JPH01501819A - 血液親和性診断方法 - Google Patents
血液親和性診断方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
′ 診゛
辻」
診断方法及び装置は、血液型及び血液中における分析物の存在の敏速な決定を提
供する。
主皿坐宜且
サンプル中における特定の化学物質を測定するための市場は、非常に拡大し・続
づけている。興味ある主な分野の1つは、生理学的流体、たとえば血液、血清、
尿、唾液及び同様のもの中の内因性又は外因性物質の検出であった。多くの目的
のだ、めに、血液中の特定の化学物質を検出することに興味が存在する。多くの
試験は、赤血球細胞の多くの妨害性質のために、その赤血球細胞の除去を必要と
する。従って、血清は、赤血球細胞を除去し、そして血清を供給するための多く
の方法が存在する。遠心分離により、それは満足されるであろう。ある膜がこの
目的のために有用であるとして報告されている。しかしながら、分離は誤差の可
能性を導ひき、時々測定のために必要な時間を長くし、そして測定のために余分
な費用を必要とする。従って、有効且つ正確な態様で完全な血液の使用を可能に
する技法を発明できることが興味の対象である。
車 る のパなi゛ 口
多くの特許、たとえばReckel呈上、、アメリカ特許第4,595.654
号; B is h o p + アメリカ特許第4,436.824号;Wa
gner?、(g、+アメリカ特許第4.205,058号は、生物学的流体、
特に血清における特異的結合アッセイを記載し、そしてPrjncefl 煮、
+EPA85/110742.5は、血清における抗原及び抗体の同時検出の
ためのアッセイを開示する。Zuk、アメ−リカ特許第4.435,504号は
、分析物と反応せしめるために特定の結合部材を含む吸収性要素を使用し、そし
てZuk、アメリカ特許第4,594.327は、赤血球細胞が完全な血液を含
むアッセイ媒体から除去され、そしてその分析物が測定されるアッセイを提供す
る。
λ所夏翌り
分析物を検出するための方法、組成物及び装置が提供される。その装置は、種々
の特異的結合対のメンバーであり、又は損われていない膜の一部としての表面エ
ピトープの検出のための、すなわち該表面エピトープのための特異的結合対受容
体の検出のためのメンバーである第1及び第2特異的結合対メンバー(“SBP
M”)を使用する。
第1及び第23BpHが使用される場合、それらは表面に密接な並列状態で結合
された第1及び第23BPMとの同時結合及び複合体形成を阻害するEflで固
体支持体に結合されるであろう。第1 SBPMは、対象の分析物に結合するで
あろう、第25BPMは、固体支持体上のシグナル中間体の検出を可能にするシ
グナル中間体に結合するであろう。
アッセイは、分析物を含み、そしてシグナル中間体を含むと思われるサンプルと
装置とを接触することによって行なわれる。シグナル中間体が移動する距離は、
サンプル中の分析物の量に関係するであろう。表面エピトープに関しては、種々
のSPBMが個々の進路にそって使用され、そして検出可能な前面部の形成が表
面エピトープの存在の徴候として使用されるであろう。
皿皿q旦巣星脱所
第1図は、スト1ノツプを用いてのアッセイの概略図であり;…定Ω皿課■附監
対象の分析物の存在を検出するための方法、組成物及び装置が提供される。その
装置は、アッセイ媒体の細管輸送を提供する。第1及び第2特異的結合対メンバ
ーじSBP?’l”)は、その装置に結合され、ここでそれらの第1及び第2結
合対メンバーは、種々の特異的結合対のメンバーである。特別な場合、すなわち
分析物が表面エピトープであり、そして損われていない膜の一部、特に損われて
いない細胞の一部として検出される場合、1種のSBPM (表面エピトープに
結合する)が使用され得る。
第1 SBPMは、対象の分析物に対して特異的であろう。第25BPMは、シ
グナル中間体に対して特異的であろう。シグナル中間体は、装置の表面上の点で
シグナル中間体の存在の検出を直接的又は間接的に提供する分子である。シグナ
ル中間体は、そのシグナル中間体が移動する進路の長さの決定を可能にする。対
象のエピトープの数のために、1種の5BPl’lが多くの個々の進路に使用さ
れ、又は2種のSBPMが進路光りに使用される場合、表面エピトープが検出さ
れるべき例外が存在する。
その方法は、水性媒体の細管輸送を提供することにより特徴づけられている装置
を用いる。種々の結合対の第1及び第25BPMは、表面に非拡散的且つ実質的
に均一に結合される。
対メンバーの1つの表面の形状及び電荷分布が相同対を定義するために他の対メ
ンバーの形状及び電荷分布により補足される場合、SBP?!は、非共有複合体
を形成するために結合する。
その相同対は複合体を形成し、そしてこれは、対象のアッセイのためには、試験
時間の間、実質的に不可逆的である。
SBPMはお互いに結合することができ、そして他のひじように関連する化合物
より高い、少なくとも102、普通少なくとも10”11モルのオーダーの結合
親和性を有し、−C的には、少なくとも約10B 11モルのKaを有すること
ができる。
アッセイは、予定された部位で装置とサンプルとを接触することによって開始さ
れる。サンプルは、いずれかの分析物及びシグナル中間体をそれと共に担持しな
がら毛管作用により移動する。シグナル中間体の移動速度は一般的に、分析物よ
りも早くなく、好ましくは実質的に遅い。分析物及びシグナル中間体は、流れの
進路にそって移動するので、その分析物は、その相同SBPMに結合し、その相
同SBPMへのシグナル中間体の結合を阻害するであろう。分析物は通常、シグ
ナル中間体を先行するので、シグナル中間体が、分析物がその相同対メンバーに
結合している領域を通して動く場合、そのシグナル中間体はそれらの領域を通し
て移動し、そして分析物が実質的に使い尽くされ、そして第1及び第2の両SR
PMが複合体形成のために利用できるまで、移動し続けるであろう。シグナル中
間体は、それが使い尽くされ又はある他の機構が、シグナル中間体のさらに一層
の移動を阻害する前面部を構成するために作用するまで、その相同対メンバーに
結合するであろう。既知の量の分析物を有するサンプルに関するシグナル中間体
の進路の長さを比較して、サンプルに関するシグナル中間体の進路の長さを決定
することによって、サンプル中の分析物の存在及び量を定性的に、半定量的に又
は定量的に決定することができる。
シグナル中間体は大きな粒子、たとえば細胞である場合、そのシグナル中間体の
