DE3586951T2

DE3586951T2 - Festphasendiffusionstextverfahren.

Info

Publication number: DE3586951T2
Application number: DE8686900694T
Authority: DE
Inventors: Erich H Cerny
Original assignee: Nycomed Pharma AS
Current assignee: Axis Shield PoC AS
Priority date: 1984-12-20
Filing date: 1985-12-19
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2005-12-20
Also published as: HK1000970A1; AU5317886A; ATE84148T1; DE3586951D1; AU592971B2; WO1986003839A1; JP2642342B2; CA1268420A; EP0207152A1; EP0207152B1; EP0207152A4; JPS62501645A

Description

Die Erfindung betrifft einen quantitativen und qualitativen Test für kleine Mengen von Substanzen in einer Lösung und insbesondere die schnelle und einfache Identifizierung und Quantifizierung von Substanzen in Lösung mit Hilfe einer neuartigen Festphasendiffusionstest-Technik. Der neuartige Test kann zur schnellen und quantitativen Bestimmung der Konzentration von Proteinen, Hormonen, Arzneistoffen, Polypeptiden, Vitaminen, Glykosiden u. dgl. verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen Kit zur Durchführung dieser quantitativen Bestimmungen und bestimmte neuartige Komponenten für solche Kits und für die Verwendung in dem neuartigen Test.
Es besteht ein fortgesetzter Bedarf an einem billigen, leicht durchzuführenden Verfahren zur Detektion von Substanzen, welche in Flüssigkeiten in Konzentrationen im Bereich von 1·10&supmin;&sup6; g/ml oder weniger vorliegen. Verfahren gemäß dem Stand der Technik, welche eine Substanz in einer Flüssigkeit exakt bei solchen Konzentrationen detektieren können, sind mühselig, teuer und erfordern eine lange Durchführungszeit. Außerdem ist eine teure und komplizierte Ausrüstung zur Durchführung dieser Verfahren gemäß dem Stand der Technik erforderlich.
Es gibt viele Testverfahren gemäß dem Stand der Technik, welche für den Nachweis der Präsenz einer löslichen Substanz im Serum oder anderen Medien von biologischer Bedeutung entwickelt wurden. Für Substanzen mit biologischer Aktivität kann man in einfacher Weise die Aktivität der biologischen Flüssigkeit bestimmen, um die Präsenz der Substanz zu detektieren. Beispielsweise kann man die Präsenz des Enzyms saure Phosphotase im Blutserum dadurch bestimmen, daß man Substrat für das Enzym saure Phosphotase, wie z. B. p-Nitrophenylphosphat zugibt und die Lösung eine gewisse Zeit inkubiert. Liegt das Enzym im Blut vor, so färbt sich die Lösung gelb, da das Substrat durch das Enzym hydrolysiert wird, wobei sich Phosphat und p-Nitrophenol bilden. Es gibt jedoch eine Vielzahl von Problemen, die mit diesem Testtypus verbunden sind. Beispielsweise muß die zu bestimmende Substanz eine meßbare biologische Aktivität aufweisen. Die Messung der biologischen Aktivität kann häufig mühsam und zeitaufwendig sein. Außerdem kann die Aktivität des Enzyms durch die Gegenwart eines Inhibitors inhibiert werden. Liegt solch ein Inhibitor vor, so wird man eine fälschlicherweise niedrige Aktivität bestimmen. Außerdem kann das Enzym in der Flüssigkeit vorliegen, jedoch inaktiv sein.
Ein anderes Verfahren zur Bestimmung der Präsenz von Spurensubstanzen in biologischen Flüssigkeiten ist die Chromatographie. Es gibt viele verschiedene Arten der Chromatographie. Dünnschichtchromatographie in Kombination mit Massenspektroskopie oder Gasphasenchromatographie wurde zur Isolierung und Quantifizierung einer einzelnen Substanz in biologischen Flüssigkeiten verwendet. Die Dünnschichtchromatographie weist jedoch eine Vielzahl von Nachteilen auf. So ist sie langsam, kann von einer Vielzahl von Materialien beeinflußt werden und weist schwerwiegende Schwankungen in bezug auf ihre Zuverlässigkeit auf.
Die Flüssigkeitschromatographie stellt ein weiteres Verfahren zur Isolierung von Stoffen aus biologischen Flüssigkeiten dar. Bei diesen Verfahren macht man sich die besonderen physikalischen Eigenschaften der Moleküle, wie Größe oder Ladung, zunutze. Man muß jedoch weiterhin ein Verfahren anwenden, um die jeweilige Substanz nach ihrer Isolierung zu analysieren. Dies kann über eine Bestimmung der biologischen Aktivität, der Extinktions-Eigenschaften, oder mit Hilfe der Massenspektroskopie oder durch eine weitere Trennungs-Analyse erfolgen.
Ein anderes Verfahren, welches die molekulare Ladung und Größe ausnutzt, ist die Gelelektrophorese. Bei diesem Verfahren wird die biologische Probe in ein poröses Gel gegeben. Die Probe und das Gel werden dann einem elektrischen Feld unterworfen, welches eine Wanderung der Probe durch das Gel bewirkt. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist abhängig von der Ladung und der Größe des Moleküls. Auf diese Weise können verschiedene Moleküle getrennt und isoliert werden.
Im Zusammenhang mit chromatographischen und elektrophoretischen Methoden zur Identifizierung von Substanzen gibt es eine Vielzahl von Problemen. Eines dieser Probleme besteht in der Identifizierung der Substanz nach deren Isolierung. Um die isolierte Substanz zu identifizieren, ist ein weiteres Verfahren durchzuführen, wie z. B. die Bestimmung der biologischen Aktivität, eine Analyse durch Massenspektroskopie oder eine Identifizierung durch andere Methoden, wie z. B. immunologische Methoden. Ein elektrophoretisches oder chromatographisches Verfahren ist ein zeitaufwendiger Prozeß von mehreren Stunden bis mehreren Tagen. Zusätzlich ist die bei diesem Verfahren verwendete Ausrüstung teuer und erfordert für die Durchführung der Analyse einen erfahrenen Techniker.
Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung von Spuren einer bestimmten Substanz in einer Lösung besteht in der Anwendung immunologischer Techniken. Sämtliche immunologische Verfahren verwenden ein Antigen und einen Antikörper, der für das Antigen spezifisch ist. Immunologische Verfahren gemäß dem Stand der Technik umfassen die immunologische Präzipitation, wobei sich der Antikörper mit einem Antigen, für welches der Antikörper spezifisch ist, verbindet. Der resultierende Komplex fällt unter Bildung eines sichtbaren Präzipitates aus der Lösung aus.
Die Agglutination ist ein weiteres Verfahren gemäß dem Stand der Technik zum Nachweis kleiner Konzentrationen einer bestimmten Substanz. Bei der Agglutination reagiert ein Körper, wie z. B. eine rote Blutzelle oder ein Bakterium mit Antikörpern, welche für ein Antigen auf der Oberfläche des Körpers spezifisch sind. Da die Antikörper mit den Oberflächenantigenen reagieren, agglutinieren die Zellen und bilden einen dichten, sichtbaren Klumpen.
Die Immunopräzipitations- und Immunoagglutinations-Verfahren weisen jedoch einen allgemeinen Mangel an Sensitivität auf. Zusätzlich erfordern diese Verfahren ein Antigen mit einer Vielzahl an Antikörperbindungsstellen, so daß die Antikörper die Antigene vernetzen und die Präzipitation oder Agglutination bewirken können. Das Immunopräzipitationsverfahren benötigt bis zur Beendigung mehrere Stunden oder mehrere Tage, so daß das Verfahren häufig dann unpraktisch wird, wenn die Identifizierung oder Quantifizierung einer bestimmten Substanz schnell durchzuführen ist.
Das Problem der mangelnden Präzision der oben beschriebenen Verfahren wurde mit Hilfe des als Radioimmunoassay bekannten Verfahrens überwunden. Bei diesem Verfahren ist das zu bestimmende Antigen mit einem radioaktiven Element markiert, wobei ein analoges, radioaktiv markiertes Antigen gebildet wird. Radioaktive Isotope, welche üblicherweise in Radioimmunoassays verwendet werden, sind in Tabelle I angegeben. TABELLE I Radioaktive Isotope zur Markierung biologischer Materialien Isotop Spezifische Aktivität des reinen Isotops (Curie pro Minute) Halbwertszeit Jahre Tage
Durch Vermischen eines Antikörpers mit Lösungen eines zu bestimmenden Haptens oder Antigens und mit dem radioaktiven Antigen-Analogon wird das radioaktive Analogon an der Bindung mit dem Antikörper in einem Maß gehindert, das proportional zur Konzentration des Haptens oder Antigens in der Lösung ist. Durch Abtrennung des freien radioaktiven Analogons von dem antikörpergebundenen radioaktiven Analogon und Bestimmung kann man direkt die Menge an Hapten oder Antigen in der ursprünglichen Lösung berechnen.
Die Verwendung von Radioisotopen in solchen Tests ist jedoch mit einer potentiellen Gesundheitsgefahr verbunden und außerdem sind die für einen Radioimmunoassay erforderlichen Instrumente relativ kompliziert und teuer. Ein weiteres Problem bei einem Radioimmunoassay liegt in der Markierung des Antigens oder Antikörpers. Die üblicherweise verwendeten Isotope besitzen eine kurze Halbwertszeit. Dies sind Jod-131 und Jod-125. Da diese Isotope eine kurze Halbwertszeit aufweisen (8,1 Tage bzw. 60 Tage) muß die markierte Komponente eines Tests periodisch durch ein neues Produkt ersetzt werden. Außerdem muß mit jeder unbekannten Probe eine Eichkurve erstellt werden, da die spezifische Aktivität des Isotops konstant abnimmt. Ein weiteres Problem bei einigen markierten Komponenten besteht in deren automatischem Abbau. Die üblicherweise zur Markierung der Verbindungen verwendeten Isotope sind relativ starke Strahlungsemitter und können den Abbau derjenigen Verbindungen bewirken, an die sie gebunden sind. Schließlich wird mit der steigenden Anzahl von Regierungsrichtlinien betreffend die Entsorgung von radioaktivem Abfall, die Beseitigung der in Radioimmunoassays verwendeten radioaktiven Isotope ein zunehmend schwieriges und kostspieliges Problem.
Mit Hilfe von Enzymimmunoassays können die oben genannten Probleme beseitigt werden und außerdem haben diese den spezifischen Vorteil, die gemessene Aktivität wirksam zu verstärken. (Das Gebiet der Enzymimmunoassays wurde ausführlich beschrieben in "Developments in Immunology", Band 18, Immunoenzymatic Techniques, Elsevier Science Publishers, 1983). Gemäß diesem Verfahren wird das radioaktive Analogon einer biologischen Substanz durch eine enzymmarkierte biologische Substanz (Hapten oder Antigen) ersetzt. Typische Enzyme, welche als Label in Enzymimmunoassays verwendet werden können, sind in Tabelle II aufgelistet.

