JPS62501645A - 固相拡散試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固相拡散試験法ｌ 関連出願とのクロスレファレンス 本出願は１９８５年８月２０日に出願された米国出願第７６１，９６１号の一部 継続出願であって、更にその出願は１９８４年１２月２０日に出願された米国出 願第６８／ＩＩ、０５９号の一部継続出願である。

炎貢且１ 本発明は、溶液中におｌプる微開物質の定量及び定性試験法に関し、更に詳しく は、新規な固相拡散試験法によ溶液中の物質の迅速簡易な定性及び定量に関する 。新規な試験法は、タンパク質、ホルモン、薬物、ポリペプチド、ビタミン、グ リコシドその伯のｍ度を迅速かつ定量的に分析するために利用することができる 。本発明は更に、このような定量分析を実施するためのキット、並びに、このよ うなキットの及び新規な試験法において使用するための一定の新規成分に関する 。

ｌ且皇遣月 ｌＸ１０’ｇ以下の濃度で溶液中に存在する物質の検出方法を安価でかつ簡易な ものにするだめの必要性が存続している。溶液中のこれら濃度の物質を正確に検 出することができる従来技術の方法は、厄介で高価であり、しかも実施に長時間 を要する。更に、高価で複雑な装δがこれら従来技術の方法を実施するために必 要とされる。

血清及び他の生物学的に重要な媒体中の可溶性物質の存在を検出するためには、 多くの従来技術試験方法がある。生物学的活性をもつ物質の場合は、単に生物学 的液体中の活性を測定するだ【ノで、物質の存在を検出づ゛ることかできる。例 えば、ｐ−二トロフェニルホスフェートのような酸性ホスファターぜ酵素物質を 加え、溶液をしばらくインキュベートづ“ることにより、血清中の酸性ホスファ ターゼ酵素の存在を分析することができる。酵素が血液中に存在する場合は、基 質が酵素によりホスフェートとｐ−ニド〔１フエノールに加水分解されるにつれ て、溶液は黄色に変色する。しかしながら、このタイプの分析に関連して多数の 問題が存在する。例えば、被検物質は、測定可能な生物学的活性を有していなけ ればならない。多くの場合、生物学的活性の測定は厄介でかつ時間の浪費に結が る可能性がある。更に、酵素活性は阻害剤の存在にＪ、って阻害されるおそれが ある。そのＪ：うな阻害剤が存在する場合は、誤って低活性として測定してしま うことがある。しかも、酵素は液体中に存在していたとしても、不活性であるか もしれない。

生物学的液体中の微量物質の存在を測定するためのもう１つの方法は、り〔１７ １−グラフィーとして知られる方法である。多数の様々なタイプのクロマトグラ フィーがある。薄層クロマトグラフィーは、Ｍ　ｆｆｉ分光分析又は気相クロマ トグラフィーと組合わされ、生物学的液体中の特定物質を単離しかつ定量するた めに利用されてぎた。

しかしながら、薄層クロマトグラフィーは、時間がかかり、広汎な妨害物質の影 響をうけ、しかも信頼性の面で著しい変動をうける等のいくつかの欠点を有する 。

液体クロマトグラフィーは、生物学的液体から物質を単離するためのもう１つの 方法である。この方法においては、大きさ又は電荷のような特定分子の物性を利 用している。しかしながら、特定物質が単離された後、それを分析するための方 法を更に利用しなければならない。

これは、生物学的活性、吸光特性、質量分光性を測定するか、又は更に分離分析 によって実施することができる。

分子電荷及び大きさを利用するもう１つの方法はゲル電気泳動である。この方法 では、生物学的試料は多孔質ゲル上に置かれる。試着及びゲルには次いで、試着 をゲル内で移動させるために、電場がか（すられる。移動速度は分子の電荷及び 大きざに依存する。このようにして様々な分子を分離し、単離づることができる 。

物質同定に関し、クロマ１〜グラフイー法及び電気泳動法には多数の問題がある 。問題の１つは、物質の単離後、それを同定しなければならないことである。単 離物質を同定するためには、更に、生物学的活性の測定のような操作、質量分光 分析又は免疫学的方法のような他の方法による同定を実施しなければならない。

電気泳動又はクロマトグラフィー操作は時間がががり、数時間〜数日を要する。

更に、これらの操作゛に使用される装置は高価であって、分析を実施するために は熟練した技術者を必要とする。

溶液中のｍｆｆ１の特定物質を同定するためのもう１つの方法は、免疫学的技術 を利用したものである。すべての免疫学的操作では、抗原、及び抗原に対し特異 的な抗体を使用する。従来技術の免疫学的方法としては免疫沈降法があるが、そ こでは特異的抗体は抗原と結合する。生成する複合体は、溶液中で沈降して可視 的沈降を形成する。

凝集反応は、低濃度の特定物質を検出するためのもう１つの従来技術方法である 。凝集反応においては、赤血球又は細菌のような物質は、物質表面上の抗原に対 し特異的な抗体と反応づる。抗体が表面抗原と反応するため、細胞は凝集して可 視的高密度凝集物を形成する。

免疫沈降法及び免疫凝集法は一般的に低感度である。

更に、それらの方法では、抗体が抗原と架橋結合して沈降又は凝集を起こづ゛よ うに、多数の抗体結合部位をもつ抗原を必要とする。免疫沈降プロセスでは操作 終了までに数時間〜数日を要するため、特定物質の同定又は定伍ｔま迅速に行な われなければならないという多くの状況から判断すると、操作を非実用的なもの にしてしまう。

上記方法における精度不足という問題は放射線免疫検定法として知られる方法に よって克服された。この方法では、被検抗原は放射性元素で“標識″され、敢Ｏ Ａ竹類似体を形成する。放）ｊ線免疫検定法において通常使用される放射性同位 元素ｔよ表■に示されている。

純粋同位体の比活性 同位体　くキューリー１モル）　半　減　期Ｉ＋３　２．９１Ｘ１０’　１２． ３年５３５１．５０Ｘ１０　８７日 １１３１１、６２Ｘ１０７８．１日 似体と混合させると、放射−性類似体は、溶液中のハブテン又は抗原の濃度にあ る程度直接的に比例して、抗体との結合が妨げられる。次いで、抗体結合放射性 類似体から放射性類似体を分離しかつ分析することにＪ：って、原溶液中のハブ テン又覧よ抗原の倒を間接的に調べることができる。

しかしながら、このような分析にお（プる放射性同位体の使用には叶庫に対する 危険性が潜在しており、更には放射線免疫検定法に必要な装置は比較的複雑でか つ高価である。放射線免疫検定法に伴うもう１つの問題は抗原ｊ、たは抗体の標 識である。最６一般的に使用される同位体は短い半減期を右したごｂのである。

これらにはヨウ素−１３１及びヨウ素−１２５がある。これらの同位体は半減期 が非常に短いため（それぞれ、８．１日及び６゜１］）、分析標識成分は周期的 に新しい生成物で交換されていなければならない。更に、標準曲線は、同位体の 比活性が絶えず減少していくことから、各々の未知試料毎に１１＋、備されてい なければならない。特定の標識成分に係わるもう１つの問題は自然分解である。

成分を標識するために通常使用される同位体は比較的強い放射線放出物であって 、それらが結合した化合物を分解させることがある。最後に、放射性廃棄物処理 に関する政府取締り規制が次第に強化されていくのに伴い、放射線免疫検定法に 使用された放射性同位体の処理は次第に困難かつ高価な問題となってぎた。　゛ 酵素免疫測定法は上記問題を克服し、更に測定活性を潜在的に増幅させるという 独特な利点を有している。

〔酊メ；免疫測定法の分野は、デベ［１ツブメンツ・イン・イムノロジー、第１ ８巻、免疫酵素学的技術、エルシビアー・サイエンス・バブリッジ１１−ズ、１ ９８３年（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏ ｌ　１８，１ｍｍｕｎｏ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｌｓ ｅｖｉｃｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９８３）において一般 的に概説されている。〕この方法では、放射性生物学的物質類似体の代わりに酵 素標識生物学的物質（ハブテン又は抗原）を使用する。酵素免疫測定法において ８！識として使用可能な典型的酵素は、表Ｈに掲載されている。

アルカリホスファターゼ類 グルコースオキシダーピ類 ウレアーゼ類 ペルオキシダーゼ類 β−ガラクトシダーゼ類 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ類リゾチーム類 リンゴ酸デヒドログナーぜ類 このような修正酵素分子は自らの酵素活性を保持してｌ１１３す、酵素標識生物 学的物質は、抗体複合体の形成の面で、系中の未知量の￥１離生物学的物質と競 合する。複合体は特定物質の不溶性を利用して分離されてもよい。分離された複 合体の活性又は溶液中に残存ザる一部の活性は、最初に存在した抗原量の測定の ために利用される。

同様の原理は、生物学的液体中に存在する同一の抗体の未修正変換体が測定され なければならないいずれの場合においても、酵素標識抗体を用いる逆の系で応用 することができる。

酵素免疫測定法にはいくつかの変形例がある。１つの変形例においては、酵素結 合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳ△）として知られているが、標識及び未ａｖＸの抗 原【ま一定量の同相抗体に対する結合の点で競合する。

置換された酵素標識が測定されるが、しかる後のｔ１粋は実質的に放射線免疫検 査法操作の場合と同様である。

リンドイッヂ法は酵素免疫測定法のもう１つの変形例であって、多１曲抗原、及 び抗体２分子との同時的結合能を必要とする。第１抗体分子は固相反応剤である 。その抗体は、未知試別中のすべての抗原分子との結合を確実化づるため、過剰 に使用される。かかる反応の終了後、酵素標識抗体が加えられ、第１相で形成さ れた複合体と一緒にインキュベートされる。標識抗体はしかる後抗原上の利用可 能な決定基と結合する。過剰の抗体は洗浄により除去され、酵素活性はしかる後 測定される。他の系の場合では、複合体結合醇索呈は試料中の抗原量から間接的 に測定される。この方法の変形例としては第２抗体法がある。その方法において は、抗１ｔ：ｉ　’＝よ最初に固相抗体と、次いで遊離抗体を反応せしめられる が、いずれの抗体ｔ）標識されていない。次いで、遊離抗体に対し特異的な酵素 標識抗体がａ後の試薬として使用される。

大半の酵素免疫測定法は不均一試験として分類される。

このことは、液体中の未知物質量を分析するのに必要なｇ］亦を実施するために は、結合標識分子が分析操作のある時点においてＴｆＩ離標識分子から９姉され なければならないことを意味する。そのことから、分析中に分離工程を要し、し かし分析操作の時間及び費用を増大させてしまう。結合標識物質及び未結合標識 物質の分離が行なわれない、均一的試験の酵素免疫測定法操作がある。このよう な系では固相反応剤を必要としないが、代わって、抗体を酵素標識抗原又はハブ テンと結合させて酵素活性を閉害ザることが必要になる。このタイプの試験法で は、すべての抗原−抗体結合にＪ：っ予測どおりに酵素活性を低下ざゼるとは限 らないため、使用に限界がある。

酵素免疫測定法は一般的に放射線免疫検定法と同等の感度を有し、放射性同位体 が使用されないことからより安全である。更に、酵素免疫測定法では一般に１１ ｉ０４線免疫検定法はど複雑な装置を必要としない。酵素免疫測定法は、放射線 免疫検定法にＪ：り行なわれる同様の分析Ｊ：りも一般的に非猟に安価である。

