwendung einer separierenden Komponente (diskutiert unten) erlaubt relativ schnelle Flußraten durch die Membran, auch wenn die Filtration von Festkörpern stattfindet.
Während die Probe durch die Matrix passiert, verursacht die Reaktion mit dem Reagenz, daß ein Licht-absorbierender Farbstoff in dem Leervolumen nahe der Testseite gebildet oder zersetzt wird, womit die Reflexion der Matrix wesentlich beeinflußt wird.
Polysulfone und Polyamide (Nylons) sind Beispiele für geeignete Matrixmaterialien. Andere Polymere, die vergleichbare Eigenschaften haben, können ebenso verwendet werden. Die Polymere können modifiziert werden, um andere funktionelle Gruppen einzuführen, die geladene Strukturen zur Verfügung stellen, so daß die Oberflächen der Matrix neutral, positiv oder negativ sein können.
Eine bevorzugte Methode zur Herstellung des porösen Materials, das die Matrix bildet, ist, den Polymer ohne einen unterstützenden Polymer zu gießen. Solch eine Matrix ist zum Beispiel die anisotropische Polysulfonmembran, erhältlich von Memtec, Inc., Timonium, MD. Eine Matrix von weniger als ungefähr 200 Mikrometern Dicke wird normalerweise verwendet, wobei ungefähr 115 bis 155. Mikrometer bevorzugt werden. Eine Dicke von ungefähr 130 bis 140 Mikrometer wird am meisten bevorzugt, besonders wenn die Matrix Nylon oder anisotropische Polysulfon ist.
Die Membran kann mit Testreagenz durch Eintauchen in eine Beimischung der Komponenten behandelt werden, wobei die Membran gesättigt wird. Bevorzugterweise werden mindestens einige der Komponenten sequentiell auf die Membran aufgetragen. Überschüssiges Reagenz kann durch mechanische Mittel, wie zum Beispiel ein Luftmesser, einen Schaber oder Glasstab, entfernt werden. Die Membran wird danach getrocknet. Das Reagenz tendiert dazu, sich nahe der kleinporigen (Test-)Seite der Membran zu konzentrieren.
Das Testreagenz umfaßt (i) eine Komponente, die Glukose in Wasserstoffperoxid umwandelt, (ii) eine Komponente zur Detektion von Wasserstoffperoxid, und (iii) eine Komponente zur Inhibierung der Komponente, die Wasserstoffperoxid detektiert. Das Reagenz kann optional weiterhin eine separierende Komponente umfassen, die dazu führt, daß Feststoffe, wie rote Blutkörperchen, in der Matrix gefangen und dabei effektiv die Feststoffe von der biologischen Flüssigkeit entfernt werden. Zusätzliche Komponenten können ebenso enthalten sein, wie hierin unten oder in den Beispielen beschrieben.
Bevorzugte Komponenten zur Umwandlung von Glukose in Wasserstoffperoxid beinhalten Glukoseoxidase, ein Enzym das normalerweise von Aspergillus niger oder Penicillium erhalten wird. Glukoseoxidase reagiert mit Glukose und Sauerstoff, um Glukonolacton und Wasserstoffperoxid herzustellen. Die optimale Glukoseoxidase- Konzentration hängt von der Zusammensetzung des Indikatorsystems ab. Wenn zum Beispiel das Indikatorsystem MBTHSB-ANS ist (welches unten beschrieben wird), dann ist die Glukoseoxidase im Bereich von ungefähr 500–10.000 U/ml geeignet, mehr bevorzugt von ungefähr 700–2.000 U/ml und am meisten bevorzugt ungefähr 1.000 U/ml. Normalerweise führen höhere Konzentrationen von Glukoseoxidase dazu, daß die Reaktion schneller abläuft und niedrigere Konzentrationen dazu, daß sie weniger schnell abläuft.
Das Wasserstoffperoxid, das so hergestellt wird, reagiert mit der Komponente zur Detektion von Wasserstoffperoxid, welches eine Peroxidase umfaßt, die selektiv eine Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid und einem Indikator katalysiert. Die Peroxidase verwendet Wasserstoffperoxid als ein Oxidans, welches fähig ist Wasserstoffatome von verschiedenen Substraten zu entfernen. Eine geeignete Peroxidase kann Eisenprotoporphyrin, ein rotes Hämin von Pflanzen erhalten, enthalten. Peroxidasen, die von Tieren, zum Beispiel aus den Schilddrüsen von Tieren, erhalten wurden, sind auch geeignet. Meerrettichperoxidase (HRPO) ist als ein Bestandteil der Komponente für die Detektion von Wasserstoffperoxid besonders bevorzugt.
Das Wasserstoffperoxid, bevorzugterweise katalysiert durch eine Peroxidase, reagiert entweder direkt oder indirekt, um einen Indikatorfarbstoff zu bilden oder zu zersetzen, der Licht in einem vorbestimmten Wellenbereich absorbiert. Bevorzugterweise absorbiert der Indikatorfarbstoff sehr stark bei einer Wellenlänge, die verschieden ist von der, bei welcher das Testreagenz stark absorbiert. Die oxidierte Form des Indikators kann das farbige, schwach farbige oder farblose Endprodukt sein, das einen Wechsel in der Farbe auf der Testseite der Matrix zeigt. Sozusagen kann das Testreagenz die Anwesenheit von Analyt in einer Probe durch ein farbiges Gebiet, das gebleicht wird, oder alternativ durch ein farbloses Gebiet, das Farbe entwickelt, anzeigen.
Indikatoren, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, enthalten (a) 3-Methyl-2-benzthiazolinonhydrazonhydrochlorid (MBTH) kombiniert mit 3-Dimethylaminobenzoesäure (DMAB); (b) MBTH kombiniert mit 3,5-Dichlor-2-Hydroxybenzol-Sulfonsäure (DCHBS); (c) 4-Aminoantipyren (4-AAP) und 5-Oxo-1-(p-sulfophenyl)-2-pyrazolin-3-carbonsäure (OPSP); (d) 4-AAP und N-(m-Tolyl)-diethanolamin (NDA); (e) 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolin)-sulfonsäure (ABTS); (f) 4-AAP und 4-Methoxynaphthol; (g) Pyrogallol-Rot (PGR); (h) Bromopyrogallol-Rot (BPR); (i) Acid Green 25 (AG); oder (j) [3-Methyl-2-benzthiazolinonhydrazon]-N-Sulfonylbenzolsulfonatmononatrium (MBTHSB), kombiniert mit 8-Anilino-1-naphthalensulfonsäureammonium (ANS). MBTHSB-ANS wird bevorzugt. Zusätzliche Informationen bezüglich MBTHSB-ANS findet sich in U.S.-Patent 5,563,031, erteilt am 8. Oktober 1996.