その相同対メンバーへの結合は、追加の細胞が付着するバリヤー又はダムの形成
をもたらす(定義された前面部を提供する)ことが見出された。次に、この前面
部は、シグナル中間体の進路の長さの測定を提供する。
特異的結合対メンバーは、任意にリガンド及び受容体に分割されるであろう。リ
ガンドは、送受容体が存在するいずれかの化合物であり得る。従って、特異的結
合対の2種のメンバーが機能的に定義され、ここで1つはお互い強い非共有複合
体を形成するそれらの能力により、特異的結合対メンバーと他結合対メンバーと
を区別することができる。受容体は通常、巨大分子であるが、リガンドは巨大分
子であってもよ(又はなくてもよい。大部分、リガンドは、少なくとも約125
ドルトン(Da)の有機分子であり、そして数百万ドルトンであることもできる
。
リガンドはそれぞれ分子、複合体、凝集体又は同様のものであり得る。リガンド
は、小さな分子、たとえば薬物、抗生物質、ホルモン、糖、オリゴヌクレオチド
、神経伝達物質、オリゴペプチド、ポリマー分子又は巨大分子、たとえば酵素、
表面エピトープ、構造タンパク質、多糖、核酸又は分子の凝集体、たとえばウィ
ルス、オルガネラ、たとえば核プラスチド、リゾソーム及びベルオキシソーム、
細胞、たとえば細菌、病原菌、哺乳類細胞、新生細胞、血液細胞、たとえばリン
パ球、白血球、赤血球及び単球、又はそのフラグメントもしくはその成分を含む
ことができる。受容体は一般的に、巨大分子、たとえば酵素、免疫グロブリン、
レクチン、核酸、天然に存在する受容体、たとえば成長因子受容体、シナプス受
容体、チロキシン結合グロブリン、及び同様のものであろう。
分析物は、いずれかのりガント又は受容体であり、そしてその相同受容体へのエ
ピトープ部位又はその同等物の結合により検出されるであろう。
装置は、非共有力又は表面の官能化及び5BPFへの共有結合のいずれかにより
、その表面への5BPHの非拡散結合を可能にすることによって、水性媒体の細
管移動を提供することにより特徴づけられるであろう。
種々の材料がその装置の製造のために使用され得る。特に吸収性材料、たとえば
セルロース紙、ニトロセルロース膜、ガラス繊維フィルター、シリカゲル又は他
の粒状ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン又は他のプラス−チック支持体、又
は親水性であり又は通切な変性により製造された他の材料が使用され得る。細管
が使用され得、そしてこの細管は、半透明又は透明な材料、たとえばガラス、プ
ラスチック、たとえば、ポリスチレン、アクリレート、ポリエチレン又は同様の
もから形成され、ここでその細管は親水性であり、又は従来の技法に従って、被
覆又は他の変性により製造される。
装置は、祇又は膜のストリップであり、これは支持体を有してもよく又は有さな
くてもよい。一般的に、そのストリップは少なくとも1龍、より普通には2龍の
幅であり、そして一般的に約10mmよりも広くなく、普通約61よりも広くな
い幅である。その長さは、所望とする分析、その幅、分析物の量、SBP!1の
密度及び同様のものに依存するであろう。普通、長さは少なくとも約5 +n、
より普通には少なくとも約10mであり、そして普通約50m、より普通には約
30mmを越えないであろう。膜、たとえばニトロセルロース膜(たとえば5c
hleicher and 5chuell、カタログIIME100)が特に
興味の対象である。便利には、タンパク質がその膜に非共有結合され得る。
使用される細管は、空の内腔又は充填された内腔を有し、ここで充填のために使
用される粒子は親水性であり、そして細管移動を可能にするであろう。特異的結
合対メンバーは、細管の表面、充填物、又は両者に結合され得る。種々の材料、
たとえばアガロース、セファロース、ビオグラス、ラテックス又は同様のものの
種々の粒子が使用され得る。
細管の内腔は、0.5■はどであり、そし−て普通約5 +nを越えず、より普
通には2mlを越えないであろう。細管の長さは、臨界でなく、普通約511を
越え、そして約100 ml、より普通には約75mmを越えず、そして好まし
くは約50+nを越えない。媒体は、水平面中を又は重力に反して毛管作用によ
り運ばれ得るであろう。
シグナル中間体は、分析物の移動の速度よりも有意に早くない速度で移動するい
ずれかの組成物により特徴づけられる。
シグナル中間体は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に提供し、その結果
、装置の表面に特異的に結合されたシグナル中間体の存在が検出される。
広い適用性を有し、完全な血液中に存在し、そして完全な血液中における血液型
及び分析物の分析を可能にし、そして測定のために比較的鋭い境界決定を提供す
るために、赤血球細胞の使用が特に興味の対象である。赤血球細胞は特徴ある赤
色を提供する。さらに、それらの赤血球細胞が、装置表面に結合されたそれらの
相同性SBPMに特異的に結合する場合、他の赤血球細胞が、境界決定の比較的
鋭い線を提供するバリヤーを形成するために付着することが見出された。この境
界決定の線は、分析物の存在か又は不在かの徴候として、赤血球細胞が移動した
進路の長さを測定するために使用され得る。
従って、完全な血液が、赤血球細胞の分離なしに使用され得、ここで赤血球細胞
は、障害物(これは、RBCがバックグラウンド値をもたらし、そして種々のシ
グナル中間体の検出を妨害するので一般的に除去される)としてよりもむしろシ
グナル中間体として作用する利点を提供する。
赤血球の他に、多(の他の化合物が、そのまま又は他の材料、たとえば巨大分子
、たとえばタンパク質、粒子、たとえばアガロース、ラテックス等、又は同様の
ものに結合されて使用され得る。使用され得る化合物は、広範囲の種類の強い吸
着性染料又は他の吸着性組成物、たとえばフェリチン、カーボンブランク、テト
ラゾリウム塩、ゲンチアンバイオレット、等;発光けい団、たとえばフルオレセ
イン、ローダミン、ダンシル、フィコビリタンパク質、ランクニドキレート、等
;酵素、たとえばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−6
−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、コリネステラーゼ、等
;酵素補因子、たとえばFAD、NADHl等;粒子、たとえば磁気粒子、前記
シグナル中間体のいずれかに結合された粒子、コロイド状金属粒子、細胞、等を
含む。
シグナル中間体は、直接的又は間接的にシグナルを提供することができる。シグ