しかしながら、典型的な酵素免疫測定法に付随してなおも重要な問題が残されて いる。酵素免疫測定法を行なうのに要する時間は、何度も実施する場合には井筒 ゛に艮くなる。大半の場合、少なくとも数片間のインキュベート時間が分析を実 施するためには必要である。更に、典型的な酵素免疫測定法では、測定可能に発 色するように、ＰＩり１１質について数回の洗浄工程と更にインキュベート工程 とを必要とする。酵素反応による発色は次いで分光光度８１で測定され４１けれ ばならｔｒい。

発明の概要 本発明の固相拡散試験法は不均一試験ではなく、したがって結合標識化合物を未 結合標識化合物から分離するための分離工程を必要としない。一方、結合分子及 び標識間に立体的相互作用がないため、本発明の固相拡散試験法を従来の如き均 一試験と呼ぶことは正確ではない。

〔この試験においては、づ−べての標識化合物が固相中の吸着剤分子に結合して いる。〕本発明にあっては、生物学的液体中に微小濃度で存在づる物質を検出す るのに際し、を２方θ、に付随した問題を生じない。本発明は、比較的５．ｔｊ 　ＢＹ間で実施することができ、しかも感度の面で放射線免疫検定法に匹敵する 、固相拡散試験法を提供するものである。更に、本発明の固相拡散試験法ではい かなる複雑な測定装置をも必要としない。本発明の固相拡散試験法は試験所で実 施されることを要せず、患者のベッドのかたわらで実ｔｓ−７−ることができる 。

本発明によれＩＳ１様々な物質が正確かつ簡易に測定されｔ９ることが明らかに された。これらの物質には、他の物質と特異的に相互作用づ−ることが可能なあ らゆる物質が含まれる。このような物質としては、例えば、タンパク質、糖タン パク質、核タンパク質及び高分子量ペプチドホルモン、例えばインシュリン及び 成長ホルモン、のような免疫原がある。これらの物質には、薬物、ビタミン、グ リコシド及びポリペプチドのようなハブテン類を含む。互いに特異的に相互反応 づる他の化合物の例としては、レクチン及び糖、酵素及び基質、ビオチン及びア ビジン、ＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ及び相補的ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡ 、並びに、リガンド及びリガンドに対するレセプターがある。

囚相拡ｒｌｉ試験法の原理は、例として競合的試験法を用いた下記記載において 概説されている。特定の試験物質に刻し特異性のある吸着剤は、ニトロセルロー ス紙のような不溶性支持体に結合されている。吸着剤がそれに対して特異的な試 験物質の未知濃度溶液は、既知濃度の酵素標識試験物質と混合される。既知量の 溶液は不溶性支持体の１筒所に塗布される。溶液は数分間で不溶性支持体中に拡 散せしめられる。拡散終了後、拡散量は酵素標識用の基質を加えることにより視 覚化される。固体支持体上における拡散パターンの直径は、溶液中の未標識試験 物質の濃度に比例覆る。本発明の全体的な固相拡散試験法では実施に数分間しか かからず、必要とされる測定器具は定規のみである。

上記基本原理を用いたこの試験の様々な変形例が実施されでもよい。試験はサン ドインチ法として行なわれてもよい。この場合には、可溶性試験試料のみが吸着 剤担持固体相上に塗イｌｉされる。固相は次いで標識吸着剤含有溶液中でインキ ュベ−１・され、標識吸着剤の結合物が洗浄工程後に視覚化される。

試験物質を直接標識するための予備インキュベート工程が行なわれてもよい。こ の場合には、試験物質及び標識吸着剤が一緒にインキュベ−１・され、混合物が 吸着剤担持固体に塗布される。

本発明の固相拡散試験法は、他の試験における生成物をモニターするために利用 されてもよい。この応用例の場合は、本発明の固相拡散試験法は各種物質の測定 試験のために視覚化工程として利用される。例えば、酵素含有リポソームに１３ ！１−！ｊる免疫試験は液相中で行なうことができる。上澄は次いで吸谷剤会右 固相に塗布される。リポソームからの酵素放出量は、界面活性剤（ｄｃｔｅｒｇ ｅｎｔ　）含右酵素基Ｙ１溶液の添加後に測定される。界面活性剤はリポソーム を溶解させるために加えられる。

各種物質の測定試験のための視覚化工程として本発明を利用づ′るもう１つの例 は、アビジン／酵素複合体で標識された抗体を使用する方法である。抗体／アビ ジン／ＦＩＦ素複合体は、その抗体が１４異的な未知量の抗原と一緒にインキュ ベ−１〜される。結合反応終了後、溶液はビオチンが結合した不溶性支持体に塗 布される。抗原の存在ｔよ、複合体を架橋結合せしめ、″Ｍ離抗体／アビジン／ 酵素複合体数を減少させ、その結果、ごれに比例して拡散パターン面積を縮小さ せる。

本発明の固相拡散試験法において使用される標識は、酵素、放印ｊ性同位体、蛍 光化合物、色素、紫外線ぐ視覚できる阜ヱｌ、又は上記標識の１秤が充填された リポソームのような担体であってもよい。更に、本発明の内相拡散試験法におい て使用される標識は、潜在的に標識可能なものであってもよい。例えば、タンパ ク質はクマシーブルー（ＣＯＯｍａＳＳｉｅ　Ｂｌｕｅ）色素溶液を加えて視覚 化することがぐきる。

本発明の固相拡散試験法において、溶液中の特定の試験物質の濃度を測定づ゛る ために必要な最大溶液量は約１〜５０μρである。このように、例えば、血中抗 生物質量の測定が必要とされる場合は、指の１回の穿刺によって試験実施に十分 な血液がｔＩられる。血中抗生物質量の従来の測定方法では、数ｃｍ”の血液が 血管穿刺により採取されることを必要とする。

したがって、新規な拡散試験法を提供することが本発明の１」的である。

本発明の他の目的は、非技術者によって実施Ｊることができる試鳩法を提供づ− ることである。

本発明の伯の目的は、微ｍ物質測定のための安価な試験法を提供することである 。

本発明の他の目的は、微ｍ物質測定のための迅速なワンステップ試験法を提供す ることである。

本発明の他の目的は、キラ１−の形で市販づることが可能な迅速かつ安価な免疫 学的試験法を提供づ゛ることである。

本発明の他の目的は、測定器具として定規のみを必要どヅる定性定量試験法を提 供づ“ることである。

本発明の他の目的は、各種物質の濃度測定のために使用づることができる多用途 向試験法を提供することである。

本発明の他の目的は、他のタイプの試験のための視覚化工程を提供することであ る。

更に、本発明の他の目的は、事前に血漿を全面から分離する必要のない血漿生物 質濃度の試験法を提供することである。

本発明のｂう１つの目的は、微量溶液中の低１１度物質の試験法を提供づること である。

本発明のこれらのそして他の目的、特徴、利点は、下記に開示された態様の詳細 な説明、添付図面及び品求の範囲を参照することにより明らかとなるであろう。

図面の簡単な説明 図１（ａ）〜１（Ｃ）は、標識試験分子のみを用いた本発明の固相拡散試験法の 概略図である。

図２（ａ）〜２（Ｃ）は、標識試験分子及び未標識試験分子を用いた固相拡散試 験法の概略図である。

図３は、本発明の固相拡散試験法により不活性ペルオキシダーゼを測定した際の 標準曲線である。

図４は、本発明の固相拡散試験法によりゲンタマイシンを測定した際の標準曲線 である。

図５は、本発明の固相拡散試験法によりテオフィリンを測定した際のＩｅＸ準曲 線曲線る。

図６は、本発明の固相拡散試験法により免疫グロブリンＧを測定した際の標準曲 線である。

好ましい態様の詳細な説明 本発明の固相拡散試験法は、微小濃度の各種可溶性物質に関ザる定量的及び／又 は定性的測定及び検出のための試験である。本発明の固相拡散試験法においては 、特定の試験物質に対し特異的な吸着剤は、試験溶媒に不溶性の支持体に共有結 合的又は非共有結合的に結合せしめられる。下記記載は競合試験の変形法にも妥 当する。未知濃度の試験物質溶液が調製される。その溶液に既知量の標識試験物 質が加えられる。試験物質及び標識試験物質含有の少量溶液は、不溶性吸着剤処 理支持体上の１箇所に塗布される。試験物質及び標識試験化合物が支持体中に拡 散するにつれて、それらは吸着剤処理不溶性支持体上で結合部位に対し競合する 。標識化合物で覆われた円形領域は、試験試料で置き代えられていくにしたがい 増加していく。

本明細書において用いられる゛リガンド″という詔は、それに対するレセプター が自然界に存在し又は製造可能である、あらゆる化合物を表わす。゛レセプター ″という詔は、分子、即ち抗原決定基部位の特定の空間的又は極性構造を認識す ることができる、あらゆる化合物又は組成物に関して使用される。レセプターの 例としては、天然レセプター、例えば、チロキシンと特異的に結合するチ［１キ シン結合グロブリン：免疫グロブリンと特異的に結合するブドウ球菌（５ｔａｐ ｈｙ　１ｏｃｏｃｃａ　Ｉ　）タフバクＴｌ１Ａ：抗体；塁質と特異的に結合づ る酵素；　Ｆａｂ断片：レクチンその他が挙げられるが、それらに限定されない 。

同一の数字がいくつかの図全体において同一の要素を示している図面を参照する ことにより、本発明の固相拡散試験法が図１　（ａ）　〜１　（Ｃ）及び図２（ ａ）〜２（Ｃ）に開示されていることがｌ！Ｉ！　ｆｆ＜されるであろう。図１ （εＩ）〜１（Ｃ）は未知濃度の標識試験物質分子の結合について示すものであ る。゛この図は、従来の試験におりる測定工程として、本発明の固相拡散試験法 を適用したことを示している。陰影を帯びた球は、溶液中の標識試験物質分子１ ２を表ねづ。これらの分子は免疫原又はハブテンのようなリガンドであつもよく 、あるいは、それらはりガントに対し特異的なレセプターであってもよい。レセ プターの例としては抗体がある。吸着剤分子１４も同様に抗原でもレセプターで あってもよい。試験物質分子１２に対し特異的な吸着剤分子は、特定の試験で使 用される溶媒に不溶性の支持体１６と結合している。

不溶性支持体の１例はニトロセルロース紙である。不溶性支持体１６は吸着剤分 子１４で処理される。例えば、本究明において使用可能な典型的吸着剤分子は、 特定の抗原又はハブテンに対し特頁的な抗体である。抗体分子は全体的に正電荷 を右している。二］ヘロセルロース紙は全体的に負電荷を有している。抗体分子 がニトロセルロース紙に溶液どして塗布された場合は、正荷電抗体は二トロゼル ロース紙上の負荷電硝酸イオン基とイオン結合する。別の固体支持体が使用され でもよく、しかｂ吸着剤分子は固体支持体とイオン結合又は共有結合していても Ｊ：い、というように理解すべきである。吸着剤分子１４は、したがって、試験 物質分子１２が結合可能な支持体１６上の特責的結合部位を提供することになる 。吸着剤分子１４で処理された不溶性支持体１Ｇは、試験に際して固相１８を提 供する。