Die inhibierende Komponente verzögert die Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und dem Indikator, zum Beispiel durch die Reduktion des Wasserstoffperoxids oder durch Reduktion des oxidierten Indikators. Im Prinzip gibt es mehrere verschiedene Funktionsweisen für einen Inhibitor. Erstens könnte der Inhibitor mit dem Indikator konkurrieren und dabei die Geschwindigkeit, mit welcher der Farbwechsel im Indikator stattfindet, verlangsamen. Zweitens könnte der Inhibitor nicht-kompetetiv sein, so daß im wesentlichen der gesamte Inhibitor verbraucht wird, ehe ein wesentlicher Farbwechsel im Indikator stattfindet. Andere Funktionsweisen des Inhibitors sind ebenso möglich. Bevorzugterweise sind die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung nicht-kompetitiv.
Innerhalb des Bereichs der geeigneten Inhibitoren sind 2,3,4-Trihydroxybenzoesäure; Propylgallat; 3,4-Dihydroxyzimtsäure; 3,4-Dihydroxybenzaldeyd; Gallussäure; 5,6-Diaminourazil; Ascorbinsäure und Isoascorbinsäure. Ascorbinsäure wird bevorzugt; jedoch oxidiert Ascorbinsäure in Lösung und muß stabilisiert werden, um zu erlauben, daß das Reagenz beschichtet werden kann. Bevorzugte Stabilisatoren sind primäre Alkohole, wie Ethyl-, Methyl- oder Propylalkohol. Ethylalkohol wird bevorzugt, insbesondere konzentrierte Lösungen; d. h. Lösungen von 50% und mehr Ethanol.
Obwohl die anisotropische Membran, die die bevorzugte Matrix ist, die roten Blutkörperchen herausfiltiert und diese von der Testseite entfernt hält, kann das Testreagenz optional auch eine separierende Komponente enthalten. Die separierende Komponente sollte in der Lage sein, eine relativ klare farblose Flüssigkeit aus der Flüssigkeit, die rote Blutkörperchen enthält, wie zum Beispiel Vollblut, durch Absondern der roten Blutzellen in der Matrix herzustellen. Separierende Komponenten für die Anwendung in der vorliegenden Erfindung beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, Polyethylenglycol, Poly(methylvinylether/malein)anhydrid, Polypropylenglycol, Polystyrolsulfonsäure, Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol und Polyvinylsulfonsäure bei einem pH von zwischen ungefähr 4,0–8,0. Solche separierenden Komponenten sind in der Matrix in Mengen anwesend, die variieren werden in Abhängigkeit von Ihrer Ladung und dem molekularen Gewicht, den anderen Komponenten die in der Matrix eingelagert sind, dem Matrix-pH und der Porengröße und der Restflüssigkeit nach dem Trocknen. Solche Parameter können von einem Fachmann einfach bestimmt werden. Wenn zum Beispiel Polypropylenglycol als die separierende Komponente verwendet wird (zum Beispiel PPG-410 von BASF, Wyandotte, MI), ist es bevorzugterweise anwesend bei ungefähr 2–30% Volumenprozent (w/v) und mehr bevorzugterweise 8–10% w/v. Andere separierende Komponenten können ebenso in einer Konzentration von ungefähr 2–30% w/v angewendet werden. Die polymeren separierenden Komponenten können in die Matrix imprägniert oder eingebettet sein oder während der Herstellung in die Membran eingegossen werden.
Einige wasserlösliche Salze können auch die Blutseparierung beeinflussen. Unter geeigneten Salzen für die Separierung von Blutkomponenten sind Citrate, Formiate und Sulfate, sowie bestimmte Säuren, wie zum Beispiel Aminosäuren, Zitronensäure, Phytinsäure und Apfelsäure. (Siehe zum Beispiel U.S.-Patent 3,552,928, erteilt am 5. Januar 1971, an M. C. Fetter.) Ein Vorteil des Einbaus der separierenden Komponente ist, daß, wenn Festkörper, wie zum Beispiel rote Blutzellen, im wesentlichen von der biologischen Flüssigkeit entfernt werden, sich weniger Hintergrundfarbe an der Teststelle ergibt, die den Wechsel in der Farbe verschleiern würde, der durch das Testreagenz hervorgerufen wird.
Andere Komponenten können in die Matrix eingebettet sein, um die Färbung und Lesbarkeit der Reagenzstreifen zu verbessern und um die Einheitlichkeit und Integrität der Matrix zu erhalten. Zum Beispiel kann das Testreagenz Salze und/oder Puffer enthalten, um die Separierung des Farbstoffs in der Matrix zu unterstützen. Solche Puffer können zum Beispiel Citrate enthalten, anwesend in der Lösung von ungefähr 0,01 M bis ungefähr 1,0 M, und bevorzugt bei ungefähr 0,1 M. Andere Puffer können ebenso angewendet werden.
Verbindungen, die die Matrix hydrophil machen, oder Verbindungen, die als Stabilisatoren agieren können, wie zum Beispiel hydrolysierte Proteine, können ebenso verwendet werden. Solche Verbindungen beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, zum Beispiel Rinderserumalbumin, Polypeptide und Proteine mit geringerem Molekulargewicht, erhältlich als Crotein SPA (CRODA, Inc. New York, N. Y.). Solche Verbindungen werden bei Konzentrationen von zum Beispiel ungefähr 1 mg/ml bis ungefähr 100 mg/ml verwendet. Im Falle von Crotein werden ungefähr 30 mg/ml bevorzugt.
