DE69021327T2

DE69021327T2 - Verbesserung in einem gerätefreien auf Entfernungsbestimmung beruhenden diagnostischen Test.

Info

Publication number: DE69021327T2
Application number: DE69021327T
Authority: DE
Inventors: Michael P Allen; Prithipal Singh; Satinder Singh
Original assignee: ChemTrak Inc
Current assignee: ChemTrak Inc
Priority date: 1989-11-08
Filing date: 1990-11-07
Publication date: 1996-03-14
Anticipated expiration: 2010-11-08
Also published as: EP0427534A1; DE69021327D1; EP0427534B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft instrumentenlose diagnostische Vorrichtungen und Assays.
Es bestand ein wachsendes Interesse daran, einen Analyten semiquantitativ oder quantitativ mit einem minimalen technischen Aufwand bestimmen zu können. Für viele Krankheitszustände, z.B. einen hoben Cholesterinspiegel, Diabetes od.dgl., oder in anderen Situationen, wo Arzneimittelwerte kontrolliert werden müssen, wäre es besonders zweckmäßig, wenn die Bestimmungen zuhause erfolgen können. Eine Reihe von Assays wurde entwickelt, die es einer Einzelperson ermöglichen, die Menge eines Analyten in einer Körperflüssigkeit, wie z.B. Blut oder Harn, zu bestimmen. Trotz umfangreicher Bemühungen bei der Entwicklung solcher Assayarten besteht nach wie vor ein Interesse an Verbesserungen, die zu leichteren Arbeitsvorschriften, raschen Ergebnissen, hoher Genauigkeit, leicht ablesbaren Werten u.dgl. führen würden.
Demacker et al., Clin. Chem. (1983) 29: 1916-1922 berichten über die Auswertung durch Cholesterin-Assaysets. Beispiele für Untersuchungen über Enzymassays sind: Gochman und Schmitz, Clin. Chem (1971: 17:12; Paul, The Enzymes (1963) 8: 227- 274; Current Status of Blood Cholesterol Measurement in Clinical Laboratories in the United States: A Report from the Laboratory Standardization Panel of the National Cholesterol Education Program (1988) 34(1): 193-201; und US-A-4.391.904; 4.366.241; 4.168.146; 4.435.504; 4.533.629; 4.504.659, sowie darin angeführte Quellenverweise. Siehe auch Zuk et al., Clin. Chem. (1985) 31: 1144-1150.
DE-C-22 22 951 beschreibt eine Filteranordnung mit chemischen Reagentien zur Entfernung von Zellen aus Blut und zur Messung von CPK; WO 88/03650 zeigt ein diagnostisches Werkzeug, worin Bluttypen und Blutanalyten durch Signalsysteme auf saugfähigen Streifen bestimmt werden, wobei die Messung eine Funktion des Abstands einer Grenzlinie von einer bestimmten Stelle ist. Die Verbesserung ermöglicht das Einfangen des Analyten oder eines Reagens eines ein nachweisbares Signal erzeugenden Systems, was zur Abwesenheit eines Signals außerhalb eines vorbestimmten Bereichs führt, wo die Menge an Analyt unterhalb eines Schwellenwerts liegt. Eine Zone ist vorgesehen die die Reaktion einer an eine Oberfläche im Flußweg gebundenen Substanz ermöglicht, was verhindert, daß ein Signal in der Meßzone auftritt, wenn der Analyt nicht oberhalb eines vorbestimmten Schwellenwerts liegt.

Erklärung der Abbildungen:

Fig.1 ist eine schematische Draufsicht eines Meßstreifens als Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
Fig.2 ist eine schematische Draufsicht der Basisplatte und des Schiebers einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
Figuren 3a und 3b sind schematische Draufsichten einer die Basisplatte bedeckenden Zwischenplatte bzw. der umgedrehten Platte zur Darstellung der Unterseite der alternativen Ausführungsform;
Fig.4 ist eine Draufsicht der zusammengesetzten alternativen Ausführungsform; und
Figuren 5 bis 7 sind schematische Ansichten von Vorrichtungsstreifen-Konfigurationen.

BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Es werden Verfahren und Vorrichtungen zur Messung eines Analyten unter Verwendung eines kontinuierlichen Flußwegs bereitgestellt der einen Probenaufnahmebereich, einen Reagenseinfangbereich zum Erhalt eines nachweisbaren Signals und einen Meßbereich aufweist. Die Gegenwart von Analyt und Reagentien des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals führt zur Erzeugung eines Produkts, das direkt oder indirekt mit einem anderen Element des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals reagiert, das an die Oberfläche des Meßbereichs gebunden ist. Das Ergebnis ist die Bildung z.B. einer gefärbten Zone im Meßbereich, wenn die Menge an Analyt oberhalb eines Schwellenwerts liegt. Die Entfernung der Grenze der gefärbten Zone von einer vorbestimmten Stelle kann mit der Analytenmenge in einer Probe in Verbindung gebracht werden. Das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung können an mehrere unterschiedliche Anwendungen angepaßt werden.
Es eignen sich zahlreiche Verfahren zur Gestaltung des Flußwegs und zur Bildung eines Flusses einer Reagenslösung durch den Probenbereich, den Reagenseinfangbereich und den Meßbereich. Außerdem kann man verschiedene Arten von Chemie unter Verwendung unterschiedlicher Typen von Reagenssystemen verwenden, um das gewünschte Signal zu erzeugen. Der Assay kann semiquantitativ oder quantitativ sein. Bei quantitativen Assays zeigt der Abstand der Grenze des nachweisbaren Signals, d.h. der gefärbten Grenze, von einer vorbestimmten Stelle die Analytenmenge in der Probe an.
Der Flußweg wird in fünf Bereiche eingeteilt, wobei bestimmte Bereiche einander entweder ganz oder teilweise überlappen können. Ein Bereich ist ein Transferbereich, der zur Beförderung eines Transportmediums (üblicherweise einer Reagenslösung) von einer Transportlösungsquelle in den Flußweg dient. Der Transferbereich kann auch ganz oder teilweise die im Reagensreaktionsbereich enthaltenen Elemente enthalten. Dies würde es dem Transportmedium erlauben, diese Reagentien zum Probenaufnahmebereich zu spülen. Ein weiterer Bereich ist der Probenaufnahmebereich. Ein dritter Bereich ist ein Reagensreaktionsbereich, wo die Probe mit einem Element des Reagenssystems zum Erhalt des nachweisbaren Signals reagiert. Ein vierter Bereich ist ein Einfangbereich, wo der Analyt oder ein Element des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals eingefangen wird, was zur Verringerung der Menge an Reagens führt, die zur Reaktion im letzten Bereich, dem Meßbereich, zur Verfügung steht.
Der erste Bereich oder Transferbereich nimmt das Transportmedium auf und leitet den Fluß des Transportmediums in den Flußweg ein. Meistens - besonders bei ausgedehnten Streifen - handelt es sich um ein saugfähiges, kurzes Element, das mittels Kapillarwirkung das Transportmedium durch Dochtwirkung ansaugt oder zum nächsten Bereich (normalerweise den Probenaufnahmebereich) befördert. Meistens ist der Transferbereich ein saugfähiger Streifen, der eine hydrophile Flüssigkeit absorbiert und den Transport aller im Transportmedium enthaltenen Reagentien ermöglicht, ohne die Komponenten des Transportmediums zu chromatographieren. Wenn die Vorrichtung kein Streifen, sondern z.B. eine runde Scheibe ist, befindet sich der Transferbereich im Mittelpunkt der Scheibe und sorgt für den radialen Transport des Mediums vom Mittelpunkt weg durch die anderen Bereiche.
Das Probenaufnahmeelement kann nur zur Aufnahme der Probe dienen oder mehrere Funktionen erfüllen. Das Probenaufnahmeelement nimmt die Probe auf, wobei eines oder mehrere Elemente des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals an der Probenaufnahmestelle oder neben der Stelle vorhanden sind. Alternativ dazu können diese Reagentien auch dort nicht vorhanden sein. Die Reagentien können, falls vorhanden, nichtdiffundierbar gebunden sein, um vom Transportmedium vom Probenaufnahmebereich weg transportiert zu werden.
