JPH05500116A - 固定された抗体を有する固体支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固定された抗体を有する固体支持体 発明の背景 本発明はその上に固定された抗体を存する固体支持体に関し、更に詳しくは固相 免疫検定に存用である前記固体支持体に関する。

生物学的流体中に存在する分析対象物（ａｎａｌｙｔｅ　）を分析する免疫検定 に使用するためのさまざまな型の検定要素か知られている。固相免疫検定として 一般に称せられる一つの型において、抗原−抗体相互作用対の】員、たとえば抗 体は微粒子状材料、繊維状材料などのような固体担体に結合させられる。これら の検定において固体支持体は、結合された材料と結合する相手の間の相互作用が 起こる部位になる。

既知の免疫的検定のどれもが、たとえばサンドイッチ検定または拮抗検定は固相 構成にて行うことができる。

そのような検定はその技術分野に精通している者にはよく知られている。要する に、たとえば、拮抗検定においては関心のある分析対象物、たとえば抗原を含有 する試料流体は、分析対象物の結合する相手、たとえば抗体を結合した固体支持 体に適用される。支持体に結合された抗体の量は試料分析対象物と標識された種 の間に必要な競合を可能にすることか必要である。続いて、インキュベーション 期間の後、標識された分析対象物または標識されたその類似体は固体支持体に添 加されて、もう一つのインキュベーション期間および洗浄工程の後、結合されな かった標識された物質を除去し、結合された標識された物質か検出されて、患者 の試料流体中の分析対象物の量の画数である信号を得る。信号は試料中の分析対 象物の量に反比例する。

固体担体上に固定される抗体は共有結合、免疫沈降などを含むさまざまな手段に よってそれへ結合させることかできる。免疫沈降技術は共有結合に対して必要と される化学反応に比較して、いっそう便利に行うことかできる。しかしながら、 先に記述された拮抗免疫検定のようないくつかの検定においては、比較的に限定 された量の抗体だけが、検定濃度範囲などのようなさまざまな要因のために担体 に結合することができる。もし使用された結合技術が十分に効率か良くなければ 低い信号レベルが所定量の抗体について得られるだけである。もちろん、信号は 固体担体に対し更に多量の抗体を添加することによって改善することかできるか 、その結果検定範囲か、関心のある分析対象物に対し必要とされる範囲の外へ移 動するときは、この代替策は満足なものではない。

従って、その上に固定された抗体を有する新しい固体支持体を有することか望ま しい。また拮抗固相免疫検定に使用することかできて改善された信号レベルを得 るが同時に低い非特異的結合を示す前記の固体支持体を有することか望ましい。

発明の概要 これらのおよび他の目的並びに利点は関心のある特異的抗体の複合体、非特異的 抗体と特異的および非特異的抗体のＦｃ断片に対して向けられた抗体をその上に 固定した固体支持体を提供することにより本発明に従って成し遂げられる。たと えば、ジゴキシンに対する免疫検定に使用するために固体支持体上に固定される 、関心のある特異的抗体としてマウスのモノクローナル抗−ジゴキシン抗体を考 えてみよう。本発明によればマウスのモノクローナル抗−ジゴキシン抗体は、非 特異的なマウスのＩｇＧ抗体およびマウスの抗体のＦｃ断片に対してひき起こさ れた抗−マウス抗体と一緒に複合体に包含される。

複合体は受動吸着により固体支持体上に固定される。

本発明の固体支持体は関心のある抗体、たとえば抗−ジゴキシン抗体とコーティ ング溶液、典型的には緩衝溶液中の非特異的抗体とを先ず混合し、次いで特異的 および非特異的抗体のＦｃ＃ｆｒ片に対してひき起こされた特異的抗体を添加す ることによって調製される。混合物は複合体か生成することを可能にする時間お よび温度条件下にインキュベートされる。コーティング溶液は固体支持体上に塗 布されて後者か乾燥させられる。抗体の複合体は受動吸着によって固体支持体に 固定される。

本発明の固体支持体は試料流体中の分析対象物の分析のだめに拮抗固相免疫検定 に使用されたとき特に宥和であることかわかった。さらに高い信号レベルを得る ことかできるか、同時に所望の検定範囲内に検定の感度を維持する。

図面の簡単な説明 他の目的および別の特徴と同様に本発明を更に良く理解するために、添付図面と ともにその好ましい実施態様の次の詳細な説明を行う。なお図は本発明に従う好 ましい検定要素の単純化された等胸回である。