Andere Stablilisatoren und Konservierungsmittel können ebenso in der Beschichtung der Matrix enthalten sein. Zum Beispiel können Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und verwandte Verbindungen verwendet werden, zum Beispiel bei Konzentrationen von ungefähr 0,01 mg/ml bis ungefähr 10 mg/ml. Einer der Zwecke der Konservierungsmittel ist es, dabei zu helfen, den Inhibitor zu stabilisieren.
Einige der Inhibitoren (z. B. BPR) haben die unerwünschte Tendenz, in die Matrix zu migrieren. Wenn ein solcher Indikator verwendet wird, wird ein Ionenpaarbildner eingefügt, um diese Migration zu verhindern. Zum Beispiel sind Polyethylenglycolderivate, die als Polyquart (H) (Henkel, Inc., Ambler, PA) käuflich erhältlich sind, besonders nützlich aufgrund ihrer Fähigkeit, Ionenpaarbildung zwischen dem Indikator und anderen Matrixsubstituenten zu unterstützen.
Wenn die Anwesenheit eines Analyts durch Farbbildung (z. B. MBTHSB-ANS) indiziert wird, können oberflächenaktive Stoffe hinzugefügt werden, um die Farbe aufzuhellen und den Kontrast mit der ungefärbten Umgebung zu verstärken.
Organische Lösungsmittel können bei der Umsetzung dieser Erfindung verwendet werden und können in der Formulierung des Testreagenz für die Matrix beinhaltet sein, natürlich unter der Voraussetzung, daß sie kompatibel mit der Matrix und den Testreagenz-Zusammensetzungen sind. Potenziell nützliche organische Lösungsmittel beinhalten Chloroform, Aceton, Alkohole, Methylenchlorid, Diethyl- und Petroleumether, Acetonitrile und Gemische davon. Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung werden 70% Ethanol in Wasser besonders bevorzugt.
Das Testreagenz, das auf die Matrix beschichtet oder in die Matrix imprägniert ist, ist nicht einheitlich auf der Oberfläche der Teststreifens. Stattdessen wird das Reagenz bevorzugterweise auf die Matrix in einer Reihe von parallelen Streifen, oder „Segmenten", aufgetragen, die sich entlang der schmalen Dimension des Streifens erstrecken. Die Zusammensetzung in benachbarten Segmenten erhöht stufenweise die Inhibitorkonzentration. Jedes Segment hat ein feuchtigkeitsaufsaugendes Testgebiet. In den Testgebieten reagiert das Testreagenz mit jeder Glukose im Blut und ruft einen Farbwechsel hervor, unter der Voraussetzung, daß die Glukose-Konzentration groß genug ist, um den Inhibitorspiegel in diesem Testgebiet zu überwinden. Daher benötigt jedes nachfolgende Testgebiet eine stufenweise höhere Glukose-Konzentration in der Probe, um eine Farbänderung in dem Gebiet zu verursachen.
Optional ist eines der Testgebiete so eingerichtet, das es als ein Timer dienen kann, um anzugeben, daß genügend Zeit für das Reagenz vergangen ist, um mit der Glukose in jedem der Testgebiete zu reagieren. Das Timersegment der Matrix ist beschichtet oder imprägniert mit einer Komposition, die aus dem Testreagenz und zusätzlich Glukose besteht. Da die Aufgabe des Testreagenz darin besteht, die Farbe in Antwort auf Glukose zu ändern, benötigt das Vereinigen der beiden einige Sorgfalt, um keinen Farbwechsel hervorzurufen. Eine Menge an Inhibitor größer als diejenige, die für die Timingfunktion benötigt wird, muß anwesend sein, um diesen Effekt zu kompensieren. Die Geschwindigkeit, mit welcher das Timersegment getrocknet wird, nachdem die Glukose beinhaltende Lösung aufgetragen wird, wird kontrolliert. In der Praxis wird die Membran zuerst mit einer Lösung beschichtet, die die Pufferstabilisatoren und Enzyme beinhaltet, und danach wird die Beschichtung getrocknet, um eine erste Schicht zu bilden. Danach trägt ein zweiter Beschichtungs-Arbeitsgang eine Lösung auf, die den Indikator, Inhibitor und Glukose enthält. Parameter, wie die Netzgeschwindigkeit, die Ofentemperatur und der Luftstrom und die Quantität der Beschichtungslösungen, die aufgetragen werden, wird zuvor festgelegt und angemessene Anpassung der Inhibitor und/oder Glukosekonzentration werden gemacht. Statt des direkten Auftragens der zweiten Beschichtung beinhaltet eine weniger bevorzugte Alternative das Herstellen der zweiten Beschichtung auf einem separaten Netz und dem Plazieren dieses über der ersten Schicht.
Wenn eine Probe auf den Streifen aufgetragen wird, erlaubt die Hydration der TimersegmentZusammensetzung, daß die farbbildende Reaktion stattfindet. Die Zeit, die das Timersegment benötigt, um die Farbe zu wechseln, wird durch die Temperatur und die Eigenschaften des Testreagenz bestimmt, insbesondere die Inhibitorkonzentration, die Menge an Glukose und die Hydrations- und Sauerstoffdiffusionsraten.
Die Farbwechselzeit des Timers kann so gemacht sein, daß sie von der Glukosekonzentration in der Probe abhängig oder alternativ unabhängig von dieser Konzentration ist. Durch Einführen eines großen Überschusses an Glukose in den Timer ist die Zeit im wesentlichen unabhängig von der Glukose-Konzentration der Probe. Durch Einführen von weniger Glukose in den Timer kann die Zeit von der Glukose in der Probe abhängig gemacht werden; d. h. der Timer wird seine Farbe schneller ändern, wenn die Glukosekonzentration in der Probe größer ist. Bevorzugterweise ist die Glukosekonzentration im Timer größer als ungefähr 1.500 mg/dl, was den Timer im wesentlichen unabhängig von der Proben-Glukose-Konzentration im Bereich von ungefähr 40–400 mg/dl macht. Die Zusammensetzung des Timer-Segments beinhaltet Überschußmengen der Komponente (wie zum Beispiel Glukoseoxidase), die Glukose in Wasserstoffperoxid und an Glukose umwandelt. Die Timer-Zusammensetzung sollte dann mindestens so viel oder mehr Inhibitor enthalten wie das Ergebnis-Segment, das die höchste Inhibitorkonzentration enthält (welche mit dem höchsten Glukose-Meßwert korrespondiert).