In einer Ausführungsform ist der Probenaufnahmebereich ein Element, das als Brücke zur Beförderung der Transportlösung durch das Probenaufnahmeelement zum nächsten Bereich dient. Bevor der Transferbereich zum Transport des Mediums zum Probenaufnahmeelement dient, wird das Probenaufnahmeelement meistens daran gehindert, als Brückenelement zwischen dem Transferbereich und dem nächsten Bereich zu dienen. Nach der Aufnahme der Probe kann das Probenaufnahmeelement die Funktion eines Brückenelements erfüllen, das für den Fluß der Transportlösung durch das Probenaufnahmeelement und in den nächsten Bereich sorgt.
Der Reagensreaktionsbereich der Elemente des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals umfaßt kann zur Gänze oder teilweise im Probenaufnahmeelement enthalten sein, ein getrennter Bereich sein, neben dem Probenaufnahmebereich angeordnet sein oder getrennt vom Probenaufnahmebereich angeordnet sein. In einigen Fällen kann der Einfangbereich zwischen dem Probenaufnahmebereich und dem Reagensreaktionsbereich angeordnet sein. Je nach Beschaffenheit des Einfangbereichs kann dessen Position relativ zu den anderen Bereichen variieren.
Der Einfangbereich weist ein Reagens auf, das mit einer bei der Erzeugung des nachweisbaren Signals beteiligten Komponente reagieren kann. Diese Komponente kann der Analyt selbst oder ein Produkt sein, das aus der Reaktion des Analyten entsteht, ist aber eine Komponente, die in einer Menge vorhanden ist, die mit der Menge des in der Probe vorhandenen Analyten in Zusammenhang steht. Der Einfangbereich kann zur Gänze oder teilweise den Probenaufnahmebereich überlappen, sich stromaufwärts vom Probenaufnahmebereich erstrecken oder stromaufwärts und getrennt vom Probenaufnahmebereich angeordnet sein.
Der Einfangbereich kann das gleiche Reagens wie der Meßbereich - jedoch mit einer höheren Dichte - verwenden. Im allgemeinen ist die Dichte zumindest 20% größer, üblicherweise zumindest zweimal größer und kann auch fünfmal oder noch größer sein. Üblicherweise umfaßt der Einfangbereich weniger als die Hälfte der Fläche des Meßbereichs, üblicherweise weniger als etwa ein Viertel. Die Einfangzone sollte groß genug sein, um das im wesentlichen vollständige Einfangen der Menge des gewünschten Analyten oder Reagens sicherzustellen.
Der Meßbereich ist üblicherweise ein längliches Element, das mittels Kapillarwirkung für den Fluß der Transportlösung durch das Meßelement sorgt. Das Meßelement weist eines oder mehrere Elemente des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals auf, die auf dem Meßelement vorhanden sind, wobei die Höhe oder Entfernung der beobachtbaren Grenze als Ergebnis eines Produkts des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals, z.B. die Entfernung vom Probenaufnahmeelement zur Signalfront, mit der Menge an Analyt in der Probe und auf dem Probenaufnahmeelement in Zusammenhang steht. Reagentien auf dem Meßbereich können gleichmäßig verteilt oder in Form alternierender Banden verstreut sein, um die Signalhöhe für eine bestimmte Probenkonzentration auszudehnen. Alternativ dazu kann das Auftreten eines Signals in einem vorbestimmten Bereich die Gegenwart oder Abwesenheit eines Analyten anzeigen. Goldsol-Assays sind ein Beispiel dafür.
Durch die richtige Auswahl von Elementen des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals kann man visuell beobachtbare Farbfronten, Fluoreszenzsignale od.dgl. für einen quantitativen Assay erhalten.
Durch Vorsehen eines Einfangbereichs, der an der Reaktion mit einer Komponente beteiligt ist, die bei der Erzeugung des nachweisbaren Signals eine Rolle spielt, zwischen dem Probenaufnahmeelement und dem Meßbereich kann der dynamische Bereich des Assays modifiziert werden. Da es für viele Analyten einen Schwellenwert gibt, der von Interesse ist, und Werte unterhalb des Schwellenwerts nicht von Interesse sind, kann man ein sekundäres Reagens vorsehen, das mit dem Analyten oder einer Komponente des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals reagiert, sodaß der Schwellenwert zu dem im Meßbereich beobachteten Null- oder niedrigen Wert wird.
Die Reaktion im Einfangbereich kann als Ergebnis spezifischer Bindungspaarelement- Komplexbildung, chemischer Reaktionen, die die Umwandlung von Reaktanden zu einem Produkt umfassen, od.dgl. erfolgen. Beispielsweise kann man Antikörper gegen den Analyten vorsehen, die den Analyten daran hindern, zu einer Zone transportiert zu werden, wo er mit einem Element des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals reagiert. Somit kann man vor der Reaktion eine vorbestimmte Analytenmenge aus dem Transportmedium oder der Probe entfernen, sodaß zur Bildung eines Signals im Meßbereich die Analytenmenge größer als jene Menge sein muß, die mit dem Einfangbereich reagiert. Alternativ dazu könnte man für eine relativ hohe Dichte einer Komponente des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals in einem relativ kleinen Bereich sorgen, sodaß in diesem engen Bereich eine starke Signalbande entsteht, die vernachlässigt werden kann. Anstatt der Verwendung eines Elements des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals kann man eine andere Verbindung einsetzen, die mit einer Reagenskomponente zum Erhalt eines nachweisbaren Signals reagiert, die in einer beschränkten Menge vorhanden ist. Bei jenen Systemen etwa, die Analyten betreffen, die mit einer Oxidase reagieren (z.B. Glukose, Cholesterin usw), können verschiedene Reagentien vorhanden seln, die mit Wasserstoffperoxid reagieren, um unreaktive Produkte zu erzeugen. Beispiele für derartige Reagentien sind Metallionen, wie z.B. Iodid.
Die vorliegende Vorrichtung kann einfach ein Streifen mit mehreren Zonen in Richtung des Transportflüssigkeitsstroms sein. Die erste Zone ist der Transportbereich, der mit dem Transportmedium in Kontakt steht und bewirkt daß das Transportmedium von der Transportmediumquelle zur Probenaufnahmestelle befördert wird. Dieser Transportbereich kann mit Reagentien imprägniert werden. Die Probenaufnahmestelle kann mehrere Formen annehmen, kann jedoch einfach ein Bereich auf dem saugfähigen Streifen sein, in dem die Probe aufgetragen wird. Alternativ kann sie ein - optimalerweise mit Reagentien imprägniertes - Kissen sein.
Verschiedene Verfahren eignen sich zur Bereitstellung einer genau bemessenen Probenmenge im Probenaufnahmebereich und im Meßbereich, wo die Messung automatisch erfolgen kann oder die Messung durch jene die Bestimmung vornehmende Person erfordert. Die Probe kann auf jede geeignete Weise dosiert werden, z.B. mittels Mikropipetten-Kapillare od.dgl., wobei die Meßvorrichtung mit dem Probenaufnahmebereich in Berührung gebracht wird. Alternativ dazu kann ein automatischer Mechanismus als Teil der Vorrichtung vorgesehen sein, der die Probe auf einem Kissen mit einer vobestimmten Flüssigkeitsabsorptions-Kapazität aufnimmt, wobei das Kissen von einer Stelle, an der die Probe aufgenommen wird, an einem Wischmechanismus vorbei zu der Stelle bewegt wird, wo das Kissen als Brücke zwischen zwei Bereichen im Flußweg dient. Die ersten beiden oben beschriebenen Bereiche werden normalerweise in der oben angeführten Reihenfolge angeordnet, während die nächsten zwei Bereiche hinsichtlich ihrer Position variieren können. Der nächste Bereich kann der Reagensreaktionsbereich sein, der die Reaktion der Probe mit einem oder mehreren Reagentien des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals ermöglicht. Dieser Bereich kann der gleiche sein wie der Probenaufnahmebereich, er kann den Probenaufnahmebereich zur Gänze oder teilweise überlappen, er kann sich über den Probenaufnahmebereich hinaus in Flußrichtung erstrecken, er kann in unmittelbarer Nähe neben dem Probenaufnahmebereich positioniert sein oder durch einen bestimmten Abstand vom Probenaufnahmebereich getrennt sein, insbesondere wenn der Einfangbereich zwischen dem Probenaufnahmebereich und dem Reagensreaktionsbereich liegt.