TABELLE II

Üblicherweise in Enzymimmunoassays verwendete Enzyme

Alkalische Phosphatasen
Glucoseoxidasen
Ureasen
Peroxidasen
β-Galactosidasen
Glucose-6-phosphatdehydrogenasen
Lysozym
Malatdehydrogenasen
Solche modifizierten Enzymmoleküle behalten ihre enzymatische Aktivität bei und die enzymmarkierte biologische Substanz konkurriert bei der Bildung des Antikörperkomplexes mit der unbekannten Menge der freien biologischen Substanz in dem System. Die Komplexe können aufgrund der Unlöslichkeit in bestimmten Substanzen abgetrennt werden. Die Aktivität des abgetrennten Komplexes oder des in der Lösung verbleibenden Anteils wird als Maß für die Menge an ursprünglich vorliegendem Antigen verwendet. Das gleiche Prinzip kann in einem umgekehrten System angewendet werden, wobei enzymmarkierte Antikörper immer dann eingesetzt werden, wenn die nicht-modifizierte Version des gleichen Antikörpers in biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen ist.
Es existieren mehrere Abwandlungen des Enzymimmunoassays. Gemäß einer Abwandung, die auch unter der Bezeichnung "Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" bekannt ist, konkurrieren markiertes und unmarkiertes Antigen um die Anlagerung an eine begrenzte Menge eines festphasengebundenen Antikörpers. Man bestimmt die Menge an verdrängter Enzymmarkierung und die darauffolgenden Berechnungen entsprechen im wesentlichen denjenigen, die bei Radioimmunoassays erforderlich sind.
Die Sandwich-Technik ist eine weitere Variante des Enzymimmunoassays und beruht auf der Multivalenz von Antigenen und deren Kapazität gleichzeitig an zwei Antikörpermoleküle zu binden. Das erste Antikörpermolekül ist ein Festphasenreaktand. Es wird im Überschuß verwendet, um eine Bindung aller Antigenmoleküle in der unbekannten Probe zu gewährleisten. Nach Beendigung der Reaktion gibt man einen enzymmarkieren Antikörper hinzu und inkubiert mit dem aus der ersten Phase resultierenden Komplex. Der markierte Antikörper bindet dann an die verfügbaren Determinanten auf dem Antigen. Überschüssigen Antikörper entfernt man durch Waschen und bestimmt anschließend die Enzymaktivität. Wie in anderen Systemen stellt die Menge von an den Komplex gebundenem Enzym ein indirektes Maß für die Menge des Antigens in der Probe dar. Abwandlungen dieser Methode umfassen die sogenannte "Zweite Antikörper"-Methode. Bei dieser Methode läßt man das Antigen zuerst mit einem festphasengebundenen Antikörper und später mit einem freien Antikörper reagieren, wobei keiner der Antikörper markiert ist. Anschließend setzt man einen enzymmarkieren Antikörper als letztes Reagens ein, der für den freien Antikörper spezifisch ist.
Die meisten Enzymimmunoassay-Techniken werden als heterogene Tests eingestuft. Dies bedeutet, daß das gebundene, markierte Molekül zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Tests von dem freien, markierten Molekül abgetrennt werden muß, um die notwendigen Berechnungen zur Bestimmung der Menge der unbekannten Substanz in der Flüssigkeit durchzuführen. Dies erfordert einen Trennschritt in dem Test und erhöht somit Zeitbedarf und Kosten dieses Testverfahrens. Es gibt auch Enzymimmunoassay-Verfahren, die als homogene Tests durchgeführt werden, insofern als keine Trennung der gebundenen, markierten Substanz und der ungebundenen markierten Substanz erfolgt. Solch ein Testsystem erfordert keinen Festphasen-Reaktanden, sondern beruht vielmehr auf einer Inhibition der Enzymaktivität durch die Kombination eines Antikörpers mit einem enzymmarkierten Antigen oder Hapten. Dieser Test-Typus ist von begrenztem Nutzen, da nicht alle Antigen-Antikörperkombinationen zu einer voraussagbaren Verringerung der Enzymaktivität führen.
Enzymimmunoassays sind allgemein betrachtet ebenso sensitiv wie Radioimmunoassays und viel sicherer durchzuführen, da keine radioaktiven Isotope verwendet werden. Zusätzlich erfordern Enzymimmunoassays im allgemeinen eine weniger komplizierte Ausrüstung als dies bei Radioimmunoassays der Fall ist. Ein Enzymimmunoassay ist im allgemeinen viel weniger kostspielig als eine über einen Radioimmunoassay durchgeführte entsprechende Bestimmung.
Es bestehen jedoch weiterhin signifikante Probleme in Verbindung mit einem typischen Enzymimmunoassay. Für viele Applikationen ist die zur Durchführung des Enzymimmunoassays benötigte Zeit zu lang. In den meisten Fällen ist eine Inkubationszeit von wenigstens mehreren Stunden für die Durchführung des Tests erforderlich. Außerdem umfaßt ein typischer Enzymimmunoassay mehrere Waschschritte und einen zusätzlichen Inkubationsschritt mit einem Enzymsubstrat, um eine Farbreaktion, die gemessen werden kann, zu entwickeln. Die aus der Enzymreaktion resultierende Farbentwicklung muß anschließend in einem Spektrophotometer gemessen werden.
Es wurde eine Reihe bekannter Immunoassays, die im folgenden beschrieben werden, vorgeschlagen, die einen Rezeptor für den Analyten verwenden, der auf einem porösen Träger immobilisiert ist, in welchen man den Analyten oder andere Flüssigkeiten diffundieren läßt.
Es wurde festgestellt, daß viele der Nachteile, welche mit den bekannten Tests auf Diffusionsbasis verbunden sind, dadurch vermieden werden können, daß man eine kolloidale Gold- oder Silbermarkierung verwendet, da dies zu einer ausgezeichneten Empfindlichkeit führt und gleichzeitig die Verwendung von radioaktiven Materialien oder Enzymen vermieden werden kann. Es wurde außerdem festgestellt, daß die Empfindlichkeit des Tests dadurch verbessert werden kann, daß man die Probe und andere Flüssigkeiten über eine Öffnung in einem Deckblatt aufträgt und/oder indem man eine hydrophile Schicht verwendet, welche die transversale Diffusion von Flüssigkeiten durch den porösen Träger, der die Rezeptorsubstanz trägt, unterstützt.
Die europäische Patentanmeldung 0007654 (Akzo) beschreibt einen Immunoassay, der in Vertiefungen von Polystyrol-Mirkotiterplatten durchgeführt wird, in denen der Analyt auf der Polystyroloberfläche über einen ersten spezifischen Bindungspartner adsorbiert ist und anschließend mit einem zweiten Bindungspartner markiert wird, der an kolloidalem Metall, wie z. B. kolloidalem Gold, gebunden ist. Das spezifisch gebundene kolloidale Metall wird vorzugsweise in einer Salzsäurelösung freigesetzt und photometrisch oder über andere analytische Methoden oder mit Hilfe des bloßen Auges bestimmt. Es gibt jedoch darin keinen Hinweis auf eine Auftragung einer Probe oder eines Metallkolloid-markierten Bindungspartners über eine Öffnung in einer Deckschicht, und/oder auf die Durchführung der Reaktion im Verlauf eines schnellen Diffusions- oder Filtrationsprozesses in einem porösen Medium. Tatsächlich wird der Analyt mit dem aktivierten Träger über Zeiträume von 1 h bis über Nacht inkubiert und der kolloidmarkierte Bindungspartner wird routinemäßig 18 h inkubiert. Dies steht im Widerspruch zu den sehr kurzen Reaktionszeiten, welche mit Hilfe der erfindungsgemäßen Diffusionsmethode erzielt werden.
Die europäische Patentanmeldung 158746 beschreibt einen Blot-Overlay-Test, worin ein Analyt auf einem Blottingmedium adsorbiert und mit einem Bindungspartner markiert wird, an dem ein kolloidales Metall, wie kolloidales Gold, gebunden ist. Darin ist jedoch kein Hinweis auf die Auftragung einer Probe und/oder eines mit kolloidalem Metall markierten Bindungspartners auf einen Träger über eine Öffnung in einer Deckschicht zu finden, um einen präzisen Applikationspunkt und einen möglichen Konzentrationseffekt zu erreichen. Tatsächlich wird der Analyt mit dem aktivierten Träger über einen Zeitraum von 1 h bis über Nacht inkubiert. Dies steht im Gegensatz zu den sehr kurzen Reaktionszeiten, welche mit Hilfe des erfindungsgemäßen Diffusionsverfahrens erreicht werden. Die Verwendung einer Absorbensschicht zur Erleichterung der Diffusion ist nicht offenbart.
In "Analytical Biochemistry" 142, 221-225 (1984) wird ein Verfahren zur Detektion von Antigenen offenbart, worin ein an Nitrocellulosepapier gebundener Antikörper und ein Tropfen aufgetragener Probe eingesetzt und anschließend 1 Stunde bei 80ºC inkubiert wird. Anschließend inkubiert man das Papier bei 4ºC über Nacht mit Antikörper gegen das Zielantigen (Kaninchenserum), wäscht bei viermaligem Wechsel von PBS und tränkt anschließend mit goldmarkiertem Anti-Antikörper. Eine Diffusion der Probe oder anderer Lösungen ist nicht offenbart und die Reaktionszeiten sind lang. Eine Auftragung der Lösungen über eine Öffnung in einer Deckschicht oder die Verwendung einer Absorbensschicht zur Erhöhung der transversalen Diffusion ist nicht offenbart.
Die DE 28 04 940 beschreibt einen auf Diffusion basierenden Immunoassays (der kein Radial-Diffusionsassay ist) unter Verwendung eines Enzyms als Markierung. Die Verwendung von kolloidalem Gold und die Auftragung der Probe und anderer Flüssigkeiten über eine Öffnung in der Deckschicht ist nicht offenbart.
Die EP 0 046 004 beschreibt die Adsorption eines Analyten in einer Membran mit einer Adsorbens-Stützschicht über eine Öffnung in einer Deckschicht. Jedoch ist die Verwendung von kolloidalem Gold oder Silber als Markierung nicht beschrieben.
Die FR 2 482 308 beschreibt einen Immunoassay basierend auf linearer Diffusion, beschreibt jedoch nicht die Verwendung von kolloidalem Gold oder Silber als Markierung, sowie die Auftragung der Probe und anderer Lösungen über eine Öffnung in einer Deckschicht oder die Verwendung eines Adsorbens als Stütze.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Testprobe bereitgestellt, wobei man:
a) eine erste Substanz an eine unlösliche, poröse Trägerplatte bindet, wobei die erste Substanz ausgewählt ist unter den, den Analyten bindenden Liganden und Rezeptoren, wobei der Träger von einer Schicht bedeckt ist aus wasserundurchlässigem Material mit einer darin ausgebildeten Öffnung und/oder mit einer unmittelbar darunter angeordneten Fläche aus hydrophilem Material, welches die transversale Diffusion der Flüssigkeit durch den Träger erhöht;
b) die Testprobe auf den unlöslichen Träger über die Öffnung, wenn die Deckschicht vorliegt, aufträgt;
c) die Testprobe durch den unlöslichen Träger, der die erste Substanz trägt, diffundieren läßt;
d) eine markierte zweite Substanz auf den unlöslichen Träger vor, zusammen mit oder nach dem Auftragen des Analyten aufträgt, wobei die zweite Substanz ausgewählt ist unter Liganden und Rezeptoren, welche durch Bindung an die erste Substanz oder an den Analyten immobilisierbar sind und mit kolloidalem Gold oder kolloidalem Silber markiert sind; und
e) die Präsenz und/oder Menge der immobilisierten, markierten zweiten Substanz bestimmt.
