JPH06508217A

JPH06508217A - 結合蛋白質捕捉アッセイ

Info

Publication number: JPH06508217A
Application number: JP5512471A
Authority: JP
Inventors: ボッチェス，フランシー，エス; ヒルヤード，キャシー，エフ; モンティチェロ，ジェイムス，イー; スミス，デニス，イー
Original assignee: デイド、ベーリング、インコーポレイテッド
Priority date: 1992-01-06
Filing date: 1992-12-28
Publication date: 1994-09-14
Also published as: DE69224631T2; ES2115750T3; US6555388B1; DE69224631D1; CA2104967A1; WO1993014405A1; EP0576645B1; AU3335093A; EP0576645A1; AU654761B2; ATE163765T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】結合蛋白質捕捉アッセイ発明の背景発明の分野：本発明は、結合蛋白質アッセイに向けられている。より具体的には、本発明はそれ自身、血清又は血漿中のＢ１２及び葉酸塩のための結合蛋白質アッセイに関する。

先行技術の記述：多重的な生理学的に活性な代謝状態においては循環中にある種の分析物が見出される。−の生理学的に活性なりラスの分析物中の−の分析物に対して作られた抗体は、一般的に−の代謝物に結合するのみであり、総代謝物濃度を検出するに際しては有用性がない。この問題を解決するため、−の生理学的に活性な代謝物のクラス全体に結合させるために、特異的結合蛋白質が使用されてきた。例えばＢ１２及び葉酸塩は、ラテックス粒子上に直接に吸収される内因子又は葉酸塩結合蛋白質をそれぞれ使用して、アッセイされる。未知の分析物は、次いで、これらの結合した結合蛋白質をめて、放射性標識した分析物又は類似の分析物と競合する。

例えば、ＱＵＡＮＴＡＰＨＡＳＥ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を参照。これらのアッセイは、しかしながら、労働集約的である。従って、生理学的に活性な分析物クラスの総濃度を測定するための単純化された方法に対する持続的な需要が存在する。

この問題への一つの最近のアプローチは、ヨーロッパ特許ＷＯ９１１００５１９に開示されている。この出願は、内因子、ビタミンＢ１２複合体に対する及び内因子上のビタミンＢ１２結合部位に対するモノクローナル抗体を使用する、Ｂ１２のためのイムノアッセイを開示する。

競合的アッセイにおいて、内因子への結合をめてＢ１２は標識されたモノクローナル抗体と競合する。そのようなアッセイにおけるこれらの部位特異的抗体の使用は、内因子に結合する抗体をモニターすることによってビタミン８１２レベルが測定されることがら、ビタミンＢ１２の間接的測定を可能にするものであることが報告されている。しかしながら、生理学的に活性な分析物のクラスの総濃度を測定するために、依然として他の技術が必要とされている。

発明の概要従って、上述の欠点を解消することが本発明の−の目的である。

特に、本発明は、特異的結合蛋白質と抗結合蛋白質抗体との組合せを使用する、競合的結合蛋白質捕捉アッセイを提供する。より具体的には、本発明は、該結合蛋白質に結合する一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質と結合する未知量の分析物を含むものであり、該方法が、　分析物を内因性の結合蛋白質から遊離するために該液体サンプルを処理し１分析物−結合蛋白質−−次抗体複合体及び結合蛋白質−一次抗体複合体の混合物を形成するために、結合条件下において遊離の分析物と、−次抗体とそして結合蛋白質とを合わせ、結合条件下において該液体混合物を該複合体を選択的に保持する固体支持体に適用し；当該指示薬が該固体支持体に結合した該結合蛋白質−−一次抗体複合体未占有の結合部位に結合する結合条件下において、指示薬を該固体支持体に適用し、該指示薬が該固体支持体上に存在する程度を観察し：該指示薬が存在する該程度を該サンプル中の未知の分析物の量とを関係づけることを伴うものである方法を提供する。結合条件は、更にＰ、　Ｔｉｊｓｓｅｎ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｐｒａｃｔｉｃｅａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　１２３−１４５．　（４版１９８７）　（参照によりここに導入する）に記述されている。加えて、本発明の文脈において、術語「指示薬」は、標識された接合体を意味する。該接合体は、分析物である。該標識は、接合体と直接的又は間接的に結合する蛍光的、酵素的、比色的又は放射測定的化合物である。該標識は、基質との接触に際して蛍光を発生する酵素的化合物よりなることができる。指示薬が固体支持体上に存在する程度は、未知の分析物の量に関係づけることができる。Ｐ、　Ｔｉｊｓｓｅｎ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　［ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　１７３−２１７及び３６８−３７６　（４版１９８７）　（参照によりここに導入する）。