Der Einfangbereich liegt nach dem Probenaufnahmebereich und entweder vor oder nach dem Reagensreaktionsbereich. Der Einfangbereich kann einen Analyten einfangen, wenn er vor dem Reagensreaktionsbereich liegt und reagiert ("reagiert" umfaßt das Einfangen mittels Hybrid-Rezeptor-Komplex oder durch eine chemische Reaktion) mit einem Element des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals, wenn er sich nach dem Reagensreaktionsbereich befindet, wobei die Menge des Elements mit der Analytenmenge in Zusammenhang steht. Ein Mischbereich kann, insbesondere bei Immunassays, nach dem Einfangbereich angeordnet sein, wobei Reagentien vor der Bewegung in den Meßbereich Gleichgewichtszustand erreichen können.
Der letzte Bereich ist der Meßbereich, in dem zumindest ein Element des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals nicht-diffundierbar gebunden ist und eine festgelegte, üblicherweise im wesentlichen einheitliche Verteilung aufweist. Alternativ dazu kann das Reagenssystem zum Erhalt eines nachweisbaren Signals auf Banden unterschiedlicher Höhe verteilt sein, um die Signalhöhe zu steigern. Das gebundene Reagens reagiert mit einem Element des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals, um eine nachweisbare Grenze zu bilden.
Das gebundene Reagens reagiert mit einem oder mehreren Elementen des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals, um eine nachweisbare Grenze zu bilden, wobei sich die anderen Elemente möglicherweise alle im Transportmedium befinden oder einige nicht-diffundierbar im Meßbereich gebunden sein können.
Da ein Teil des Reagens oder Analyten gebunden oder chemisch umgesetzt wird, um im Einfangbereich eine nicht in Wechselwirkung tretende Verbindung zu erzeugen, kann die Menge des nicht-diffundierbar im Meßbereich gebundenen Reagens verringert und über einen größeren Bereich verteilt werden, wodurch sich eine geringere Dichte des Reagens im Meßbereich pro Flächeneinheit ergibt. Dies führt zu einer stärkeren Auftrennung pro Analyteneinheit und demnach zu einem empfindlicheren Assay. Es stellt sich heraus, daß man stärkere Auftrennungen erzielen kann, obwohl nach wie vor eine klar nachweisbare Grenze erhalten wird. Die Verteilung des Reagens, wie z.B. Leukofarbstoff, auf dem Meßbereich ermöglicht es, daß sich das signalerzeugende Material, z.B. der Analyt oder ein daraus abgeleitetes Produkt, wie etwa H&sub2;O&sub2;, aus Cholesterin, weiterbewegt, wodurch sich eine zusätzliche Signalhöhe für eine fixe Probenmenge ergibt. Dies verleiht dem Assay eine höhere Empfindlichkeit und Präzision.
Das vorliegende Verfahren kann in jeder Situation zum Einsatz kommen, wo eine fixe Menge einer Substanz beteiligt ist, die zur Messung zum Probenaufnahmebereich transportiert werden kann, wobei schließlich eine Wechselwirkung mit einer anderen Verbindung eintritt, um eine nachweisbare Grenze zu erzeugen. Beispiele für diese Assaytypen sind ELLSA-, EMIT-, Sandwich-, CEDIA- und Agglutinationssassays od.dgl.
Je nach Arbeitsvorschrift kann das Probenaufnahmeelement, zu dem die Probe hinzugefügt wird, auf unterschiedliche Weise präpariert werden. Es kann unbehandelt bleiben, mit Puffer imprägniert werden oder einen oder mehrere Reagentien eines ein nachweisbares Signal erzeugenden Systems bereitstellen. Eine Vielzahl an komplexen Reagentien, Arbeitsvorschriften oder Systemen kann auf der Grundlage einer beschränkten Menge von wanderndem Material entwickelt werden, um eine zur Menge des vorhandenen Analyten proportionale Grenze zu bilden. Beispiele für Arbeitsvorschriften umfassen Teilchen mit ersten und zweiten Liganden, wobei der ersten Ligand mit dem Analyten um den an einer Oberfläche gebundenen Rezeptor konkurriert. Nach der Konkurrenz um eine beschränkte Menge an Rezeptor zwischen dem Analyten und dem Teilchen wird ein Aliquot des Assaymediums zum Probenaufnahmeelement übertragen und das Teilchen mit dem Ausfluß durch die Meßzone transportiert. Durch gefärbte Teilchen, wie z.B. gefärbte Latexperlen, Aktivkohleteilchen, Magnetteilchen, mit Gold und Selensalzen beschichtete Teilchen, Farbstoffe, Farbstoff-Polymer-Konjugate, Proteine mit hohen sichtbaren Extinktionskoeffizienten, wie z.B. Phycobili-Proteine, od.dgl., wird die Grenze problemlos definiert.
Es eignet sich jedes beliebige Verfahren, das die Bindung einer nachweisbaren Substanz proportional zu einem interessierenden Analyten ermöglicht. Dazu gehört das Spalten einer Bindung zur Freisetzung der Substanz, wobei die Bindung zur Substanz nicht spaltbar ist, wenn die Substanz an einen Rezeptor gebunden ist, das Binden an einen Träger, der die Wanderung der Substanz proportional zur Menge des Analyten in einer Probe hemmt, od.dgl. Die Substanz kann ein wie oben beschriebenes Teilchen, ein Enzym, das die Erzeugung eines nachweisbaren Produkts katalysiert, od.dgl. sein.
Von besonderem Interesse ist jener Fall, wo ein Produkt auf dem Probenaufnahmebereich erzeugt wird, das eine nachweisbare Grenze bildet. Wenn der Analyt beispielsweise ein Substrat ist, kann das Probenaufnahmeelement mit dem oder den geeigneten Enzym(en) imprägniert werden, um das Produkt zu bilden. Normalerweise reagiert das Enzymprodukt, entweder direkt oder indirekt, mit einer Verbindung, die in der Meßzone fixiert ist. Beispiele dafür sind Cholesterin, Glukose od.dgl., die mit einer Oxidase reagieren, um eine oxidierende Spezies zu liefern. Die oxidierende Spezies kann dann mit der gebundenen Verbindung oder einer mobilen Verbindung reagieren, die mit der gebundenen Verbindung reagiert, um eine nachweisbare Grenze zu bilden. Ein Beispiel für diese Situation wäre die Hydrolyse von Serumcholesterinester durch Cholesterinesterase (EC:3.1.1.13) und die anschließende Oxidation von Cholesterin durch Cholesterinoxidase (EC:1.1.3.6), um eine stöchiometrisch gleiche Menge an H&sub2;O&sub2; zu erzeugen. Dieses H&sub2;O&sub2; wird im Probenaufnahmebereichen gebildet und verbindet sich mit Meerrettich-Peroxidase (HRP), die sich in der mobilen Phase befindet. HRP H&sub2;O&sub2; reagiert mit einem gebundenen Substrat, um eine nachweisbare Grenze zu bilden.