Für eine quantitative Bestimmung liegt die Markierung vorzugsweise in einer Menge vor, die ausreicht, um ein deutliches Signal zu erzeugen, das mit dem bloßen Auge erkenntlich ist, wenn die zweite Substanz in einer Menge oberhalb einer vorbestimmten Nachweisgrenze vorliegt und für das bloße Auge nicht erkennbar ist, wenn die zweite Substanz in einer Menge unterhalb der vorbestimmten Nachweisgrenze vorliegt.
Der erfindungsgemäße Festphasen-Diffusionstest ist kein heterogener Test und erfordert daher keinen besonderen Trennungsschritt, um gebundene markierte Verbindungen von ungebundenen markierten Verbindungen zu trennen. Die vorliegende Erfindung weist viele derjenigen Probleme nicht auf, welche mit den oben erwähnten Methoden zur Detektion von Substanzen in biologischen Flüssigkeiten in geringen Konzentrationen verbunden sind. Es wird ein Festphasen-Diffusionstest bereitgestellt, der innerhalb einer relativ kurzen Zeitspanne durchgeführt werden kann und hinsichtlich Sensitivität mit einem Radioimmunoassay vergleichbar ist. Außerdem erfordert der erfindungsgemäße Festphasen-Diffusionsassay nicht notwendigerweise eine komplizierte Meßausrüstung. Der erfindungsgemäße Festphasen- Diffusionstest muß nicht in einem Labor durchgeführt werden und kann am Bett des Patienten durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß ein breites Spektrum von Substanzen genau und einfach bestimmbar ist. Diese Substanzen umfassen jede Substanz, die mit einer anderen Substanz spezifisch wechselwirken kann. Solche Substanzen sind Immunogene, wie Proteine, Glycoproteine, Nukleoproteine und große Peptidhormone, wie Insulin und Wachstumshormon. Diese Substanzen umfassen ebenfalls Haptene, wie Arzneistoffe, Vitamine, Glycoside und Polypeptide. Beispiele für andere Verbindungen, welche miteinander spezifisch wechselwirken, sind Lectine und Zucker, Enzyme und Substrate, Biotin und Avidin, DNA und komplementäre DNA, RNA und komplementäre RNA, DNA und RNA und Liganden und Rezeptoren für die Liganden.
Das Prinzip des Festphasendiffusionstests wird in der folgenden Beschreibung unter Verwendung eines kompetitiven Radikaldiffusionstestes als Beispiel veranschaulicht. Ein Adsorbens, welches spezifisch für eine bestimmte Testsubstanz ist, wird an einen unlöslichen Träger, wie Nitrocellulosepapier, gebunden, der von einer Schicht aus wasserundurchlässigem Material, wie einem Kunststoffblatt oder -band, bedeckt ist und wobei eine Öffnung in der Deckschicht ausgebildet ist, um den Träger freizugeben. Der Durchmesser der Öffnung kann beispielsweise bis zu 5 mm, wie z. B. 1-5 mm, betragen.
Andere geeignete feste Träger umfassen dünnschichtchromatographische Platten mit einer Dicke von etwa 250 um.
Eine Lösung einer Testsubstanz, für die das Adsorbens spezifisch ist, in unbekannter Konzentration wird mit einer bekannten Konzentration der mit kolloidalem Gold oder Silber markierten Testsubstanz vermischt. Eine bestimmte Menge der Lösung wird auf die freie Fläche des unlöslichen Trägers aufgetragen. Die Lösung läßt man in den unlöslichen Träger mehrere Minuten diffundieren. Nach Beendigung der Diffusion erfolgt die Visualisierung der diffundierten Menge. Der Durchmesser des Diffusionsmusters auf dem festen Träger ist proportional zur Konzentration der unmarkierten Testsubstanz in der Lösung. Der gesamte Festphasen-Radialdiffusionstest erfordert zu seiner Durchführung lediglich wenige Minuten und das einzig erforderliche Meßinstrument ist ein Lineal.
Werden dagegen Mittel eingesetzt, die einen transversalen Durchlauf der Probe durch den Träger (anstelle eines radialen Durchlaufes) bewirken, so z. B. wenn man eine Absorbensschicht unterhalb des Trägers anordnet, wird die gesamte Target-Sustanz im Bereich der freien Fläche des Trägers immobilisiert und die Intensität der Färbung ist proportional zur Menge an immobilisierter Target-Substanz.
Unter Anwendung des beschriebenen, grundlegenden Prinzips kann eine Vielzahl von Testvarianten verwirklicht werden. Der Test kann als Sandwich-Test durchgeführt werden. In diesem Fall wird lediglich die lösliche Testprobe auf die Festphase mit dem Adsorbens aufgetragen. Anschließend wird die Festphase in einer Lösung inkubiert, welche das markierte Adsorbens enthält und die Bindung des markierten Adsorbens wird nach einem Waschschritt sichtbar gemacht.
Weiterhin kann ein Vorinkubationsschritt durchgeführt werden, um die Testsubstanz direkt zu markieren. In diesem Fall inkubiert man die Testsubstanz und die markierten Adsorbenten miteinander und trägt das Gemisch auf die Festphase mit den Adsorbenten auf.
Der erfindungsgemäße Festphasen-Diffusionstest kann auch zur Überprüfung eines Produktes eines anderen Tests eingesetzt werden. Bei dieser Anwendung wird der erfindungsgemäße Festphasen-Diffusionstest im Rahmen eines Visualisierungsschrittes bei Tests zur Bestimmung verschiedener Substanzen eingesetzt.
Bei dem erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstest beträgt die maximale Lösungsmenge die zur Bestimmung der Konzentration einer bestimmten Testsubstanz in der Lösung erforderlich ist, etwa 1-50 ul. Um z. B. einen Antibiotikagehalt im Blut zu bestimmen, erhält man durch Anstechen des Fingers genügend Blut, um den Test durchzuführen. Herkömmliche Methoden zur Bestimmung von Antibiotikagehalten im Blut erfordern mehrere Kubikzentimeter Blut, das durch Venenpunktion zu entnehmen ist.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen weiter veranschaulicht:
Die Fig. 1(a) bis 1(c) sind schematische Darstellungen eines erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstests, bei dem lediglich markierte Testmoleküle verwendet werden.
Die Fig. 2(a) bis 2(c) sind schematische Darstellungen des Festphasen-Diffusionstests mit markierten Testmolekülen und unmarkierten Testmolekülen.
Der hierin verwendete Ausdruck "Ligand" steht für jede Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich vorkommt oder hergestellt werden kann. Der Ausdruck "Rezeptor" wird für jede Verbindung oder Zusammensetzung verwendet, welche eine bestimmte räumliche oder polare Organisation eines Moleküls, d. h. Epitop, erkennen kann. Solche Rezeptoren umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, natürlich vorkommende Rezeptoren, wie z. B. Thyroxin-Bindungsglobulin, das spezifisch Thyroxin bindet; Staphylococcus-Protein A, das spezifisch Immonglobuline bildet; Antikörper; Enzyme, welche spezifisch Substrate binden; Fab- Fragmente; Lectine und dergleichen.
Im folgenden wird nunmehr auf die Zeichnungen bezug genommen, in denen gleiche Nummern die gleichen Elemente in den verschiedenen Ansichten bezeichnen. Die Fig. 1(a) bis 1(c) veranschaulichen die Bindung von markierten Testsubstanzmolekülen in unbekannter Konzentration in einem Radialdiffusionstest. Zur Vereinfachung ist die Deckschicht nicht gezeigt. Diese Figur zeigt die Verwendung des erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstests als Meßschritt eines herkömmlichen Tests. Die schattiert gezeichneten Kugeln stellen die markierten Testsubstanzmoleküle 12 in Lösung dar. Diese Moleküle können entweder Liganden sein, wie Immunogene oder Haptene, oder es kann sich hierbei um für Liganden spezifische Rezeptoren handeln. Beispiele für Rezeptoren sind Antikörper. Die Adsorbensmoleküle 14 können ebenfalls Antigene oder Rezeptoren sein. Die Adsorbensmoleküle, welche für die Testsubstanz-Moleküle 12 spezifisch sind, werden auf einen Träger 16 gebunden, der in den in dem jeweiligen Test verwendeten Lösungsmitteln unlöslich ist. Ein Beispiel für einen unlöslichen Träger ist Nitrocellulosepapier (mit einer Dicke von z. B. 0,45 um). Der unlösliche Träger 16 wird mit den Adsorbensmolekülen 14 behandelt. Ein typisches Adsorbensmolekül, welches erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist z. B. ein für ein bestimmtes Antigen oder Hapten spezifischer Antikörper. Der Antikörper weist eine positive Gesamtladung auf. Das Nitrocellulosepapier besitzt eine negative Gesamtladung. Werden die Antikörpermoleküle in Lösung auf das Nitrocellulosepapier aufgetragen, so werden die positiv geladenen Antikörper an die negativ geladenen Nitratgruppen auf dem Nitrocellulosepapier ionisch gebunden. Verständlicherweise können andere feste Träger verwendet werden und die Adsorbensmoleküle können an den festen Träger entweder ionisch oder kovalent gebunden werden. Die Adsorbensmoleküle 14 stellen damit spezifische Bindungsstellen auf dem Träger 16 dar, an denen die Testsubstanzmoleküle 12 gebunden werden können. Der unlösliche Träger 16, behandelt mit den Adsorbensmolekülen 14, stellt die Festphase 18 des Tests dar.
Eine bekannte Menge der Testsubstanzmoleküle 12 wird auf die Festphase 18 aufgetragen (über die Öffnung in der nicht gezeigten Deckschicht). Die Auftragung erfolgt über ein Kapillarrohr 20 oder mit Hilfe bekannter Vorrichtungen, wie z. B. einer Mikropipette oder einer mikrobiologischen Schlinge. Wie in Fig. 1(b) gezeigt, erfolgt nach Auftragung der Testsubstanzmoleküle 12 auf die Festphase 18 eine radiale Diffusion durch die Festphase, die beginnend beim Auftragungspunkt, nach außen gerichtet ist. Da die Testsubstanzmoleküle 12 durch die Festphase 18 diffundieren, binden die Testsubstanzenmoleküle an die freien Adsorbensmoleküle 16.
Wie Fig. 1(c) zeigt, stoppt die Diffusion der Testsubstanzmoleküle durch die Festphase 18, sobald sämtliche markierten Testsubstanzmoleküle 12 an Adsorbensmoleküle 14 gebunden sind. Die gebundenen Testsubstanzmoleküle 12 ergeben ein kreisförmiges Diffusionsmuster auf der Festphase. Das kreisförmige Diffusionsmuster weist beispielsweise einen durch Bezugszeichen 22 gekennzeichneten Durchmesser auf, der mit Hilfe bekannter Techniken gemessen werden kann und in Abhängigkeit vom Typ der verwendeten markierten Substanz variiert. Der Durchmesser des Diffusionsmusters ist proportional zur Menge der markierten Testsubstanz in Lösung.
In den Fig. 2(a) bis 2(c) wird ein Festphasendiffusionstest 25 gemäß vorliegender Erfindung gezeigt, bei dem eine unbekannte Menge einer unmarkierten Testsubstanz zu der Lösung einer bekannten, markierten Testsubstanz gegeben wird. Die Deckschicht ist wiederum nicht gezeigt. Diese Variante des Festphasendiffusionstests verwendet das Prinzip der Konkurrenz um die Bindungsstellen auf der Festphase zwischen der markierten Testsubstanz und der unmarkierten Testsubstanz. Eine unbekannte Konzentration von unmarkierten Testsubstanzmolekülen 24, wie z. B. von einem Antigen oder Hapten, wird mit einer bekannten Konzentration markierter Testsubstanzmoleküle 14 unter Ausbildung der Testlösung vermischt. Die Festphase 18 stellt man gemäß obiger Beschreibung her. Die Adsorbensmoleküle 14 sind jedoch so gewählt, daß sie Bindungsstellen sowohl für die markierten Testsubstanzmoleküle 12 als auch für die unmarkierten Testsubstanzmoleküle 24 darstellen.