取知聞の試験物質分子１２は、キｔ？ピラリー管２０により又はマイクロピペッ トもしくは微生物用ループのＪ：うな他の周知器具により、固相１８に塗布され る。図１（ｂ）に示されているＪ：うに、試験物質分子１２が固相１８に塗布さ れると、それらは塗布部位から外方に向は急速に固相中に拡散していく。試験物 質分子１２が固相１８を拡散づるにしたがい、試験物質分子は遊離吸着剤分子１ ４部位にし１１合していく。

図１（Ｃ）に示されているように、すべての標識試験物質分子１２が吸着剤分子 １４と結合するようになると、固相１８におりる試験物質分子の拡散は停止する 。結合試験物質分子１２は固相上で円形拡散パターンを展開する。円形拡散パタ ーンは２２のような直径を右′しており、この直径は使用される標識物質のタイ プにより変更される周知の技術によって測定することができる。拡散パターンの 直径は溶液中の標識試験物質量に比例する。

次いで図２（ａ）〜２（Ｃ）では、未知酊の未標識試験物質が既知標識試験物質 溶液に加えられた場合における本発明の固相拡散試験法２５が示されている。こ の固相拡散試験変形例では、固相上の結合部位に対する標識試験物質及び未標識 試験物質間の競合原理を利用している。抗原又はハプテンのような未知潤度の未 標識試験物質分子２４は、試験溶液を調製するために、既知濃度の標識試験物質 分子１２と混合される。固相１８は上記のＪ：うにして調製される；しかしなが ら、吸着剤分子１４は、それらが標識試験物質分子１２及び未標識試験物質分子 ２４の双方に対する結合部位を与えるように選択される。

試験溶液は上記方法により固相１８に塗布される。試験溶液は塗布部位から外方 に向は急速に固相１８中に拡散していく。標識試験物質分子１２及び未標識試験 物質分子２４の双方は、遊離吸着剤１４結合部位との結合に関し競合する。固相 １８における試験溶液の拡散は、づべての標識試験物質分子１２及びすべての未 標識試験物質分子２４が吸着剤分子１４と結合するまで続く。

ある程度の結合部位が未標識試験物質分子２４によって占められているため、標 識試験物質分子１２は、未標識試験物質分子が存在していない場合よりも塗布部 位から更に外方に拡散する。その結果、試験溶液の拡散パターンは、標識試験物 質分子１２のみの拡散パターンである図１（Ｃ）の直ＩＹ２２よりも大きい図２ （Ｃ）の直径２６を有している。

標識試験物質が移動する距ｍは図１（Ｃ）の場合にりも図２（Ｃ）の場合の方が 良いが、その理由は、図２（Ｃ）にｄ３いて、ある程度の割合の吸着剤し１１合 部位が未標識試験物質にＪ：つて占められていて、標識試験物質が遊離吸着剤結 合部位と出会うまでに更に拡散されてしまうからである。このにうに、標識試験 物質にＪ：って形成される拡散パターンの直径は、溶液中の未標識試験物質の０ 度に比例しているのである。

本発明の固相拡散試験法には多種のものがある。例えば、（ａ）試惑物質が標識 することができない、又ｔ；Ｌ（ｂ）試験物質及びレセプター間の親和性が低い ため、本発明の固相拡散試験法において使用することができない、又は（Ｃ）極 めて高い感度が要求される、又ｔよ（ｄ）各種物質の濃度測定のために、同一の 固相拡散試薬を使用したい、という状況がある。

上記状況において上記試験物質を測定するためには予備工程が必要とされる。試 験物質が標識することができないという状況（ａ）では、試験物質に対するレセ プターを標識することができ、このレセプターは次いで本究明の固相拡散試験法 の最終工程において分析される。

試験物質及びレセプター間の親和性が低い場合には、試験物質又はレセプターは ごオヂン（リガンド）−アごジン（レセプター）系のような高親和性リガンド又 はレセプターと結合さぜることができる。本発明の固相拡散試験法はしかる後高 親和性リガンド及びレセプターを用いて実施されてもよい。（例は以下に記載さ れている。）本発明の固相拡散試験の感度は、増幅工程を取り入れることによっ て非常に大ぎく増大させることができる。

この工程の例としては、補体系を利用するもの、あるいは、酵素又は伯の標識が 充填された１４層リすソーＩ＼膜中に試験物υ（に刻づる抗体を組込ませるしの がある。

各種試験試料について同一の本発明の固相拡散試験法を適用する場合は、各種試 験物質を測定づるために、ビオチンを不溶性支持体に結合させがつアビジンをリ ガンドとして用いることにより行なわれてもよい。この場合において、酵素標識 アビジンは各種試験試粕に対する抗体に結合ゼしめられる。試験試ｒ１はしがる 後イの相補的標識抗体と一緒にインＶユベー１−され、ビオチン／アビ固相拡散 試験法験払により抗体が分析される。抗原が存在づると、不溶性支持体上の拡散 パターン面積を減少させることにつながる架橋結合によって、標識抗体聞を減少 させる。

本発明の固相拡散試験法において、試験溶液はいくつかの方法ににって塗布づ゛ ることができる。試験溶液は、処理された不溶性支持体」二に直接、キルピラリ −管、マイクロピペット又は微生物用ループににって１箇所に塗イ］」ツること ができる。更に、小孔を有するプラスデック製シート又はテープが不溶性支持体 上に載置されていてｂよい。試験溶液はしかる後直接孔全体にわたりプラスチッ ク製シート又はテープ上に直接塗布される。試験溶液は次いで孔を通過して不溶 性支持体中に拡散する。試験溶液は、処理された不溶性支持体スｌ−リップの一 端を既知ｔＢの試験溶液と接触せしめることにより塗布づることｂできる。溶液 はしかる後不溶性支持体中に拡散する。

標識試験物別の拡散距離は溶液中の未標識試験物質量に比例する。

試験物質に結合せしめられる標識は酵素であってもよいと理Ｍされたい。酵素標 識試験物質は、酵素基質を加え、拡散パターンの測定が可能になるほど発色が生 じるまで固体支持体を短時間インキュベ−１−することにより視覚化される。試 験方法は、酵素基質溶液の１成分を試験試ｆ１混合物に加え、第２成分を固相中 に組み込んでおくことにＪ：ってら簡易化することができる。試Ｆ４混合物を塗 布することにより、Ｆｌｙ累基質は自動的に再調製される。

試験物！１に結合せしめられる標識は放射性同位体であってｂよい。標識が放射 性同位体である場合は、試験物質溶液の拡散パターンは、不溶性支持体をＸ線フ ィルムに接触させ、拡散パターンをフィルム上に写すために必要な時間の間フィ ルムを暴露づることによって視覚化される。この時間は、使用される同位体及び ｆＶ１位体の比活性に依存する。フィルムを支持体に対し秘露した後、フィルム は現像され、拡散パターンの直径が測定される。

試験物質に結合せしめられる標識は蛍光化合物であってもＪ：い。標識が蛍光化 合物である場合は、不溶性支持体上の試験物質溶液の拡散パターンは支持体を紫 外光下におくことにＪ：って視覚化される。紫外光は試験物質に結合した化合物 に蛍光を発生させ、拡散パターンの直径は定規で測定Ｊることができる。

試験物質に結合ししめられる標識は、金コロイド、銀コロイド、〔ヤンセン・フ ァーマシューティカル社（Ｊａｎｓｓｃｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）　 、ビールス、ベルギー〕コンゴーレッド２２１２０．４’　、６’　−ジアジジ ノ−２−フェニルインドール、エオシン１０Ｂ及びヘマトキシリン７５２９０　 （シグマ・ケミカル・カンパニー社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ）　、セントルイス、ミズーリ州〕のような色素であってもよい。

試験物質に結合せしめられる標識は、従来の：連層クロマトグラフィーで広く使 用された検出方法の１つにより検出されてもよい。これには、特定の化学物質に 対し親和性をもつ色素が含まれる〔薄層クロマトグラフィーの実施における視覚 化操作、ジェイ・シー・タッチストーン及びエム・エフ・ドビンズ、第１６１− ２１９頁。

１９７０年（Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｉｎ　ｔｈ ｅＰｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｔｈ１ｎ　Ｌａｙｅｒ　ｃｈｒｏａ＋ａｔｏｇｒａ ｐｈｙ、　Ｊ、　Ｃ。

Ｔｏｕｃｈｓｔｏｎｅ　ａｎｄ　ＨｌＦ、　Ｄｏｂｂｉｎｓ、　ｐｇｓ、　１６ １−２１９．１９７０）参照〕。

試験物質に結合せしめられる標識は、間接的に試験物質に結合されてもよい。例 えば、試験物質がハブテンである場合は、タンパク質をハブテンに結合さゼ、次 いで標識をこのタンパク質に結合させることができる。あるいは、抗原に対する 抗体が標識され、試験に際し標識抗体−抗原複合体として使用されてもＪ：い。

抗原に結合ゼしめられる標識はリポソームのような担体中に組み込まれてもよい 〔ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ、第６２巻、第１５５−１６２ 頁。

１９８３年（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｖ＋ｎｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ、　６２：１５５−１６２．１９８３）参照）。この方法では、抗原は単 層リポソーム膜中に加えられる。酵素はリポソーム内部に存在１′る。リボンー ム標識をもつ試験物質が固体支持体中に拡散した後、界面活性剤が酵素基質と一 緒に固体支持体に加えられる。界面活性剤はリポソーム膜を破壊し、酵素を放出 させ、酵素基質と反応させる。リポソーム内部に保持された酵素又は色素に対す る抗体は、４！？ｉ識の非特異的拡散を防止するため、固相中に組み込まれても よい。

固体支持体の様々な特徴は試験の実施に強い影響を与える。したがって、本発明 の固相拡散試験法に対する具体的ニーズに特に適した固体支持体を開発すること ができる。一般に、固体支持体の厚さは、所定の表面を覆うのに要する試料の爪 及び試験の感度差に間接的に比例する。親水性及び疎水性成分の濃度も試料の拡 散挙動に影響を与える。レセプターに対する固体支持体の結合力は、本発明の固 相拡散試験法の感度にとって重要である。各種固体支持体の製造方法は当業者に 周知である。

本発明で使用される固相不溶性支持体は、全体的に正電荷を帯びた吸着剤分子（ レセプター又はリガンド）が不溶性支持体に非共有結合し得るように、全体的に 負電荷を帯びたものであれば、いかなる支持体であってもよい。これらのタイプ の支持体の例としては、ニトロセルロース紙、吸取膜、ジエチルアミノエチルイ オン交換紙及び吸取吸着か紙がある。更に、固相不溶性支持体は、吸着剤分子（ レセプター又はリガンド）が其有結合することが可６能な支持体結合性官能基を 右づるｂのであれば、いかなる支持体であってもよい。これらのタイプの支持体 の例として【ま、アミノベンジルオキシメチル（ＡＢＭ）紙、２−アミノフェニ ルチオエーテル（ΔＰＴ）紙、臭化シアン活性化Ｎ（ＣＢＡ）（ＣＢＡ紙につい て記載されているメソッズ・イン・エンザイモロジー、アール・ウー（編集＞、 １９７９年、アカデミツク・プレス・ニューヨーク、第６８巻、第４３６−４４ ２巻（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｌｙｍｏｌｏｇｙ、Ｒ，Ｍｕ　（ｃｄ。）　１ ９７９．　ＡｃａｄｅｍｉＣＰｒｅｓｓＮｅｗ　Ｙｏｒｋ、　６８：４３Ｇ−４ ４２）参照〕、ジアゾベンジルオキシメチルセルロース紙（ＤＢＭ）、ジアゾフ ェニルチオニーデルセルロースＫｔｔ（ＤＰＴ）及びニトロベンジルオキシメチ ルセルロース紙（ＮＢＭ＞がある。