Je nach Assay können auch andere Reagentien vorhanden sein. Beispielsweise kommen Detergentien zur Anwendung, wenn ein lipophiler Analyt im Blut beteiligt ist, der sich an im Blut vorhandene Proteine bindet. Ein Beispiel dafür ist Cholesterin, das sich an Proteine bindet, wie z.B. in Lipoproteinen sehr niedriger, niedriger und hoher Dichte. Es eignen sich demnach Detergentien wie z.B. nichtionogene, anionische oder kationische Detergentien. Von besonderem Interesse sind Polyoxyalkylene, ethoxylierte Alkylphenole, Octylphenoxypolyethoxyethanol, Octylphenol-Ethylenoxid-Kondensate und Polyoxytheylenlaurylether oder anionische Detergentien, wie etwa Gallensäuren, z.B. Natriumcholat und Natriumtaurocholat. Zusätzlich können verschiedene Haftmittel oder Klebstoffe verwendet werden, z.B. Gummiarabikum. Von Interesse sind auch Proteine, die im wesentlichen nicht störend sind; dazu gehören Gelatine, Casein, Serumalbumin oder Gammaglobuline. Zusätzlich kann das Reagenskissen Konservierungsstoffe, wie z.B. Saccharose, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Dextran oder Natriumazid, enthalten. Schließlich wird normalerweise eine gepufferte Lösung zur Imprägnierung des Probenaufnahmeelements verwendet, wobei sich jeder geeignete Puffer eignet, im allgemeinen ein stark verdünnter Puffer, der Phosphat, Tris, MOPS, Borat, Carbonat od.dgl. enthalten kann. Üblicherweise weist die gepufferte Lösung einen ph-Wert im Bereich von etwa 4 bis 9 auf. Die Pufferkonzentration liegt m allgemeinen bei etwa 10 bis 500 mM.
Im Fall des Cholesterinassays als Beispiel für andere Assays weist die Imprägnierungslösung etwa 2 bis 100 Einheiten/ml der beiden Enzyme Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase auf. Die Detergentien besitzen ein Gesamtgewicht von etwa 0.1 bis 5 Gew.-% des Mediums, obwohl im Fall von Gemischen das Gewicht der nichtionogenen Detergentien etwa 10 bis 90 Gew.-%, üblicherweise etwa 25 bis 75 Gew.-%, des gesamten Detergentiengemischs ausmacht. Die Bindemittel oder Klebstoffe liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 0,2 bis 10 Gew.-%, üblicherweise von etwa 1 bis 5 Gew.-%, des Mediums. Ein Konservierungsmittel oder Wasserstoffbindungsmittel kann zu etwa 1 bis 20 Gew.-%, üblicherweise von etwa 2 bis 10 Gew.-%, vorhanden sein. Die übrigen Additive sind im allgemeinen in einer Gesamtmenge von weniger als etwa 10 Gew.-%, üblichererweise von weniger als etwa 5 Gew.-%, vorhanden. Der Rest der Zusammensetzung kann z.B. aus Wasser, nicht-reagierenden Ingredientien, Exzipienten oder Streckmitteln bestehen.
Im Fall von Thyroxin können verschiedene Reagentien zur Freisetzung der Polyiodthyronine aus B indeproteinen, z. B. Thyroxin-Bindeproteinen, verwendet werden. Beispiele für Reagentien sind Natriumhydroxid, Tetrachlorthyroninsalicylat, 8- Amino-1-naphthalinsulfonsäure und 2-Hydroxy-4methoxybenzophenon-5-sulfonsäure (siehe EP-A-0.133.464).
Jeder beliebige Analyt kann durch Anwendung einer Vielzahl verschiedener Arbeitsvorschriften bestimmt werden - beispielsweise durch Verwendung von Konjugaten einer epitop kreuzreaktiven Verbindung und eines Enzyms, wie z.B. Meerrettich-Peroxidase, worin Anti-Analytrezeptoren, insbesondere Antikörper, gleichmäßig in der Meßzone gebunden sind. Zusätzlich ist eine Oxidase ebenfalls gleichmäßig in der Meßzone gebunden. Die Gegenwart von Analyt in der Probe sorgt für die Konkurrenz zwischen Analyt und Enzym um den verfügbaren Antikörper. Je mehr Analyt vorhanden ist, desto weiter steigt die begrenzte Menge an Konjugat hoch.
Wenn als Reagenslösung ein Reaktand (1), der in Kombination mit der Oxidase (2) Wasserstoffperoxid erzeugt und ein Leukofarbstoff (3) verwendet werden, der bei einer durch Meerrettich-Peroxidase katalysierten Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid und dem Leukfarbstoff einen gefärbten Farbstoff bildet, kann die Farbfront mit der Analytenmenge in der Probe in Zusammenhang gebracht werden. Beispielsweise können auch Glukoseoxidase mit Glukose oder Harnstoff-Oxidase mit Harnstoff verwendet werden.
Für unterschiedliche Analyten eignen sich unterschiedliche Arbeitsvorschriften. Bei Theophyillin beispielsweise können die gleichen Reagentien verwenden werden wie bei Zuk et al., oben. Der Meßbereich weist Antitheophyllin-Antikörper auf. Die Lösung mit Dochtwirkung umfaßt Theophyllin-HRP-Konjugat in PBS und Glukoseoxidase, die auch im Meßbereich vorhanden sein kann. Nach dem Hochsteigen der Probe durch Dochtwirkung kann der Meßbereich mit Substrat, z.B. 4-Chlor-1-naphthol und Glukose in PBS überströmt werden.
Bei einem Thyroxin-(T&sub4;)-Assay wird die Probe mit einem Thyroxin freisetzenden Reagens in Kontakt gebracht, das auf Membranen vorhanden sein kann, die zur Abtrennung der roten Blutkörperchen verwendet werden. Der Meßbereich würde Anti- T&sub4;-Antikörper umfassen. Das Transportmedium und die Reagentien zur Bildung einer gefärbten Grenze würden dieselben wie beim Theophyllin-Assay sein, wobei im Konjugat Theophyllin durch T&sub4; ersetzt wird. In gleicher Weise könnte auf andere Haptenanalyten getestet werden.
Der Assay erfolgt durch Imprägnieren eines Probenaufnahmebereichs mit der Probe. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Probenaufnahmebereich ein Kissen, das als Brücke zwischen den anderen Flußwegelementen dient, die entlang ihrer Längsachsen jeweils zu zweit nebeneinander angeordnet sind. Somit definieren die Elemente einen langen Flußweg, der üblicherweise aus saugfähigen Streifen unterschiedlicher Größe besteht, wobei die Streifen vorzugsweise getrennt sind und das Probenaufnahmeelement als Brücke dienen kann, um den Flüssigkeitsstrom zwischen den Streifen zu ermöglichen.
Wenn die Probe Blut ist, ist der Probenaufnahmebereich normalerweise unter einer rote Blutkörperchen entfernenden Filtervorrichtung positioniert. Die Blutprobe ist normalerweise ein oder eine Reihe kleiner Tropfen mit einem Gesamtvolumen von im allgemeinen weniger als etwa 100 ul, ublichererweise von etwa 10-50 ul. Die Schichten, durch die die Probe fließt enthält üblicherweise eine Maschenschicht, eine erste Membran und eine zweite Membran, die mit der ersten Membran zusammenwirkt, um die im wesentlichen vollständige Entfernung allenfalls störender Zellen aus der Blutprobe sicherzustellen. Das erste Zell-Trennungselement dient dazu, die Konzentration roter und weißer Blutkörperchen zu verringern, die durch das zweite Filterelement aufgenommen werden. Durch Verringerung des Anteils der roten Blutkörperchen um etwa 10 bis 90%, üblicherweise um etwa 30 bis 90%, im Vergleich zum ursprünglichen Anteil roter Blutkörperchen beim ersten Membranelement kann das zweite Membranelement zumindest im wesentlichen alle roten Blutkörperchen aus der Blutprobe wirkungsvoll und genau entfernen. Da die erste Membran als grobes Trennmittel dient, kann sie eine Vielzahl unterschiedlicher Formen aufweisen.
Es können verschiedene Packungen oder Siebtiefen von Filtern verwendet werden, z.B. Glasfasern, Zellulosefilter, die mit Reagentien zum Einfangen roter Blutkörperchen behandelt wurden, Glasfaserfilter oder Filter aus synthetischen Fasern. Glasfaserfilter werden z.B. von Whatman, Schleicher and Schuell, MSI und Pall erzeugt. Die Glasfaserfilter sind weiters durch einen Glasfaserdurchmesser im Bereich von etwa 0,5- 9 um und eine Dichte von etwa 50 bis 150 g/m² charakterisiert. Beispiele für Glasfaserfilter sind S&S Glass 30, Whatman GFD und S&S 3362.