本発明は更に、結合蛋白質に結合する一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施する方法であって、該液体サンプルが結合タンパク質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：　−次抗体又は修飾された一次抗体を選択的に保持する第１の試薬及び−次抗体の十分な量を固定化し；該分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体サンプルを処理し：分析物−結合蛋白質複合体及び遊離の結合蛋白質の混合物を形成するために、結合条件下において遊離の分析物と該結合蛋白質とを組み合わせ、結合条件下において該液体混合物を該複合体及び遊離の蛋白質を選択的に保持する該固体支持体に適用し；該固体支持体に結合した該結合蛋白質の未占有の結合部位と結合させるために、結合条件下において指示薬を該固体支持体に適用し：該指示薬が該固相上に存在する程度を観察し：該結合した指示薬が存在する程度を該サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うものである方法を提供する。

本発明は更に、結合蛋白質に対する一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質が結合する未知量の分析物を含むものであり、該方法が：　当核種又は相同種からの抗体に結合させるために特定の動物種に対する抗体の十分量を固体支持体に固定化し２分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体混合物を処理し：結合条件下において、分析物−結合蛋白質一一次抗体複合体及び結合蛋白質 −一次抗体複合体を形成するために、遊離の分析物、該結合蛋白質、及び特定の動物種の一次抗体を合わせ：結合条件下において該液体混合物を該固体支持体に適用し；該固体支持体に結合した該結合蛋白質−抗体複合体の未占有の結合部位と結合させるため、結合条件下において該固体支持体に指示薬を適用し；該指示薬が該固体支持体上に存在する程度を観察し：酸指示薬が存在する該程度を該サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うものである方法を提供する。

本発明は更に、固体の、不活性な多孔性媒体中において結合蛋白質に対する一次抗体を用いて、液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含んでおり、該方法が：　該マトリクスの隙間の有限の区域内に当核種又は相同種からの抗体を結合させるために特定の動物種に対する抗体の十分量を固定化し；分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体サンプルを処理し；結合条件下において、分析物−結合蛋白質一一次抗体複合体及び結合蛋白質−一次抗体複合体の混合物を形成するために、遊離の分析物と、該特定の動物種の一次抗体とそして該結合蛋白質を合わせ；該複合体を特定種に対する該固定化抗体に結合させるために、結合条件下において該液体混合物を該有限な区域の中心に適用し：該固体支持体に結合した該結合蛋白質−抗体複合体の未占有の結合部位と結合させるために、結合条件下において指示薬を該固体支持体に適用し；該指示薬が該反応区域の限定された領域内に存在する程度を観察し：そして該結合した指示薬が該限定された領域内に存在する程度を該サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うものである方法を提供する。

本発明は更に、結合蛋白質に対する一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：　固体支持体に結合した一次抗体によって結合蛋白質の十分量を固定化し：分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体サンプルを処理し：結合条件下において該遊離の分析物を該固体支持体に適用し：該固体支持体に結合した結合蛋白質−抗体複合体の未占有の結合部位と結合させるために、結合条件下において指示薬を該固体支持体に適用し；該指示薬が存在する程度を観察し；そして該指示薬が存在する該程度を該サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うものである方法を提供する。

本発明は更に、固体の、不活性な多孔性媒体の隙間中において結合蛋白質に対する一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：　該結合蛋白質に対する抗体によって一定量の結合蛋白質を固定化しくここに該抗体は特定種又は相同種のものであり、該抗体は該媒体の隙間の有限な区域内に固定化されたその種又は相同種に対する抗体によって結合されるものである）：分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体混合物を処理し：酸結合蛋白質を結合させるために、結合条件下において該分析物を該有限な区域の中心に適用し、未占有の結合蛋白質と結合させるために、結合条件下において指示薬を該固体支持体に適用し：酸指示薬が該反応領域の限定された領域内に存在する程度を観察し：そして該限定された領域に存在する指示薬の程度を該サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うものである方法を提供する。