Die Testlösung trägt man auf die Festphase 18, wie oben beschrieben, auf. Die Testlösung diffundiert durch die Festphase 18, ausgehend vom Auftragspunkt radial nach außen. Sowohl die markierten Testsubstanzmoleküle 12 als auch die unmarkierten Testsubstanzmoleküle 24 konkurrieren um die Bindung mit den freien Bindungsstelle der Adsorbensmoleküle 14. Die Diffusion der Testlösung durch die Festphase 18 setzt sich so lange fort, bis sämtliche markierten Testsubstanzmoleküle 12 und sämtliche unmarkierten Testsubstanzmoleküle 24 durch die Adsorbensmoleküle 14 gebunden sind.
Da einige der Bindungsstellen durch unmarkierte Testsubstanzmoleküle 24 besetzt sind, diffundieren die markierten Testsubstanzmoleküle 12 vom Auftragungspunkt weiter nach außen als dies der Fall wäre, wenn keine unmarkierten Testsubstanzmoleküle vorhanden wären. Als Ergebnis weist das Diffusionsmuster der Testlösung einen mit dem Bezugszeichen 26 gekennzeichneten Durchmesser auf (Fig. 2(c)), der größer ist als der Durchmesser 22 gemäß Fig. 1(c) des Diffusionsmusters für die markierten Testsubstanzmoleküle 12 alleine.
Die Entfernung, die von der markierten Testsubstanz zurückgelegt wird, ist in Fig. 2(c) größer als in Fig. 1(c), da in Fig. 2(c) der prozentuale Anteil an Adsorbens-Bindungsstellen, welche durch die unmarkierte Testsubstanz blockiert werden, eine weitreichendere Diffusion der markierten Testsubstanzmoleküle bewirkt, bevor eine freie Adsorbens-Bindungsstelle erreicht wird. Somit ist der Durchmesser des Diffusionsmusters, welches durch die markierte Testsubstanz gebildet wird, proportional zur Konzentration der unmarkierten Testsubstanz in der Lösung.
Es sind viele Varianten des erfindungsgemäßen Festphasen- Diffusionstests denkbar. Beispielsweise gibt es Situationen, in denen die Testsubstanz entweder (a) nicht markiert werden kann oder (b) in denen die Affinität zwischen der Testsubstanz und den Rezeptoren zu niedrig ist, um im erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstest angewendet zu werden oder (c) in denen eine sehr hohe Sensitivität wünschenswert ist oder (d) in denen die Verwendung der gleichen Festphasen-Diffusionsreagentien zur Bestimmung der Konzentration verschiedener Substanzen wünschenswert ist.
In den oben geschilderten Situationen ist ein vorausgehender Schritt zur Bestimmung der obigen Testsubstanzen erforderlich. Im Fall (a), bei dem die Testsubstanz nicht markiert werden kann, kann der Rezeptor für die Testsubstanz markiert werden und anschließend wird dieser Rezeptor über den erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstest in einem letzten Schritt bestimmt.
Ist die Affinität zwischen der Testsubstanz und dem Rezeptor gering, so kann die Testsubstanz oder der Rezeptor mit einem Liganden oder Rezeptor hoher Affinität konjugiert werden, wie z. B. mit dem Biotin-(Ligand)-Avidin(Rezeptor)-System. Der erfindungsgemäße Festphasen-Diffusionstest kann dann unter Verwendung von Ligand und Rezeptor mit hoher Affinität durchgeführt werden.
Die Verwendung des gleichen Festphasen-Diffusionstests gemäß vorliegender Erfindung für verschiedene Testproben kann dadurch erfolgen, daß man Biotin an den unlöslichen Träger koppelt und markiertes Avidin als Ligand zur Bestimmung verschiedener Testsubstanzen verwendet. In diesem Fall wird markiertes Avidin an Antikörper gegen die verschiedenen Testproben konjugiert. Die Testprobe wird anschließend mit dem komplementären markierten Antikörper inkubiert und der Antikörper wird mit Hilfe des Biotin/Avidin-Festphasen-Diffusionstests bestimmt. Durch das Vorliegen von Antigen wird die Menge an markiertem Antikörper durch Vernetzung verringert, die eine Verringerung der Fläche des Diffusionsmusters auf dem unlöslichen Träger bewirkt.
Die Testlösung in dem erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstest kann in unterschiedlicher Weise aufgetragen werden. Die Testlösung kann auf den behandelten, unterhalb der Öffnung in der Deckschicht offenliegenden Träger über ein Kapillarrohr, eine Mikropipette oder eine mikrobiologische Schleife aufgetragen werden. Die Testlösung kann auch direkt auf das Kunststoffblatt oder -band direkt über der Öffnung aufgetragen werden. Die Testlösung diffundiert anschließend durch die Öffnung in den unlöslichen Träger und vergrößert somit die Probenmenge, die auf die exponierte Fläche des Trägers aufgetragen werden kann. Die Verwendung einer Deckschicht mit einer Öffnung erleichtert außerdem die Auftragung mit Hilfe eines in die Probe getauchten Tupfers.
Die mit der Testsubstanz konjugierte Markierungssubstanz kann auch indirekt an die Testsubstanz gebunden sein. Beispielsweise besteht die Möglichkeit, wenn die Testsubstanz ein Hapten ist, ein Protein an das Hapten zu binden und anschließend die Markierungssubstanz an dieses Protein zu binden. Es kann aber auch ein Antikörper gegen das Antigen markiert und als markierter Antikörper-Antigenkomplex in dem Test verwendet werden.
Die verschiedenen Merkmale des festen Trägers beeinflussen die Ausführung des Tests wesentlich. Es besteht daher die Möglichkeit, feste Träger zu entwickeln, welche für die speziellen Erfordernisse des erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstests speziell geeignet sind. Eine allgemeine Regel ist, daß die Dicke des festen Trägers umgekehrt proportional ist zu der Probenmenge, die zur Abdeckung einer gegebenen Oberfläche erforderlich ist, sowie zur Unterscheidungs-Kapazität des Tests. Die Konzentration an hydrophilen und hydrophoben Komponenten beeinflußt außerdem das Diffusionsverhalten der Probe. Die Bindungskapazität des festen Trägers für den Rezeptor ist von Bedeutung für die Sensitivität des erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstests. Herstellungsverfahren für verschiedene feste Träger sind dem Fachmann bekannt.
Die unlöslichen Festphasenträger, welche erfindungsgemäß geeignet sind, können beispielsweise Träger sein, die eine negative Gesamtladung aufweisen, so daß ein Adsorbens-Molekül (entweder ein Rezeptor oder ein Ligand) mit einer positiven Gesamtladung nicht kovalent an den unlöslichen Träger binden kann. Beispiele für solche Trägertypen sind Nitrocellulosepapier, Blottingmembranen, Diethylaminoethylionenaustauscherpapier und Blot-Adsorbens-filterpapier. Bei dem unlöslichen Festphasenträger kann es sich auch um einen Träger handeln, der eine an den Träger gebundene funktionelle Gruppe aufweist, woran ein Adsorbensmolekül (entweder ein Rezeptor oder ein Ligand) kovalent gebunden sein kann.
Beispiele für diese Trägertypen sind Aminobenzyloxymethyl (ABM)-Papier, 2-Aminophenylthioether (APT)-Papier, Bromcyan- aktiviertes Papier (CBA) (vgl. "Methods in Enzymology", R. Wu (ed.) 1979, Academic Press New York, 68:436-442, worin CBA-Papier beschrieben ist), Diazobenzyloxymethylcellulosepapier (DMB), Diazophenylthioethercellulosepapier (DPT) und Nitrobenzyloxymethylcellulosepapier (NBM).
Die Verfahren, welche zur Kopplung chemischer Substanzen an den Festphasenträger verwendet werden können, sind zum Teil abhängig von der chemischen Zusammensetzung des Trägers und der chemischen Zusammensetzung der an den Träger zu koppelnden chemischen Substanz. Chemische Stoffe können an den Träger mit Hilfe der Bromcyankopplung, durch Silanierung, Diazokopplung, Carbodiimidkopplung, Glutaraldehydkopplung und durch die Verwendung heterobifunktioneller Reagenzien gebunden werden. In vielen Fällen sind aufgrund stereochemischer Inhibition Spacergruppen für die Kopplung einer chemischen Substanz an eine andere erforderlich. Übliche Spacergruppen sind beispielsweise Diaminoalkyl- oder Alkylgruppen, Arylcarbonsäure- oder Gamma- Aminoalkylgruppen, Thiol, Hydroxyl und mercurierte Basen.
Die durch die Porengröße des unlöslichen Trägers vorgegebene Ausschlußgrenze bestimmt die Größe der Partikel, welche in der Festphase diffundieren können. Die Porengröße der Festphase kann dazu verwendet werden, um einen Trennungsschritt in einem Test zu eliminieren. Wird beispielsweise heparinisiertes Blut analysiert, so müssen üblicherweise die zellulären Komponenten des Bluts von der Flüssigkeit oder dem Plasma des Bluts abgetrennt werden, um die Analyse durchführen zu können. Dies erfolgt üblicherweise durch Zentrifugation. Bei dem erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstest kann der Zentrifugationsschritt entfallen, da die Porengröße des unlöslichen Trägers so gewählt werden kann, daß die Diffusion der zellulären Blutkomponenten blockiert wird.
Gemäß einer weiteren Variante dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstests wird die Testlösung auf den unlöslichen Träger über einen Filter aufgetragen. Die Testlösung wird auf das Oberteil des Filters aufgetragen und dann diffundiert die Testlösung durch den Filter in den unlöslichen Träger. Beispiele für typische Filter sind Blottingpapier und Diethylaminoethylionenaustauscherpapier. Ein Beispiel für die Verwendung dieser Prozedur ist die Abtrennung der Blutzellen vom Plasma, wenn der unlösliche Träger eine Lyse der Erythrozyten im gesamten, heparinisierten Blut verursachen würde. Das freigesetzte Hämoglobin aus den lysierten Zellen würde eine starke Hintergrundfärbung im unlöslichen Träger verursachen und die Visualisierung des Diffusionsmusters erschweren.
Die unmarkierten Testsubstanzen, welche mit Hilfe des erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstests analysiert werden können, gehören zur Klasse der als Antigene bekannten Substanzen, ohne darauf beschränkt zu sein. Antigene können in zwei Gruppen aufgeteilt werden: Immunogene und Haptene.
Immunogene sind Verbindungen, die nach Einführung in Chordata zur Bildung von Antikörpern führen. Repräsentanten für Immunogene sind Proteine, Glycoproteine und Nukleoproteine, wie Peptidhormone, Serumproteine, Komplementproteine, Gerinnungsfaktoren und virale oder bakterielle Produkte. Bestimmte Verbindungen des Körpers mit ubiquitärer Präsenz in sämtlichen tierischen Spezies können nicht zur Produktion von Antikörpern verwendet werden, da diese Verbindungen in dem immunisierten Tier nicht als fremd erkannt werden. Diese Verbindungen können durch chemische Derivatisierung zu "Fremd"-Verbindungen gemacht werden. Die in einem Test eingesetzte Testsubstanz ist der gleichen Derivatisierungsprozedur zu unterziehen, wenn Antikörper gegen eine veränderte Verbindung verwendet werden.
Tabelle III zeigt eine unvollständige Auflistung einiger Typen von Immunogenen, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstests quantifiziert werden können.