Andere grobe Trennmembranen sind beispielsweise Zellulosemembranen, z.B. Filterpapier, an die rote Blutkörperchen bindende Proteine oder Agglutinationsmittel immobilisiert wurden. Solche Proteine können Lectine, für RBC-Oberflächenmembran- Proteine spezifische Antikörper, Thrombin, Ionenaustauscher usw. enthalten. Die Präparierung solcher Filter durch Konjugieren von Proteinen oder anderen Mitteln an Zellulose ist wohlbekannt. Zellulose kann auf unterschiedliche Weise unter Verwendung von Carbodiimid. Carbonyldiimidazol, Bromcyan. Chloressigsäure, worin die Säure dann mit Carbodiimid aktiviert werden kann, od.dgl. aktiviert werden. In der Literatur findet sich eine Fülle an Beispielen für das Binden von Proteinen an Zellulosemembranen aus einer Vielzahl an Gründen, welche Verfahren hierzu geeignet sind. Alternativ dazu können mehrere Schichten grober Trennmembranen verwendet werden.
Bei zwei Membranen befindet sich unmittelbar unterhalb der ersten Membran die zweite Membran, die in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung zur ersten Membran entweder in Kontakt mit dieser oder in allernächster Nähe zu ihr steht. Im allgemeinen ist der Abstand zwischen der ersten und zweiten Membran nicht größer als ein Abstand, der den Flüssigkeitsstrom hemmt, sodaß Flüssigkeit ungehindert von der ersten zur zweiten Membran fließt. Die verwendeten, nicht-asymmetrischen Membranen liegen im mittleren Porositätsbereich und besitzen eine durchschnittliche Porosität im Bereich von etwa 0,65 bis 7 um, vorzugsweise etwa 1 bis 5 um, wobei die Poren über die gesamte Membran einen im wesentlichen einheitlichen Durchmesser aufweisen können oder nicht. Bei Verwendung einer asymmetrischen Membran hingegen (d.h. einer, bei der der Porendurchmesser von einer Oberfläche zur anderen variiert) weist die Membran günstigerweise eine minimale Porosität von nicht weniger als etwa 0,2 um, vorzugsweise von nicht weniger als etwa 0,45 um, auf, wobei die maximale Porosität im allgemeinen etwa 40 um, üblichererweise etwa 20 um, nicht übersteigt. Beispiele für geeignete mikroporöse Membranen sind Filterite-Polysulfon (asymmetrisch), 20-0,45 um; Sartorious-Zelluloseacetat, 1,2 um; Nucleopore usw.
Die Auwahl der zweiten Membran ist wichtig, da das Ausmaß an Lyse roter Blutkörperchen von einer Anzahl an Faktoren abhängt. Je nach Größe der Poren ist das Ausmaß an Lyse starken Variationen unterworfen. Da die Lyse zur Freisetzung gefärbter Zellkomponenten führt, die die Bestimmung der Grenze im Meßstreifen beeinträchtigen und die Zersetzung von Wasserstoffperoxid bewirken, ist die bloße Entfernung der Zellen unzureichend. Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt ist der Druckunterschied über die Membranen. Wiederum beeinflußt die richtige Wahl von Membranen den Druckabfall und die auf die Zellen wirkenden Kräfte, wobei der Druckunterschied die Stabilität der Zellen beeinflussen kann.
Somit dienen die beiden Membranen gemeinsam dazu, rote Blutkörperchen wirkungsvoll und genau mit geringer oder überhaupt keiner Hämolyse aus der Blutprobe zu entfernen, sodaß eine Plasma- oder Serumprobe gebildet wird, die ohne Störung durch hämolytische Produkte, wie z.B. Häm, genau analysiert werden kann.
Der Probenaufnahmebereich ist unmittelbar unterhalb der rote Blutkörperchen entfernenden Membranen und in flüssigkeitsaufnehmender Beziehung zu den Membranen angeordnet. Der Probenaufnahmebereich ist normalerweise ein saugfähiges Element, das die Flüssigkeit absorbieren kann. Es eignen sich verschiedene saugfähige Materialien, wie etwa zellulosehältige Materialien, z.B. Papier, od.dgl. Der Probenaufnahmebereich weist üblicherweise eine Größe im Bereich von 5 bis 100 mm², üblicherweise nicht mehr als etwa 50 mm², Oberfläche auf und besitzt eine Dicke im Bereich von etwa 0,1 bis 2 mm, sowie eine Volumskapazität von etwa 1 bis 75 ul. Wenn der Probenaufnahmebereich ein Kissen ist, kann das Kissen rund, quadratisch, rechteckig, viereckig oder polygonal sein,, je nachdem, wie es verwendet werden soll, um als Brücke für die anderen Elemente des Flußwegs zu dienen. Eine weitere Charakterisierung findet sich in US-A-4.999.287, eingereicht am 19. Mai 1988.
Ein erstes saugfähiges Transferelement dient zur Aufnahme der Transport- und Reagenslösung, die je nach Assay Reaktionskomponenten aufweisen kann oder nicht. Das erste saugfähige Transferelement befördert die Flüssigkeit zum Probenaufnahmebereich. Dieser nimmt die Transport- und Reagensflüssigkeit aus dem ersten saugfähigen Transferelement auf und dient als Brücke zum Transport der Reagensflüssigkeit in den nächsten Bereich.
Die aufgebrachte Probe wird im Probenaufnahmebereich absorbiert und kann sich je nach Größe des Bereichs, der Beschaffenheit des Assays und der Beschaffenheit des stromaufwärtigen Bereichs sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts außerhalb des Bereichs erstrecken. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe an der Wechselwirkung mit den angrenzenden saugfähigen Elementen gehindert, wenn die Probe zum Probenaufnahmebereich übertragen wird.
Verschiedene Verfahren eignen sich zur Verhinderung des Transfers der Probe vor dem Fluß des Transportmediums aus dem Probenaufnahmebereich (z.B. einem Kissen) in die anderen Bereiche. Von besonderem Interesse ist die Verwendung eines Schiebers, der von einer ersten Position, wo der Probenaufnahmebereich die Probe erhält, zu einer zweiten Position bewegt werden kann, wo der Probenaufnahmebereich als Brücke zwischen den anderen beiden Bereichen des Flußwegs dient. Der Schieber verhindert daher das Ausbreiten der Probe in andere Bereiche des Flußwegs, bevor der Zeitpunkt zur Durchführung des Assays gekommen ist. Der Weg im Probenaufnahmebereich, der von der Stelle, an der die Probe aufgenommen wird, bis zur Stelle, wo sie sich im Flußweg befindet, reicht, kann ein Mittel zur Entfernung überschüssiger Probenmenge aus dem Probenaufnahmebereich umfassen. Ein solches Mittel bietet ein quantitatives Maß für die vom Probenaufnahmebereich aufgenommene Probenmenge. Durch das Vorsehen eines Bereichs im Weg des Schiebers, der verschmälert ist, um nichtabsorbiertes Probenmedium zu entfernen, ohne den Probenaufnahmebereich stark zusammenzudrücken, kann die durch den Probenaufnahmebereich absorbierte Probenmenge relativ genau reproduziert werden. Die Verschmälerung kann die Folge einer Konvexität sein, z.B. eine stangenförmige Wölbung, eine Walze oder jedes beliebige Schabmittel. Die Verschmälerung des Wegs sollte einen Raum bilden, der etwa gleich oder etwas weniger groß als die Dicke des feuchten Probenaufnahmebereichs ist. Der Schieber dient daher nicht nur dazu, den Probenaufnahmebereich zu bewegen, sondern auch dazu, die Menge an durch den Probenaufnahmebereich absorbierter Flüssigkeit zu dosieren.
Neben dem Schiebermechanismus können andere Flußhemmer eingesetzt werden, die üblicherweise aus einem inerten, nichtporösen Film bestehen, der die Übertragung vom Probenaufnahmeelement zu den saugfähigen Elementen des Flußwegs blockiert. Die durch das Probenaufnahmeelement angenommene und im Assaymedium vorhandene Probenmenge kann gesteuert werden, indem die Übertragung von Flüssigkeit über die das Probenaufnahmelement sättigende Menge hinaus durch einen nichtbenetzenden Schirm in eine absorbierende Schicht ermöglicht wird. Nach der Zugabe der Probe zum Probenaufnahmeelement und einer bis zu 30 min dauernden Inkubation werden das poröse, nichtbenetzende Material und die absorbierende Schicht entfernt, wodurch das Probenaufnahmeelement zum einzigen Speicher der Probe für den Assay wird. Bei Verwendung eines Wischfilms wird dieser nach Sättigung des Probenaufnahmeelements entfernt (siehe US-A-4.987.085, eingereicht am 16. März 1989).