好ましい実施態様の説明 本発明の固体支持体はたとえば、微粒子状材料、その構成要素上に付着された流 体がその構成要素を通り抜けて拡かるような至る所に互いに通じる網状の孔を有 する多孔性構成要素なとのような適当な固体担体をも含むことかできる。適当な 多孔性構成要素は多孔性膜、繊維状網目材料などを含み、ガラス、重合体物質、 紙なとの適当な材料てもありうる。好ましい実施態様において、固体担体は毛管 作用のために付着した流体かすぐにすみずみまで拡がることを可能ならしめる細 い繊維状網目構成要素である。その構成要素は適当な繊維状材料でもありうる。

好ましい材料は不織ガラス繊維メツシュであり、その繊維は約１マイクロメータ ー（μｍ）のオーダーのような非常に細いものである。

関心のあるモノクナール抗体もたとえはシコキシン、トリョートチロニン（Ｔ３ ）なとのようなハブテン、ミオグロビン、ホルモンなどのようなタンパク質など に対する抗体のように固体担体上に固定化されうる。非特異的抗体は特異的抗体 と非特異的抗体のＦｃ断片に対して向けられた抗体が結合するとのようなもので もあってもよい。好ましくは非特異的抗体は特異的抗体と同じ種である、すなわ ちそれらは同し型の宿主動物、たとえばマウスにおいて生じる。特異的抗体と非 特異的抗体のＦｃ断片に対して生じる抗体はとのような宿主動物においても生じ ることが可能である。

固体支持体に抗体複合体を適用するために使用されるコーティング溶液は先ず関 心のある特異的抗体と非特異的抗体を適当な溶液中で、好ましくは緩衝溶液中で 結合することによって調製される。その溶液はたとえば非特異的結合を減少する のに有用なタンパク質のような他の一添加剤、砂糖のような安定剤、固体支持体 の湿潤性を改善する界面活性剤、抗微生物作用を抑える防腐剤などを含有しうる 。次に、特異的抗体と非特異的抗体のＦｃ断片に対して向けられた抗体が加えら れる。次いで溶液は複合体の生成することを可能にするために必要とされる時間 と温度の条１件下でインキュベートされる。これらの条件は特異的物質、含まれ る量なとによって変わる。好ましい実施態様においてコーティング溶液は３７° Ｃて１時間インキュベートされる。

溶液は次いて固体支持体に付着し、受動吸着によってその上に固定化されるよう になる。固体支持体は固相免疫検定において有用な構成要素を提供するために乾 燥される。

好ましい実施態様において本発明の固体支持体は関心のある分析対象のための既 知の拮抗固相免疫検定に利用される。このような検定はその技術分野に精通して いる者には良く知られており、その広範囲の討論は本明細書においては必要では ない。本発明の固体支持体の利点を更に記述するために好ましい繊維状固相拮抗 免疫検定におけるそれらの使用を記述する。図を参照して説明すると、ハウジン グ１２の中に多数の空洞を含む検定要素ＩＯかあり、その中で最初の空洞１４が 検定に利用される流体試薬の貯蔵のための前端貯蔵所として役立ち、第二の空洞 か検定のための他の流体試薬の貯蔵のために後面の貯蔵所１６として役立ち、第 三の空洞１８は試薬を混合するために混合くぼみとして役立ち、第四の空洞２０ は多孔性固体支持体２２の一端へ流体を分配するために適合させられる。ハウジ ング１２の中にはまた空洞２４か示されており、その中に洗浄流体により吸収性 流体が繊維状固体支持体を通して拡かるような固体支持体２２から除去された吸 収性流体のための吸収性材料が配列されている。穴かあけられるのでこわれやす い箔（図示せず）か前面と後面の貯蔵所１４．１６の上に、これらの貯蔵所の中 に流体試薬を含有するために、それぞれ配置されていて、かくして自給式の検定 要素を提供する。

この好ましい実施態様において固体支持体２２は本発明に従って関心のある抗体 を固定化する細い繊維状メツシュパッドより成る。好ましい固体支持体は約１マ イクロメーター（μｍ）のオーダーの非常に細い繊維を有する不織ガラス繊維メ ツシュである。この好ましい固体支持体は厚さが約０．３０ｍｍ〜約０．６０市 、好ましくは約０．４０皿である。

固体支持体２２は分配空洞２０から吸収性材料を保持する空洞２４まて拡がる。

適当な材料ならどのようなものでも良い流体吸収性材料２６は、空洞２４の中に おかれ、固体支持体とその支持体が配列させられるガイドエリア（図示せず）と から排出された流体を取り上げるために空洞２４の１部を形成する。吸収性材料 ２６は隣接している固体支持体２２におかれ、好ましい実施態様において、図に 示されるように、それ自身が後から前へ折りたたまれた固体支持体材料の延長部 分として都合良く形成される。