本発明は更に、結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：　固体支持体上に十分量の一次抗体を固定化し１分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体混合物を処理し、液体混合物を形成するために結合条件下において結合蛋白質と遊離の分析物とを合わせ、結合条件下において該液体混合物を該固体支持体に適用し；該固体支持体に結合した結合蛋白質−抗体複合体の未占有の結合部位と結合させるために結合条件下において該固体支持体に指示薬を適用し：酸指示薬が存在する程度を観察し：酸指示薬が存在する該程度を該サンプル中の未知の分析物の量と関係付けることを伴うものである方法を提供する。

本発明は更に、結合蛋白質に対する一次抗体によって結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有する液体サンプルをの固相法を実施するための方法であって、該方法が：　結合蛋白質に対する十分量の抗体を固定化しくここに該抗体は特定の種又は相同種のものであり、該抗体は該特定の種又は相同種に対する抗体によって固体支持体上に固定されており）；分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体混合物を処理し：液体混合物を形成するために結合条件下において結合蛋白質と遊離の分析物とを合わせ；結合条件下において該液体混合物を該固体支持体に適用し：未占有の結合蛋白質と結合させるために結合条件下において該固相に指示薬を適用し、該固相上に該指示薬が存在する程度を観察し；そして該指示薬が存在する程度とサンプル中の未知の分析物の量とを関係づけることを伴うものである方法を提供する。

該指示薬はまた、液体サンプルに加えてもよく、これは、各成分を同時に加えることによっても又は該指示薬の添加前に該分析物と抗体とを短時間インキュベートさせることによっても行うことかでｅ　ｔｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　１２３−１４５．　（４版１９８７）　（参照によりここに導入する）に記述されている。

図面の簡単な説明図１は、ＱＵＡＮＴＡＰＨＡＳＥ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　ＢＩ２ラジオアッセイと本開示の８１２酵素結合アッセイとの比較を示す。

図２は、ＱＵＡＮＴＡＰＨＡＳＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）葉酸塩ラジオアッセイと本開示の葉酸塩酵素結合アッセイとの比較を示す。

発明の詳細な説明本発明の結合蛋白質捕捉アッセイは、特異的な結合蛋白質、及び抗結合蛋白質抗体との組合せを伴う。該結合蛋白質に対する抗体を、ここに「−次抗体」という。ここに記述の該抗結合蛋白質抗体は、分析物の結合に必要でない該結合蛋白質の部位を認識し、従って、該結合蛋白質又は該結合蛋白質分析物複合体のいずれにも結合する。該抗結合蛋白質抗体は、固体表面上に該結合蛋白質を捕捉し配向させる機能をする。

より具体的には、本発明は、二次抗体より作られる免疫化学的試薬を提供する。

該免疫化学的試薬は、特定の種に対する抗血清から作られることができる。該抗血清は例えば、ヤギ抗マウス、山羊抗家兎、ヤギ抗ヒツジ、ヒツジ抗ヤギ、家兎抗ヤギ、ロバ抗ヤギ、又はより一般的に、第２種抗第１種であることができる。

本発明の目的のため、抗血清は、ここに「二次抗体」と呼ぶことができる。該二次抗体は、精製されていても未精製でもよい。ある具体例においては、該不活性の多孔性媒体に対して種々の抗血清の組合せもまた適用される。

一次抗体のある系統間に存する相同性のため、−の種に対して作られた二次抗体はまた、他の密接に関係した種とも反応するであろう。例えば、ヤギ抗マウスは、ラットより調製された一次抗体としばしば反応する。本発明の目的にため、これらの種はここに「相同種」と呼ぶ。

本発明の方法は、Ｂ１２又は葉酸塩のような生理学的に活性な一部の代謝物を検出するために、特異的な結合蛋白質及びこれらの結合蛋白質に対する抗体を使用する。Ｂ１２及び葉酸塩の血中濃度は、巨歩芽球性貧血の診断に有用である。これらのアッセイの文脈において、「分析物」とは、結合蛋白質に対して高い親和性を有する低分子量の、弱抗原性の物質を意味する。これらの分析物には、Ｂ１２、葉酸塩、Ｔ４、Ｔ３、エストラジオール及びテストステロンが包含されるがこれらに限定されない。本アッセイはまた、特異的な結合蛋白質と関連する分析物又はホルモンに関しても有用である。加えて、この方法を使用して酵素を測定することが可能であろう。本発明おいて有用な他の結合蛋白質には、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）　、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）　、酵素が包含される。加えて、結合蛋白質自体は本方法及び標識された分析物を用いて測定できることを認識しなければならない。