Der gesamte Flußweg kann eine Länge von etwa 25 bis 200 mm, üblicherweise etwa 50 bis 150 mm, vorzugsweise etwa 100 mm, aufweisen. Etwa 25 bis 90% der Länge des Flußwegs bilden den Meßbereich mit der Quantifizierungszone, gegebenenfalls einer Mischzone und/oder einer Schwellenwertzone. Die Misch- und/oder Schwellenwertzone machen im allgmeinen etwa 5 bis 35% des Flußwegs aus. Die Streifen, die für den Flüssigkeitsstrom vom und zum Probenaufnahmeelement sorgen, können die gleiche oder eine unterschiedliche Länge aufweisen, wobei jeder im allgemeinen etwa 5 bis 25 mm, üblichererweise etwa 10 bis 20%, der Länge des Flußwegs ausmacht. Die stromautwärtigen Streifen können Teil des Meßbereichstreifens oder unabhängige Einheiten sein. Alternativ dazu kann der Streifen zur Steuerung des Schwellenwerts verwendet werden. Das Probenaufnahmeelement macht im allgemeinen etwa 1 bis 10%, üblichererweise etwa 2 bis 8%, der Länge des Flußwegs aus; je länger der Flußweg ist, desto größer kann das Probenaufnahmeelement normalerweise sein. Die Breite der Streifen kann variieren und beträgt üblicherweise zumindest etwa 2 mm und nicht mehr als etwa 10 mm, vorzugsweise etwa 3 bis 7 mm. Die zwei Streifen überlappen üblicherweise das Reaktandenkissen um zumindest etwa 0,2 mm und nicht mehr als etwa 2 mm, üblicherweise etwa 1 mm, wobei dies vor allem eine praktische Überlegung ist, solange die zwei Streifen nicht in direkter Fluidkommunikation stehen.
Jedes geeignete Material kann für die verschiedenen saugfähigen Teile der den Flußweg bildenden Assaystreifen verwendet werden. Üblicherweise liegt die Dicke der saugfähigen Komponenten im Bereich von etwa 0,05 bis 2,0 mm, üblichererweise von 0,15 bis 0,75 mm. Eine Vielzahl an saugfähigen Trägern ist geeignet, insbesondere Zelluloseträger, wie z.B. Chromatographiepapier. Silika auf einem Träger, Aluminiumoxid auf einem Träger und polymere Membranen, wie z.B. Nitrozellulose und Nylon. Die Anforderungen an die Eigenschaften des für den Meßbereich oder die Meßzone verwendeten saugfähigen Materials sind solcherart, daß dieses in vielen Fällen ein Indikatormolekül kovalent oder irreversibel an den Träger binden muß, daß die entwickelte Farbe klar und scharf sein soll und daß die Flüssigkeit mit einer geeigneten Rate durch die saugfähigen Elemente fließen können sollte.
Von besonderem Interesse ist eine Assayvorrichtung, die unabhängig ist und zur Durchführung des Assays lediglich die Probe braucht. Die Vorrichtung kann als Ein- Stufen-Diagnosetestvorrichtung unter Verwendung eines Einweg-Kassettenformats dienen. Die Vorrichtung kann aus drei einzelnen, spritzgußgeformten Teilen bestehen, in die verschiedene Komponenten des Assaysystems eingebaut werden. Dazu gehören das Filtrationsmedium zur Trennung von Plasma von Gesamtblut, Mittel zur Dosierung eines genauen Probenvolumens, ein Schieber zur Übertragung des Probenaufnahmelements zum Transfer- und Meßelement und zur Freisetzung einer Transport- und Reagenslösung. Die Transportlösung leitet die Kapillarwanderung durch den Flußweg ein, wodurch eine nachweisbare Grenze entsteht, die mit der Analytenmenge in der Probe in Zusammenhang steht.
Wenn eine verringerte Menge des Produkts, das aus der Reaktion des Analyten mit einem Enzym entsteht, aufgrund des Einfangens eines solchen Produkts im Einfangbereich im Meßbereich vorhanden ist, ist es häufig wünschenswert, eine geringere Konzentration von Elementen des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals vorzusehen als im Falle des Fehlens des Einfangbereichs. Wenn z.B. Wasserstoffperoxid das Produkt in einem Cholesterinassay ist, liegt die optimale Menge an nicht-diffundierbar gebundenem Meßreagens (in diesem Fall ein oder mehrere Substrat(e) für Meerrettich-Peroxidase) im Bereich von etwa 0,25 bis 0,50 mg/ml in der Tauchimmobilisierungs-Lösung, während in der vorliegenden Ausführungsform unter Verwendung eines Einfangbereichs die Tauchkonzentration von Peroxidasesubstrat um 10 bis 75% auf 0,05 mg/ml bis 0,45 mg/ml gesenkt werden kann.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung erfolgt nun eine Besprechung der Abbildungen. In einer ersten Ausführungsform in Fig.1 ist ein Streifen 10 vorgesehen, der einen eingekerbten Bereich 12 besitzt der ein Kissen 14 als das Probenaufnahmeelement zur Aufnahme der Probe aufweist. Das Kissen 14 kann aus dem eingekerbten Bereich 12 entfernt und in die Probe eingetaucht werden, um eine halbquantitative Messung der vom Probenaufnahmeelement 14 absorbierten Probenmenge vorzunehmen. Nach dem Eintauchen des Probenaufnahmeelements in die Probe wird sie dann zum eingekerbten Bereich 12 zurückgebracht und fest darin eingepaßt, um Teil des Streifens 10 zu sein.
Stromaufwärts vom Probenaufnahmeelement 14 befindet sich ein Reagensbereich 16 zum Erhalt eines nachweisbaren Signals. Wenn in diesem Bereich z.B. Glukose der Analyt ist, würde Glukoseoxidase zur Reaktion mit der Glukose verwendet werden, um Wasserstoffperoxid zu erzeugen. Für andere Assays würden in ähnlicher Weise andere Reagentien verwendet werden, um ein Produkt zu erzeugen, das direkt oder indirekt zu einem nachweisbaren Signal führen kann.
Stromaufwärts vom Reagensbereich zum Erhalt eines nachweisbaren Signals befindet sich ein schmaler Bereich 18, der dazu dient, eine vorbestimmte Menge einer Komponente des Reagenssystems zum Erhalt des nachweisbaren Signals einzufangen, die in beschränkter Menge vorhanden ist, da sie in einer mit der Analytenmenge in der Probe in Zusammenhang stehenden Menge vorhanden ist. In dieser Situation könnte z.B. wiederum unter Wasserstoffperoxid-Bildung ein Leukofarbstoff verwendet werden, der in Gegenwart von Peroxidase mit Wasserstoffperoxid reagiert. Somit würde man in Bereich 18 eine starke Färbung erzeugen, wenn Analyt über einen Schwellenwert hinausgehend vorhanden ist, der durch die Menge an Farbstoff im Bereich 18 bestimmt wird. Dieser Farbstoff könnte an der Basis des Bereichs 18 aufgetropft und getrocknet werden, wodurch die Notwendigkeit eines gesonderten Bereichs wegfällt und ein ähnlicher Stufengradient von reaktivem Farbstoff entlang des Flußwegs des Assaystreifens entsteht. Der Bereich 20 hätte auf seiner gesamten Fläche eine viel geringere Farbstoffdichte, sodaß sich eine Grenze bilden kann, wodurch man das Ende der Reaktion zwischen dem Wasserstoffperoxid und dem Farbstoff feststellen kann. Günstigerweise erhält man eine durch die strichlierte Linie 22 dargestellte Bogenfront, wobei man klar die Spitze der Bogenfront vom unmittelbar stromaufwärts von der Linie 22 befindlichen Bereich unterscheiden kann. Günstigerweise sind die Seitenkanten 24 perforiert, da dies für eine deutlichere Unterscheidung der Grenze zu sorgen scheint. Siehe US-A-4.757.004.