ハウジング１２はまた免疫相互作用がおこる固体支持体の領域のすぐ上に位置す る空洞２８を含んでいる。固体支持体に結合された固定化された抗体複合体が免 疫相互作用かおこるであろう支持体の部分にのみ存在することか必要なことはそ の技術分野に精通している者には明らかである。ハウジング】２はまた検定法の 結果として支持体において達成された検出可能な変化を測定するために使用され た読み取り照度のための接近方法を提供するために固定支持体２２の底表面のす ぐ下に位置するハウジングの中の透明な窓（図示せず）または開口を含む。

検定法において試料流体の体積、典型的には３０〜４５μｌは空洞２８を通って 固体支持体２２に付着される。

試料液体は、固体支持体の反応部位において試料抗原と固定化された抗体とか相 互作用することを可能にする適当な温度で適当な時間インキュベートすることが 可能である。次に、酵素標識した抗原（試料抗原と同じもの）の抱合体またはそ れの類似体を空洞１４からとりのぞきそして空洞２８を通って固体支持体に付着 させた。抱合体は試料抗原に結合しない固体担体上のどの特異的抗体とも結合す るだろう。検定要素１０は再びインキュベート可能である。

酵素レベルは間接的に検出されなければならないので、基質溶液、典型的に５０ 〜１００μｌは空洞２０を通って多孔性固体支持体２２に適用される。基質溶液 は結合していない試料抗原または抱合体を固体支持体から除去し、酵素レベルを 検出できるようにするための両方の洗浄流体として利用される。基質溶液は固体 支持体の末端部に入れさせられ、溶液か担体２２を通して広がるので、それは流 体とともに未結合試料抗原および酵素抱合体をも固体支持体から強制的に取り除 き、吸収材空洞２４の中に押し込め吸収材料２６によって取り上げられる。基質 物質と酵素の反応によって放出された蛍光種によって発せられる信号は適当な光 学装置によって読みとられる。

本発明の固体支持体によって行われるこのような拮抗検定はより高い信号レベル と検定範囲内の望ましいより勾配の険しい標準曲線スロープを与えることがわか った。

好ましい拮抗固相検定を逐次型に関して記述したけれども、それはまた同時方式 で実行できることも明確に理解されるへきである。

本発明を実施例によって具体的な好ましい実施態様に関して更に詳細に記述する か、それらは単に説明することを意図するものであって、本発明はその中に挙げ られている物質、条件、プロセスパラメーターなどに限定されるものではない。

例　１ ｐＨ７，２のリン酸緩衝生理食塩水溶液中に０．１μｇ／ｍｌの抗−ジゴキシン 抗体と工０μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ抗体とを含み、さらに他のタンパク質、安 定剤、界面活性剤および抗微生物試薬も含む抗体溶液を調製した。その溶液を０ ．２μｍのフィルターを通して濾過し、次いで２ｍｌのヤギの抗−マウスＩｇＧ 、溶液、Ｆｃフラグメントスペシフィック（Ｆ　ｃ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　５ｐｅ ｃｉｆｉｃ　）（Ｊａｃｋｓｏｎ　［ｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）を抗体 溶液を用いて１：１００に希釈してコーティング溶液を生成した。

コーティング溶液を３７°Ｃて１時間インキュベートし、約３５μｌをおよそ７ ×８皿の面積のＷｈａｔｍａｎ　Ｇ　Ｆ　／　Ｆのガラス繊維の濾材に加えた。

濾材を７５°Ｃて１０分間乾燥し、先に述へた検定要素に混合した。

次いて検定要素は既知濃度のジゴキシンを含む試料流体を用いて先に記述された 拮抗免疫検定法を行うために使用した。この検定は自動化された実験室の装置で 行った。抱合体に用いられた酵素標識はリン酸メチルウシ・＼リフェリル（ｍｅ ｔｈｙｌ　ｕｎｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　）てあり、読みと られる信号は固体支持体底部表面に対する３６０ｎｍの直接放射によって得られ 、４５０ｎｍの反射放射を測定することにより得られる。

得られた信号を表Ｉに示す。検定は速度論的に読みとられ、得られた信号は速度 論的測定の傾斜である。表Ｉに示された各数値は３回のくりかえしの平均である 。

本発明の検定方法は検定範囲内（約０．５〜４．Ｏｎｇ／ｍ１）での高い信号レ ベルと望ましい勾配の険しい標準曲線スロープを与えることかわかった。

例　２ 抗−ジゴキシン抗体のかわりに０．０６２５μｇ／＋ｕｌのモノクローナル抗体 をＴ３に対して含む以外は例１に記述したのと同じコーティング溶液を調製した 。例１に記述したように検定要素を調製して先に記述した拮抗固相検定法を行う ために使用した。得られた結果を表＋＋に４．００　１９８１ ８．００　１２２０ さらにまた本発明の検定法は検定範囲内（約０．５０〜８　、ＯＯｎｇ／　ｍｌ ）ての高い信号レベルと望ましい勾配の険しい標準曲線スロープを与えた。