固体支持体は、ガラス繊維マトリクス「タブ」、マイクロスフイア、又は試験管等であってよい。該固体支持体は、抗体、又はアビジン接合抗体（ここでは該固相はビオチンを含有する）若しくはレクチンに接合した抗体（ここでは該固相は糖を含有する）のような修飾された抗体を選択的に保持する、プロティンＡ又はプロティンＧのような、試薬を含んでいてよい。該固体支持体は、結合蛋白質に対する抗体、結合蛋白質及び当該種または相同種に対する抗体によって固体支持体に取り付けられた特定の種の結合蛋白質抗体、又は当該種又は相同種に対する抗体によって該固体支持体に取り付けられた特定種の抗体に結合した結合蛋白質を含むことができる。

好ましくは、該固体支持体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ／Ｆｃ　（Ｇａｍ／Ｆｃ）又はヤギ抗マウスＩｇＧ／Ｆｃ、結合蛋白質及び該結合蛋白質に対するモノクローナル抗体で被覆される。加えて、酵素を測定することが可能である。この方法においては、該固相上に該酵素を固定化するために抗酵素抗体（それは活性部位に対し末梢に結合する）を使用することができ、固定化された酵素の量は特定の基質を加えることによって定量できよう。

本アッセイの第１段階は、分析物を遊離させ内因性の結合蛋白質を破壊するために、サンプルを変性させることを伴う。該サンプルは、分析物を遊離させるために、水酸化ナトリウム処理、煮沸、力オトロフィック（ｃｈａｏｔｒｏｐｈｉｃ）な試薬（尿素、チオシアン酸カリウム、グアニジン、過塩素酸塩）、特異的阻害剤（８−アニリノ−■−ナフタリソースルホン酸又はジヒドロテストステロン）で処理することにより、及びｐＨによって、サンプルを変性させることができる。分析物が一旦内因性の結合蛋白質から遊離されると、該変性されたサンプルは、外因性の結合蛋白質の非結合性配列に対する抗体及び外因性結合蛋白質を含有する溶液と組み合わされる。液中の拡散が唯一の律速段階であることから、この混合物中においては分析物の結合は改善される。

この液体混合物は、当該タブに吸収されたヤギ抗マウス［ｇＧ／Ｆｃを有するガラス繊維紙（「タブ」）よりなる固体支持体に加えられる。結合蛋白質抗体複合体は、該固体支持体上に吸収されたヒツジ抗マウスＩｇＧ／Ｆｃ抗体によって固定化される。

本発明の文脈において術語「指示薬」は、標識された接合体を意味する。該接合体は、アッセイ方式に応じて、抗体又は分析物である。標識は、蛍光的、酵素的、若しくは比色的な、該接合体と直接又は間接に結合する化合物である。該標識は、基質と接触したとき蛍光を生ずる酵素化合物よりなるものであってよい。固体支持体上に該指示薬が存在する程度は、該サンプル中の未知量の分析物と関係づけることができる。

実施例１−８１２のアッセイタブの調製＝　３％（ｖ　／　ｖ　）のＧａｍ／Ｆｃ及び５０　ｍｍｏｌ／Ｌのトリスを含有するｐＨ８，０の溶液を、ＧＦ／Ｆガラス繊維紙に適用し、そして乾燥させた。

酵素標識接合体の調製：　１００ｍｍｏｌルのガラクトース及びＯ１１％ｖ　／　ｖのＺＱＮＹＬ　ＦＳＮ　（Ｄｕ　Ｐｏｎｔによる界面活性剤）を含有する５０ｍｍｏｌルのトリスマレイン酸緩衝液（ｐＨ７，２）中において、酸加水分解Ｂ１２をスクシンイミジルエステル結合を介して哺乳類のアルカリ性フォスファターゼと結合させた。

アッセイ較正標準の調製二　本アッセイのための較正標準は、５％（ｗ／ｖ）Ｂ１２不含ヒト血清アルブミンを含有する１　０　ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）にＢ１２を加えることによって調製した。較正標準セットの最終濃度は０，１００．２００．４００．５００及び２０００　ｐｇ　Ｂ１２／ｍＬであった。