化学物質を固相支持体に結合するために使用可能な方法は、支持体の化学構造及 び支持体に結合せしめられる化学物質の化学構造に一部依存でる。化学物質は、 臭化シアンカップリング、シランカップリング（５ｌｌａｔｉＯｎ）、ジアゾカ ップリング、カルボジイミドカップリング、グルタルアルデヒドカップリングの 利用にＪ：つ、及びヘテロ２官能試薬の使用により、支持体に結合重ることがで きる。多くの場合、立体障害があるため、スペーサー基が、１つの化学物質をも う１つの化学物質に結合させるために必要とされる。通常のスペーサー基として は、ジアミノアルキルもしくはアリール基、アリールカルボンＭ　ｂｔ、　＜は Ｔ−アミノアルキル基、ヂＡ−ル、ヒドロキシ及び水銀系塩基があるが、これら に限定されない。

不溶性支持体の孔径にＪ：り定められる耕除限界は、固相中で拡散し１！する粒 子の径を決定することになる。固相の孔径は、試験に際し分離工程を省略するた めに利用することができる。例えば、ヘパリン処理血液が分析される場合は、血 液の細胞成分は、いずれかの試験が行なわれる前に血液中の液体又は血漿部分か ら通常分離されなければならない。これは補記遠心分離により行なわれる。

本発明の固相拡散試験ではこの遠心分離工程は省略することができるが、その理 由は、不溶性支持体の孔径は血液中の細胞成分の拡散を■止づるＪ：うに選択づ ることができるからである。

本発明の固相拡散試験法におけるこの態様のもう１つの変形例においては、試験 溶液はフィルターを介して不溶性支持体に塗布されてしよい。試験溶液はフィル ターの頂部に塗布され、試験溶液はフィルターを介して不溶性支持体中に拡散づ る。典型的フィルターの例どしては、吸取紙及びジエチルアミノエヂルイオン交 換紙があるが、これらに限定されない。この方法の利用例としては、不溶性支持 体がヘパリン処理全面中の赤血球を溶解させてしまう場合に血球を血漿から分離 させる例がある。溶解細胞から放出されるへ七グロビンは不溶性支持体において 濃い背珀色を呈し、拡散パターンの視覚化を困ｊ！！ならしめる。

不溶性支持体への試験試料の塗布は、下記の方法のように修正されてらよい。薄 いプラスチック製シート又はプラスチック製テープ【ま、シート又はテープの中 心に孔を穿設して製造することができる。孔径は約１〜５ＩｎＩＡとすることが できる。プラスナック製シート又はテープは次いで不溶性支持体上におかれる。

試験試料ｔましかる後シート又はテープの孔全体にわたり不溶性支持体に迅速に 塗布されてｂよい。試験試料は次いで孔を通過し不溶性支持体中に拡散していく 。

本発明の固相拡散試験によって分析され得る未標識試験物質としては、抗原とし て公知の物質群があるが、それらに限定されない。抗原は２群：即ち、免疫原及 びハブテンに分類することができる。

免疫原とは、を索動物に導入された場合に、抗体を生成する化合物である。免疫 原の代表例は、タンパク質、糖タンパク質及び核タンパク質、例えば、ペプチド ホルモン、血清タンパク質、補体タンパク質、凝固因子及びウィルスもしくは細 菌の産生物である。すべての動物種に遍在する一定のの体内化合物は、これらの 化合物が免疫された動物で貢物として認識されないため、抗体の産生用としては 使用することができない。これらの化合物は化学的誘導によって“異物″に変換 することができる。

試験にお（プる試論物質は、変換後の化合物に対する抗体衣■は、本発明の固相 拡散試験法による定量が可能ないくつかのタイプの免疫原に関する部分的リスト である。

タンパク質　糖タンパク質 核タンパク質　ペプチドホルモン 血清タンパク質　補体タンパク質 凝固囚子　殺菌性産物 ウィルス産物　細菌産物 真菌産物　特安的免疫原 アルブミン　アンギオテンシン ブラジキニン　カルシトニン 癌胎児性抗原　コリオマンモトロビン コリオゴナド１〜【コピン　コルヂコｉ〜ロピン■リスロボエチン　第８因子 フィブリノーゲン　α−２−１（グロブリンフオリトロピン　ガストリン 硫酸ガストリン　グルノノゴン ゴブドトロビン　ハプトグロビン Ｂ型肝炎表面抗原　免疫グロブリン（Ａ、　Ｄ、　Ｅ、　Ｇ、　）ｌ）インシュ リン　リボトロビン カリジン　リボトロビン メラノｈロピン　Ａキシ１〜シン パンクレＡＩアイミン　胎盤竹うクトグンブラｌ−リイン　ブロアンギオデンシ ンブロラクチン　ツマ１−トロビン リラキシン　セクレチン ソマトマシン　ツマ１〜スタブン ｉ〜リロ［へロビン　バソ１へシン ヂモボエチン　パップレシン α−１−フェトプロティン　α−２−１−１グロブリンハブテンは、免疫原担体 と結合しｎ索動物に導入された場合に、ハブテンに対し特異的な抗体を生成せし める化合物である。ハブテンの代表例は、エストロゲン及びコルデシンのような ステロイド類、低分子ｆｉｌベブブド、伯の低分子量生物学的化合物、抗生物質 及び化学療Ｖ、剤のような染物、工業汚染物質、香味剤、良品添加剤、食品）り 染物質及び／又はそれらの代謝産物もしくは話導体である。

上記分類では、抗体を形成し得るいずれかの分子について分析するために本発明 の固相拡散試験法が利用可能である場合において、明らかに不十分である。更に 、本発明の固相拡散試験法は抗体分子を定性宙吊づるために使用することもでき る。

一本発明の固相拡散試験法において使用可能な抗体番よ、分析リベぎ抗原を、そ れが免疫原である場合には、牛きた育索ｆＪＪ物に導入することによって産生ず ることができる。免疫原の導入に応答して産生される抗体ｔよ、免疫原を覆って それを解毒し、それを溶液から沈降させ、又は単にそれに結合するタンパク質で ある。抗体タンパク質は、免疫原がタンパク質の空間配置と一致づるように幾何 学的に配列されたレセプターを形成する。ハブテンの場合では、余分の■程が抗 体の産生のために必要とされる。ハブテンは、生きた？７椎動物に導入される前 に免疫原担体に結合されな（）ればならない。ハブテンからの抗体産生方法は当 業者において周知である。

本発明の固相拡散試験法において使用可能な抗体のもう１つの供給源はモノクロ ーナル抗体である。モノクローナル抗体を産生づる技術では、牌臓リンパ球と骨 髄初代肝；ｇの悪性却１胞とを融合させなければならない。この方法では、リン パ球及び骨髄肝細胞系双方の特徴を有する単一の融合細胞ハイブリッド又はクロ ーンから発生したハイブリッド細胞系を産生づ−る。（特定の抗原で処理された 動物から採取される）リンパ球と同様に、ハイブリドーマと称される融合ハイブ リッドは抗原に対し特異的な単一種の免疫グロブリンを分泌し；しかも、骨髄細 胞系と同様に、ハイブリッド細胞系は不死である。これら２つの特徴の組合せは 、従来の抗血清が使用されている研究及び医学の分野に大ぎなインパクトを与え た。接ｔト動物から４！１られる抗血清は、同一に再度産生ずることのできない 様々な抗体の混合物であるが、モノクローナル抗体は単一種でかつ特異性の高い 免疫グロブリンである。ハイブリドーマから分泌される単一種の免疫グロブリン は、多数の抗原決定基をもつ複合分子たる抗原上の１つ、しかもたった１つの抗 原決定基のみに対してｆｊ５１シ的である〔シー・ミルシュタイン、サイエンテ ィフィック・アメリカン、第２４３巻、第４号、第６６−７４頁、１９８０年（ Ｃ，Ｈｉｌｓｔｅｉｎ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ。

２４３（４）：　６６−７４．１９８０）参照〕。

抗原−酵素免疫複合体（又は、抗体−酵素複合体）は標識剤として作用づる。可 溶性抗原又ｔよ抗体−酵素複合体の産生及び用途は、シュターンバーガーら、ジ ャーナル・Ａブ・ヒストケミス１〜り一及びサイ１−ケミストリー。

第１８巻、第３１５頁、１９７０年（ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｃｒ　ａｔａｔ、、　 ｉｎ　、Ｉｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｌｌｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃ ｙｔｏ−ＣｈｃｍｉＳｔｒｙ　、　１８：３１５　（１９７０１）に記載されて いる。望ましい酵素は、高い交代率を有し、様々なりガントと容易に結合゛する ことができ、非特異的相互反応に対し比較的感受性が低く、高分子試薬にＪ：り 調節される交代率をイｉし、特に電磁放射線の吸収又は放出にＪ、って可視的に ４ｒる生成物を生じるような酵素である。本発明の内相拡散試験法にＪ３ける使 用に適した酵素は西洋ワ１Ｊビベルオ↓シダーゼ（シグマ・ケミカル・カンパニ ー社、セントルイス、ミズーリー州）である。好ましい酵素は様々な化合物と容 易に複合化Ｊることができる。標識として使用可能な他の＾）素は、アルカリホ スファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベルオキシダーゼ、β−ガラクトシダ ーぜ、ウレアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲプーゼ、リゾデーム及び リンゴ酸デヒドロゲナーゼである。

物質量で特異的相互反応が生じるいずれの系も本発明の同相拡散試験法において 使用づることができる。本発明で使用される抗体／′抗原系以外の系の例どして は、レクチン／糖系、酵素／基質、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子のハイブリッド形成、 ビオチン／アジピン系及びブドウ球菌タンパク質Ａ／免疫グロブリン系がある。

便宜上、固相拡散試験用の試薬は、所用の範囲内で分析感度を実質的に最適にブ るため、試薬が規定比率で収納されたキットとして提供することができる。乾燥 試薬を規定容積に再調製すると、試薬′ｃＪＩ印は適切なレベルに達する。

本発明は下記例によって説明されるが、下記例は本発明をそこに記載された具体 的な方法のみに限定するというＪ、うに解釈されるべぎものではない。

下記例は、少量の不活性西洋ワサビベル第４−シダーゼを検出するために利用さ れた本発明の同相拡散試験法につい゛Ｃ説明づるものである。これは抗体／抗原 相互反応に基づく競合試験の例であって、そこでは競合的化合物自体が標識とし て使用されている。抗ベルＡキシダーピ抗体は固相に結合せしめられるが、この 例における固相はニトロセルロース紙である。不活性西洋ワサビベルオキシダー じは抗原であり、活性ペルオキシダーゼはこの試験において標識抗原に相当すヘ ラ 不活性西洋ワザごペルオキシダーゼの高温度溶液を調製することによりＪｆｆ型 曲線を作成する。活性ペルオキシダーゼ（この場合は標識）の濃度を以下の如く 測定した。