本発明を種々の好ましい実施態様に関して詳細に記述したか、変化と修正か本発 明の精神と添付された請求の範囲内でなしうろことをその技術分野に精通してい る者は明確に理解するであろう。

要　約　書 固定された抗体を有する担体を開示する。関心のある特異的抗体は、非特異的抗 体と特異的および非特異的抗体のＦｃ断片に対して向けられた抗体を含む複合体 の一部として固体支持体上に固定される、好ましい実施態様において固体支持体 は固相拮抗免疫検定に使用され、そして所望の検定感度範囲内に望ましい勾配の 険しい標準曲線スロープをおよび改善された信号レベルを与える。

ＩＩＩ電ｊ、ＡｌＩｎＡｌ１＾−１−１１鼻ｔ−）ず覧−１−ＰＣＴ／ｌｊｓ９ １１０２０９２

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．固定された関心のある抗体を有する固体支持体において、（１）関心のある 特異的なモノクローナル抗体；（２）非特異的抗体；および（３）前記特異的お よび非特異的抗体のＦｃ断片に対して向けられた抗体の複合体が付着させられた 固体支持体を含む固体支持体。
2. ２．前記固体支持体が繊維状ガラス材料である請求項１に記載の固体支持体。
3. ３．前記特異的モノクローナル抗体がマウスの抗−ジゴキシン抗体またはマウス の抗−トリヨードチロニン（Ｔ３）抗体であり、前記非特異的抗体がマウスのＩ ｇＧ抗体であり、そして前記特異的および非特異的抗体のＦｃ断片に対して向け られた前記抗体がヤギの抗−マウス抗体である請求項２に記載の固体支持体。
4. ４．特異的抗体と非特異的抗体が同じ種のものである請求項１に記載の固体支持 体。
5. ５．固定された関心のある抗体を有する固体支持体を製造する方法において （ａ）関心のある特異的モノクローナル抗体および非特異的抗体、前記特異的お よび非特異的抗体のＦｃ断片に対して向けられた抗体を含有する溶液を添加し； （ｂ）前記抗体に複合体を生成することを可能ならしむるに十分な時間と温度で 前記溶液をインキュベートし； （ｃ）前記溶液を固体支持体に適用し；および（ｄ）前記固体支持体を乾燥しそ れによって前記抗体複合体が固体支持体上に固定されることを含んでなる方法。
6. ６．前記固体支持体が繊維状ガラス材料である請求項５に記載の方法。
7. ７．工程（ｂ）が約３７℃で約１時間行なわれる請求項５に記載の方法。
8. ８．前記特異的抗体と非特異的抗体が同じ種のものである請求項５に記載の方法 。
9. ９．前記特異的抗体がマウスのモノクローナル抗体でありそして前記非特異的抗 体がマウスのＩｇＧ抗体である請求項８に記載の方法。
10. １０．前記特異的抗体がマウスの抗−ジゴキシン抗体またはマウスの抗−トリヨ ードチロニン（Ｔ３）抗体である請求項９に記載の方法。
11. １１．（ａ）請求項１に記載の固体支持体と（ｉ）前記固体支持体上に固定され た特異的モノクローナル抗体の結合する相手である分析対象物を含有する試料流 体および（ｉｉ）前記分析対象物またはその類似体に結合させられた標識を含む 抱合体とを接触させ； （ｂ）固相と流体相を分離し；および （ｃ）固相または流体相のいずれかに存在する標識の量を検出することを含んで なる拮抗固相免疫検定方法。
12. １２．前記標識が酵素でありそして工程（ｂ）が前記固体支持体に基質溶液を適 用することにより行なわれる請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記基質と前記酵素の反応が蛍光種を与える請求項１２に記載の方法。
14. １４．工程（ａ）が前記固体支持体に前記試料流体を先ず適用し次いで固体支持 体に前記抱合体の溶液を適用することによって行なわれる請求項１１に記載の方 法。
15. １５．前記固体支持体上に固定された前記特異的モノクローナル抗体がモノクロ ーナル抗−ジゴキシン抗体またはモノクローナル抗−トリヨードチロニン（Ｔ３ ）抗体である請求項１１に記載の方法。
16. １６．前記固体支持体上に固定された前記特異的モノクローナル抗体がモノクロ ーナル抗−ジゴキシン抗体またはモノクローナル抗−トリヨードチロニン（Ｔ３ ）抗体である請求項１４に記載の方法。