Der Timer dient ebenso einer bedeutenden Qualitätskontrollfunktion, indem er deutlich macht, wann ein Teststreifen durch Feuchtigkeitsaussetzung beeinträchtigt wurde. Der Teststreifen muß bis zu der Zeit trocken bleiben, zu der er verwendet werden soll, weil die Komponenten, die Glukose in Wasserstoffperoxid umwandeln (normalerweise Enzyme), dazu tendieren, bei Feuchtigkeitsaussetzungen zu degenerieren. Wenn daher der Streifen vorzeitig Feuchtigkeit ausgesetzt wird, wird er beeinträchtigt. Aber die Beeinträchtigung des Teststreifens ist nicht offensichtlich für den Anwender, der daher den Teststreifen verwenden und ein falsches Ergebnis erhalten wird. Wenn jedoch der Streifen ein Timersegment enthält, wird die Feuchtigkeitsaussetzung einen Farbwechsel des Timers verursachen, was den Anwender darauf aufmerksam macht, daß der Streifen be einträchtigt wurde und nicht mehr verwendet werden sollte. Zusätzliche Informationen bezüglich des Timers finden sich in EP-97306765.5.
Zusätzlich zur Reagenz-enthaltenden Matrix beinhaltet der Streifen der vorliegenden Erfindung eine untere Schicht, die die Matrix unterstützt. Die untere Schicht ist bevorzugterweise ein Thermoplastiksheet, mehr bevorzugt ein Polyester, normalerweise ungefähr 0,05 bis 0,2 mm dick, und besitzt ein Loch, durch welches die Probe auf die Probenseite der Matrix aufgetragen werden kann. Vom Probenloch verteilt sich die Blutprobe entlang der Länge der Matrix. Wenn die untere Schicht hauptsächlich opak (blickdicht) ist, dann können eines oder mehrere transparente Fenstersektionen in entsprechenden Abständen vom Probenloch lokalisiert sein, wobei das Erscheinen der Probe in dem Fenster (Fenstern) bestätigt, daß ausreichend Probe auf den Streifen aufgebracht wurde.
Die Verteilung des Blutes vom Probenloch zu den Testgebieten involviert eine Zwischenschicht, die zwischen der unteren Schicht und der Membran liegt und optional an beiden anhaftet. Die Zwischenschicht ist bevorzugterweise ein Thermoplastiksheet, mehr bevorzugt ein Polyester, normalerweise ungefähr 0,05 bis 0,2 mm dick. In einer Ausführungsform aus dem Stand der Technik führen Ausschnitte in der Zwischenschicht die Probe entlang der Länge des Streifens auf nicht feuchtigkeitsaufsaugenden Wegen in der Membran und leiten die Probe zu jedem der Testgebiete. Aussparungen in der Zwischenschicht sind an die Testgebiete angeglichen, so daß jedes Testgebiet im wesentlichen von Mauern der Zwischenschicht umgeben ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die Zwischenschicht einen verlängerten, im wesentlichen rechteckigen Schlitz, der die Probe entlang der Membranoberfläche zu den Testgebieten führt. Die Schlitzbreite ist normalerweise im Bereich zwischen 0,5 bis 3 mm.
Eine bevorzugte Struktur für die nicht-feuchtigkeitsaufsaugenden Wege in der Membran wird durch das Kollabieren der Membranporenstruktur gebildet. Das kann durch Hitze hervorgerufen werden, entweder direkt oder unter der Verwendung eines Lasers oder Ultraschalls, und bevorzugterweise Druck beinhaltend. Jedoch ist die bevorzugte Methode Zerdrücken. Die Membran wird also zerdrückt, um sie nicht-feuchtigkeitsaufsaugend (aber immer noch hydrophil) überall, außer in den Testgebieten zu machen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Membran zwischen flachen Platten mit einem Stempel, der verhindert, daß die Testgebiete zerdrückt werden, zerdrückt. Drücke von mindestens ungefähr 6 Tonnen/in² (80.000 kPa) werden bevorzugt. Optional können die Platten auf mindestens ungefähr 110°C erhitzt werden. Die bevorzugten Drücke und Temperaturen hängen natürlich vom Zerdrückungsmechanismus und der Haltezeit sowie den Membranparametern ab. Optimale Werte können durch Routineexperimentation bestimmt werden. Die Ausführungsform, in welcher die Membran auf diese Weise zerdrückt wird, führt zu Testgebieten, die sich zur unteren Lage hin erstrecken, und wird, wie unten beschrieben, mit der eingekerbten Zwischenlage verwendet.
Für präzise Messungen ist das Volumen an Blut, was für jedes Testgebiet zur Verfügung gestellt wird, bevorzugterweise reproduzierbar. Würden die Aussparungen das gesamte Testgebiet umrunden, dann würde unter der Annahme eines flüssigkeitsfesten Siegels zwischen der Zwischenschicht und der unteren Schicht und der zerdrückten Membran jedes Testgebiet mit einem geschlossenen (zylindrischen) Volumen assoziiert sein, dessen Wände von der Zwischenschicht und dessen Enden von der Membran und der unteren Schicht gebildet werden. Jedoch läuft ein Verteilungskanal entlang des Streifens und führt Probe in jedes der Testgebiete. Bevorzugterweise hat die untere Schicht Entlüftungsbohrungen in Abgleich mit den Testgebieten, um das Füllen des Kanals und der Testgebiete einheitlich zu ermöglichen. Hohe Präzision erfordert, daß der Verteilungskanal ein fixes Volumen an Probe an jedes Testgebiet zur Verfügung stellt, aber danach nicht mehr; zumindest nicht im Zeitrahmen der Messung – ungefähr 1 bis 2 Minuten, beginnend ungefähr 90 Sekunden nachdem Blut aufgetragen ist. Da jedoch das Ausgangs-Probenvolumen variabel ist, gibt es bevorzugterweise eine absorbierende Schicht an jedem Ende der Membran, um überflüssige Probe von den Enden des Verteilungskanals abzutragen. Absorbierende Schichten an den Enden des Kanals verstärken auch die Dochtwirkung der Probe entlang der Länge des Streifens. Nicht-gewebte Materialien (Vliesstoffe), die im Stand der Technik sehr gut bekannt sind, bilden die bevorzugten absorbierenden Schichten.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Membran und das Deckblatt zwischen Rollen gedrückt. Das Deckblatt hat Löcher, die so positioniert sind, um die Testgebiete aufzunehmen, und diese Gebiete erstrecken sich dann in diese Löcher und verbleiben unzerdrückt. Für diese Ausführungsform wird kein Stempel benötigt und das Zerdrücken wird bevorzugterweise durch Rollen erreicht, mit einer angelegten Kraft von mindestens ungefähr 1.000 lb (4.450 N). Es ist zu bemerken, daß sich die Testgebiete in dieser Ausführungsform in die entgegengesetzte Richtung im Vergleich zu den Ausführungsformen aus dem Stand der Technik, wie oben beschrieben, erstrecken. Da die Probe zur oberen Schicht, offen zur Außenseite, hingezogen wird, werden keine Entlüftungsbohrungen in der unteren Schicht verwendet. Diese Ausführungsform wird mit der Zwischenschicht verwendet, die einen im wesentlichen rechteckigen Schlitz hat, der die Probe zu den Testgebieten leitet. Da diese Ausführungsform ein Probenloch hat, das sich in der Nähe des Endes des Streifens befindet, das „hohe Glukose"-Testgebiete hat, wird nur eine einzige absorbierende Schicht nahe des entgegengesetzten Ende des Streifens verwendet.