Eine komplexere Vorrichtung ist in den Figuren 2 bis 4 dargestellt. Die Vorrichtung kann aus drei spritzgußgeformten Teilen oder nach jedem anderen geeigneten Verfahren hergestellt werden. Die Teile umfassen eine Basisplatte 40, einen Schieber 42 und eine Abdeckplatte 44, wie dies aus Figuren 2 und 3 hervorgeht. Die Basisplatte 40 besteht aus einem Ausschnitt, um den Schieber 42 aufzunehmen, einem Schlitz 46 mit Fixierstiften 48, in die der Quantifizierungsstreifen 50 und saugfähige Streifen 52 präzise eingepaßt werden, wobei ein Spalt 54 von etwa 2 mm dazwischen aufrechterhalten wird, und einem Napf 56 zum Einfangen der freigesetzten Transportslösung, z.B. von Dochtwirkungspuffer.
Der Schieber 42 besteht aus einer belüfteten Aufnahmestelle 58, in die das Probenaufnahmekissen 59 eingesetzt wird, einem Arm 60 mit doppelter Scherwirkung zur Erleichterung der Freisetzung der Transportlösung aus einer Tasche, die im Napf 62 der Abdeckplatte 44 untergebracht ist, und einem Schnappverschluß 61 zum Fixieren des Schiebers, nachdem er verschoben wurde. Das Probenaufnahmekissen kann Antikörper enthalten, die mit dem Analyten reagieren, um eine Reaktion des Analyten mit einem Enzymreagens auf dem Kissen zu verhindern. Somit wird verhindert, daß eine vorbestimmte Menge an Analyt mit dem Enzym reagiert, um ein Produkt zu erzeugen, das an einer Grenze zu einem nachweisbaren Signal führt.
Die Abdeckplatte 44 besteht aus einem Napf 62, der eine (nicht dargestellte) abgedichtete Folientasche aufnimmt, die die Transportlösung enthält; der Napf 62 kann auch mit Transportlösung gefüllt und mit einer abziehbaren Foliendichtung abgedeckt sein. Die Abdeckplatte besitzt eine Öffnung 64 zum Einbringen der Probe. Unterhalb der Öffnung 64 sind Filter 66 zur Abtrennung der Zellen aus den Blutproben angeordnet. Das Filtrationssystem kann doppelte Glasfaserscheiben und eine abschließende Filtrationsmembran umfassen, um zellfreies Plasma zum Probenaufnahmeelement zu befördern. Die Abdeckplatte umfaßt auch die Rakelmeßstange 68, die zur Steuerung des Volumens der vom Probenaufnahmeelement absorbierten Probe dient, sowie einen Sichtschlitz 70. An der Spitze des Sichtschlitzes 70 befindet sich ein Indikatorloch 72, das seine Farbe verändert, wenn der Test abgeschlossen ist, um den Benutzer zu informieren, daß eine Ablesung vorgenommen werden kann.
Die fertige Anordnung ist in Fig.4 dargestellt, wobei die zusammengesetzte Vorrichtung folgendermaßen entsteht: Einsetzen des Schiebers 42 in die Basisplatte 40, Positionieren des Transferstreifens 52 und Meßstreifens 50 an den richtigen Stellen, Einbringen der Transportlösungstasche in den Napf 62 oder, wie oben beschrieben, Einfüllen der Transportlösung in den Napf 62 und Abdichten mit einer abziehbaren Foliendichtung, Zusammensetzen von Abdeckplatte und Basisplatte und anschließendes Abdichten der Basisplatte und der Abdeckplatte, geeigneterweise durch Ultraschallverschweißen. Diese Vorgangsweise positioniert die Probenaufnahmestelle des Schiebers direkt unterhalb des Filtrationsmediums der Abdeckplatte und positioniert auch die Scherpunkte des Schiebers unterhalb der in der Abdeckplatte angeordneten folienabgedichteten Tasche.
Zur Durchführung einer Cholesterinmessung sticht sich der Benutzer in den Finger und bringt einen hängenden Bluttropfen auf die Aufbringungsstelle auf, die ein weißer mittlerer Napf mit einer roten Begrenzung ist. Wenn das weiße Zentrum nicht mehr sichtbar ist, wurde eine ausreichende Blutmenge aufgebracht. Der Benutzer wartet dann etwa 30 Sekunden bis 2 Minuten oder länger, um eine adäquate Filtration und Gewinnung von Plasma auf dem Probenaufnahmekissen sicherzustellen. Je nach Ausführungsform kann das Probenaufnahmekissen einen oder mehrere Reagentien des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals und die Einfangreagentien enthalten oder nicht.
Der Schieber wird dann verschoben, bis er einschnappt. Zu diesem Zeitpunkt wurde das die Plasmaprobe enthaltende Probenaufnahmekissen durch die Rakelmeßstange dosiert und wird mit dem Transferbereich und dem Meßbereich über den 2 mm-Spalt in Kontakt gebracht und Flüssigkeitstransfer ermöglicht. Die Scherpunkte des Schiebers haben auch die Foliendichtung der Tasche im Napf der Abdeckplatte durchbohrt, wodurch die Transportlösung in den Aufnahmenapf in der Basisplatte abgegeben wird. Die Transportlösung ist 0,10 bis 2 ml eines wäßrigen Puffers, der Meerrettich-Peroxidase in ausreichender Menge enthalten kann, um eine rasche Reaktion des Wasserstoffperoxids und des Farbstoffs sicherzustellen. Dadurch beginnt das Ansaugen durch Dochtwirkung durch die Streifenanordnung, wodurch die Probe vom Probenaufnahmekissen auf den Meßstreifen gespült wird.
Der Meßbereich ist mit einem Peroxidasesubstrat, insbesondere einem modifizierten N,N-Dimethylanilin, imprägniert. (Siehe US-A-4.999.287, eingereicht am 19. Mai 1988.) Die Reaktion der Reagentien läßt einen gefärbten Bereich mit einer definierten Grenze entstehen, wodurch der Benutzer eine genaue Ablesung des über dem Schwellenwert liegenden Cholesterinspiegels vornehmen kann. Diese Ablesung erfolgt, wenn die Farbindikatorstelle oberhalb des Sichtschlitzes anzeigt, daß der Test abgeschlossen ist. Normalerweise dauert dies weniger als etwa 15 min, wobei der höchste Punkt eines blauen Bereichs im Sichtschlitz abgelesen wird.
Zur Durchführung des Cholesterinassays wurde eine Vorrichtung mit einer Gesamtlänge von etwa 150 mm hergestellt, wobei der Transferbereich 11 mm und das Probenaufnahmekissen etwa 7 mm davon aus machten und der Rest der Meßbereich war. Der Streifen bestand aus Whatman 31ET- Papier, worauf ein modifiziertes N,N- Dimethylanilin kovalent mit dem Papier verbunden wird, wobei MBTH passiv immobilisiert wird. Das Probenaufnahmereagens oder -kissen wird in eine Reagenslösung eingetaucht und bei 450 30 min lang getrocknet. Die Reagenslösung umfaßt 5,33 g Natriumdihydrogenphosphat, 1,25 g Saccharose, 1 ml Nonidet P-40, 1,0 g Cholsäure, 0,83 g Mega-8, 0,71 g Natriumkaliumtartrat, 0,65 g Natriumnitroprussid, 0,577 g Natriumstannat und 0,01 g Natriumazid; nach deren Zugabe wird die Lösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und 0,016 g Cholesterinesterase, 0,201 g Cholesterinoxidase plus eine vorbestimmte Menge an monoklonalem Anticholesterin hinzugefügt, das sich an den Bereich der A- und B-Ringe bindet, und das Volumen auf 100 ml gebracht.
Der Dochtwirkungspuffer oder die Transportlösung besteht aus 0,05 M Natriumphosphat, 2 mg/ml BGG, 0,005 mml HRP, 0,01% Gentamycin und 0,01% Plurafec A-39.