ナルが直接的に提供される場合、単に物理的測定が、装置の表面に結合されたシ
グナル中間体の存在を検出するために必要とされる。しかしながら、シグナルが
間接的に提供される場合、シグナル中間体の検出のために第2段階が普通必要と
されるであろう。特に、エピトープ部位はシグナル中間体(このために受容体が
利用できる)上に存在するであろう。その受容体は、シグナル中間体に結合でき
、そして検出可能なシグナルを提供するであろう。従って、直接的な検出を可能
にする前記のシグナル中間体の1つは、受容体に結合されるであろう。普通、シ
グナル中間体は、受容体が結合できる多(のエピトープ部位を有し、従ってシグ
ナルの有意な増幅を提供するであろう。この技法は、文献に広く例示されている
、特に酵素ラベルによるサントイソチアフセイに類似する。
相同性筒1及び第25BpFIの同時結合が阻害される態様は、種々の方法で達
成され得る。分析物及び/又はその相同結合メ゛ンパーの性質に依存して、種々
の技法が使用され得る。たとえば、2種の5BpPは、空間的にきわめて接近す
るために、直接的に又は結合基により共有結合され得る。他方、2種の異なった
SBPMは、非拡散的に、普通共有的に表面に結合され得、ここで相同結合メン
バーのサイズの相対的割合が所望する同時結合の阻害を提供する。多くの場合、
2種の異なった結合基を有するために、表面を特異的に活性化することが所望さ
れ、ここで種々の特異的結合対メンバーが1又は他の結合基に選択的に結合する
であろう。たとえば、メルカプト基及びアミノ基を使用することができ、ここで
メルカプト基は活性化されたオレフィンに選択的に結合し、そしてカルボキシ基
は選択的にアミノ基に結合するであろう。表面に結合された適切な二官能価化合
物を用いることによって、単一の分子、たとえば多官能価ポリマーへの2種の特
異的結合メンバーの結合が達成され得る。
第1特異的結合対メンバー:第2 SBPMの比は、広く異なり、普通約0.1
〜1:1、より普通には約0.3〜1:1であろう。
最適な比は、実験的に決定され得る。
表面エピトープを決定するために、普通表面に非拡散的に結合されるであろう、
1〜2種のSBPM、及びリガンド又は受容体のいずれかを通常使用するであろ
う。便利には、それぞれの進路が、対象の表面結合タンパク質又は対象のエピト
ープの数(ここで同じタンパク質の種々のエピトープが対象のものである)を提
供されるであろう。従って、ストリップ上でお互い隣接する多くの進路を有する
ことができ、ここで進路のそれぞれは、サンプルと同時に接触される。境界決定
の線の存在は、特別な表面エピトープを指示する。境界決定の線が目により又は
装置により検出できない場合、装置は、細胞の検出を提供するために、細胞を結
合する物質と接触せしめられ得る。広く、比較的濃い細胞含有領域の存在は、表
面エピトープの存在を示す。進路は複数の異なった5BP11対のSBPMを有
し、ここでそれぞれのSBPMはその進路にそっての連続距離で個々の領域を有
する。それぞれの細胞がたった1種のSBPMを有するかぎり、細胞が捕獲され
る領域は、対象のSBPMが膜上に存在することを決定するであろう。
サンプルは、水性液体として装置に与えられ得るいずれがσタイプのサンプルで
ある。従って、サンプルは、固体、液体又は気体であることができ、生理学的流
体、たとえば血液、尿、血請、血清、脳背髄液、接眼レンズ液、シトソール、又
は同様のもの、水サンプル、土壌サンプル、化学加工サンプル、等であることが
できる。サンプルは直接的lこ使用され得、又は種々の処理、たとえば抽出、分
離、溶解、加熱、冷却、クロマトグラフィー処理、′;気泳動又は同様のものに
ゆだねられ得る。サンプルは、種々の緩衝液、たとえば炭酸水素塩、トリス、リ
ン酸塩、バルビツール、FIOPS、グリシン、等のいずれかにより緩衝化され
得る。一般的に、緩衝液は約50mM〜0.5Mで存在するであろう。他の添加
剤、たとえば酵素インヒビター、静菌剤、抗凝集剤、非特異的結合を阻害するた
めのタンパク質又は他の従来の添加剤もまた含まれ得る。
分析物の性質に依存して、種々の試薬がアッセイを行なうために添加され得る。
たとえば、分析物がリガンドである場合、アッセイ媒体中に存在するすべてのり
ガントを完全に結合するために過剰の受容体が添加され得る。過剰の受容体を結
合するであろうリガンドがまた装置に結合されるであろう。
従って、過剰の受容体は、第25BPt1パートナ−の同時結合を阻害するよう
に作用するであろう。同様に、受容体が関与する場合、正反対のことを行なうこ
とができ、そしてリガンドを過剰に提供することができ、ここでその過剰のリガ
ンドは装置表面上で受容体に結合するであろう。この場合、シグナル中間体が移
動する距離は、サンプル中の分析物の量に逆比例して関与するであろう。
シグナル中間体がサンプル中に存在しない場合、シグナル中間体が添加され得る
。そのシグナル中間体は、約150〜2000Daの小さな有機分子、約200
0〜約1 、000.0OODaの中間サイズの分子又は大きな分子もしくは他
の組成物、たとえば分子凝集体、たとえばヘモグロビン、ポリサブユニットのタ
ンパク質、オルガネラ、細胞、粒子、たとえば金属粒子、磁気粒子、蛍光粒子及
び同様のものであり得る。
シグナルは、光の吸収、蛍光、電磁力、たとえば磁石、酵素(特に紫外線〜可視
線の範囲で光吸収性生成物を提供する)、蛍光生成物もしくは他の検出可能な生
成物、酵素補因子(酵素と共に検出され得る)、及び同様のものの結果として存
在することができる。
シグナル中間体は、分子の検出を可能にし、そして第1特異的結合対の複合体形
成体の存在下でその逆結合メンバーへの結合を阻害されるであろう。粒状のシグ
ナル中間体は、比較的大きく、普通少なくとも約10no+、より普通には約5
゜nl11であり、そして50μm又はそれ以上、好ましくは1μm〜20μ稲
の範囲で存在することができる。
シグナル中間体により、検出の手段が容易にならない場合、そのシグナル中間体
はそのような検出を提供するために変性され、又は検出を可能にする分子の非共
有結合のための基礎を提供することができる。検出を可能にするシグナル中間体
は赤血球細胞、フエレチン、ヘモグロビン又は同様のものである。同様に、粒子
、たとえば金属粒子及びコロイド、カーボンブランク又は同様のものが使用され
得、ここでそれらの粒子は特異的結合対メンバーに接合され得る。着色された粒
子又は蛍光粒子が使用され得、ここでラテックス粒子、アガロース粒子、セファ
ロース粒子、又は同様のものが色素への接合により着色され得、蛍光体への接合