Der Farbwechsel, der durch Glukose in der Testprobe hervorgerufen wird, erscheint auf der Testseite der Membran. In der Ausführungsform, in welcher sich die Testgebiete zur unteren Schicht erstrecken, ist es günstig, die Testseite der Membran mit einer oberen Schicht zu belegen, die Löcher hat, die mit den Testgebieten abgeglichen sind. Die Löcher machen den Farbwechsel sichtbar und erlauben außerdem dem Sauerstoff, die Reaktionsstellen zu erreichen. Wenn sich die Testgebiete in die entgegengesetzte Richtung erstrecken, definieren die Löcher in der oberen Schicht die Testgebiete während des Zerdrückungsprozesses, wie oben beschrieben. In beiden Fällen ist die obere Schicht bevorzugterweise ein Thermoplastiksheet, mehr bevorzugterweise ein Polyester, normalerweise ungefähr 0,05 bis 0,2 mm dick. Die obere Schicht kann an die Membran angeheftet sein, zum Beispiel mit einem Haftmittel. Jedes Haftmittel ist bevorzugterweise limitiert zu den nicht-feuchtigkeitsaufsaugenden Gebieten der Membran, falls es mit den Reaktionen der Glukose-Messung interferieren würde. Wenn jedoch das Haftmittel nicht mit den Reaktionen interferiert, so ist seine Platzierung weniger kritisch.
Da die Testgebiete, wenn sie das bevorzugte Reagenz enthalten, langsam einen Farbwechsel unterlaufen, wenn sie Licht oder Sauerstoff ausgesetzt sind, und da der optionale Timer sensitiv gegenüber Feuchtigkeit ist, werden die Streifen bevorzugterweise in einer blickdichten Sauerstoff- und feuchtigkeits-undurchlässigen Verpackung verpackt, wie zum Beispiel versiegelten Folienverpackungen. Wenn die Streifen einzeln verpackt sind, kann der Streifen in der geöffneten Verpackung während der Anwendung verbleiben.
Die Erfindung wird nun weiterhin mit Bezug auf die Figuren, in welchen die 1–7 Reagenzstreifen des verwandten Standes der Technik illustrieren, beschrieben. 1 zeigt eine Matrix 10 für die Messung der Menge an Analyt in einer biologischen Flüssigkeit. Obwohl in einer bogenförmigen Position gezeigt, ist Matrix 10 flexibel und normalerweise in einer flachen Ebene, wenn sie benutzt wird. Die Matrix beinhaltet eine Probenseite 12, auf welcher die biologische Flüssigkeitsprobe aufgetragen wird, und eine Testseite 14, an oder nahe welcher ein Wechsel in der Farbe die Anwesenheit des Analyts indiziert. Der Farbwechsel resultiert aus der Interaktion von Analyt mit Reagenz imprägniert in Poren 16. Bevorzugterweise sind für die Messung der Konzentration von Glukose in Blut die Porengrößen relativ groß nahe der Probenseite 12 und verringern ihre Größe, wenn sie sich die Testseite 14 nähern. Der Gradient der Porengrößen dient dazu, rote Blutkörperchen nahe der Probenseite 12 zu fangen, so daß deren Farbe nicht mit der Fähigkeit interferiert, den Farbwechsel zu sehen, der die Anwesenheit des Analyts anzeigt.
Drei parallele Segmente, a, b und c sind schematisch gezeigt. Jedes nachfolgende Segment enthält stufenweise mehr Inhibitor als dasjenige davor. In einer bevorzugten Ausführungsform wird, nachdem das Reagenz auf die Membran in parallelen Segmenten, wie gezeigt, aufgetragen wurde, die Membran überall dort, außer in den Testgebieten, gedrückt, wo die Analyt-Reagenz-Reaktionen stattfinden. Eine Ausführungsform eines Musters von feuchtigkeitsaufsaugenden Testgebieten – ein einzelnes Gebiet lokalisiert in jedem der parallelen Segmente – und nicht-feuchtigkeitsaufsaugenden zerdrückten Gebieten ist in der Draufsicht von 2 und der vergrößerten, fragmentarischen perspektivischen Ansicht von 3 dargestellt.