ペルオキシダーゼＩＩ！？／Ｉｄの数種の希釈溶液を１０％ウサギ血清及びリン 酸緩衝液と混合しく試験溶液ではない）、処理されたニトロセルロースに塗布し た。測定可能な拡散パターンを与えた最大の希釈液をこの例において標識として 使用した。不活性西洋ワサビベルオキシダー１溶液（５０μ９／ｌｎｆ！＞を１ ０％つ罎ツギ血清含有すン酸緩配液で連続的に希釈する。不活性西洋ワサビペル オキシダーゼ溶液各２．５μｐを活性ペルオキシダーゼ（この例における標識抗 原）０．３μ９含イ１溶液２．５μｍと混合する。溶液５μｍを次いでキャピラ リー管から結合抗ベルオキシダーピ抗体含有ニトロセルロース紙に慎ｍに塗布す る。溶液はキャピラリー管からニトロセルロース紙中に拡散し、円形の拡散パタ ーンを形成する。

ニトロセルロース紙を次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（４−クロロ−１ −ナフトール及び過酸化水素）溶液中に２２泊し、青色用が展開づるまでインキ ュベート積はｒａ液液中未標識抗原量に比例する。本発明によれば、単一の標準 曲線のみが所定の抗体及び標識抗原試薬の組合せについて作成されなければなら ないことが判明した。

本発明の固相拡散試験法の詳細な態様は以下のとおりである： ニトロヒルロース紙〔バイＡ−ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）　。

ロックビルセンター、ニューヨーク州、へ０１６２−０１１５．０．４５ミクロ ン〕を約１平方インチ（約６．５Ｃｍ）の大きさに裁断する。これら各月を次い でリン酸緩Ｖ８ｊ液（ｐＨ７，２）で１０分間洗浄する。洗浄された紙を次いで ウサギ抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリンＧ（バッチ（Ｂａｔｃｈ　）　ＣＩ　 、　７７７ニテイ一クｏｖトゲラフイー精製〕１０■／ｄ含有溶液中４℃で１２ 時間インキュベー１−する。１２時間のイン４：ユベート後、紙を再びリン酸緩 衝液中で１０分間洗浄する。紙を次いで５％血清アルブミン溶液中で２時間イン キュベートする。この工程はすべての非特箕的結合部位を飽和させるために行わ れる。紙を再びリン酸緩衝液中で洗浄する。

蒸留水で短時間洗浄した後、膜片を風乾し、給湯室中室温で保存する。

この例において使用された抗原は不活性西洋ワサビペルオキシダーゼであった。

この抗原を、西洋ワサビベルオキシダーぜ（Ｖｌ型、シグマ・ケミカル・′カン パニー社。

セントルイス、ミズーリー州、ＮαＰ−８３７５．ロフト４３Ｆ−９５８９＞１ ．５ｍｇをリン酸緩衝液に溶解することにより調製する。酵素を、最終濃度１． ０％となるまで過酸化水素を加えることにより不活性化し、次いでリン酸緩衝液 に対して一夜透析する。

未知西洋ワサビペルＡキシダーピ抗原含有試料２．５μｐを活性ペルオキシダー ゼ０．３μグ含右溶液２．５μｐと混合する。溶液５μｍをキャピラリーピペッ トから拡散させることにより、抗体処理ニトロセルロース紙に慎重に塗布した。

基質溶液は次のようにして調製される：４−クロロー１−ナフトール（バイオ− ラッド社。

ロックビルセンター、ニューヨーク州、Ｎα１７〇−６５３４）１５ＩＲｇをメ タノール５！ｄ！に溶解する。この溶液に蒸留水２５ｄ及びメタノール１５μｇ を加える。この溶液に蒸留水２５ｍ１！及び３０％過酎化耐累１５μｐを加える 。青色円形パターンは数分後に展開づる。

試験溶液中の抗原開度を調べるためには、円形パターン面積を測定づる。ａｑ； 曲線を利用することにより、溶液中の正確な抗原濃度値をめることができる。

図３は拡散パターン面積と試験試料中の未標貫不活性ペルオキシダーゼ濃度との 相関々係を示している。

匠２ この例は、溶液中低濃度の抗生物質ゲンタマイシンを検出するために利用される 本発明の固相拡散試験法について説明するものである。これは抗原／抗体相亙反 応に基づく競合試験の例であり、ここでは試験物質はハブテンで、４？！識化合 物は標識が結合した担体に結合せしめられたハブテンからなる。

ニトロセルロース紙（バイオ−ランド社、ロックビルセンター、二：ｘ−”Ｊ− り州、ＮＱＩ　６２−０１１５゜０．４５ミクロン）を約１平方インチ（約６． ５ＣＩｌ１２）の大きさに裁１１１１ｉづる。これら各月を次いでリン酸緩衝液 （ｐＨ７，２）で１０分間洗浄する。洗浄された紙を次いで、リン酸緩衝液で１ ＝３に希釈されたＡ７ギ抗ゲンタマイシン抗体含有ヤギ全血清中４℃で１２時間 インキュベートする。飽和■稈は、希釈ヤギ血清が高タンパク質濃度であること から、この例においては不必要である。

紙を次いでリン酸緩衝液で洗浄Ｊる。蒸留水で短時間洗浄した後、膜片を）！ｌ ａ乾する。

ゲンタマイシンをノノルボジイミドカップリング処理によってウシＡロソムコイ ドに化学的に結合させるが、その処理法は当業者に周知である°。ゲンタマイシ ンをオーロソムコイドに結合させた後、西洋ワサビベルＡキシダーピを次いでグ ルタルアルデヒド法によりオロソムコイドタンパク′ｄと結合させる〔ニス・ア ブラミーズ、イムノケミストリー、第１６巻、第４３頁、１９６９年（Ｓ。

Ａｒｒａｍｃａｓ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、　１［ｉ： ４３．１９６９）参照〕。

この操作により、オロソムコイドーゲンタマイシンー西洋ワυビベルオキシダー ゼ複合体からなる複合体を生ずる。

オロソムコイドーゲンタマイシンー西洋ワザビベルオ手シグーゼ複合体をアフィ ニティークロマトグラフィー処理により精製する。臭化シアン活性化セファし！ −ス４Ｂ〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社（Ｐｈａｒｍａ−ｃｉａ　Ｆ ｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、アツブシコラ、スウェーデン〕１９を１ｍＭ　ｌ −１ｃＩで洗浄する。ゲンタマイシン−オロソムコイドー四ン羊ワリビベルＡキ シダーゼ１０■／　ｍＱを次いで製造者用標準プロｌ−コールによりセファロー ス４Ｂに共有結合さゼる。１（Ｉられたゲルをしかる後小さなりロマトグラフイ ー用カラム〔工」ノモ・カラム（１：ｃｏ−ｎｏｍｏ　ｃｏｌｕｍｎ　）　、バ イオ−ラッド礼〕に注入する。Ａ７ギ抗ゲンタマイシン抗体を次いで、リン酸緩 衝液中１：１０希釈−１１ギ抗ゲンタマイシン血清５　ｍＱをツノラムに通過さ せることにＪ：つてカラムに吸着させる。抗体をしかる後、０．０２Ｍグルタル アルデヒド溶液と一緒に室温で２時間インキコベー１−　Ｊることにより、固相 に共有結合させる。グルタルアルデヒドの遊離結合部位をグリシン緩衝剤で飽和 し、カラムをしかる後大量のリンＦｌ！２緩衝液で洗汀Ｉする。

アフィニティーカラムは次いでグンタマイシンーオロソムコイドーペルオキシダ ーゼ複合体の精製のために使用される。ｐＨ２，５の０．１Ｍ＋−１ｃＩ及び０ ．２Ｍグリシンを標識複合体の溶出用に使用する。溶出液のｐｌ−（は固体トリ ス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、シグマ・ケミカル・カンパニー 社、ゼントルイス）を加えることににり直ちに修正される。１７られた精ｉツゲ ンタマイシンーオ［１ツム］イド−ベルオキシダーゼ複合体溶液を次いで保存前 にリン酸緩衝液に対して透析する。

標準曲線作成用の溶液は、リン酸緩衝液及び１０％正常ウサギ血清に６種のｙシ なるゲンタマイシン希釈液を加えて調製される。標準曲線におけるゲンタマイシ ン濃度はＯ，／Ｉμｑ／ｍ！！、　〜１２．４μｇ／　ｍｆｆの範囲である。標 識グンタマシインーオロソムコイドーベルオキシダーゼ複合体のタンパク質濃度 は約０．３ｍｙであって、２８０ｎｍにおける溶液の吸光度から調べられる。核 希釈液５μρをキャピラリー管にＪ：リニトロセルロース紙上に塗イ［ｉ？１″ る。試験液がニトロセルロース紙中に拡散した後、基質溶液に浸漬させる。基質 溶液は次のようにして調製される：４−クロ【コー１−ナフトール（バイオ−ラ ッド着、ロックビルセントレ、ニューヨーク州、Ｎα１７０−６５３４）１５μ ｐをメタノール５　ｍＱに溶解する。この溶液に蒸留水２５　ｍｅ及び３０％過 酸化水素１５μｍを加えた。青色円形パターンが数分後に展開する。

図４は、拡散パターン面積と試験試料中の未標識ゲンタマイシン濃度との相関々 係を示している。

し 下記例は、低濃度の薬物テオフィリンを検出づ−るために利用される本発明の固 相拡散試験法について説明するものである。これは抗原−抗体相互反応のもう１ つの例であって、ここでは試験物質は低分子量ハブテンで、標識化合物は西洋ワ サビペルオキシダーゼに結合したハブテンからなる。この試験では更に、不均一 抗体と（３１異なるモノクローナル抗体を使用する。

ニトロセルロース紙（バイオ−ラッド社、ロックビル廿ントレ、ニューヨーク州 、ＮＱ１６２−０１１５゜０．４５ミクロン）は、例１および２で記載されたよ うにして調製される。洗浄された紙を次いでテオフィリンに対するマウスモノク ローナル抗体１０μ７／ｄ及びウシ血消アルブミン（シグマ・ケミカル・カンパ ニー１１゜セントルイス）２μｇの沢合物含右すン耐緩衝液中４℃で一夜インキ コベートする。紙をしかる後リン［衝液で洗郡し、風乾し、給２Ｌ１１室中で保 存する。

テオフィリンを西洋ワ］ノごペルオキシダーゼに結合する〔デオフィリン放用線 免疫検定法：抗原の合成と抗血清の特徴、シー・イー・クールら、すυ−チ・コ ミコニケーションズ・イン・ケミカル・パソロジー・アンド・ファーマコロジー 、第１３巻、第３号、１９７６年（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ　ｒａｄｉｏｉｍ ｍｎｏａｓｓａｙ：　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ａｎｔｉ−ｇｅｎ　ａｎｄ　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｌａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ａｎｔｉｓｃｒｕｍ、Ｃ，Ｅ、Ｃｏ ｏｌｅ。