により蛍光性にされ、そして逆特異的結合対メンバーへの結合のために特異的結
合対に接合され得る。
アッセイ媒体は、逆結合メンバーの間に増強された複合体形成を提供するために
、通常約4〜10、より普通には6〜9の範囲のp)lであろう。他の溶媒、た
とえば極性有機溶媒、たとえばアルカノール、エーテル、アミド又は同様のもの
もまた含まれ得、そしてこれはアッセイ媒体の粘度を減じ、5BPHの結合特性
を変え、又はある他の所望とする特性を提供するために作用する。
サンプルが処理された後、所望により、装置はサンプルと接触され得る。接触は
、緑で、端で、いく置端の近くの位置で起こり、ここで装置は、サンプル中に浸
され、サンプルの表面で接触され、少量のサンプルが装置とサンプルとを接触せ
しめるために装置又は他の便利な手段に通用される。多くの状況の場合、周囲条
件で十分である。他の状況の場合、温度調整が必要とされ、ここで温度は、約O
℃〜40℃に変化することができる。アッセイのための時間は普通少な(とも1
秒〜1時間又はそれ以であり、通常約5秒〜30分であろう。
所望とする進路の距離を移動するための、アッセイ媒体のための十分な時間の後
、シグナル中間体により移動する距離が決定され得る。シグナル中間体が実質的
に測定される場合、それは目により又は装置により直接的に測定され得る0種々
の分光光度計、蛍光計、磁気計、反射計、 、等が使用され得る。しかしながら
、シグナル中間体が直接的な測定をできない場合、追加の段階が、たとえばシグ
ナル中間体に特異的に結合する分子に結合される検出を可能にする分子の接合体
を添加する段階が必要とされ得る。この場合、装置は、シグナルを提供する接合
体により被覆され−、噴霧され又はアッセイ媒体の進路にわたって接触され得る
。いくつかの場合、シグナル中間体により移動する距離を決定する前、すべての
非特異的な結合接合体を洗浄することが所望されるであろう。
酵素がラベルである場合、基質がSBPMの領域から下流の領域に掃供される。
従って、5BPHの領域は、サンプル中の予定されたレベルの分析物が基質領域
中への酵素ラベルの移動をもたらすであろうことを予定される。基質領域の色の
変化は、分析物の量が予定レベル以上であることを指摘するであろう。
分析物の量を定量したい場合、抗−酵素が基質領域に均一に結合され、その結果
、J素うベルが使い尽くされるまで基質を通して移動するであろう。表面に強く
結合する着色されたU素生成物を有することによって、その着色された境界が存
在する分析物の量を示すであろう。
分析物の量を定量するために、1又は複数の標準液が使用され得、ここでアッセ
イがサンプル媒体中の既知量の分析物により行なわれる。事実、直接的な比較の
ために標準液及びサンプルの同時実施を可能にする装置が提供され得る。既知量
の分析物を有するサンプルにより得られた結果と観察された結果とを比べること
によって、サンプル中に存在する分析物の量に距離を定量的に関連づけることが
できる。
表面エピトープに興味がもたれる場合、細胞の厚い縁又は前面部(ここでそのよ
うな厚い前面部の不在は、表面エピトープの不在を示すであろう)の形成に主と
して関心を有するであろう。従って、距離についての関心は必要ではなく、むし
ろサンプルとの接触の部位から幾分除去された部位でのダム又はバリヤー細胞の
形成に関心がある。
便利なものとして、他の試薬、たとえばシグナル中間体、及び検出可能な接合体
、標準液、及び他の試薬、たとえば緩提供する装置に関係されるであろう。
図は、図的に2種の異なった装置を示す。第1図のストリップ装置10は、アッ
セイの実施の後の装置の外観を示す。
装置10は吸着性基材12を゛有し、これにRBC14及び抗原16に対する抗
体が結釡される。アッセイは、抗原16のための受容体18、たとえば抗原に対
する抗体の存在に関する。
血液は基材の一端20で通用され、そしてその基材にそって移動する。陰性の結
果の場合、赤血球細胞22は基材にそって移動し、そして抗−RBC14によっ
て捕獲される。それらは凝集し、そしそれらの一層の移動を妨ぐバリヤーをもた
らす。
陽性の結果の場合、抗−抗原18は、RBCよりも早く移動し、そして抗原16
に結合する。抗−抗原18の存在は、抗−RBC14へのRBCの結合を阻害す
る。抗−抗原18が使い尽くされた場合、次に抗−RBC14がRBC22に結
合する。図面においては、抗−RBC14及び抗原16が存在する領域が抗−抗
原18により飽和され、その結果、RBCは基材上をさらに移動し続け、そして
赤い領域24を作り出す。
第2a図においては、細管装置30が描かれている。アッセイの始めで、細管装
置30はサンプル32中に浸される。
細管34は、抗体接合体38を結合された粒子36により充填される。抗体接合
体38はまた、細管34の壁に結合される。その抗体接合体は、Yにより示され
る抗体及び黒点により示されるハブテンを含んで成る。装置30は、十分な量の
サンプルが細管30中に入った後、サンプル32から除去され、又は装置34は
、サンプル32が細管34の上部に移動するまで、サンプル中にそのまま置かれ
る。
第2b図において、アッセイは完結される。アッセイはハブテンのために行なわ
れ、ここで過剰のハブテンに対する抗体、すなわち抗−ハブテンの既知量が、サ
ンプル32中に存在するすべてのハブテンを結合するために添加される。サンプ
ル中のハブテンに結合しなかった抗−ハブテン40は、接合体38のハブテンに
結合することができる。接合体38への抗−ハブテン40の結合は、細胞42が
接合体に結合することを妨げ、その結果、細胞は、抗−ハブテン40が接合体3
8に結合される領域を通り過ぎる。抗−ハブテン40が使い尽くされた場合、細
胞42は接合体38に結合し、そして追加の細胞が前面部44を形成するために
非特異的に結合し始める。細胞34の端から前面部までの距離は、サンプル中の
ハブテンの量の測定である。その距離が短いほど、サンプル中により多くの量の
分析物が存在する。
次の例は、例示的であって、制限するものではない。
患者中における抗−A又は抗−B循環fL体の存在を決定するためには、検出の
ために利用できる特異的抗原を有すべきである。これは、A型又はB型(ABO
血液グループ)の個人の唾液から可溶性糖タンパク質を単離することによって達
成される。次に、これらの糖タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー
上での第2特異的結合対として使用する。
その可溶性糖タンパク質を、標準の唾液の血球凝集阻止試験に基づいて、A型又