2 ist eine Unteransicht, teilweise ein Ausschnitt, der Probenseite 12 der Membran 10 und den absorbierenden Schichten 20 und 22, übergelegt mit der Zwischenschicht 24 und der unteren Schicht 26. Membran 10 und absorbierende Schichten 20 und 22 sind bevorzugterweise unterstützt durch eine oberste Schicht, nicht gezeigt. Absorbierende Schichten 20 und 22 sind bevorzugterweise an den Enden der Membran lokalisiert (über den gestrichelten Linien A und B), um die Blutprobe zu absorbieren, die in Überschuß des Volumens, das für die Messung gebraucht wird, vorliegt. Dieses Volumen muß ausreichend sein, um Proben für jedes der Testgebiete, und, wenn anwesend, ebenso für das Timergebiet zur Verfügung zu stellen. Im allgemeinen benötigt ein Streifen, der weniger Testgebiete hat, nicht so viel Probe, stellt aber einen geringeren Bereich von Glukosewerten und/oder weniger Präzision zur Verfügung. 2 zeigt 9 feuchtigkeitsaufsaugende Gebiete, die 8 Testgebiete (numeriert 1–8) und einen Timer (T) repräsentieren, welche einen adäquaten Bereich und Präzision zur Verfügung stellen, die wiederum keine unakzeptabel großen Proben benötigen. Die Zwischenschicht 24 hat eine Aussparung 28, welche mit Probenloch 30 in der unteren Schicht 26 abgleicht. Die Probe wird durch das Probenloch 30 eingeführt und durch Kapillarfluß entlang des zentralen Kanals 32 der Zwischenschicht 24 zu jedem der Testgebiete und dem Timinggebiet geleitet, wobei jeder Überschuß an Probe in den absorbierenden Schichten 20 und 22 absorbiert wird. Das Erscheinen der Probe durch optionale klare Fenster 34 und 35 bestätigt, daß genügend Probe für die Messung zur Verfügung gestellt wurde. Bevorzugterweise bildet die Zwischenschicht 24 ein Siegel mit der Probenseite 12 der Membran, so daß zum Beispiel die Probe nicht direkt zwischen den benachbarten Testgebieten fließen kann.
3 ist eine vergrößerte fragmentarische, perspektivische Ansicht, die Teile von drei Testgebieten 6, 7 und 8 darstellt, gesehen durch die untere Schicht 26 und separiert durch Finger der Zwischenschicht 24. Optionale anhaftende Schichten 24a verbinden Zwischenschicht 24 mit der unteren Schicht 26 und Membran 10. Belüftungslöcher 40 in der Schicht 26 ermöglichen den Probenfluß in den Streifen. Löcher, wie zum Beispiel 38, in der obersten Schicht 36 reihen sich mit den feuchtigkeitsaufsaugenden Gebieten in eine Reihe, machen jeden Farbwechsel in den feuchtigkeitsaufsaugenden Gebieten sichtbar und nehmen Sauerstoff auf, der für die Farbwechselreaktion nötig ist. Optionale anhaftende Schichten 36a verbinden die oberste Schicht 36 mit der Testseite von Membran 10.
4 ist ein Querschnitt, entlang der Linie 4-4 von 2 genommen, welcher die oberste Schicht 36 zusätzlich zu den Schichten, die in 2 gezeigt werden, zeigt. Entlüftungsbohrungen in der unteren Schicht 26, wie zum Beispiel 40, sind abgeglichen mit den Test- und den Timergebieten und ermöglichen, daß die Probe das Volumen, das jedes dieser Gebiete umgibt, füllt. Die Volumen, die gefüllt werden, werden begrenzt durch Membran 10, Zwischenschicht 24 und untere Schicht 26. Es ist zu bemerken, daß sich das säulenartige Testgebiet 3 zur unteren Schicht 26 erstreckt und daß es minimale Separation zwischen dem Testgebiet und der unteren Schicht, die typischerweise nur ungefähr 12 Mikrometer beträgt, gibt. Die Separierung ist zur Klarheit größer gezeigt als der Maßstab.
5 ist eine Unteransicht eines Streifens der vorliegenden Erfindung, die das Probenloch 30 und graphische Darstellungen zeigt, die den Anwender anleiten, die Probe durch das Loch einzuführen. Wenn die Probe durch die durchsichtigen Fenster 34 und 35 gesehen wird, bestätigt dies, daß adäquat Probe auf den Streifen aufgetragen wurde.
6 ist eine Draufsicht auf die obersten Schicht 36 eines Streifens, der kalibriert wurde, um die Testgebiete mit der Glukosekonzentration zu assoziieren.
7 zeigt den Streifen von 6, nachdem eine Blutprobe in die Öffnung 30 (2) aufgetragen wurde, die Probe sich entlang des zentralen Kanals 32 verbreitet und Glukose in der Probe mit dem Reagenz in den Testgebieten reagiert hat. Da das untere Testgebiet den wenigsten Inhibitor hat, wird dieses Gebiet seine Farbe zuerst ändern. Danach werden das zweite und danach das dritte Gebiet die Farbe ändern. Die oberen Kreise veränderten ihre Farbe nicht, da zu wenig Glukose in der Probe vorhanden war. Da genügend Zeit vergangen ist, so daß Timergebiet 32 die Farbe ändern konnte, kann der Streifen abgelesen werden. Daher indiziert das Ergebnis, welches in 7 abgebildet ist, daß die Glukose-Konzentration der Probe mindestens 120 mg/dl, aber weniger als 150 mg/dl beträgt. Der Meßwert kann zu jeder Zeit abgelesen werden, nachdem Timergebiet 32 die Farbe geändert hat. Man beachte, daß in 7 die Farbänderung, die durch die Reaktion mit Glukose verursacht wurde, von weiß nach farbig ist. Jedoch könnte das System alternativ mit einem Indikatorfarbstoff durchgeführt werden, der durch die Glukose-induzierte Oxidation zerstört wird, mit einer korrespondierenden Farbänderung von farbig bis weiß.