阻害剤の調製二　本アッセイのための阻害剤は、１５０　ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム及び１．２μｍｏｌ凡のコビナミドジシアニドを含有する、５０　ｍｍｏｌルホウ砂（ｐＨ９，２）であった。

抽出剤の調製：　本アッセイのための抽出剤は、１２％（Ｖ　／　Ｖ）のエタノール及び１　ｍｍｏｌ凡のシアン化カリウムを含有する５００　ｍｍｏｌルの水酸化ナトリウムである。

中和剤の調製二０．２％（Ｗ／Ｖ）のＢ１２不含ヒト血清アルブミン及び０．　５％（ｖ　／　ｖ　）　Ｂｒｉ　ｊ−３０を含有するＩＬの５０　ｍｍｏｌ／Ｌホウ砂緩衝液（’ｐＨ９，２）中において、４００１Ｕの内因子を６ｍｇのマウス抗内因子抗体と混合した。

基質洗浄溶液の調製：　蛍光原性アルカリ性フォスファターゼ基質は、ＩＬ当たり３　ｍｍｏｌの酢酸マグネシウム及びｌ　ｍｍｏｌの硫酸亜鉛を含有する、１　ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ９，０）のジェタノールアミン緩衝液中の１　ｍｍｏｌ凡の４−メチルウンベリフェリルホスフェートよりなる。１０　ｍｍｏｌ凡のレバミゾールが、残りの血清アルカリ性フォスファターゼ活性を阻害するために加えられた。

アッセイ手順：　アッセイに先立ち、６０μＬの各較正標準、対照及び臨床標本が、２０μＬの阻害剤及び５０μＬの抽出剤で逐次的に希釈された。短いインキュベーションの後、２００μＬの中和剤が各希釈サンプルに加えられ、サンプル中の８１２は該中和剤中に含有される内因子／杭内因子に結合する。次いで、固体支持体、固定化ＣＡＭ／Ｆｃを含有するガラス繊維タブが、固定された負荷ステーションにおいて５ＴＲＡＴＵＳ　＠　（Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　［ｎｃ、）分析器中に導入される。間欠的駆動システムが最上タブを加熱されたコンベア上に押しやり、これは該タブを４つの異なるステーションへと移動させる。ステーションＮｏ、　ｌにおいては、希釈されたサンプルがタブに加えられる。内因子／杭内因子複合体（結合したＢ１２を有し又は有しない）は、固定化ＣＡＭ／Ｆｃに結合させられる。この反応の後、タブはステーションＮＯ１２へと移動される。ここで、接合体がタブに加えられる。該接合体は、未占有の内因子結合部位に結合する。この反応の間、タブはステーションＮ００３に輸送される。接合体の結合が完了したとき、過剰の基質洗浄液がタブに加えられる。未結合の接合体及びサンプル構成成分が放射状溶出によって除去され、酵素活性が開始される。米国特許第４．５１７．２８８．４．７５２．５６２．４．７７４．１７４及び４．７８６．６０６を参照（参照によりここに導入する）。

タブは、ステーションＮｏ、　４へ移動されそこで測定が行われる。ＱＵＡＮＴＡＰＨＡＳＥ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と本発明との８１２法の比較の結果を、図１に示す。

実施例１１−葉酸のアッセイタブの調製：　２６μＬのＧＡＭ／Ｆｃ、４５μｇの葉酸結合蛋白質、５００μ ｇのマウス抗葉酸塩結合蛋白質及び２５ｍＬのマウス血清が、ｓ　ｏ　ｍｍｏｌルの塩化ナトリウム及びＯ，１％（ｖ／ｖ）のＺＯＮＹＬ　ＦＳＮ　（ＤｕＰｏｎｔ）を含有する５　０　ｍｍｏｌルのトリス（ｐＨ８，０）ＩＬ中において混合された。