はB型の糖タンパク質の分泌者であることが知られている個人から単離した。B
arrieなど。
1EcCentra −7遠心分離機を用いて2000rpmで10分間、遠心
分難し、粒状物質を沈降せしめ、そしてその上滑液両分を、95%エタノール6
倍の体積と共に混合した。その混合物を4℃で一晩貯蔵し、そして2000rp
mで10分間遠心分離し、抗原性糖タンパク質画分を沈降せしめた。その糖タン
パク質のベレットを、95%エタノールにより1度洗浄し、2000rp■で沈
降せしめ、そして真空乾燥せしめた。最後ベレットを、下記のようにしてクロマ
トグラフィーストリップ上に固定するだめに、生理食塩水中に再懸濁した。
2. −一、・ ” 疫グロブSンのビオチンアビジンは、ビオチンに対して強
い結合親和性を有するタンパク質であり、そして従って、血清サンプル中のアビ
ジンの存在を検出するための能力を示すために、抗−赤血球細胞免疫グロブリン
と共に使用された。ヒト赤血球細胞(CooperBiomedi−cal)に
対して向けられたウサギ抗−血清のIgG画分3 mlを、30■のタンパク質
/ mjに再構成し、そして0.1モル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液(pH7
,6) 11に対して4℃で一晩透析した。この透析されたIgGのアリコート
を、23℃で2時間、N−ヒドロキシスクシンイミドビオチン(N)IS−ビオ
チン)と共に、1 : 1〜1 :100 (7)−E7L、比(IgG :
NH3−ビオチン)で反応せしめた。そのアリコートを、ビオチン−免疫グロブ
リン接合体の固定化の前、リン’J1N衝溶液(PBS:20mMのリン酸ナト
リウムにより緩衝化された0、 9%Nacl 、 p)!7.2) 11に対
して透析した(2回)。
3、 セルロース 上への ンパク の古 ヒ種々の試薬が、これらの材料、た
とえば臭化シアン、塩化シアヌル及びカルボニルジイミダゾールへのタンパク質
の共有結合のために存在する。出版された方法(Bethellなど、。
J、Chromatography 219:361〜371.1981Zuk
、 fcC&、、C1inicC11nicalChe 31:1144〜11
50.1985)からの変法である1つの方法の例が、Whatman 31
ET Chrom祇上にビオチン−免疫グロブリン接合体の固定化のために下記
に説明される。
4枚のWhatnran 31 ET Chrom紙を、紙の機械方向に平行す
る長軸にそって4cmX17cmのストリップに切断した。これらのシートを、
平底ガラス容器中における無水ジクロロメタン中、0.2Mの1.1′−カルボ
ニルジイミダゾール(CDI)136−中に浸し、そして回転撹拌しながら23
℃で2時間反応せしめた。その紙をジクロロメタン(5分間にわたってそれぞれ
150mf)により3度洗浄し、窒素下で乾燥せしめ、そして長軸に垂直に3m
mX4Qmmのストリップに切断した。
ストリップの底として予定された一端から1011のCDl−活性化ストリップ
の局部領域上に、PBS中に溶解されたタンパク質接合体溶液(1〜30■/
me )のサンプル5μlを接触することによって、タンパク質をこの活性化さ
れた紙に添加した。接合体溶液を含むこれらのストリップを、水により飽和され
た大気中において23℃で1時間インキュベートし、過剰のPBS中で10分間
撹拌しながら洗浄し、そして37°Cで10分間にわたって対流下で乾燥せしめ
た。この方法により、タンパク質を、ストリップの底から4〜5■−の領域又は
1011付近の領域に固定した。他方、そのストリップをタンパク質接合体溶液
50μpにより均一に湿潤し、そして次にインキュベートし、洗浄し、そして前
記のようにして乾燥せしめた。次に、これらのストリップを、前進血液判定又は
検出物の検出のために使用した。
A型の個人における抗−B抗体又はB型の個人における抗−A抗体の存在を検出
する、逆転血液判定のだめのストリップを、抗−赤血球細胞接合体について前に
記載されたのと同じ方法で、抗−赤血球細胞免疫グロブリン及び唾液糖タンパク
質抗原の混合物を固定化することによって調製した。同様に、HTLV−mに対
する血清免疫グロブリンの検出のためのストリップを、抗−赤血球細胞免疫グロ
ブリン及びHTLV−In不活性化ウィルスの抗体混合物の使用により製造した
。
4、7准 5゛′ のためのストリ・・プの8,1す前進血液判定は、血液型抗
原の表面上でそれらの抗原に対して特異的な免疫グロブリンによる赤血球細胞の
結合に関し、それによって、アフィニティクロマトグラフィー中における赤血球
細胞の一層の動きに対してバリヤーを形成する。ストリップは、CDI活性化段
階の省略を伴って、前記のようにして31ET Chrom紙から切断された。
抗−A又は抗−Bヒト血清免疫グロブリン(American Daol ;血
液凝集力価= 1/1024)5μlも、それぞれのストリップの底部から1c
mのところに通用し、そして空気乾燥せしめた。この免疫グロブリンは共有結合
されず、そしてストリップ紙中に単に乾燥された。赤′血球細胞を含むサンプル
が通用される場合、免疫グロブリンが一部溶解し、そして赤血球細胞に結合した
。
5、 ストリップ7による−1・な: 法ストリップ紙を、21の深さまで血液
サンプル中に垂直に浸し、そしてその血液を5〜10分間にわたってストリップ
内で上昇せしめた。次に、そのストリップを血液から取り出し、そして空気乾燥
せしめた。ストリップの底から赤血球細胞の前面部までの距離を、結果を定量化
するために測定した。
赤血球細胞を含むサンプルの添加の後、ストリップ内で乾燥せしめられた抗−血
液型免疫グロブリンを、上昇された血液として可溶化し、それによって赤血球細
胞の血液凝集化を促進せしめた。“前進”血液型判定においては、赤血球細胞が
木目補的免疫グロブリン−既知の0型血液(A又は8表面抗原を有さす、そして
前進血液型判定試験において対照として作用する)に対して陰性であることが知
られている血液よりもさらに移動する場合、ストリップは陰性として記録される
。
逆転血液型アッセイにおいては、赤血球細胞が相補的免疫グロブリンに対して陰
性であることが知られている血液中で展開されるストリップよりもさらに移動す
る場合、糖タンパク質“A”抗原を用いて、ストリップは陽性として記録された
。抗−A抗体がサンプル中に分析物として存在する場合、それは糖タンパク質に
結合し、それによって赤血球細胞受容体への赤血球細胞の結合を阻害し、そして
移動を可能にした(例■)。抗−A又は−Bを含まない、AB型であることが知