8 ist eine Ausschnitt-, perspektivische Ansicht von einer Ausführungsform des Streifens dieser Erfindung. Die untere Schicht 126 hat Probenloch 130 zum Einführen der Blutprobe. Im Gegensatz zur Ausführungsform von 2, wo das Probenloch 30 nahe der Mitte (Ende-zu-Ende) des Streifens lokalisiert ist, ist das Probenloch 130 nahe des Endes des Streifens lokalisiert, das die Testgebiete, die die hohe Glukosekonzentrati on indizieren sowie den optionalen Timer haben. Das Positionieren des Probenloches an diesem Ende stellt zwei Vorteile zur Verfügung. Erstens ist die Zeit, die für die Glukosemessung benötigt wird, reduziert durch die reduzierte Zeit, die das Blut benötigt, um die „hohe Glukose"-Testgebiete zu erreichen (welche am längsten brauchen, um zu antworten). Zweitens ist die Timer-Variabilität reduziert, weil die Probe im wesentlichen direkt auf den Timer appliziert wird, was die Variabilität in der Zeit eliminiert, die das Blut benötigt, um den Timer zu erreichen. Die Zwischenschicht 124 hat einen verlängerten Schlitz 132, der die Länge des Streifens von einem Ausschnitt, der mit dem Probenloch 130 korrespondiert und mit diesem abgeglichen ist, entlangführt. Der Schlitz kanalisiert die Blutprobe entlang der Länge des Streifens, über Membran 110, in Richtung der absorbierenden Schicht 120. Wenn die Probe über die Membran 110, passiert, wird ein Teil davon in den Timer T' und in jedes der 8 Testgebiete (numeriert 101–108) abgelagert. Der Timer und die Testgebiete werden jeweils durch korrespondierende Löcher in der obersten Schicht 136 beobachtet, die mit diesen abgeglichen sind. Das Sichtbarwerden von Blut durch das durchsichtige Fenster 135 bestätigt, daß ausreichend Probe für die Messung zur Verfügung gestellt wurde.
9 ist eine Unteransicht des Streifens von 8, in welchem die graphischen Darstellungen (wie dargestellt in 5) entfernt wurden, welche den Anwender anleiten, die Probe durch das Loch 130 in der unteren Schicht (und mit-ausgerichtetes Loch 128 in der Zwischenschicht) einzuführen.
10 ist eine Draufsicht der obersten Schicht 136, die die Timer-Graphiken sowie die Kalibrierung der Testgebiete zeigt.
11 ist ein Querschnitt entlang der Linie 11-11 von 10, welcher die oberste Schicht 136, Membran 110, Zwischenschicht 124 und untere Schicht 126 zeigt. Der Pfeil illustriert die Richtung der Probeneinführung in das Loch 130, in die untere Schicht 126 und mit-ausgerichtetes Loch 128, in der Zwischenschicht 124. Man nehme zur Kenntnis, daß sich das säulenartige Timergebiet T' aufwärts in Richtung und bevorzugterweise in das korrespondierende Loch 138 erstreckt, welches mit dem Timer T' abgeglichen und eines der neun Löcher in der obersten Schicht 136 ist, die mit dem korrespondierendem Timer und Testgebieten abgeglichen sind.
Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung illustrieren die folgenden Beispiele weiterhin die verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen nicht dazu, in irgendeiner Art und Weise limitierend zu sein.
BEISPIEL 1 – BPR-INDIKATOR
Die folgenden Lösungen wurden präpariert: Enzymlösungen
Memtec BTSH 55-Membran wurde in dieser Lösung Immersions-beschichtet und mit Glasstäben abgeschabt. Die beschichtete Membran wurde in einem Flotationstrockner bei 180F unter moderaten Luftflüssen getrocknet, so daß das Netz im wesentlichen innerhalb von 20 Sekunden trocken war. Das Netz wurde in Vorbereitung für die zweite Beschichtung, die unten beschrieben ist, gespult.
Die folgenden Lösungen wurden präpariert

Timerlösung

Verdünnungsmittel (nach oberer Formel) 120 g

Ascorbinsäure 0,885 g

Glukoselösung 17,25 g
Die folgenden Verdünnungen der Stammlösung wurden hergestellt:
0,0405 : 1; 0,108 : 1; 0,236 : 1; 0,369 : 1; 0,569 : 1; 1,260 : 1. Dieser stufenweise Anstieg in der Inhibitorkonzentration korrespondiert mit dem der stufenweise größeren Glukosekonzentration, die die Testgebiete anzeigen. Diese Lösungen wurden zusammen mit der Timerlösung Seite an Seite auf die große-Poren-Seite der Enzym-beladenen Membran beschichtet, so daß ungefähr 1,2 × 10^–4 ml pro Quadratmillimeter Membran abgelagert wurden. Die Membran war für ungefähr 15 Sekunden naß, bevor sie die gleichen Trockenbedingungen, wie oben für den Enzym-Beschichtungs-Schritt beschrieben, erfuhr.
Die Ergebnisse zeigen, daß der Timer in ungefähr 70 Sekunden reagierte, mit ungefähr 95% der Ergebnisse zwischen 64 und 69 Sekunden fallend.
BEISPIEL 2 – MBTHSB-ANS-INDIKATOR

Die folgende Lösung wurde hergestellt:

HPLC-Wasser	1500 ml
Zitronensäure	16,92 g
Natriumzitrat	20,88 g
Mannitol	15 g
Dinatrium EDTA	1,26 g
Gantrez S95	6,75 g
Crotein SPA	36 g
Glukoseoxidase	1,69 MU
HRPO	1,5 MU
Carbopol 910	75 ml
Dinatriumzitrat	225 ml

Memtec BTS 55-Membran wurde in einer Mulde beschichtet, so daß die großporige Oberfläche die Beschichtungslösung berührte; Überschuß an Lösung wurde wie zuvor mit Glasstäben entfernt. Die Membran wurde getrocknet und gespult wie in Beispiel 1.
Die folgenden Lösungen wurden hergestellt:
Für jede Inhibitorlösung wurde das Volumen von Lösung A auf 263 ml festgelegt. Für die verschiedenen Testgebiete wurde das Verhältnis von 70% EtOH : Lösung C von 58,9 bis 0,200 variiert, so daß das Volumen von 70% EtOH + Lösung C addiert zu Lösung A 87,5 ml für alle Inhibitorlösungen war. Dies modifizierte tatsächlich nur die Konzentration von Inhibitor in jeder Lösung. Die Lösungen, die die stufenweise ansteigende Inhibitorkonzentration enthielten, und die Timerlösung (Lösung D), wurden Seite an Seite auf die großporige Seite der Membran geschichtet. Die Auftragungsrate wurde adjustiert, um ~8 × 10^–5 ml Inhibitor pro Quadratmillimeter Membran zu erreichen. Die Membran wurde wie oben getrocknet, außer daß der Abstand zwischen Beschichtung und Trocknung ungefähr 1,6 Minuten betrug. Die Ergebnisse zeigten, daß der Timer in ungefähr 60 Sekunden reagierte, mit wenig Einfluß von Bluthämatocrit von 30–55% oder Glukose von 78 bis 420 mg/dl.