酵素標識された接合体の調製二　葉酸は、０．３％（ｗ／ｖ）の葉酸不含牛血清アルブミン、２　ｍｍｏｌルのＭｇＣ１及び０．２ｍｍ。

ｌ凡の硫酸亜鉛を含有する５　０　ｍｍｏｌルのトリス（ｐＨ７，１）中において、スクシンイミジルエステル結合を介して哺乳類のアルカリ性ホスファーターゼに結合された。

アッセイ較正標準の調製：　本アッセイのための較正標準は、５．５％（Ｗ／Ｖ）の葉酸不含牛血清アルブミン、１５０　ｍｍｏｌ凡の塩化ナトリウム、ｏ、ｉ％（ｖ　／　ｖ　）のＢｒ１ｊ−３５及び０．３５％（ｖ　／　ｖ　）のＦＳＮを含有する５　０　ｍｍｏｌ凡のリン酸緩衝液（ｐＨ７゜２）に葉酸を加えることによって調製された。較正標準セットの最終濃度は、０．１．２．４．８及び１５％ｇ葉酸／ｍＬとした。

還元剤の調製：　本アッセイのための還元剤は、１．５０　ｍｍｏｌ、／Ｌの塩化ナトリウム、２　ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、　４０　ｍｍｏｌルのジチオスレイトール（ＤＴＴ）　及び２７５　ｍｍｏｌ凡のマンニトールを含有する１、０　ｍｍｏｌ凡のリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）である。

抽出剤の調製二　本アッセイのための抽出剤は、２５％（Ｖ　／　Ｖ）のエタノールを含有する１、Ｏｍｍｏｌルの水酸化ナトリウムであ中和剤の調製・　本アッセイのための中和剤は、５０ｍｍｏｌルホウ砂（ｐＨ９，０）である。

基質洗浄溶液の調製　蛍光原性のアルカリ性ホスファターゼ基質は、ＩＬ当たり３　ｍｍｏｌルの酢酸マグネシウム及び１　ｍｍｏｌルの硫酸亜鉛を含有する、１　ｍｍｏｌ／Ｌ　（ｐＨ９，Ｏ）のジェタノールアミン緩衝液中の１　ｍｍｏｌ凡の４−メチルウンベリフェリルホスフェートよりなる。残存する血清アルカリ性ホスファターゼ活性を阻害するために、１０　ｍｍｏｌ凡のレバミゾールが加えられた。

アッセイ手順：　アッセイに先立ち、各５０μＬの較正標準、対照及び臨床標本が、２０μＬの還元剤で希釈された。短いインキュベーションの後、２０μＬの抽出剤が混合物に加えられた。第２のインキュベーションの後、２００μＬの中和剤が各希釈サンプルに加えられた。次いて、固定化されたヤギ抗マウス／　Ｆ　ｃ　／抗葉酸塩結合蛋白質抗体／葉酸塩結合蛋白質を含有するタブが、固定された負荷ステーションにおいて５ＴＲＡＴＵＳ　＠　（Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、［ｎｃ。

）分析器内に導入された。間欠的駆動システムが、最上タブを加熱されたコンベア上へと押しやり、これは該タブを４つの異なるステーションへと移動させる。

ステーションＮｏ、　１においては、タブにサンプルが加えられる。サンプル中の葉酸塩は、固定化された葉酸塩結合蛋白質に結合させられる。次いて、タブはステーションＮＯ３２に移動される。ここにおいて、接合体がタブに加えられる。接合体は、未占有の結合蛋白質結合部位に結合する。この反応の間、タブはステーションＮ０１３へ輸送される。接合体の結合が完了したとき、過剰の基質洗浄液がタブに加えられる。未結合の接合体及びサンプル成分は、放射状溶出によって除去され、酵素活動が開始される。タブは、ステーションＮ００４へと移動され、そこで測定が行われる。

ＱＵＡＮＴＡＰＨＡＳＥ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と本発明との葉酸塩法との比較結果を、図２に示す。

本発明は、主として特定の且つ好ましい具体例との関連において記述されたか、本発明の範囲から外れることなく修正が可能であることは理解されるであろう。

以下の請求の範囲は、一般的に本発明の原理に従う本発明の全ての変形、用途、又は適合を包含し、且つ、本発明の関係する分野の既知の又は慣用の手法内に入るような又は該分野の当業者に明らかであるような本開示からの逸脱を含むことが意図されている。

Ｆｉｇ、　１０　２００　４００　６００　１１Ｇ０１０００１２００１４００１６００１８００２０００Ｆｉｇ、　２国際調査報告　＋１１”Ｔ／ＩＩｃ　Ｏ）／＋＋フ轟１フロントページの続き（７２）発明者　モンティチェロ、ジエイムス、イーアメリカ合衆国３３１５７フロリダ、マイアミ、サウスウエスト８８アベニュー　１５８１５（７２）発明者　スミス、デニス、イーアメリカ合衆国９５１４８カリフォルニア、サンホセ、フィンビーロード　３７３９