TABELLE III

Nukleoproteine Peptidhormone
Serumproteine Komplementproteine
Koagulierungsfaktoren mikrobiozide Produkte
virale Produkte bakterielle Produkte
Fungusprodukte spezifische Immunogene
Albumin Angiotensin
Bradykinin Calcitonin
carcinoembryonisches Antigen Chloriomamotropin
Chorogonadotropin Corticotropin
Erythropoietin Faktor VIII
Fibrinogin Alpha-2-H-Globulin
Follitropin Gastrin
Gastrinsulfat Glucagon
Gonadotropin Haptoglobin
Hepatitis B-Oberflächenantigen Immunoglobuline (A,D,E,G,M)
Insulin Lipotropin
Kallidin Lipotropin
Melanotropin Oxytocin
Pancreozymin Placenta-Lactogen
Prathryin Proangiotensin
Prolactin Somatotropin
Relaxin Secretin
Somatomedin Somatostatin
Thyrotropin Vasotocin
Thymopoietin Vasopressin
Alpha-1-Fetoprotein Alpha-2-H-Globulin
Haptene sind Verbindungen, die nach Bindung an einen immunogenen Träger und Einführung in ein Chordata zur Bildung von Hapten-spezifischen Antikörpern führen. Beispiele für Haptene sind Steroide, wie Östrogene und Cortisone, Peptide mit niedrigem Molekulargewicht, andere biologische Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, Arzneistoffe, wie Antibiotika und chemotherapeutische Verbindungen, industrielle Schadstoffe, Geschmacksstoffe, Nahrungsmitteladditive und Nahrungsmittelkontaminationen und/oder deren Metabolite oder Derivate.
Die Aufzählung obiger Stoffklassen ist insofern unvollständig, als der erfindungsgemäße Festphasen-Diffusionstest zur Bestimmung jedes Moleküls verwendet werden kann, für das ein Antikörper gebildet werden kann. Zusätzlich kann der erfindungsgemäße Festphasen-Diffusionstest zur Identifizierung und Quantifizierung eines Antikörpermoleküls verwendet werden.
Ein Antikörper, der in dem erfindungsgemäßen Festphasen- Diffusionstest eingesetzt werden kann, kann dadurch hergestellt werden, daß man das zu bestimmende Antigen, wenn es sich dabei um ein Immunogen handelt, in ein lebendes Chordata einführt. Die Antikörper, die als Antwort auf die Einführung des Immunogens produziert werden, sind Proteine, welche das Immunogen beschichten und entgiften, es aus Lösung ausfällen, oder einfach daran binden. Das Antikörperprotein bildet einen Rezeptor, der geometrisch angeordnet ist, so daß das Immunogen zu der räumlichen Anordnung des Proteins paßt. Im Falle eines Haptens ist ein zusätzlicher Schritt bei der Herstellung des Antikörpers erforderlich. Das Hapten muß mit einem immunogenen Träger konjugiert werden, bevor man es in einen lebenden Vertebraten einführt. Die Herstellung von Antikörpern ausgehend von Haptenen ist dem Fachmann bekannt.
Eine andere Antikörperquelle, welche in dem erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstest verwendet werden kann, sind monoklonale Antikörper. Die Technik zur Herstellung monoklonaler Antikörper umfaßt die Fusion von Milzlymphozyten mit malignen Zellen von primären Knochenmarkstumoren. Durch dieses Verfahren erhält man eine Hybridzellinie, die aus einem einzelnen fusionierten Zellhybrid oder Klon stammt und die Merkmale sowohl der Lymphozyten als auch der Myelomzellinien aufweist. Wie die Lymphozyten (isoliert aus Tieren, welche mit dem jeweiligen Antigen behandelt wurden) so scheiden auch die fusionierten Hybride, genannt Hybridome, einen einzelnen für das Antigen spezifischen Immunoglobulintyp aus. Darüber hinaus ist die Hybridzellinie ebenso wie die Myelomzellinien unsterblich. Die Kombination dieser beiden Merkmale hatte einen wesentlichen Einfluß auf diejenigen Gebiete in Forschung und Medizin, in denen herkömmliche Antiseren verwendet wurden. Während Antiseren aus geimpften Tieren variable Gemische von Antikörper darstellen, die niemals identisch reproduzierbar sind, sind monoklonale Antikörper hochspezifische Immunoglobuline eines einzelnen Typs. Der durch ein Hybridom ausgeschiedene einzige Immunoglobulintyp ist für eine einzige antigene Determinante auf einem Antigen spezifisch. Das Antigen stellt ein komplexes Molekül mit einer Vielzahl antigener Determinanten dar (vgl. C. Milstein, "Scientific American", 243(4):66-74, 1980).
In dem erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstest kann jedes System verwendet werden, in dem eine spezifische Wechselwirkung zwischen Substanzen erfolgt. Beispiele für Systeme, die sich von dem Antikörper/Antigensystem unterscheiden und sich erfindungsgemäß eignen, sind Lectin/Zuckersysteme, Enzym/Substratsysteme, Hybridisierungssysteme von DNA- und RNA-Molekülen, das Biotin/Avidinsystem und das Staphylococcus-Protein A/ Immunoglobulinsystem.
Vorteilhafterweise können die Reagenzien für den Festphasen-Diffusionstest in Form eines Kits vorliegen, wobei die Reagenzien in vorgegebenen Verhältnissen vorliegen, um die Sensitivität des Tests in dem interessierenden Bereich im wesentlichen zu optimieren. Nach Rekonstitution der trockenen Reagenzien in vorgegebenen Voluminas liegt die Konzentration der Reagenzien in geeigneten Bereichen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Testprobe bereitgestellt, wobei der Kit umfaßt:
(a) eine unlösliche, poröse Trägerplatte, an die eine erste Substanz gebunden ist, die ausgewählt ist unter für den Analyten spezifischen Liganden und Rezeptoren, wobei der Träger von einer Schicht aus wasserundurchlässigem Material bedeckt ist, in der eine Öffnung ausgebildet ist, und/oder die unmittelbar darunter eine Fläche aus hydrophilem Material aufweist, welche die transversale Diffusion der Flüssigkeit durch den Träger erhöht, und
(b) eine Lösung einer zweiten Substanz, wobei die zweite Substanz ausgewählt ist unter Liganden und Rezeptoren, welche die erste Substanz oder den Analyten binden, wobei die zweite Lösung eine bekannte Konzentration der zweiten Substanz umfaßt, welche mit einer Markierung, umfassend kolloidales Gold oder kolloidales Silber, konjugiert ist.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, ohne die Erfindung auf die darin beschriebenen besonderen Verfahrensweisen zu beschränken.

Beispiel 1

Ein Gemisch aus drei monoklonalen Antikörpern gegen die Alpha-Untereinheit von humanem Choriogonadotropin (HCG) wird mit kolloidalem Gold unter Anwendung des Verfahrens von J. De- May, Collidal Gold Probes in Immunocytochemistry, Immunocytochemistry: Applications in Pathology and Biology, Ed.: J. Polak, S. Van Noorden, J. Wright & Sons Ltd., London, Seiten 82- 112, 1983, markiert. Eine Nitrocellulosemembran (BioRad, Rockville Centre, NY, Nr. 162-0115, 0,45 um) wird mit polyklonalen Antikörpern gegen HCG gesättigt, die in einem Kaninchen produziert wurden und über eine Staphylococcus-Protein A-Säule, wie aus dem Stand der Technik bekannt, gereinigt wurden. Die Membran wird anschließend mit einer Schicht bedeckt, die eine Öffnung von etwa 2 mm² aufweist. Ein Tupfer, der lyophilisierte, goldmarkierte Anti-HCG-Antikörper enthält, wird mit der vermutlich HCG enthaltenden Urinprobe angefeuchtet. Den Tupfer bringt man anschließend sofort mit der Membranschicht in Kontakt. Urin diffundiert von dem Tupfer durch die Öffnung in der Membranschicht in die Nitrocellulosemembran. Den Tupfer hält man etwa 30 s in dieser Position und entfernt ihn dann. HCG-Konzentrationen von mehr als 50 mIU/ml, die im allgemeinen eine Schwangerschaft anzeigen, können durch Vorliegen eines roten Spots diagnostiziert werden. HCG-Konzentratioinen unterhalb von 50 mIU/ml ergeben keinen sichtbaren Spot.

Beispiel 2

Man wiederholt das Verfahren gemäß Beispiel 1, wobei man einen negativen Druck (z. B. Vakuum) auf die Unterseite des Nitrocellulosepapiers ausübt. Der negative Druck verstärkt die Diffusion der Testlösung (z. B. Urin) durch das Nitrocellulosepapier. Das Nitrocellulosepapier wird an beiden Seiten mit einem Klebestreifen bedeckt, d. h. mit einer Schicht versehen, welche die Kontaktfläche zwischen der Probe und der Membran beschränkt. Der Streifen weist jeweils eine Öffnung von 2 mm² an sich entsprechenden Stellen auf beiden Seiten der Membran auf, so daß eine Konzentrierung des Komplexes aus Analyt und markiertem Antikörper auf eine sehr kleine Oberfläche ermöglicht wird. Die Präsenz des Analyten kann über einen roten Spot am Ort der Auftragung bestimmt werden.

Beispiel 3

Man wiederholt das Verfahren gemäß Beispiel 2, wobei man einen positiven Druck zur Erhöhung der Diffusion anstelle des negativen Druckes verwendet. Der positive Druck wird dadurch erzeugt, daß man eine 1 ml Spritze, enthaltend 0,5 ml des Gemischs aus Analyten und goldmarkiertem Antikörper verwendet. Die beschichtete Membran enthält korrespondierende Öffnungen von 2 mm² in den Beschichtungen auf beiden Seiten der Membran. Die Membran und deren beidseitige Beschichtung wird in einem sterilen Standardfiltergehäuse gehalten, dessen Membran durch die oben beschriebene Anordnung aus Membran und Beschichtung ersetzt wurde. Die Spritze verbindet man mit dem Filtergehäuse und drückt das Gemisch aus dem Analyten und dem goldmarkierten Antikörper durch den durch die korrespondierenden Öffnungen freigegebenen Membranabschnitt. Die Präsenz des Analyten kann in Form eines roten Spots am Ort der Auftragung nachgewiesen werden.