Claims

Verlängerter mehrlagiger Reagenzteststreifen zum Messen der Konzentration von Analyt in einer Probe von biologischer Flüssigkeit, die auf den Streifen aufgebracht wird, umfassend: a) eine untere Lage (126) mit einem durchgängigen Loch (130) zum Aufnehmen der Probe; b) eine Membranlage (110) mit einer Probenseite zur unteren Lage zeigend und einer Testseite gegenüber davon und angeordnet entlang ihrer Länge einer Vielzahl von einzelnen saugfähigen Testbereichen (101–108), getrennt durch eine nicht-saugfähige Region, wobei die Membran ein Reagenz enthält, das mit dem Analyt reagieren kann, um einen Farbwechsel zu ergeben, wobei das Reagenz umfaßt i) eine erste Komponente, die mit dem Analyt interagiert, um Wasserstoffperoxid zu bilden ii) eine zweite Komponente, die mit dem Wasserstoffperoxid interagiert, um einen Farbwechsel einzugehen; und iii) eine dritte Komponente, die den Farbwechsel der zweiten Komponente inhibiert; c) eine Zwischenlage (124) zwischen der unteren und den Membranlagen; d) eine obere Lage (136); und e) Dosierungsmittel, um die Probe entlang des Streifens zu verteilen, wobei die Dosierungsmittel einen Flüssigkeitstransportkanal umfassen, der in der Zwischenlage gebildet wird, um Proben über die Membranoberfläche zu den saugfähigen Testgebieten zu leiten; wobei die Inhibitorkonzentration in einer vorgegebenen Weise mit dem Abstand von einem ersten Ende des Streifens zunimmt, so daß eine entsprechende zunehmende Konzentration an Analyt in der Probe enthalten sein muß, wenn sie einen Farbwechsel bewirken soll, wobei ein oder mehrere Testbereiche die Farbe verändern können, wenn eine Probe auf den Streifen aufgebracht wird, und das farbveränderende Gebiet, das am weitesten von dem ersten Ende entfernt ist, die Analytkonzentration der Probe anzeigt, in welchem die saugfähigen Gebiete und die nicht-saugfähige Region jeweils unzerstörte und zerstörte Bereiche der Membranlage umfassen, und die unzerstörten saugfähigen Gebiete im wesentlichen säulenartig sind, jedes mit einer Basis in der Membran und einem Ende gegenüber der Basis, das an die obere Lage angrenzt, und wobei der Streifen weiterhin eine absorbierende Lage umfaßt, die das Ende der Membran berührt, das dem ersten Ende des Streifens am nächsten ist, und wobei sich das durchgängige Loch (130) zur Aufnahme der Probe nahe des Endes des Streifens befindet, das entfernt vom ersten Ende ist.
Streifen nach Anspruch 1, in welchem der Analyt Glukose ist.
Streifen nach Anspruch 1 oder 2, in welchem die biologische Flüssigkeit Blut ist.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in welchem die obere Lage (136) weiterhin eine Vielzahl von durchgängigen Löchern umfaßt, die nach den Testgebieten ausgerichtet sind.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in welchem die untere Lage (126) ein thermoplastische Lage umfaßt, die bevorzugterweise Polyester ist.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in welchem die untere Lage (126) einen durchsichtigen Abschnitt (135) hat, der sich in einem vorbestimmten Abstand zum Probenaufnahmeloch (130) befindet, um eine geeignete Probenmenge sicherzustellen.
Streifen nach Anspruch 1, in welchem die Membranlage eine anisotrope poröse Membran umfaßt, die Poren aufweist, die nahe der Probenseite größer und nahe der Testseite kleiner sind.
Streifen nach Anspruch 7, in welchem die biologische Flüssigkeit Vollblut ist, das rote Blutzellen enthält, und die Porengröße so gewählt ist, daß die roten Blutzellen der Vollblutprobe in der Membran gefangen werden.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in welchem die Membran Polysulfon umfaßt.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in welchem der Flüssigkeitstransportkanal ein verlängerter im wesentlichen rechteckiger Schlitz (132) ist, der sich bevorzugt über die Länge des Streifens hinweg vom Probenloch (130) erstreckt.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in welchem die erste Komponente Glukose-Oxidase umfaßt.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 11, in welchem die zweite Komponente eine Peroxidase umfaßt, bevorzugt Meerrettichperoxidase, und einen Indikatorfarbstoff oder ein Farbstoffpaar, der/das die Farbe ändert, wenn er/es oxidiert ist, bevorzugt [3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon] N-sulfonylbenzensulfonatmononatrium, kombiniert mit 8-Anilin-1-Naphthalinsulfonsäureammonium (MBTHSB-ANS).
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, in welchem die dritte Komponente Ascorbinsäure umfaßt.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 13, in welchem das Reagenz weiterhin eine Trenn-Komponente umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Polyethylenglycol, Poly(methylvinylether/malein)anhydrid, Polypropylenglycol, Polystyrolsulfonsäure, Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol und Polyvinylsulfonsäure.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, in welchem die Zwischenlage eine thermoplastische Lage umfaßt, bevorzugt aus Polyester.
Streifen nach einem der Ansprüche 1 bis 15, weiterhin umfassend ein Zeitmeßelement (T'), welches einen Testbereich umfaßt, das zusätzlich zum Reagenz eine Menge an Glukose beinhaltet, die das Gebiet veranlaßt, seine Farbe in einer vorbestimmten Zeit, nachdem die Probe auf den Streifen aufgebracht wurde, zu verändern.
Verfahren zur Messung der Konzentration eines Analyts in einer Probe an biologischer Flüssigkeit, umfassend die Schritte von: (a) Aufbringen der Probe auf einen Reagenzteststreifen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 16 definiert, und (b) Bestimmen der Analytkonzentration durch Beobachten desjenigen Testbereichs, das seine Farbe verändert und am weitesten vom ersten Ende des Streifens entfernt ist.