ａｔ、ａｔ、、Ｒｃｓｅａｒｃｂ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ 　１３．　Ｎｏ、３．　１９７６　）参照〕。テオフィリン−西洋ワサビベルオ ”キシダーゼ複合体を、モノクローナル抗テＡ゛フィリン抗体を用い、例２で記 載されたものと同様の方法にＪこり、アファニティークロマトグラフィーによっ て精製する。

標準曲線作成用の溶液は、リン酸緩衝液及び１０％ウサギ血清中に６種の異なる テオフィリン希釈液を含有させて調製される。テオフィリンｉ１１度は１．６〜 ２５．６μｇ／　ｍ（！の範囲である。１０％ウサギ血清中標識抗原の１＝２希 釈液２．５μｇ及び各希釈液２．５μｐを含有した混合物を、キャピラリー管で 二ｌ−ロセルロース紙上に塗布ザる。ニトロセルロース紙中に液（↑、が拡散し た後、紙を上記基質溶液中に浸漬し、発色反応を進行させる。

拡散パターンの直径を次いで測定し、拡散パターン面積を針筒する。

図５は、拡散パターン面積と試験試ｖｌ中の未標識テオフィリン濃度との相関々 係を示している。

性Ａ 下記例は、ブドウ球菌タンパク質Ａと反応する低濃度のヒト免疫グロブリンを検 出するために利用される本発明の固相拡散試験法について説明するものである。

これｔまりガント（免疫グロブリン）及びレセプター（タンバり質Δ）の相互反 応に基づり゛サンドイッチ法″の例である。ヒト免疫グロブリンに対するベルオ キシダーげ標識ウサギ抗体は′ｆｌ離抗体どして使用される。

ニトロセルロース紙（バイオ−ラッド社、［１ツクビルセンター、ニューヨーモ ノ州、ＮＱ１６２−０１１５゜０．４５ミクロン）を約１平方インチ（約６．５ Ｃｍ２）の大きさに裁断する。これら６片を次いでリン酸緩衝液（ｐＨ７，２） で１０分間洗浄する。洗浄された紙を次いでブドウ球菌タンパク質Ａ（ファルマ シア・ファイン・ケミカルズ礼、アップシュラ、スウェーデン）０．０１１ｒｒ ｇ／ｄ及びウシ血清アルブミン（シグマ・ケミカル・カンパニー社、セントルイ ス、ミズーリー州）１ｑ／−含有リン酸緩衝液中４℃で１２　［１，’ｊ間イン キュベートづ゛る。１２時間のインキュベ−１〜１１２、紙を再びリン酸緩衝液 中で１０分間洗浄づる。紙を次いで５％ウシ血消アルブミン溶液中で２時間イン キュベート−する。このインキュベ−１−は非特異的結合部位を飽和するために 行なわれる。グリシンインキュベートはづべての非特異的結合部位を飽和するた めに行なわれる。紙を再びリン酸緩ｔｆｊ液で洗浄する。蒸留水で類１１１間洗 浄した３！ｊ　％膜片を風乾する。

標準曲線は５％ウシ血消アルブミン含有リン酸緩衝液に６種のヒト免疫グロブリ ンＧ８釈液を混合して調製される。標準曲線におれる免疫グロブリンＧ〔ベーリ ンガー礼（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｒ）　、？ンハイム、　西ト−＋’　ツ）　ｉｌ Ｊ度＋１３２μ！７　／　ｍＱ〜１ｍり／ｄの範囲である。各希釈液１０μｍ含 有溶液をキャピラリー管によりニトロセル［１−ス紙上に塗布した。試験液がニ トロセルロース紙中に拡散した後、紙を次いで０．５％ツイーン（Ｔｗｃｅｎ　 ）　２０（モノラウリン酸ポリＡＶジエチレンソルビタン、シグマ・ケミカル・ カンパニー社、セン１〜ルイス、ミズーリー州）含有リン酸緩衝液で３分間洗を 介する。しかる後、ヒトＩｇＧ）−１及びＬ鎖〔ダ］・アキュレート・ケミカル ズ礼（Ｄａｋｏ　Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　）に特異的なベ ルオキシダーぜ標識抗体を１ノンドイツチの第２層として塗布りる。これらの標 識抗体を１％ウシ血清アルブミン含有リす酸緩衝ｉ！ｔ１：１０００に希釈する 。

リン酸緩衝液及び０．５％ツイーン２０を用いる第二洗浄工程後、紙を次いでも （貿溶液中に浸油する。基質溶液は次のにうにして調製される：４−クロロー１ −ナフトール（バイオ−ラッド礼、［−］ツクビルセンター、ニューヨーク州、 Ｎα１７０−６５３／Ｉ）１５μりをメタノール５ｉに溶解した。この溶液に蒸 留水２５ｉｆ！及び３０％過酸化水素１５μρを加える。青色円形パターンは数 分後に展開覆る。

図６で示されているように、円形拡散パターンの面積は試験溶液中の遊離免疫グ ロブリンｆｄに比例する。本発明にＪ：れば、単一の標準曲線のみが所定の調製 二１〜ロセルロース試験物質及びａ　Ｗ＆抗体の組合せについて作成されなけれ ばならないことが判明した。

例５ 薄層クロマトグラフィー用の市販固相支持体が本発明の固相拡散試験法に使用す ることができる。市販薄層クロマトグラフィー用支持体は極めて薄く、通常約２ ５０ミクロン厚であり、本発明の同相拡散試験法に容易に適用することができる 。

抗ゲンタマイシン抗体は下記の方法で固体支持体に共有結合Ｖしめられる。アビ セル（Ａｖｉｃｃｌ）　Ｆクロマトグラフィー用プレート〔アナルテック社（Ａ ｎａ　ｌ　ｔｅｃｈ。

Ｉｎｃ、）　、　ニューアークＤ　Ｅ　（Ｎｅｗａｒｋ　ＤＥ　）　）及びセル ロース基質薄層クロマトグラフィー用プレートを、リン酸緩衝液で１：４に希釈 されたＡ７ギ抗ゲンタマイシン血清及び溶液１００−ｄにつぎ５０μｇのグルタ ルアルデヒドと一緒に４℃で一夜インキユベートする。プレートを次いで１％ウ シ血清アルブミン（シグマ・グミカル・カンパニー社、セントルイス、ミズーリ ー州）含有リン酸緩衝液、最後にリンＭ緩衝液単独で大規模に洗浄ザる。プレー ｉ〜を次いで風乾する。

試験は、例２で記載されたゲンタマイシン−西洋ワサビベルオキシダーゼーオロ ソムコイド複合体の４種の希釈液２０μｇを薄層クロマトグラフィー用プレーｉ −上の１箇所に加えることによって行なわれる。溶液が拡散した後、酵素基質を 前記例で記載されているように加える。

乳ｌ 下記例は、多工程試験の最終工程としての本発明の固相拡散試験法の利用例を示 Ｊものである。この試験はヒト免疫グロブリンＧのＱ度を測定づるためのもの、 である。

ヒト免疫グロブリンＧ（ダコ・アキュレート・ケミカルズ礼、ウェストベリー、 ニューヨーク州）に対し特異的なアフィニティー精製ペルオキシダーゼ標識抗体 １μ９を、１０％つ４ツギ血清含有リン酸緩衝液１００μｐ中、リンＭ緩罰液で 希釈された１：１０００試験血清希釈液１０μＱと一緒に室温で１５分間インキ ュベートする。

試験物質５μｐを次いでウサギ抗ペルオキシダーゼ抗体で被１３れたニトロセル ロース紙に塗布する。このニトロセルロース紙は以下の差異以外例１で記載され たように調製された。即ら、つυギ免疫グロブリンを、上記ベルオキシダーゼ椋 識抗体１μｑ含有溶液４μｇが拡散溶液の端部（約８　ｒｎｍ　）近くまで拡散 Ｊるにうに、正常ウサギ血清で希釈したのである。このように木光朗の固相拡散 試験法のこの変形例の場合において、試験溶液が加えられていない試薬の拡散パ ターンは最大の面積を右するようになる。試験溶液がいずれかのヒト免疫グロブ リンＧを含有する場合は、免疫グロブリンＧ分子は溶液中のペルオキシダーゼ標 識抗体と反応してしまう。抗体に対し特ｙシ的な１個の免疫グＩコブリンＧは２ 以上の免疫グロブリン分子と反応するため、結合反応処理の結果、免疫グロブリ ン分子間で不要な架橋結合が生じる。したがって免疫グロブリン特異性抗体の大 きな複合体が形成される。この架橋れ１１合は溶液中のｙ１離ベルＡキシダーゼ 標標識体数を減少させ、しかも拡散複合体の大きさを増大ざ■てしまう。その結 果、拡散パターンの大ささは、試験溶液中のヒト免疫グロブリンＧ濃度が増加づ るにしたがい、茗しく減少せしめられる。標岸曲線は、試験溶液中のヒト免疫グ ロブリンＧ濃度を徐々に高めていくことにより作成される。

肩 下記例は、最終生成物を定性定量分析づ−る試験の最終工程として試ＩＩるため に適用される本発明の固相拡散試験法の利用例について説明する′しのである。

このアプローチは、高アフィニティレセブクーが思い出されず、極めて特殊な標 識しか使用することがぐさず、又【よ非１１（に高い感度が要求されるＪ、う４ １場合の物質のために選択することができる。

例えば、ウェルシュ金（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ　） 毒素に対し十分に高い親和性をもつ抗体を産生１−ることは困難であることが判 明した。したがって、７７ｊ素に対ザる抗体は低親和性であるため、例１〜４で 記載されている固相拡散試験法を実施することは困難であろう。固相拡散試験法 のこの変形例として、低親和性抗体を用いて固相拡散試験法を実施しなければな らない。

しかる後当業省に周知の７アイニテイー精製を行なう・ニトロセルロース紙を西 洋ワザごペルオキシダーゼに対し特異的な抗体で処理する。一定石のペルオキシ ダーゼ標識抗体を次いで未知量のウェルシュ菌ｉδ素と一緒にインキ］べ−ｔ− する。標識つ■ルシコー菌毒素抗体及び未知ウェルシュ菌毒素の況合物を次いで 不溶性支持体上の１箇所に塗布し、拡散させる。このＪ：うに、例６と同様に、 本発明の固相拡散試験法におけるこの変形例では、試験溶液が加えられていない 試薬の拡散パターンが最大面積を右するようになる。

１個のｍ累特異性抗体は２以上の毒素化合物と反応づ゛るため、抗体−毒素分子 どして毒素分子及びベルオキシダーげ標識ｆ７ｊ素特異性抗体間で不要な架橋結 合を生じる。

この架橋結合はしたがって溶液中の遊離毒索抗体数を減少させ、しかも拡散複合 体の大きさを増大ざぜる。このＪ：うに、毒素−抗体−ベルＡキシダーぜ複合体 をベルオキシダーピ特異性抗体処理ニド［］レヒル１−ス紙に塗布ηる場合ｔよ 、拡散パターンの大きさは、試験溶液中の毒素分子潤度が増加するにしたがい、 署しく縮少せしめられる。標準曲線は、試験溶液中のウェルシュ菌ｉ万素濃度を 徐々に高めていみことにより作成される。