Beispiel 4

Man wiederholt das Verfahren gemäß Beispiel 2, wobei man hydrophiles Material anstelle eines negativen Drucks zur Erhöhung der Diffusion verwendet. Das hydrophile Material ordnet man auf der der Membranabdeckung gegenüberliegenden Seite an. Das Gemisch aus dem Analyten und dem goldmarkierten Antikörper pipettiert man auf die der hydrophilen Membran gegenüberliegenden Öffnung und erlaubt die allmähliche Diffusion durch die Öffnung, durch das Papier und in die hydrophile Membran. Die Präsenz des Analyten wird über einen roten Spot visualisiert.
Die vorausgegangenen Beispiele 2, 3 und 4 können auch unter Verwendung einer Membran durchgeführt werden, die nur auf derjenigen Seite beschichtet wird, auf der die Probe aufgetragen wird. Ist jedoch nur eine Seite beschichtet, so kommt es wahrscheinlich zu einer größeren lateralen Diffusion des Gemisches aus Analyten und goldmarkiertem Antikörper.
Die folgenden Referenzbeispiele veranschaulichen die Anwendung von Immunodiffusionstests bei einer Anzahl von Analyten, wobei andere Markierungen als kolloidales Gold oder Silber verwendet werden und/oder wobei die Verwendung einer Schicht über dem porösen Träger nicht erfolgt.

Referenzbeispiel I

Das folgende Referenzbeispiel beschreibt einen Festphasen- Diffusionstest, wie er zum Nachweis geringer Mengen inaktivierter Meerrettichperoxidase verwendet wird. Dies ist ein Beispiel für einen kompetitiven Test, basierend auf einer Antikörper/- Antigen-Wechselwirkung, wobei die kompetitive Verbindung selbst als Markierung verwendet wird. Anti-Peroxidase-Antikörper werden an die Festphase gebunden, bei der es sich in diesem Beispiel um Nitrocellulosepapier handelt. Inaktivierte Meerrettichperoxidase ist das Antigen und aktive Peroxidase entspricht bei diesem Test dem markierten Antigen.
Man bestimmt eine Standardkurve, indem man eine konzentrierte Lösung von inaktivierter Meerrettichperoxidase herstellt. Die Konzentration von aktiver Peroxidase (in diesem Fall der Markierung) bestimmt man wie folgt. Mehrere Verdünnungen einer Lösung mit 1 mg/ml Peroxidase mischt man mit 10%igem Kaninchenserum und phosphatgepufferter Saline (keine Testlösung) und trägt auf die behandelte Nitrocellulose auf. Die höchste Verdünnung, die noch zu einem meßbaren Diffusionsmuster führt, dient in diesem Beispiel als Markierung. Die Lösung von inaktivierter Meerrettichperoxidase (50 ug/ml) verdünnt man seriell in phosphatgepufferter Saline, enthaltend 10% Kaninchenserum. Die 5 ul Lösung trägt man dann vorsichtig durch Diffusion aus einem Kapillarrohr auf Nitrocellulosepapier auf, welches die gebundenen Anti-Peroxidase-Antikörper enthält. Die Lösung diffundiert aus dem Kapillarrohr in das Nitrocellulosepapier und bildet ein kreisförmiges Diffusionsmuster aus. Die Nitrocellulosepapierstücke werden dann in einer Lösung aus Meerrettichperoxidasesubstraten (4-Chlor-1-naphthol und Wasserstoffperoxid) immergiert und inkubiert, bis blaue Kreise auftreten. Wie in Fig. 3 gezeigt, ist die Fläche der kreisförmigen Diffusionsmuster proportional zur Menge an unmarkiertem Antigen in der Lösung. Es wurde festgestellt, daß nur eine einzige Standardkurve für einen gegebenen Satz aus Antikörper und markiertem Antigenreagens zu erstellen ist. Das Festphasen-Diffusionsverfahren wird im einzelnen folgendermaßen durchgeführt:
Das Nitrocellulosepapier (Bio-Rad, Rockville Centre, NY, Nr. 162-0115, 0,45 um) schneidet man in Stücke mit einer Größe von etwa 6,45 cm²(1 square inch). Diese Stücke wäscht man anschließend 10 min in phosphatgepufferter Saline (pH 7,2). Die gewaschenen Papierstücke inkubiert man anschließend 12 h bei 4ºC in einer Lösung, enthaltend 10 mg/ml Kaninchen-Anti-Peroxidase/Immunoglobulin G (Batch C1, gereinigt durch Affinitätschromatographie). Nach 12stündiger Inkubation wäscht man die Papierstücke erneut 10 min in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Die Papierstücke inkubiert man anschließend 2 h in einer 5%igen Serumalbuminlösung. Diesen Schritt führt man durch, um alle unspezifischen Bindungsstellen zu sättigen. Dann wäscht man die Papierstücke erneut in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Nach einer kurzen Waschphase in destilliertem Wasser trocknet man die Membranstücke an der Luft und lagert sie bei Zimmertemperatur in einer Feuchtigkeitskammer.
Das in diesem Beispiel verwendete Antigen ist inaktivierte Meerrettichperoxidase. Dieses Antigen stellt man her, indem man 1,5 mg Meerrettichperoxidase (Type VI, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, Nr. P-8375, Lot 43F-9598) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt. Das Enzym aktiviert man durch Zugabe von Wasserstoffperoxid in einer Endkonzentration von 1,0% und anschließende Dialyse gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung über Nacht.
2,5 ul der Probe, die das unbekannte Meerrettichperoxidase-Antigen enthält, mischt man mit 2,5 ul einer Lösung, enthaltend 0,3 ug aktivierte Peroxidase. Die 5 ul Lösung trägt man vorsichtig durch Diffusion aus einer Kapillarpipette auf ein Antikörper-behandeltes Nitrocellulosepapier auf. Die Substratlösung stellt man wie folgt her: 15 mg 4-Chlor-1-naphthol (Bio- Rad, Rockville Centre, NY, Nr. 170-6534) löst man in 5 ml Methanol. Zu dieser Lösung gibt man 25 ml destilliertes Wasser und 15 ul Methanol. Zu dieser Lösung gibt man 25 ml destilliertes Wasser und 15 ul 30%iges Wasserstoffperoxid. Ein blaues, kreisförmiges Muster entwickelt sich innerhalb mehrerer Minuten.
Zur Bestimmung der Konzentration des Antigens in der Testlösung bestimmt man die Fläche des kreisförmigen Musters. Durch Verwendung einer Standardkurve kann der genaue Wert für die Konzentration des Antigens in der Lösung bestimmt werden.
Fig. 3 zeigt den Zusammenhang zwischen der Fläche des Diffusionsmusters und der Konzentration an unmarkierter, inaktivierter Peroxidase in der Testprobe.

Referenzbeispiel II

Dieses Referenzbeispiel beschreibt einen Festphasen-Diffusionstest, wie er zum Nachweis niedriger Konzentrationen des Antibiotikums Gentamicin in Lösung verwendet wird. Dies ist ein Beispiel für einen kompetitiven Test, basierend auf einer Antigen/Antikörper-Wechselwirkung, wobei die Testsubstanz ein Hapten ist und die markierte Verbindung ein an einen Träger gebundenes Hapten umfaßt, an das eine Markierung gebunden ist.
Nitrocellulosepapier (Bio-Rad, Rockville Centre, NY, Nr. 162-0115, 0,45 um) schneidet man in Stücke mit einer Größe von etwa 6,45 cm² (1 square inch). Diese Stücke wäscht man anschließend 10 min in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2). Die gewaschenen Papierstücke inkubiert man anschließend 12 h bei 4ºC in komplettem Ziegenserum, enthaltend Ziegen-Anti- Gentamicin-Antikörper, 1:3 verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. In dem Referenzbeispiel ist aufgrund der hohen Proteinkonzentration in dem verdünnten Ziegenserum kein Sättigungsschritt erforderlich. Die Papierstücke wäscht man anschließend in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Nach einer kurzen Waschphase in destilliertem Wasser trocknet man die Membranstücke an der Luft.
Gentamicin wird chemisch an bovines Orosomucoid unter Anwendung des Carbodiimidkupplungsverfahrens, das aus dem Stand der Technik bekannt ist, gebunden. Nach Anbinden von Gentamicin an Orosomucoid bindet man Meerrettichperoxidase unter Anwendung der Glutaraldehydmethode (vgl. S. Avrameas, "Immunochemistry", Band 1 6:43, 1969) an das Orosomucoidprotein. Mit Hilfe dieses Verfahrens erhält man einen Komplex aus dem Orosomucoid-Gentamicin-Meerrettichperoxidase-Komplex.
Der Orosomucoid-Gentamicin-Meerrettichperoxidase-Komplex wird durch Affinitätschromatographie gereinigt. 1 g bromcyanaktivierte Sepharose® 4B (Phartmacia Fine Chemicals, Upsala, Schweden) wäscht man mit 1 mM HCl. 10 mg/ml des Gentamicin-Orosomucoid-Meerrettichperoxidase-Komplexes wird anschließend kovalent an Sepharose® 4B unter Befolgung der vom Hersteller angegebenen Standardprozedur gebunden. Das resultierende Gel wird anschließend in eine kleine Chromatographiesäule (Economo-Säule, Bio-Rad) gegeben. Die Ziegen-Anti-Gentamicin-Antikörper werden anschließend auf der Säule adsorbiert, indem man 5 ml des Ziegen-Anti-Gentamicinserums 1:10 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt über die Säule gibt. Den Antikörper bindet man dann kovalent an die Festphase, indem man mit einer 0,02 M Glutaraldehydlösung 2 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Freie Bindungsstellen des Glutaraldehyds sättigt man mit Glycinpuffer ab und wäscht anschließend ausgiebig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
Anschließend verwendet man die Affinitätssäule zur Reinigung des Gentamicin-Orosomucoid-Peroxidase-Komplexes. 0,1 M HCl und 0,2 M Glycin verwendet man bei einem pH von 2,5 zur Eluierung des markierten Komplexes. Der pH des Eluates wird durch Zugabe von festem Tris (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Sigma Chemcial Company, St. Louis) sofort korrigiert. Die resultierende Lösung von gereinigtem Gentamicin-Orosomucoid-Peroxidase-Komplex wird anschließend vor der Lagerung gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert.
Die Lösungen zur Bestimmung der Standardkurve stellt man in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 10% normalem Kaninchenserum, enthaltend sechs verschiedene Gentamicinverdünnungen, her. Die Gentamicinkonzentrationen für die Standardkurve liegen im Bereich von 0,4 ug/ml bis 12,4 ug/ml. Die Proteinkonzentration des markierten Gentamicin-Orosomucoid-Peroxidase-Komplexes beträgt etwa 0,3 mg, bestimmt über die Extinktion der Lösung bei 280 nm. 5 ul einer jeden Verdünnung trägt man mit Hilfe eines Kapillarrohres auf das Nitrocellulosepapier auf. Nach Diffusion der Testflüssigkeit in die Nitrocellulose wird das Papier anschließend in eine Substratlösung eingetaucht. Die Substratlösung wird wie folgt hergestellt: 15 ug 4-Chlor-1- naphthol (Bio-Rad, Rockville Centre, NY, Nr. 170-6534) löst man in 5 ml Methanol. Zu dieser Lösung gibt man 25 ml destilliertes Wasser und 15 ul 30%iges Wasserstoffperoxid. Nach mehreren Minuten entwickelt sich ein blaues kreisförmiges Muster.
Fig. 4 zeigt den Zusammenhang zwischen der Fläche des Diffusionsmusters und der Konzentration an unmarkiertem Gentamicin in den Testproben.