られている血液は、逆転血液型判定のために対照として働くことができる。同様
に、HTLV−n[ウィルスに対する抗体が存在する場合、その抗体はHTLV
−III抗原に結合し、そしてアフィニティクロマトグラフィー中への赤血球細
胞の一層の動きを可能にした(例■)。HTLV−I[1抗原及び赤血球細胞免
疫グロブリンを含むストリップは、その赤血球細胞がHTLV−nl抗体に対し
て陰性であることが知られているサンプルを試験するために使用されるストリッ
プよりも一層移動する場合、陽性として記録された。
固定されたビオチン化抗−赤血球細胞免疫グロブリンを含むストリップ紙は、ア
ビジンの検出を可能にした。ストリフブ内での赤血球細胞の動きは、血液サンプ
ルに添加されたアビジンの濃度に比例した。従って、ビオチンは、赤血球細胞に
対する結合特異性を伴って免疫グロブリンに共有結合し、そしてアビジンの結合
が赤血球細胞に結合するその免疫グロブリンの能力を妨げた(例■)。記録は、
サンプル中における抗−人又はHTLV−DI抗体の検出のために使用された記
録を同じであった。
■−上
ABOS刑の″′i准:゛、
血液サンプルのABO血液型の前進試験を、次の方法で行なった。
前記の試験ストリップ(3in X 4(bm)は、底部から10mmのCDI
活性化領域に結合された抗−へ抗体5μlを有した。
洗浄し、そして乾燥せしめた後、それぞれのストリップを、血液1mff(20
ドロツプの完全な血液)を含む10−ビーカー中に浸し、そして室温で10分間
放置した。アッセイは二重に行なわれ、そしてその結果は第1表に示された。
A 抗−A 14 、16
B 抗−A 21 、23
A 抗−A 14 、14
B 抗−A 20.17
′″Ab−試験ストリップ内に固定された抗体抗体5μEが洗浄しないで活性化
されていない紙上で乾燥された場合、その結果は第2表に示された。
−Ab−試験ストリップ中に乾燥せしめられた抗体1(TLV−I[[(AID
S) = (7) (7)’完全な血液サンプルにおける分析物として)!TL
V−II+抗体の検出を、次の方法で行なった。
HTLV−III抗原を次の方法で調製した:)19HXB株の組織培養6紺胞
をHTLV−I[[により感染せしめ、次にペレット化し、そしてTriton
X −100により溶解した。CDIにより活性化された祇(3*nX40+
u)を、前記のようにして同時に結合される抗−RBC抗体5μl及びHTLV
−I[1抗原5μlにより結合せしめた。充填されたタイプ0赤血球細胞(1−
)を、抗−)ITLV−nllEji性(P)又は陰性(N)供与体のいずれか
からのヒト血清(1−) と共に混合した。第3表はその結果を示す:
陰性 O抗−RBCHTLVI[[14、16陽性 0 抗−RBCI(TLV
III 18 、17.5七L−l
ビオチン 人の−によるアビジンの
アビジン(溶解されたタンパク質)の検出を、赤血球細胞に対して特異的なビオ
チン接合の抗体を用いることによって達成した。
ビオチンを、前記のようにして抗−RE3C抗体に共有結合せしめた。抗体;
N HSビオチンのモル比は、1:1.1:10及び1:100であった。1:
100の比は、たぶん抗体構造の有意な変化を引き起こした。サンプル5μlを
、CDI活性化ストリップ紙(3w X40n)の端から10m1の位置に滴下
し、そして前記のようにして調製した。A型血液とアビジンとの混合物を調製し
、最終濃度を1■/−にした。その結果は下記に示される:
アビジンを含むRBC141615
アビジン分析物の存在は移動を促進せしめる。但し、抗体が処理される高いビオ
チン濃度でを除く。
勇−工
U: ンバク2の による −A は−−Bに文、して。
・な血?1″′ の
血液血清中の抗−A又は抗−B抗体の存在は、添加された血液型に対する強い反
応の可能性の測定である。抗−A抗体は、A−抗原を含む唾液糖タンパク質によ
り検出され、そして血清中の抗−B抗体は、唾液糊タンパク質Bを用いることに
よって検出される。
個人のABO血液型は、B−型の人における抗−A抗体;A−型の人における抗
−B抗体及び〇−型の人における抗−A及び抗−B抗体の両者の存在を検出する
ことによって決定され得る。この血清抗体は、抗原として唾液糖タンパク質を用
いて検出され得る。なぜならば、それらは赤血球細胞の表面上に抗原と同じ抗原
特異性を含むからである。1 /128の血球凝集阻止反応力価を有する唾液専
唐タンパク質を前記のようにして調製した。抗−RBC抗体抗体+nZ)及び糖
タンパク質A1−を混合し゛た。1つの実験においては、その混合物50μlを
用いて、CDI活性化ストリップ紙(3X40+n)を飽和せしめた。第2の実
験においては、その混合物5μpを、ストリップ紙の底からIonの領域に滴下
した。そのストリップを、室温で55間、血液サンプル中に置いた。50μりに
より飽和されたストリップの結果は下記の通りである二車3已14 、1.たR
BCの さ
B−型血液は、A型糖タンパク質に結合された抗−A抗体を含み、そしてアフィ
ニティクロマトグラフでのRBCの一層の移動を可能にした。
抗−RBC抗体抗体タンパク質Aの混合物のサンプル5μEがクロマトグラフィ
ーストリップ上にスポットされた場合、結果は次の通りであった:
5飛 したRBCの
A 18.5 、18.5
B 21.0 、22.5
アビジンのビオチン −−RBC−シ
次の研究においては、5chleicher及び5chuell #AE100
の12庫気孔サイズニトロセルロースを、両面テープ(3M#666)によりプ
ラスチック支持体上に張り付け、そして3mmX4Qxmのストリップに切断し
た。
30■/−のビオチン化された抗〜RBC抗体1μiを、ストリップの底から1
011の部分にスポットし、そのストリップを、室温で5分間100%湿度中で
インキュベートした。
次にそのストリップを100 mmmベト皿中に置き、そして回転撹拌(50H
z)Lながら、30分間室温テPBs 20−中、0.1%ポリビニルピロリド
ン(〜l0KDA)により?A浄した。そのストリップを、37℃で対流オーブ
ン中において5分間空気乾燥せしめた。
アッセイを次の通りに行う: 1.5 rniのマイクロ遠心分層管中に、血液
サンプル20μkを充填し、そしてそのストリップを血液サンプル中に浸しす。
そのストリップを室温で1゜分間インキュベートし、管から取り出し、そして空
気乾燥せしめる。
上記アンセイ方法において、完全な血液中のRBCは1゜1璽移動し、そして1
■/−のアビジンを含む完全な血液中のRBCは、2回の測定において15及び
16+am移動した。アビジン濃度が異なる研究において、すなわち1■/dの