先君 本発明の固相拡散試験法における試験試料は、いくつかの方法で不溶性支持体に 塗布することができる。試薬及び不溶性支持体を例４と同様にして調製覆る。薄 いプラスチック製シートは、シー１−の中心に穿孔を設けて製造される。孔径は ２＃である。プラスチック製シートを次いで、孔がニトロセルロース紙のほぼ中 央に位置するように、ニトロセル［Ｊ−ス紙上に載置する。試験溶液１０μｍを プラスデックの孔上にのぜる。試験溶液はブしていく。拡散終了後、す質を加え 、前記例で記載されているように拡散パターンを測定づる。

肚ユ この例では、金コロイドが色素型標識として使用される。本発明の固相免疫試験 法において標識として色素を用いた場合は、標識を視覚化させるための余分な工 程が必要になるという利点を生ずる。この例は、酵素標識の代わりに金コロイド が使用されたこと以外、例１で記載された方法と類似している。

西洋９１ノビベルＡキシダーゼを、ジエイ・デメイ、免疫細胞化学にお（プる金 コロイドプローブ、免疫細胞化学：アプリケーションズ・イン・パソロジー・ア ンド・バイオロジー、編集ニジエイ・ボラーク、ニス・ファン・ヌールデン、ジ エイ・ライ１へ・アンド・リンス礼、ロンドン、第８２−１１２頁、１９８３年 （Ｊ、　ＤｅＨａｙｆＣｏｌｌｏｉｄａｌ　Ｇｏｌｄ　Ｐｒｏｂｅｓ　ｉｎ　Ｉ ｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ：　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ 　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ、Ｅｄ：　Ｊ、Ｐｏ１ａｋ、Ｓ、 Ｖａｎ　Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｊ、Ｗｒｉｇｈｔ　＆５ｏｎｓ　Ｌｔｄ、、　Ｌｏｎ ｄｏｎ、　ｐ（Ｉ３８２−１１２．１９８３　）で記載された方法により金コロ イドで標識づる。

ニトロヒルロース紙を例１で記載されたように調製する。未標識ベルオキシダー ビ測定用の標準曲線を次いで例１のように作成する。濃度２．４．６．８及び１ ０μシ／　ｍｅの未標識ベルオキシダーげ２．５μρを同量の１μ９／ｄ金コロ イド標識ペルオキシダーゼに加え、例１で記載されたようにして標準曲線を作成 する。試料の拡散を示１円は直ちに目で見ることができる。拡散パターンを視覚 化Ｊるためには、インキユベートを要しない。

金コ［」イドを用いる固相免疫試験法の変形例は、定性結果のみが要求される分 析のために実施覆ることができる。未標識ベルオキシダーぜ合有試Ｉｔを、例９ と同様に調製きれたペルオキシダーゼに対する金コロイド標識抗体と一緒にイン キコベ−１−′１Ｊ−る。試料を次いで例１及び例９のようにニトロセルロース 紙に塗布でる。その結果、ニトロセルロース紙上のスボッ１へとして直ちに目で 見ることができ、その方法は１μｇ／　ｍｆ！未満のベルオキシダーげに感受性 がある。

このような定性試験の実用例としては下記の妊娠試験がある。ヒ１−コリＡゴナ ドｌ〜ロピン（トＩＣＧ＞のαサブユニットに対する３秤のモノクローナル抗体 の混合物を例９の方法により金コロイドで標識する。二１−ロセルロース膜をＨ ＣＧに対するポリクローナル抗体で飽和させるが、その抗体はウサギから産生さ れ、しかし当ｆｆｉ者に公知のブドウ球菌タンパク７４　Ａのカラムでアフィニ ティー精製されたものである。股を次いで約２　ｍｍ２の孔をもつカバーで被覆 する。凍結乾燥された金標識抗１−Ｉ　ＣＧ抗体を含有する綿棒をＨＣＧ含有尿 試料で湿潤させる。綿棒をしかる後直らに膜）ｊバーと接触させる。尿は膜力バ ーの孔を通過して綿棒からニトロセルロース膜中に拡散する。綿棒を約３０秒間 同じ箇所に保持し、しかる後取り去る。５０ｍ１Ｕ／ｄ以上のｌ−Ｉ　ＣＧ　１ 度は通常妊娠を示すが、これは赤色スポットの存在ににり診断することができる 。５０　ｍ　Ｉ　Ｌｌ　／　ｍＱ以下の１−ＩＣＧ濃度では可視的スポットを発 現しない。

例１１ ニトロセルロース紙の下面に負の圧力（例えば、減圧）を加え、例１０の方法を 繰り返した。負の圧力はニトロセルロース紙中での試験溶液（例えば、尿）の拡 散を高めるために加えられる。ニトロセルロース紙の両面を粘着テープで覆い、 即ち、それを試料及び膜間の接触面積を制限するカバーとして用いた。テープは 、微少表面」ニに分析対象物−標識抗体複合体を集中させるために、膜の両面の ヌ・ｊ応位置に２　ｍｍ２の孔を右していた。分析対象物の？’？在は、塗布箇 所にお【ノる赤色スポットとしてＴＡｔ認することができた・ 例１２ 拡散を早めるため負の圧力の代わりに正の圧ツノを加え、例１１の方法を繰り返 した。正の圧力は、分析対象物／金標識抗体混合物０．５ｍ含有１ｄシリンジを 用いて加えられた。被ｆｆｆされた膜（ま、膜の各面のカバー上において、対応 した２ＩＩＩｍ２の孔を有していた。膜及びその両面のカバーを標準的無菌フィ ルター容器に収納したが、フィルター容器の１１！、！は上記膜及びカバーで置 き換えられた。

シリンジをフィルター容器に接続し、分析対象物／全標識抗体混合物を対応した 孔に向けて露出した膜部分に注入した。分析対象物の存在は、塗布箇所における 赤色スポットとじて確認覆ることができた。

例１３ 拡散を高めるため負の圧力の代わりに親水性物質を用い、例１１の方法を繰り返 した。親水性物質を膜力バーの片面に隣接さＵた。分析夕・ｊ象物／金標識抗体 混合物を親水性膜とｔよ反対面上の孔部分にビベツ１〜で注入し、孔、紙から親 水ｆ’ｌ：　ｎ’ｓ中に連続的に拡散させた。分析対象物の存在は赤色スポット により視覚化された。

例１１．１２及び１３の操作は、試料が塗イ１１される側のみ被覆された膜を用 いて行なわれ工もよいと理解Ｊ−べきである。しかしながら、片面のみが被覆さ れた場合は、分析対象物／全標識抗体混合物がおそらくより広く拡散するように なるであろう。

カバーの効果は他の手段でも達成可能である、というようにも理解すべきである 。例えば、ニトロセルロース紙の表面に直接接触する漏斗を使用することができ 、この漏斗は試験溶液を紙上に塗布するための小孔を有して例１４は、デオキシ リボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）の定性定己分析のための同相拡散試 験法の利用例について説明するものである。この例では、試料中のクラミジア・ トラコマテイス菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ　）　Ｄ　ＮＡ を迅速に定ｆｆｉ？ｉることができる。

Ａ、ニトロセルロースフィルターの製造：　０　、１〜ｌＮａＯＨ，１Ｍ　Ｎａ Ｃ１，１５０ｍＭクエン酸ナトリウム中の０．１キロ塩基対クラミジア・トラコ マディスＤＮＡプローブの１０μ９　／　ｍｆｆ溶液を３分聞沸１疫して加熱変 性させ、２Ｃｍ２のニトロセルロース紙（パイオニランド社、上記と同一）に塗 布する。紙を次いでｐ　Ｈ７の１Ｍリン酸緩衝液中に１０秒間浸潰し、ＮａＯト １を中和づる。未反応部位を、“分子クローニング、研究所マニュアル″１編集 、チー・マニアティス、イー・エフ・フリツチュ及びジエ付ナムブルック、］− ルド・スプリング・ハーバ−・ラボレーＩ−リー、１９８２年、第３２６頁（” Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｌａｔｏｒｙ。

Ｍａｎｕａｌ”　、ｅｄｓ、ｒ、）ｌａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ 　ａｎｄ　Ｊ。

Ｓａｍｂｒｏｏｃｋ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　１（１’２゜１３ａ（ｌｅ　３２６）に記載されているように、 Ｄ　Ｎ　Ａブロッキング緩函液中で一夜インキユベートすることによりブロック する。

Ｂ、核」！ｎの」灸」４：　核酸試料１０μｇをＤＮＡブロッキング１ｍ液中の 第２クラミジア・１〜ラコマテイスＤＮＡプローブ０．２μＳ？／■溶液１０μ ９と混合する。

この第２ＤＮＡプローブを当業者が公知のようにビオチンで標識づる。ビオチン 標識ＤＮＡプローブ配列は固相プローブ配列に対し相補的ではない。核酸試料及 び標識プローブの混合物を次いで３分間沸１１１−Ｊることにより加熱変性づる 。混合物５μｐをキャピラリー管でニトロセルロースに塗布し、放射状に拡散さ せる。ビオチン標識ＤＮＡプローブを次いで、キャピラリーマイクロビベツ１〜 で正確に同一部位上に、ｌＮ−１７，４のリンＭ緩衝液中１５ｎｍのアビジン− 金コロイド粒子（ＥＹラボラトリーズ、サンマチＡ、カリフォルニア州、カタロ グＮ（ｌ　Ｇ　Ａ−０，１）０．００１ｑ／〆溶液５μｇを塗布することにＪ： す、視覚化させる。赤色スボッ１への生成は試料中にお【ノるクラミジア・トラ コマティスＤＮＡの存在を示す。

本発明はそのりＴましい態様に関し詳細に記載されているが、変更及び修正は前 ）ホされかつ添イ４された請求の範囲で規定されるように本発明の精神及び範囲 を逸脱しない限り行なうことができる。

浄書（内容に変更なし） Ｆ／Ｃ；、　４゜ 浄書こ内容に変更なしン ＯＬ６　３．２　６．４　＋２．８　２５．６国際調査報告 手続卒甫正書（方式） ％式％） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８５１０２５３４ ２、発明の名称 固相拡散試験法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ツエルニ−、エーリッヒ　バー。

４、代　理　人（郵便番号１００） 昭和６２年３月１９日 （発送日　昭和６２年３月２４日） ６、補正の対象 ７、補正の内容 （１）　明細書、請求の範囲および図面翻訳文の浄書（内容に

Claims (64)