Referenzbeispiel III

Das folgende Referenzbeispiel beschreibt einen Festphasen- Diffusionstest, wie er zum Nachweis geringer Konzentrationen des Arzneistoffs Theophyllin verwendet wird. Dies ist ein weiteres Beispiel für eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung, wobei die Testsubstanz ein Hapten mit niedrigem Molekulargewicht ist und die markierte Substanz ein an Meerrettichperoxidase gebundenes Hapten umfaßt. Dieser Test verwendet außerdem einen monoklonalen Antikörper anstelle eines heterogenen Antikörpers.
Nitrocellulosepapier (Bio-Rad, Rockville Centre, NY, Nr. 162-0115, 0,45 um) stellt man her, wie in den Referenzbeispielen I und II beschrieben. Das gewaschene Papier inkubiert man anschließend über Nacht bei 4ºC in phosphatgepufferte Kochsalzlösung, welche ein Gemisch aus 10 ug/ml monoklonalem Maus-Antikörper gegen Theophyllin und 2 mg Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Company, St. Louis) enthält. Das Papier wäscht man anschließend in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, trocknet an der Luft und lagert es in einer Feuchtigkeitskammer.
Theophyllin konjugiert man mit Meerrettichperoxidase (vgl. Theophyllin-Radioimmunoassay: Synthesis of Antigen and Characterization of Antiserum, C.E. Coole, et al., Research Communications in Chemical Pathology and Pharmacology, Band 13, Nr. 3, 1976). Das Theophyllin/Meerrettichperoxidasekonjugat reinigt man durch Affinitätschromatographie, indem man das in Referenzbeispiel II beschriebene Verfahren befolgt und einen monoklonalen Anti-Theophyllin-Antikörper verwendet.
Man bestimmt eine Standardkurve mit Hilfe von sechs verschieden Theophyllinverdünnungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung und 10% Kaninchenserum. Die Theophyllinkonzentrationen liegen im Bereich von 1,6 bis 25,6 ug/ml. Ein Gemisch, enthaltend 2,5 ul einer 1:2 Verdünnung des markierten Antigens in 10% Kaninchenserum und 2,5 ul einer jeden Verdünnung trägt man mit Hilfe eines Kapillarrohres auf das Nitrocellulosepapier auf. Nach Diffusion der Flüssigkeit in das Nitrocellulosepapier taucht man das Papier in die oben beschriebene Substratlösung ein und beobachtet die Entwicklung der Farbreaktion. Die Durchmesser der Diffusionsmuster werden bestimmt und die Flächen der Diffusionsmuster werden berechnet.
Fig. 5 zeigt den Zusammenhang zwischen Fläche der Diffusionsmuster und der Konzentration an unmarkiertem Theophyllin in den Testproben.

Referenzbeispiel IV

Das folgende Referenzbeispiel beschreibt einen Festphasen- Diffusionstest zur Bestimmung niedriger Konzentrationen von Humanimmunoglobulin, welches mit Staphylococcus Protein A reagiert. Dies ist ein Beispiel für einen "Sandwich-Test", basierend auf einer Wechselwirkung zwischen einem Liganden (Immunoglobulin) und einem Rezeptor (Protein A). Peroxidase-markierte Kaninchenantikörper gegen Humanimmunoglobuline verwendet man als freie Antikörper.
Nitrocellulosepapier (Bio-Rad, Rockville Centre, NY, Nr. 162-0115, 0,45 um) schneidet man in Stücke mit einer Größe von etwa 6,45 cm² (1 square inch). Diese Stücke wäscht man 10 min in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2). Die gewaschenen Papierstücke inkubiert man anschließend bei 4ºC 12 h in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,01 mg/ml Staphylococcus Protein A (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und 1 mg/ml Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) enthält. Nach 12stündiger Inkubation wäscht man die Papierstücke erneut 10 min in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Die Papierstücke inkubiert man anschließend 2 h in einer 5%igen Rinderserumalbuminlösung. Die Inkubation erfolgt zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen. Die Glycininkubation erfolgt zur Absättigung aller unspezifischen Bindungsstellen. Die Papierstücke werden erneut mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Nach einem kurzen Waschschritt in destilliertem Wasser werden die Membranstücke an der Luft getrocknet.
Eine Standardkurve stellt man her aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 5% Rinderserumalbumin und unter Verwendung sechs verschiedener Verdünnungen von humanem Immunoglobulin G. Die Konzentrationen an Immunoglobulin G (Boehringer Mannheim, Deutschland) für die Standardkurve liegen im Bereich von 32 ug/ml bis 1 mg/ml. Eine Lösung, enthaltend 10 ul einer jeden Verdünnung trägt man über ein Kapillarrohr auf das Nitrocellulosepapier auf. Nach Diffusion der Flüssigkeit in das Nitrocellulosepapier wäscht man die Papierstücke 3 min in einer phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,5% Tween® 20 (Polyoxyethylensorbitan-monolaurat, Sigma Chemical Comapyn, St. Louis, Mo). Anschließend setzt man Peroxidase-markierte Antikörper, welche spezifisch für die schwere und die leichte Kette von Human IgG (Dako Accurate Chemicals) sind, als zweite Schicht des Sandwichs ein. Diese markierten Antikörper verdünnt man 1:1000 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 1% Rinderserumalbumin.
Nach einem zweiten Waschschritt unter Verwendung phosphatgepufferter Kochsalzlösung und 0,5% Tween® 20 taucht man die Papierstücke in eine Substratlösung ein. Die Substratlösung wird wie folgt hergestellt: 15 ug 4-Chlor-1-naphthol (Bio-Rad, Rockville Centre, NY, Nr. 170-6534) löst man in 5 ml Methanol. Zu dieser Lösung gibt man 25 ml destilliertes Wasser und 15 ul 30%iges Wasserstoffperoxid. Nach mehreren Minuten entwickelt sich ein blaues kreisförmiges Muster.
Wie in Fig. 6 gezeigt, ist die Fläche des kreisförmigen Diffusionsmusters proportional zur Menge an freiem Immunoglobulin in der Testlösung. Es wurde festgestellt, daß nur eine einzige Standardkurve für ein bestimmtes Batch an vorbereiteten Nitrocellulosetestsubstanzen und markiertem Antikörper herzustellen ist.

Referenzbeispiel V

Für die Dünnschichtchromatographie bereits zur Verfügung stehende Festphasenträger können im Festphasen-Diffusionstest verwendet werden. Käuflich erhältliche Dünnschichtchromatographie-Träger sind sehr dünn, üblicherweise etwa 200 um dick und können in einfacher Weise für den erfindungsgemäßen Festphasen- Diffusionstest angepaßt werden.
Anti-Gentamicin-Antikörper bindet man kovalent in folgender Weise an den festen Träger. Eine Avicel F-Chromatographieplatte inkubiert man über Nacht bei 4ºC mit Ziegen-Anti-Gentamicin-Serum, 1:4 verdünnt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und 50 ul Glutaraldehyd je 100 ml Lösung. Die Platte wäscht man anschließend ausgiebig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) und schließlich mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung alleine. Die Platte wird an der Luft getrocknet.
Den Test führt man durch, indem man 20 ul des in Referenzbeispiel II beschriebenen Gentamicin-Meerrettichperoxidase-Orosomucoid-Konjugates in einer Portion auf die Dünnschichtchromatographieplatte in verschiedenen Verdünnungen aufträgt. Nach Diffusion der Lösung gibt man, wie in den vorausgegangenen Beispielen beschrieben, das Enzymsubstrat hinzu.

Referenzbeispiel VI

Das folgende Referenzbeispiel veranschaulicht die Anwendung des erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstestes als abschließenden Schritt in einem Mehrschrittest. Dieser Test ist auf die Bestimmung der Konzentration von Humanimmunoglobulin G ausgelegt. 1 ug von affinitätsgereinigtem, für Humanimmunoglobulin G spezifischen, Peroxidase-markierten Antikörper (Dako Accurate Chemicals, Westbury, New York) inkubiert man 15 min bei Zimmertemperatur in 100 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 10% Kaninchenserum, zusammen mit 10 ul einer 1:1000 Verdünnung des Testserums (verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung). 5 ul der Testsubstanz trägt man anschließend auf Nitrocellulose auf, welche mit Kaninchen-Anti-Peroxidase-Antikörper beschichtet ist. Diese Nitrocellulose stellt man gemäß Beispiel I mit folgendem Unterschied her. Das Kaninchenimmunoglobulin verdünnt man mit normalem Kaninchenserum so, daß 4 ul, enthaltend 1 ug des oben genannten Peroxidase-markierten Antikörpers bis nahe an die Front der diffundierenden Lösung diffundieren (etwa 8 mm). Gemäß dieser Variante des erfindungsgemäßen Festphasen-Diffusionstests weist das Diffusionsmuster der Reagenzien, die nicht mit Testlösung versetzt sind, die größte Fläche auf. Enthält die Testlösung irgendwelches Humanimmunoglobulin G, so reagieren die Immunoglobulin G-Moleküle mit den Peroxidase-markierten Antikörpern in der Lösung. Da ein einzelner für Immunoglobulin G spezifischer Antikörper, mit mehr als einem Immunoglobulin G-Molekül reagiert, erfolgt eine ausgedehnte Vernetzung zwischen Immunoglobulin-Molekülen im Verlauf der Bindungsreaktion. Große Komplexe reduzieren daher die Anzahl freier Peroxidase-markierter Antikörper in der Lösung und vergrößern auch die Größe der diffundierenden Komplexe. Somit wird die Größe des Diffusionsmusters mit zunehmender Konzentration von Humanimmunoglobulin G-Molekülen in der Testlösung merklich verringert. Eine Standardkurve stellt man mit geringfügig steigenden Konzentrationen von Humanimmunoglobulin G in der Testlösung her.