アビジンで、RBCの移動距離は18mmであり、そして0.5■/dのアビジ
ンで、その距離は11.5−mであった。
班一旦
二亘!企旦i床足
細管の使用が、血液型物質Aに対する12■/−のヒトモノクローナル抗体によ
り、0.1 p 1で内径89.2側のDrummonclMicrocaps
を充填することによって例示された。液体を排出した後、その細管を空気乾燥せ
しめた。その細管をA型又はB型血液のいずれか中に5秒間浸し、そしてRBC
により移動した距離を測定した。2回の測定におけるA型血液の距離は7及び5
1mであり、そしてB型血液のための距離は15及び16m豫であった。
本発明の方法は、特に専門の職員によらないで、広範囲の種類の分析物を検出す
るための敏速、正確且つ便利な方法を提供することは上記結果から明らかである
。はとんどの場合、はとんどのP練は必要とされず、そして所望に従って、読み
取りは眼によって行なわれ得る。従って、病院、実験室、医者の事務所、及び同
様の所で、本発明のだめの広範囲の用途が存在する。本発明は、結果の指示薬と
して赤血球細胞を使用することができるような特定の用途を見出す。この態様に
おいて、血液又は赤血球細胞が添加され得る他のサンプルを用いる場合、赤血球
細胞は、赤血球細胞(それらは所望する結果を不明りょうにする)が他のアッセ
イにおいて除去される必要があることよりもむしろ、サンプル中における分析物
の量を正確に確定するように作用する。本発明は、分析物の性質、所望とする定
量又は同様のものに依存して広範囲の種類の方法を可能にする高い柔軟性付与す
る。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び倒曲にいくらか詳細に記載され
ているけれども、特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
浄書(内容に変更なし)
FIG、Ia
FIG、Ib
FI G−2o FIG−2b
手続補正書(方式)
%式%
1、事件の表示
PCT/US87102974
2、発明の名称
血液親和性診断方法
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
名称 ジェネ ラプス、インコーホレイティド4、代理人
住所 〒105東京都港区虎ノ門−丁目8番10号5、補正命令の日付
平成1年3月7日(発送日)
6、補正の対象
(1)特許法第184条の5第1項の規定による書面の「特許出願人の代表者」
の欄
(2)委任状
(3)明細書の翻訳文
(4)請求の範囲の翻訳文
(5)図面の翻訳文
7、補正の内容
(1) (2) 別紙の通り
(3)明細書の翻訳文の浄書(内容に変更なし)(4)請求の範囲の翻訳文の浄
書
(内容に変更なし)
(5)図面の翻訳文の浄書(内容に変更なし)8、添付書類の目録
(1) 訂正した特許法第184条の5第1項の規定による書面 1通
(2)委任状及びその翻訳文 各1通
(3)明細書の翻訳文 1通
(4)請求の範囲の翻訳文 1通
(5) 図面の翻訳文の浄書 1通
国際調査報告
Claims (35)
- 1.第1及び第2特異的結合対メンバー(該メンバーのそれぞれは、種々の特異 的結合対のメンバーであり、そして前記第1及び第2特異的対の相同メンバーの 同時結合を阻害するために比較的一定の間隔で表面に非拡散的に結合される)を 含んで成る装置を用いて水性アッセイ媒体中の分析物を検出するための方法であ って(前記装置は、予定された進路にそって前記アッセイ媒体の細管輸送を提供 し、ここで前記アッセイ媒体がシグナル中間体を含んで成り、該中間体は相同の 第2特異的結合対メンバーであり、そして前記第2特異的結合対メンバーとの複 合体のメンバーとして存在する場合、検出可能なシグナルを提供し、そして前記 第1特異的結合対メンバーは前記分析物又は前記相同の特異的結合対メンバーと 交差反応する): 前記進路の一端で前記装置と前記サンプルとを接触し(これにより、前記サンプ ルは前記進路にそって前記毛管作用により輸送され、そして前記分析物又はその 相同の特異的結合対メンバーが前記シグナル中間体と少なくともほぼ同じ速さで 移動し、それにより、前記シグナル中間体は前記第1特異的結合対の複合体形成 体に隣接するその相同の結合対メンバーへの結合を阻害される);そして 既知量の分析物を有するサンプルと比較して、前記シグナル中間体により移動し た距離を決定することを含んで成る方法。
- 2.前記装置が細管である請求の範囲第1項記載の方法。
- 3.前記装置が吸着性ストリップである請求の範囲第1項記載の方法。
- 4.前記シグナル中間体が粒子てある請求の範囲第1項記載の方法。
- 5.前記粒子が赤血球である請求の範囲第1項記載の方法。
- 6.前記サンプルが完全な血液である請求の範囲第5項記載の方法。
- 7.前記第1及び第2結合対メンバーがお互い共有結合される請求の範囲第1項 記載の方法。
- 8.前記第2結合対メンバーが免疫グロブリンである請求の範囲第1項記載の方 法。
- 9.第1及び第2特異的結合対メンバー(該メンバーのそれぞれは、種々の特異 的結合対のメンバーであり、そして前記第1及び第2特異的対の相同メンバーの 同時結合を阻害するために比較的一定の間隔で表面に非拡散的に結合される)を 含んで成る吸着性ストリップ装置を用いて水性アッセイ媒体中の分析物を検出す るための方法であって(前記装置は、予定された進路にそって前記アッセイ媒体 の細管輸送を提供し、ここで前記アッセイ媒体がシグナル中間体を含んで成り、 該中間体は、相同の第2特異的結合対メンバーであり、そして前記第2特異的結 合対メンバーとの複合体のメンバーとして存在する場合、検出可能なシグナルを 提供し、そして前記第1特異的結合対メンバーは前記分析物又は前記相同の第1 特異的結合対メンバーと交差反応する):前記進路の一端で前記装置と前記サン プルとを接触し(これにより、前記サンプルは前記進路にそって前記毛管作用に より輸送され、そして前記分析物又はその相同の特異的結合対メンパーが前記シ グナル中間体よりも速く移動し、それにより、前記シグナル中間体は前記第1特 異的結合対の複合体形成体に隣接するその相同の結合対メンバーへの結合を阻害 される);そして 既知量の分析物を有するサンプルと比較して、前記シグナル中間体により移動し た距離を決定することを含んで成る方法。
- 10.前記吸着性ストリップがセルロース材料である請求の範囲第9項記載の方 法。
- 11.前記セルロース材料かニトロセルロース膜である請求の範囲第10項記載 の方法。