Claims

【特許請求の範囲】

１．当該結合蛋白質に結合する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：ａ）前記分析物を内因性の待合蛋白質から遊離させるために前記液体サンプルを処理し、ｂ）分析物一結合蛋白質−一次抗体複合体及び結合蛋白質−一次抗体複合体の混合物を形成するために結合条件下において遊離の分析物と、前記一次抗体と、そして前記結合蛋白質とを合わせ、ｃ）前記複合体を選択的に保持する固体支持体に結合条件下において前記液体混合物を適用し、ｄ）前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一次抗体複合体の未占有の結合部位と結合させるために結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、ｅ）該指示薬が前記固体支持体上に存在する程度を観察し、ｆ）前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
２．前記分析物がＢ１２でありそして前記結合蛋白質が内因子である、請求項１に記載の方法。
３．前記分析物が葉酸塩でありそして前記結合蛋白質が棄酸塩結合蛋白質である、請求項１に記載の方法。
４．前記固体支持体が、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン、アビジン、レクチン及び糖又は二次抗体よりなる群より選ばれる、抗体、修飾された抗体を選択的に保持する試薬を含むものである、請求項１に記載の方法。
５．結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に緒合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：ａ）前記一次抗体又は修飾された一次抗体を選択的に保持する第１の試薬及び前記一次抗体の十分量を固定化し、ｂ）前記分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体サンプルを処理し、ｃ）分析物一結合蛋白質複合体と遊離の結合蛋白質との混合物を形成するために結合条件下において遊離の分析物と前記結合蛋白質とを合わせ、ｄ）前記複合体及び遊離の結合蛋白質を選択的に保持する前記固体支持体に、結合条件下において前記液体混合物を適用し、ｅ）前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質の未占有の結合部位と結合させるために結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、ｆ）前記指示薬が前記固相上に存在する程度を観察し、ｇ）前記結合した指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
６．前記分析物がＢ１２であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項５に記載の方法。
７．前記分析物が葉酸塩であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求項５に記載の方法。
８．前記固体支持体がプロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン、アビジン、レクチン又は糖よりなる群より選ばれる試薬を含むものである、請求項５に記載の方法。
９．結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：ａ）固体支持体上に当該積又は相同種からの抗体を結合させるために特定の動物種に対する抗体の十分量を固定化し、ｂ）分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体混合物を処理し、ｃ）分析物一結合蛋白質−一次抗体複合体及び結合蛋白質−一次抗体複合体を形成するために、結合条件下において遊離の分析物と、前記結合蛋白質と、そして前記特定の動物種の一次抗体とを合わせ、ｄ）結合条件下において前記液体混合物を前記固体支持体に適用し、ｅ）前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一抗体複合体の未占有の結合部位と結合させるために結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、ｆ）該指示薬が前記固相上に存在する程度を観察し、ｇ）前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
１０．前記分析物がＢ１２であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項９に記載の方法。
１１．前記分析物が葉酸塩であり前記結合蛋白質が棄酸塩結合蛋白質である、請求項９に記載の方法。
１２．固体の、不活性な多孔性媒体内において、結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：ａ）前記マトリクスの隙間の有限な区域内に当該種又は相同種からの抗体を結合させるために特定の動物種に対する抗体の十分量を固定化し、ｂ）分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体混合物を処理し、ｃ）分析物一結合蛋白質−一次抗体複合体及び結合蛋白質−一次抗体複合体を形成するために、結合条件下において遊離の分析物と、前記特定の動物種の一次抗体と、そして前記結合蛋白質とを合わせ、ｄ）前記複合体を特定種に対する前記固定化された抗体に結合させるために、結合条件下において前記有限な区域の中心に前記液体混合物を適用し、ｅ）前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一抗体複合体の未占有の結合部位と結合させるために、結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、ｆ）該指示薬が前記反応区域の限定された領域内に存在する程度を観察し、ｇ）前記結合した指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
１３．前記分析物がＢ１２であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項１２に記載の方法。
１４．前記分析物が葉酸塩であり前記結合蛋白質が秦酸塩結合蛋白質である、請求項１２に記載の方法。
１５．前記固体支持体が固定化されたヤギ抗マウスｌｇＧ／Ｆｃを有するガラス繊維マトリクスよりなるものである、請求項１２に記載の方法。