Referenzbeispiel VII

Das folgende Beispiel veranschaulicht die Anwendung des Festphasen-Diffusionstestes als letzten Schritt in einem Test zur qualitativen und quantitativen Analyse des Endprodukts. Diese Variante wählt man aus für eine Substanz, für die keine Rezeptoren mit hoher Affinität gefunden werden, wobei nur sehr spezifische Label verwendet werden können und wobei eine sehr hohe Empfindlichkeit erforderlich sein kann.
So hat sich z. B. die Produktion eines Antikörpers als schwierig erwiesen, der eine Affinität aufweist, die groß genug ist, um ihn gegen Clostridium Perfringens-Toxin anzuwenden. Die Durchführung des Festphasen-Diffusionstests, wie in den Referenzbeispielen I bis IV beschrieben, wäre schwierig, da der Antikörper gegen das Toxin eine geringe Affinität besitzt. Die vorliegenden Variante des Festphasen-Diffusionstests erlaubt die Durchführung eines Festphasen-Diffusionstests unter Verwendung von Antikörpern geringer Affinität.
Kaninchen-Antikörper gegen das Toxin markiert man mit Peroxidase und führt damit eine Affinitätsreinigung gemäß Stand der Technik durch. Nitrocellulosepapier behandelt man mit für Meerrettichperoxidase spezifischen Antikörpern. Eine konstante Menge Peroxidase-markierter Antikörper inkubiert man anschließend mit einer unbekannten Menge Perfringens-Toxin. Das Gemisch aus markiertem Perfringens-Toxin-Antikörpern und unbekanntem Perfringens-Toxin trägt man dann an einer einzigen Stelle auf den unlöslichen Träger auf und führt die Diffusion durch. Wie in Referenzbeispiel VI weist auch bei dieser Variante des Festphasen-Diffusionstests das Diffusionsmuster von Reagenzien ohne zugesetzter Testlösung die größte Fläche auf.
Da ein einzelner toxinspezifischer Antikörper mit mehr als einem Toxinmolekül reagiert, kommt es zu einer ausgedehnten Quervernetzung zwischen Toxinmolekülen in Form der Antikörper- Toxinmoleküle und den Peroxidase-markierten toxinspezifischen Antikörpern. Diese Quervernetzung reduziert die Anzahl freier Toxinantikörper in Lösung und vergrößert die Größe der diffundierenden Komplexe. Werden somit Toxin-Antikörper-Peroxidasekomplexe auf Nitrocellulosepapier aufgetragen, welches mit peroxidasespezifischen Antikörpern behandelt ist, so wird die Größe des Diffusionsmusters mit zunehmender Konzentration der Toxinmoleküle in der Testlösung merklich verringert. Die Standardkurve stellt man mit geringfügig steigenden Konzentrationen von Clostridium perfringens-Toxin in der Testlösung her.

Referenzbeispiel VIII

In diesem Referenzbeispiel werden die Reagenzien und der unlösliche Träger gemäß Beispiel IV hergestellt. Man stellt eine dünne Kunststoffolie her, in deren Zentrum eine Öffnung ausgebildet ist. Der Durchmesser der Öffnung beträgt 2 mm. Die Kunststoffscheibe bringt man anschließend auf das Nitrocellulosepapier auf, und zwar so, daß die Öffnung in etwa in der Mitte des Nitrocellulosepapiers angeordnet ist. 10 ul der Testlösung bringt man über der Öffnung in der Kunststoffschicht auf. Die Testlösung diffundiert durch die Öffnung in der Kunststoffschicht in das Nitrocellulosepapier. Nach Beendigung der Diffusion gibt man Substrat hinzu und bestimmt das Diffusionsmuster, wie in den vorausgegangenen Referenzbeispielen beschrieben.

Referenzbeispiel IX

Meerrettichperoxidase markiert man gemäß dem in J. DeMay, Colloidal Gold Probes in Immunocytochemistry, Immunocytochemistry; Applications in Pathology and Biology, Ed.: J. Polak, S. Van Noorden, J. Wright & Sons Ltd., London, Seiten 82-112, 1983, beschriebenen Verfahren mit kolloidalem Gold.
Nitrocellulosepapier stellt man gemäß Referenzbeispiel I her. Eine Standardkurve zur Bestimmung von unmarkierter Peroxidase wird anschließend gemäß Referenzbeispiel I erstellt. 2 und 0,5 ul von nicht-markierter Peroxidase in Konzentrationen von 2, 4, 6, 8 und 10 ug/ml gibt man zu der gleichen Menge von 1 ug/ml mit kolloidalem Gold markierter Peroxidase hinzu und erstellt die Standardkurve gemäß Referenzbeispiel I. Der auf die Diffusion der Probe hinweisende Kreis wird unmittelbar sichtbar. Keine folgenden Inkubationen sind zur Visualisierung des Diffusionsmusters erforderlich.

Referenzbeispiel X

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung eines Festphasen-Diffusionstests zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Desoxyribonucleinsäure (DNA) oder Ribonucleinsäure (RNA). Dieses Beispiel ermöglicht eine schnelle Quantifizierung von Chlamydia trachomatis DNA in einer Probe.

A. Herstellung des Nitrocellulosefilters:

Eine Lösung aus 10 ug/ml einer 0,1 Kilobasen großen DNA- Sonde für Chlamydia trachomatis in 0,1 M NaOH, 1 M NaCl, 150 mM Na-Citrat wird durch 3minütiges Kochen hitzedenaturiert und auf ein 2 cm² großes Nitrocellulosepapier (Bio-Rad, wie beschrieben) aufgetragen. Das Papier spült man anschließend 10 s in einer Lösung aus 1 M Phosphatpuffer pH 7, um NaOH zu neutralisieren. Den Filter bäckt man anschließend 10 min bei 80ºC im Vakuum. Nicht-reagierende Stellen blockiert man durch Inkubation über Nacht in DNA-Blockingpuffer, wie beschrieben in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", eds. T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambroock, Gold Spring Harbor Laboratory, 1982, Seite 326.

B. Nachweis der Nucleinsäureprobe:

10 ul der Nucleinsäureprobe mischt man mit 10 ul einer 0,2 ug/ml Lösung einer zweiten Chlamydia trachomatis DNA-Sonde in DNA-Blockingpuffer. Diese zweite DNA-Sonde ist in bekannter Weise mit Biotin markiert. Die Sequenzen der Biotin-markierten DNA-Sonde sind nicht komplementär zu derjenigen der Festphasen- Sonde. Das Gemisch aus Nucleinsäureprobe und markierter Sonde wird anschließend durch 3minütiges Kochen hitzedenaturiert. 5 ul des Gemischs trägt man mit Hilfe einer Kapillarmikropipette auf die Nitrocellulose auf und läßt radial diffundieren. Die Biotin-markierte DNA-Sonde wird anschließend dadurch sichtbar gemacht, daß man mit der Kapillarmikropipette auf exakt die gleiche Stelle 5 ul einer 0,001 mg/ml Lösung von kolloidalen Avidin-Gold-15 nm-Partikeln (EY Laboratories, San Mateo CA, Katalog Nr. GA-01) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) aufträgt. Die Bildung eines roten Spots weist auf das Vorliegen von Chlamydia trachomatis DNA in der Probe hin.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Testprobe, wobei man:

a) eine erste Substanz an eine unlösliche, poröse Trägerplatte bindet, wobei die erste Substanz ausgewählt ist unter den, den Analyten bindenden Liganden und Rezeptoren, wobei der Träger von einer Schicht bedeckt ist aus wasserundurchlässigem Material mit einer darin ausgebildeten Öffnung und/oder mit einer unmittelbar darunter angeordneten Fläche aus hydrophilem Material, welches die transversale Diffusion der Flüssigkeit durch den Träger erhöht;

b) die Testprobe auf den unlöslichen Träger über die Öffnung, wenn die Deckschicht vorliegt, aufträgt;

c) die Testprobe durch den unlöslichen Träger, der die erste Substanz trägt, diffundieren läßt;

d) eine markierte zweite Substanz auf den unlöslichen Träger vor, zusammen mit oder nach dem Auftragen des Analyten aufträgt, wobei die zweite Substanz ausgewählt ist unter Liganden und Rezeptoren, welche durch Bindung an die erste Substanz oder an den Analyten immobilisierbar sind und mit kolloidalem Gold oder kolloidalem Silber markiert sind; und

e) die Präsenz und/oder Menge der immobilisierten, markierten zweiten Substanz bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin für eine qualitative Bestimmung die Markierung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um ein deutliches Signal zu erzeugen, welches mit dem bloßen Auge erkenntlich ist, wenn die zweite Substanz in einer Menge oberhalb einer vorbestimmten Nachweisgrenze vorliegt, und das für das bloße Auge nicht erkenntlich ist, wenn die zweite Substanz in einer Menge unterhalb der vorbestimmten Nachweisgrenze vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die hydrophile Fläche fehlt und man zur quantitativen Bestimmung des Analyten die Testprobe lateral durch den unlöslichen Träger diffundieren läßt, um ein radiales Diffusionsmuster zu erhalten, und man den Durchmesser des Diffusionsmusters bestimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Deckschicht aus wasserundurchlässigem Material vorliegt und die Diffusion der Testprobe transversal durch den unlöslichen Träger durch Anwenden eines negativen Drucks oder eines positiven Drucks oder durch Anbringen des hydrophilen Materials auf der der Öffnung gegenüberliegenden Seite des unlöslichen Trägers, erhöht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Testprobe eine unbekannte Konzentration des Analyten und eine bekannte Konzentration der markierten zweiten Substanz enthält, wobei die zweite Substanz zur Bindung an die immobilisierte erste Substanz befähigt ist, wodurch ein kompetitiver Bindungstest bewirkt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem die markierte zweite Substanz zur Bindung an den Analyten befähigt ist und nach dem Analyten auf den Träger aufgetragen wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die zweite Substanz mit Hilfe einer weiteren markierten Verbindung markiert wird, wobei diese Verbindung zur Gruppe von Liganden und Rezeptoren gehört, welche an die zweite Substanz binden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Durchmesser der Öffnung bis zu etwa 5 mm beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die erste Substanz direkt oder indirekt, kovalent oder nicht-kovalent an den unlöslichen Träger gebunden ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Liganden und Rezeptoren ausgewählt sind unter spezifisch wechselwirkenden Antigenen und Antikörpern, Zuckern und Lectinen, Nukleinsäuren, Enzymen und Substraten, Enzymen und Inhibitoren, Biotin und Avidin oder Komplexen davon, oder Immunglobulin und Staphylococcus Protein A oder Komplexen davon.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der unlösliche Träger ein polymeres Material ist, welches funktionelle Gruppen trägt, die an Proteine, Kohlehydrate oder Nukleinsäuren gebunden werden können.

12. Kit für die qualitative oder quantitative Bestimmung von Analyten in einer Testprobe, wobei der Kit umfaßt:

a) eine unlösliche, poröse Trägerplatte, an die eine erste Substanz gebunden ist, die ausgewählt ist unter für den Analyten spezifischen Liganden und Rezeptoren, wobei der Träger von einer Schicht aus wasserundurchlässigem Material bedeckt ist, in der eine Öffnung ausgebildet ist und/oder die unmittelbar darunter eine Fläche aus hydrophilem Material aufweist, welche die transversale Diffusion der Flüssigkeit durch den Träger erhöht, und

b) eine Lösung einer zweiten Substanz, wobei die zweite Substanz ausgewählt ist unter Liganden und Rezeptoren, welche die erste Substanz oder den Analyten binden, wobei die zweite Lösung eine bekannte Konzentration der zweiten Substanz umfaßt, welche mit einer Markierung, umfassend kolloidales Gold oder kolloidales Silber, konjugiert ist.

13. Kit nach Anspruch 11, worin bei Vorliegen der Deckschicht der Durchmesser der Öffnung bis zu 5 mm beträgt.

14. Kit nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin die erste Substanz direkt oder indirekt, kovalent oder nicht-kovalent an den unlöslichen Träger gebunden ist.

15. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin die Liganden und Rezeptoren ausgewählt sind unter spezifisch wechselwirkenden Antigenen und Antikörpern, Zuckern und Lectinen, Nukleinsäuren, Enzymen und Substraten, Enzymen und Inhibitoren, Biotin und Avidin oder Komplexen davon, oder Immunglobulin und Staphylococcus Protein A oder Komplexen davon.