- 12.前記第1及び第2特異的結合対メンバーがお互い共有結合される請求の範 囲第9項記載の方法。
- 13.前記第1及び第2特異的結合対メンバーが前記吸着性ストリップに独立し て結合される請求の範囲第9項記載の方法。
- 14.前記分析物がハプテンであり、前記第1特異的結合対メンバーが前記分析 物と交差反応するハプテンであり、そして 前記接触の前、前記サンプルに相同の第1特異的結合対メンバーを添加する追加 の段階を含む請求の範囲第9項記載の方法。
- 15.前記第1特異的結合対メンバーが前記第2特異的結合対メンバーに共有結 合され、ここで前記第2特異的結合対メンバーが抗体であり、そして前記相同の 第2特異的結合対メンバーが粒子である請求の範囲第4項記載の方法。
- 16.前記粒子が赤血球細胞である請求の範囲第15項記載の方法。
- 17.前記分析物が抗原である請求の範囲第9項記載の方法。
- 18.第1及び第2特異的結合対メンバー(該メンバーのそれぞれは、種々の特 異的結合対のメンバーであり、そして前記第1及び第2特異的対の相同メンバー の同時結合を阻害するために比較的一定の間隔で細管の表面に結合される)を含 んで成る細管装置を用いて水性アッセイ媒体中の分析物を検出するための方法で あって(前記装置は、予定された進路にそって前記アッセイ媒体の細管輸送を提 供し、ここで前記アッセイ媒体がシグナル中間体を含んで成り、該中間体は相同 の第2特異的結合対メンバーであり、そして前記第2特異的結合対メンバーとの 複合体のメンバーとして存在する場合、検出可能なシグナルを提供し、そして前 記第1特異的結合対メンバーは前記分析物又は前記相同の第1特異的結合対メン バーと交差反応する): 前記進路の一端で前記装置と前記サンプルとを接触し(これにより、前記サンプ ルは前記進路にそって前記毛管作用により輸送され、そして前記分析物又はその 相同の特異的結合対メンバーが前記シグナル中間体と少なくともほぼ同じ速さで 移動し、それにより、前記シグナル中間体は前記第1特異的結合対の複合体形成 体に隣接するその相同の結合対メンバーへの結合を阻害される);そして 既知量の分析物を有するサンプルと比較して、前記シグナル中間体により移動し た距離を決定することを含んで成る方法。
- 19.前記第1及び第2特異的結合対メンパーがお互い共有結合される請求の範 囲第18項記載の方法。
- 20.前記第1及び第2特異的結合対メンバーが前記吸着性ストリップに独立し て結合される請求の範囲第18項記載の方法。
- 21.前記分析物がハプテンであり、前記特異的結合対メンバーが前記分析物と 交差反応するハプテンであり;そして前記接触の前、前記サンプルに相同の第1 特異的結合対メンバを添加する追加の段階を含む請求の範囲第18項記載の方法 。
- 22.前記第1特異的結合対メンバーが前記第2特異的結合対メンバーに共有結 合され、ここで前記第2特異的結合対メンバーが抗体であり、そして前記相同の 第2特異的結合対メンバーが粒子である請求の範囲第21項記載の方法。
- 23.前記粒子が赤血球細胞である請求の範囲第22項記載の方法。
- 24.前記分析物が抗原である請求の範囲第18項記載の方法。
- 25.第1及び第2特異的結合対メンバー(該第1特異的結合対メンバーは血液 型抗原と交差反応する抗原であり、そして第2特異的結合対メンバーは血液型抗 原以外の赤血球細胞のエピトープに対して特異的であり、前記第1及び第2特異 的結合対メンバーは、前記抗体及び前記赤血球細胞の同時結合を阻害するするた めに比較的一定の間隔で表面に結合される)を含んで成る装置を用いて、血液型 抗原に対する抗体を検出することによって、血液サンプル中の逆型判定による血 液型を検出するための方法であって(前記装置は、予定された進路にそって前記 血液サンプルの細管輸送を提供する)、前記進路の一端で前記装置と前記サンプ ルとを接触し(これにより、前記サンプルは前記進路にそって前記毛管作用によ り輸送され、そして前記赤血球細胞は、前記第1特異的結合対メンバーへの前記 抗体の結合の存在下で前記第2特異的結合対メンバーへの結合を阻害される); そして既知血液型のサンプルと比較して、前記赤血球細胞により移動した距離を 決定することを含んで成る方法。
- 26.特異的結合対メンバーを含んで成る装置を用いて、水性アッセイ媒体中に おける細胞膜上のエピトープ側の存在を決定するための方法であって(該装置は 、前記特異的結合対メンバーへの前記エピトープ部位の結合に基づく相対的に定 義された境界で前記膜の堆積をもたらすのに十分な量で表面に結合される特異的 結合対メンバーを含んで成り、そして予定された進路にそって前記アッセイ媒の 細管輸送を提供し、ここで前記細胞膜が検出可能なシグナルを提供し、又はサン プルが予定された進路にそって移動した後、その装置は、前記膜に対して特異的 な試薬と接触せしめられ、そして検出可能なシグナルを供給することができる) :前記進路の一端で前記装置と前記サンプルとを接触し(これにより、前記サン プルは前記進路にそって前記毛管作用により輸送され);そして 前記境界を検出することによって前記膜により移動した距離を決定することを含 んで成る方法。
- 27.前記装置が前記進路にそって少なくとも2種の連続的な領域を有し、前記 領域のそれぞれは、細胞膜上に存在する異なったエピトープに対する特異的結合 対メンバーを有する請求の範囲第26項記載の方法。
- 28.前記膜が損われていない赤血球細胞膜である請求の範囲第26項記載の方 法。
- 29.分析物の決定のための装置であって:水性媒体のために細管輸送を提供す ることができる表面;前記表面に結合された第1及び第2特異的結合対膜(ここ で該第1及び第2特異的結合対メンバーは種々の特異的結合対のメンバーであり 、そして一定の間隔で並列に前記表面に非拡散的に結合され、その結果、前記第 1特異的結合対の複合体形成が前記第2特異的結合対の複合体形成を阻害する) を含んで成る装置。
- 30.前記表面が吸着性表面である請求の範囲第29項記載の装置。
- 31.前記吸着性表面がセルロース表面である請求の範囲第30項記載の装置。
- 32.前記セルロース表面がニトロセルロース膜である請求の範囲第31項記載 の装置。
- 33.前記表面が細管の表面である請求の範囲第29項記載の装置。
- 34.前記第2特異的結合対膜が赤血球細胞に結合する請求の範囲第29項記載 の装置。
- 35.前記第1特異的結合対メンバーがハプテンである請求の範囲第29項記載 の装置。
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