１６．結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：ａ）固体支持体に結合した一次抗体によって十分量の結合蛋白質を固定化し、ｂ）分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体サンプルを処理し、ｃ）結合条件下において遊離の分析物を前記固体支持体に適用し、ｄ）前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一抗体複合体の未占有の結合部位と結合させるために、結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、ｅ）該指示薬が存在する程度を観察し、ｆ）前記指示薬が存在する程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
１７．前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求項１６に記載の方法。
１８．前記分析物がＢ１２であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項１６に記載の方法。
１９．固体の、不活性な多孔性媒体内において、結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：ａ）一定量の結合蛋白質を該結合蛋白質に対する抗体によって固定化し、（ここに前記抗体は特定種又は相同種のものであり、前記抗体は前記媒体の隙間の有限な区域内に固定された該種又は相同種に対する抗体によって結合されている）、ｂ）分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体混合物を処理し、ｃ）前記結合蛋白質を結合するために結合条件下において前記分析物を前記有限な区域の中心に適用し、ｄ）未占有の待合蛋白質と結合させるために、結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、ｅ）該指示薬が前記反応区域の限定された領域内に存在する程度を観察し、そしてｆ）前記指示薬が前記限定された領域内に存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
２０．前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求項１９に記載の方法。
２１．前記分析物がＢ１２であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項１９に記載の方法。
２２．前記固体支持体が、ガラス繊維マトリクスに取り付けられたヤギ抗マウスｌｇＧ／Ｆｃに結合されたマウス抗葉酸塩結合蛋白質に結合された棄酸塩結合蛋白質よりなるものである、請求項１９に記載の方法。
２３．結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：ａ）固体支持体上に一次抗体の十分量を固定化し、ｂ）分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体混合物を処理し、ｃ）液体混合物を形成するために結合条件下において結合蛋白質及び遊離の分析物を合わせ、ｄ）結合条件下において前記液体混合物を前記固体支持体に適用し、ｅ）前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一抗体複合体の未占有の結合部位と結合させるために、結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、ｆ）該指示薬が存在する程度を観察し、ｇ）前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
２４．前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求項２３に記載の方法。
２５．前記分析物がＢ１２であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項２３に記載の方法。
２６．結合蛋白質に対する一次抗体によって結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有する液体サンプルの固相を実施するための方法であって、該方法が：ａ）結合蛋白質に対する十分量の抗体を固定化し（ここに前記抗体は特定の種又は相同種のものであり、前記抗体は該種又は相同種に対する抗体によって固体支持体上に結合されている）、ｂ）分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体混合物を処理し、ｃ）液体混合物を形成するために結合蛋白質と遊離の分析物とを結合条件下において合わせ、ｄ）結合条件下において前記液体混合物を前記固体支持体に適用し、ｅ）未占有の結合蛋白質と結合させるために結合条件下において指示薬を前記固相に適用し、ｆ）前記指示薬が前記固体支持体上に存在する程度を観察し、そしてｇ）前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
２７．前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求項２６に記載の方法。
２８．前記分析物がＢ１２であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項２６に記載の方法。
２９．前記固体支持体が、ガラス繊維マトリクスに取り付けられたヤギ抗マウスｌｇＧ／Ｆｃに結合されたマウス抗葉酸塩結合蛋白質に緒合された葉酸塩結合蛋白質よりなるものである、請求項２６に記載の方法。
３０．結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が：ａ）固体支持体上に当該種又は相同種からの抗体を結合させるために、特定の動物種に対する十分量の抗体を固定化し、ｂ）分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体混合物を処理し、ｃ）結合蛋白質−一次抗体複合体及び指示薬一結合蛋白質−一次抗体複合体の混合物を形成するために、結合条件下において遊離の分析物と、前記結合蛋白質と、そして前記特定動物種の一次抗体とそして前記結合蛋白質を結合させるための指示薬とを合わせ、ｄ）結合条件下において前記液体混合物を前記固体支持体に適用し、ｅ）該指示薬が前記固相上に存在する程度を観察し、ｆ）前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
３１．前記分析物がＢ１２であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項３０に記載の方法。３２，前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求項３０に記載の方法。