【特許請求の範囲】
1. １．試験試料中の物質の定量定性分析方法であって、（ａ）第１物質を不溶性支 持体に結合し（該第１物質はリガンド及びレセプターからなる群より選択される ）；（ｂ）第２物質含有試験溶液を調製し（該第２物質は上記第１物質に対応し たリガンド及びレセブターからなる群より選択され、該第２物質は標識と結合し ている）；（ｃ）上記第１物質で処理された上記不溶性支持体上の１箇所に上記 試験溶液を塗布し； （ｄ）上記試験溶液を上記第１物質で処理された上記不溶性支持体中に拡散せし めて、上記標識第２物質の拡散パターンを得；次いで （ｃ）上記標識第２物質の拡散量を測定する；工程からなることを特徴とする方 法。
2. ２．試験溶液が、更に、標識と結合した既知濃度の第２物資及び未知濃度の第２ 物質を含有する、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．方法が従来の試験の測定工程に該当する、請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．試験溶液を不溶性支持体上のフィルターに塗布する工程を更に含む、請求の 範囲第１項記載の方法。
5. ５．リガンドが免疫原である、請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．リガンドがハブテンである、請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．レセブターが抗体である、請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．リガンドが糖で、レセブターが該糖に対し特異的なレクチンである、請求の 範囲第１項記載の方法。
9. ９．リガンドがビオチンで、レセプターがアビジンである、請求の範囲第１項記 載の方法。
10. １０．リガンドが免疫グロブリンＧで、レセブターがブドウ球菌タンパク質Ａで ある、請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．抗体が、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＥ、免疫 グロブリンＤ及び免疫グロブリンＡからなる群より選択される、請求の範囲第１ 項記載の方法。
12. １２．不溶性支持体がリガンド及びレセブターからなる群より選択される物質を 共有結合せしめることができる、請求の範囲第１項記載の方法。
13. １３．不溶性支持体が、アミノペンジルオキシメチル紙、２−アミノフェニルチ オエーテル紙、臭化シアン活性化紙、ジアゾベンジルオキシメチルセルロース紙 、ジアゾフェニルチオエーテルセルロース紙及びニトロベンジルオキシメチルセ ルロース紙からなる群より選択される、請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．不溶性支持体がリガンド及びレセブターからなる群より選択される物質を 非共有的に結合せしめることができる、請求の範囲第１項記載の方法。
15. １５．不溶性支持体がニトロセルロース紙、ナイロン、イオン交換紙及び吸取吸 着紙からなる群より選択される、請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．標識が、酵素、蛍光化合物、色素、放射性化合物及び内在性標識化合物か らなる群より選択される、請求の範囲第１項記載の方法。
17. １７．色素が金コロイド及び銀コロイドからなる群より選択される、請求の範囲 第１６項記載の方法。
18. １８．酵素が、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ 、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロ ゲナーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される、 請求の範囲第１６項記載の方法。
19. １９．ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求の範囲第１ ８項記載の方法。
20. ２０．第２物質がリボソーム膜中に組み込まれる、請求の範囲第１項記載の方法 。
21. ２１．リボソームが標識を含有し、該標識が酵素、蛍光化合物、色素及び放射性 化合物からなる群より選択される、請求の範囲第２０項記載の方法。
22. ２２．試験試料中の物質の定量分析方法であって、（ａ）第１物質を不溶性支持 体に結合し（該第１物質はリガンド及びレセブターからなる群より選択される） ；（ｂ）第２物質含有第１溶液を調製し（該第２物質は上記第１物質に対応した リガンド及びレセブターからなる群より選択される； （ｃ）上記第１溶液を上記第１物質で処理された上記不溶性支持体に塗布し； （ｄ）上記第１溶液を上記第１物質で処理された上記不溶性支持体中に拡散せし めて、拡散パターンを得；（ｃ）上記第２物質に対応したリガンド及びレセブタ ーからなる群より選択される既知量の第３物質を調製し（該第３物質は標識と結 合している）；（ｆ）上記標識第３物質を上記第１物質及び上記第２物質で処理 された上記不溶性支持体に塗布し；（ｇ）上記第２物質の拡散量を測定する；こ とからなることを特徴とする方法。
23. ２３．試験試料中の物質量を定量分析するためのキットであって、 該キツトが： （ａ）リガンド及び該リガンドに対し特異的なレセプターからなる群より選択さ れる第１物質が吸着せしめられた不溶性支持体；並びに （ｂ）第２物質の溶液（該第２物質は上記第１物質に対応したリガンド及びレセ ブターからなる群より選択され、該第２溶液は更に標識と結合した既知濃度の上 記第２物質を含有している）； からなることを特徴とするキット。
24. ２４．測定可能な拡散パターンを形成するように、第２物質を未知濃度の未標識 第２物質と一緒に不溶性支持体に塗布するための手段を更に有する、請求の範囲 第２３項記載のキット。
25. ２５．測定可能な拡散パターンを測定するための手段を更に有する、請求の範囲 第２４項記載のキット。
26. ２６．不溶性支持体が、アミノベンジルオキシメチル紙、２−アミノフェニルチ オエーテル紙、臭化シアン活性化紙、ニトロベンジルオキシメチルセルロース紙 、ジアゾフェニルチオエーテルセルロース紙及びニトロベンジルオキシメチルセ ルロース紙からなる群より選択される、請求の範囲第２３項記載のキット。
27. ２７．不溶性支持体がリガンド及びレセプターからなる群より選択される物質を 非共有的に結合せしめることができる、請求の範囲第２３項記載のキット。
28. ２８．不溶性支持体がニトロセルロース紙、ナイロン、イオン交換紙及び吸取吸 着紙からなる群より選択される、請求の範囲第２７項記載のキット。
29. ２９．（ａ）第１リガンド及び第２リガンド含有試験溶液を調製し（該試験溶液 は未知量の該第１リガンド及び既知量の該第２リガンドを含有し、該第２リガン ドは標識と結合している）； （ｂ）上記第１及び第２リガンドに対するレセプターで処理された不溶性支持体 に適量の上記試験溶液を塗布し；（ｃ）上記試験溶液を上記レセプター処理支持 体中に拡散せしめて、上記標識第２リガンドの拡散パターンを得；次いで （ｄ）上記拡散パターンの大きさを測定する；工程からなることを特徴とする固 相拡散試験法。
30. ３０．（ａ）第１レセブター及び第２レセブター含有試験溶液を調製し（該試験 溶液は未知量の該第１レセブター及び既知量の該第２レセプターを含有し、該第 ２レセプターは標識と結合している）； （ｂ）上記第１及び第２レセプターに対するリガンドで処理された不溶性支持体 に適量の上記試験溶液を塗布し；（ｃ）上記試験溶液を上記リガンド処理不溶性 支持体中に拡散せしめて、上記標識第２レセプターの拡散パターンを得；次いで （ｄ）上記拡散パターンの大きさを測定する；工程からなることを特徴する固相 拡散試験法。
31. ３１．溶液が、不溶性支持体の第１面に隣接する第１カバーに設けられた第１小 孔から塗布される、請求の範囲第３０項記載の方法。
32. ３２．負の圧力が不溶性支持体中への拡散を嵩めるために使用される、請求の範 囲第３１項記載の方法。
33. ３３．正の圧力が不溶性支持体中への拡散を高めるために使用される、請求の範 囲第３１項記載の方法。
34. ３４．親水性物質が不溶性支持体中への拡散を高めるために使用される、請求の 範囲第３１項記載の方法。
35. ３５．溶液が、第１面とは反対の第２面に隣接した第２カバーを有する不溶性支 持体に塗布される、請求の範囲第３１項記載の方法。
36. ３６．第２カバーが第１孔の反対に位置した孔を有する、請求の範囲第３５項記 載の方法。
37. ３７．負の圧力が不溶性支持体中への拡散を高めるために使用される、請求の範 囲第３６項記載の方法。
38. ３８．正の圧力が不溶性支持体中への拡散を高めるために使用される、請求の範 囲第３６項記載の方法。
39. ３９．親水性物質が不溶性支持体中への拡散を高めるために使用される、請求の 範囲第３６項記載の方法。
40. ４０．リガンドがＤＮＡで、レセブターがＤＮＡである、請求の範囲第１項記載 の方法。
41. ４１．リガンドがＲＮＡで、レセプターがＲＮＡである、請求の範囲第１項記載 の方法。
42. ４２．リガンドがＤＮＡで、レセプターがＲＮＡである、請求の範囲第１項記載 の方法。
43. ４３．リガンドがＲＮＡで、レセプターがＤＮＡである、請求の範囲第１項記載 の方法。
44. ４４．第１物質がコリオゴナドトロピン（ＣＧ）に対する抗体からなり、試験溶 液が試験試料中に存在するいずれかのＣＧと結合する金標識抗ＣＧ抗体を含有す る、妊娠診断用の請求の範囲第１項記載の方法。
45. ４５．コリオゴナドトロピンがヒトコリオゴナドトロピン（ＨＣＧ）である、ヒ ト女性の妊娠診断用の請求の範囲第４４項記載の方法。
46. ４６．第１物質が黄体刺激ホルモン（ＬＨ）に対する抗体からなり、試験溶液が 該試験溶液中のいずれかのしＨ抗体と結合する金標識抗ＬＨ抗体を含有する、生 殖能力診断用の請求の範囲第１項記載の方法。
47. ４７．（ａ）抗ＨＣＧ抗体が吸着した不溶性支持体；並びに （ｂ）標識抗ＨＣＧ抗体（該標識は金コロイド及び銀コロイドからなる群より選 択される）； からなることを特徴とする妊娠診断用キット。
48. ４８．（ｃ）標識抗ＨＣＧ抗体を収納する収集手段；を更に有する、請求の範囲 第４７項記載のキット。
49. ４９．標識抗ＨＣＧ抗体が凍結乾燥形である、請求の範囲第４７項記載のキット 。
50. ５０．（ａ）抗しＨ抗体が吸着した不溶性支持体；並びに （ｂ）標識抗ＬＨ抗体（該標識は金コロイド及び銀コロイドからなる群より選択 される）； からなることを特徴とする生殖能力診断用キツト。
51. ５１．（ｃ）標識抗ＬＨ抗体を収納する収集手段；を更に有する、請求の範囲第 ５０項記載のキツト。
52. ５２．標識抗ＬＨ抗体が凍結乾燥形である、請求の範囲第５０項記載のキット。
53. ５３．第２物質が表ＩＩＩの化合物リストから選択される、請求の範囲第２項記 載の方法。
54. ５４．標識が金コロイド及び銀コロイドからなる群より選択される、請求の範囲 第５３項記載の方法。
55. ５５．負の圧力が拡散を高めるために使用される、請求の範囲第１項記載の方法 。
56. ５６．正の圧力が拡散を高めるために使用される、請求の範囲第１項記載の方法 。
57. ５７．親水性物質が拡散を高めるために使用される、請求の範囲第１項記載の方 法。
58. ５８．（ｃ）不溶性支持体中への溶液の拡散を高めるための手段； を更に有する、請求の範囲第４７項記載のキット。
59. ５９．（ｃ）不溶性支持体中への溶液の拡散を高めるための手段； を更に有する、請求の範囲第５０項記載のキット。
60. ６０．試験溶液を調製するための工程が、他の標識化合物（該化合物は第２物質 に対応したリガンド及びレセプターの群に属する）によって第２物質を標識と結 合せしめることを含む、請求の範囲第１項記載の方法。
61. ６１．標識が金コロイド及び銀コロイドからなる群より選択される、請求の範囲 第６０項記載の方法。
62. ６２．定量分析のために、標識が、分析対象物が既決検出限界以上の量で存在す る場合には肉眼で見ることができ、分析対象物が既決検出限界以下の量で存在す る場合には肉眼で見ることができない明瞭なシグナルを発するのに十分な量で存 在する、請求の範囲第６０項記載の方法。
63. ６３．１つの箇所が直径約３ｍｍ以下である、請求の範囲第１項記載の方法。
64. ６４．不溶性支持体中に拡散する試験溶液の容積が不溶性支持体の大きさによっ て予め決定される、請求の範囲第１項記載の方法。