Die resultierende Vorrichtung wurde unter Verwendung von drei Eichlösungen mit unterschiedlichen Werten (bereitgestellt durch das College of American Pathologists (CAP)) mit Cholesterinmengen von 147, 234 und 333 mg/dl untersucht, die lyophilisiertes menschliches Serum verwenden; die Eichlösungen wurden jeden Tag frisch angerührt.
Drei Modifikationen der obigen Vorrichtung wurden auf die Auftrennung (in mm) zwischen den Dreiwert-CAP-Eichlösungen untersucht. Diese Modifikationen der Vorrichtung umfaßten: 1) den "Vergleichs"-Streifen, der aus einem Meßbreich von 78 mm, einem gemeinsamen Probenaufnahme- und Reagensreaktionsbereich von 7 mm und einem Transferbereich von 12 mm besteht (siehe Fig.5); 2) die Reagenseinfangbereich-Streifenkonfiguration, die aus einem Meßbereich von 71 mm, einem Einfangbereich von 10 mm, einem gemeinsamen Probenaufnahme- und Reagensreaktionsbereich von 7 mm und einem Transferbereich von 10 mm besteht (Fig.6); und 3) die Auftropf-Einfangreagensassay-Streifenkonfiguration nach Fig.5, außer daß das Einfangreagens (in diesem Fall MBTH) auf die Basis (in einer Zone von etwa 10 mm) des Meßbereichs aufgetropft und getrocknet wird (Fig.7).
Bei der Durchführung des Assays unter Verwendung der obigen drei Konfigurationen der Vorrichtung wird eine Serumprobe von 10 ul auf das Probenaufnahmekissen aufgebracht und 3 min lang inkubiert. Während dieser Zeit wandelt sich das Serum auf dem Kissen in Wasserstoffperoxid um. Nach der Inkubationszeit wird der Schieber entfernt, und die HRP-Lösung wird durch Dochtwirkung auf dem Streifen aufwärtsgesaugt. Das Wasserstoffperoxid reagiert mit MBTH in Gegenwart der HRP- Lösung, und es entsteht eine blaue Färbung. Nach dem Abschluß der Ansaugung durch Dochtwirkung wird die Farbfronthöhe gemessen. Diese steht in direkter Korrelation mit der Cholesterinmenge im Serum.
Bei den obigen modifizierten Ausgestaltungen verbesserte sich die Auftrennung, um einen Wert von 16,5 bis mehr als 23,3 mm zwischen jeder weiteren 100mg/dl-Messung zu ergeben. Hingegen betrug die Auftrennung zwischen jeder weiteren 100 mg/dl- Messung unter Verwendung der Vergleichsstreifen-Konfiguration etwa 7 bis 10 mm. Aus der folgenden Tabelle gehen die Ergebnisse hervor. Tabelle 1 Assaystreifen-Konfiguration Cholesterin 1mg/dl Signalauftrennung (mm) Zunahme im vollen Bereich in % gegenüber Vergleich MBTH immöbilisiert auf Einfangbereich Fig. 6 MBTH-Fleck immöbilisiert auf der Basis des Meßbereichs Fig. 7 1. Serum-Eichlösungssatz des College of American Pathologists 2. Der volle Assaybereich wird als mm bei 333 mg/dl minus mm-Response bei 147 mg/dl definiert
Neben MBTH kann Kaliumlodid zur Entfernung des Wasserstoffperoxids verwendet werden. Siehe nachstehende Tabelle II. TABELLE II Auswirkung von Kaliumiodid auf die Cholesterinassay-Signalhöhe Cholesterin Signalhöhe K1 in Einfangbereich Vergleich
1. Die Quantifizierungsstreifen bestanden aus 31ET Whatman -Papier, auf dem DMA und MBTH immobilisiert waren.
2. Wurde durch Eintauchen von 31ET Whatman in eine 10 mg/ml-Lösung von wäßrigem Kaliumiodid gebildet. Das Papier wurde ofengetrocknet und mit Spuren von Säure behandelt.
3. Unbehandeltes 31 ET Whatman -Papier wurde als Einfangbereich verwendet.
Aus den obigen Ergebnissen ist es offenkundig, daß sich einige große Vorteile ergeben, wenn man den interessierenden dynamischen Bereich für jene Analyten ändert, wo Werte unterhalb eines Schwellenwerts nicht entscheidend sind. Durch das Einfangen eines Analyten oder einer Komponente eines Systems, das ein nachweisbares Signal liefert, worin die Komponentenmenge mit der Analytenmenge in der Probe in Zusammenhang steht, kann man die Streifenlänge verkürzen und die Ansaugzeit verringern, während trotzdem die für einen Analyten-Inkrementwert zurückgelegte Distanz verlängert wird. Somit werden gemeinsam mit höherer Empfindlichkeit günstige Eigenschaften bei der Anwendung des Verfahrens erzielt.
Obwohl die obige Erfindung zum besseren Verständnis durch Veranschaulichungen und Beispiele ausführlich beschrieben wurde, ist es für Fachleute auf dem Gebiet im Lichte der Lehren der vorliegenden Erfindung offenkundig, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können.

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen der Menge an Analyt in einem Medium mittels eines saugfähigen Elements, das einen Meßbereich und ein Reagenssystem zum Erhalt eines nachweisbaren Signals umfaßt, worin das Reagenssystem zum Erhalt eines nachweisbaren Signals ein erstes Reagens umfaßt, das im Meßbereich nicht- diffundierbar mit einer ersten Dichte gebunden ist, wobei ein zweites Reagens des Systems durch Reaktion mit dem ersten Reagens eine nachweisbare Grenze im Meßbereich definiert, wobei das Verfahren das Hineinwandern des zweiten Reagens in den Meßbereich umfaßt, sodaß die Position der Grenze ein Indikator für die Menge an Analyt im Medium ist,

gekennzeichnet durch das Hindurchwandern des Analyten oder des zweiten Reagens durch einen vor dem Meßbereich angeordneten Einfangbereich und das Einfangen des Analyten oder des zweiten Reagens im Einfangbereich mittels eines Einfangreagens.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Einfangreagens das erste Reagens ist und im Einfangbereich in einer höheren Dichte als der ersten Dichte vorhanden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das zweite Reagens als Ergebnis einer Enzymreaktion mit einem Analyten erzeugt wird und das zweite Reagens mit einem nichtdiffundierbar gebundenen Reaktanden im Einfangbereich reagiert, um ein nicht- diffundierbares Produkt zu erzeugen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Reaktand ein Element des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals ist und im Einfangbereich in einer höheren Dichte als im Meßbereich vorhanden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, worin der Analyt im Einfangbereich eingefangen wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Reagenssystem ein Element eines spezifischen Bindungspaares umfaßt, das mit einem Enzym verbunden ist, um ein nachweisbares Signal zu liefern, wobei das Element immunologisch kreuzreaktiv oder komplementär zum Analyten ist.

7. Analytische Vorrichtung zum Messen eines Analyten, wobei die Vorrichtung einen saugfähigen Streifen (10,52) umfaßt, der einen Transferbereich zum Transportieren eines Transportmediums von einer Transportmediumquelle, einen Probenaufnahmebereich (14,58) in Fluidkommunikation mit dem Transferbereich, einen Einfangbereich (18) zum Einfangen von Analyt oder eines zweiten Elements eines Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals sowie einen Meßbereich (20) umfaßt, der ein nichtdiffundierbar gebundenes erstes Element des Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals umfaßt das zusammen mit dem Analyten und dem zweiten Element so reagiert, daß eine nachweisbare Grenze (22) erzeugt wird, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts vom Meßbereich ein Einfangbereich (18) zum Einfangen des Analyten oder eines zweiten Elements eines Reagenssystems zum Erhalt eines nachweisbaren Signals mittels eines Einfangreagens vorhanden ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, worin der Einfangbereich (18) und/oder ein Reagens- Reaktionsbereich (16) den Probenaufnahmebereich (14,58) überlappt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7, worin der Einfangbereich (18) dem Probenaufnahmebereich (14) näher ist als ein Reagens-Reaktionsbereich (16).