JPH06508217A - 結合蛋白質捕捉アッセイ - Google Patents
結合蛋白質捕捉アッセイInfo
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- JPH06508217A JPH06508217A JP5512471A JP51247193A JPH06508217A JP H06508217 A JPH06508217 A JP H06508217A JP 5512471 A JP5512471 A JP 5512471A JP 51247193 A JP51247193 A JP 51247193A JP H06508217 A JPH06508217 A JP H06508217A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
結合蛋白質捕捉アッセイ
発明の背景
発明の分野:本発明は、結合蛋白質アッセイに向けられている。より具体的には
、本発明はそれ自身、血清又は血漿中のB12及び葉酸塩のための結合蛋白質ア
ッセイに関する。
先行技術の記述:多重的な生理学的に活性な代謝状態においては循環中にある種
の分析物が見出される。−の生理学的に活性なりラスの分析物中の−の分析物に
対して作られた抗体は、一般的に−の代謝物に結合するのみであり、総代謝物濃
度を検出するに際しては有用性がない。この問題を解決するため、−の生理学的
に活性な代謝物のクラス全体に結合させるために、特異的結合蛋白質が使用され
てきた。例えばB12及び葉酸塩は、ラテックス粒子上に直接に吸収される内因
子又は葉酸塩結合蛋白質をそれぞれ使用して、アッセイされる。未知の分析物は
、次いで、これらの結合した結合蛋白質をめて、放射性標識した分析物又は類似
の分析物と競合する。
例えば、QUANTAPHASE (Bio−Rad)を参照。これらのアッセ
イは、しかしながら、労働集約的である。従って、生理学的に活性な分析物クラ
スの総濃度を測定するための単純化された方法に対する持続的な需要が存在する
。
この問題への一つの最近のアプローチは、ヨーロッパ特許WO91100519
に開示されている。この出願は、内因子、ビタミンB12複合体に対する及び内
因子上のビタミンB12結合部位に対するモノクローナル抗体を使用する、B1
2のためのイムノアッセイを開示する。
競合的アッセイにおいて、内因子への結合をめてB12は標識されたモノクロー
ナル抗体と競合する。そのようなアッセイにおけるこれらの部位特異的抗体の使
用は、内因子に結合する抗体をモニターすることによってビタミン812レベル
が測定されることがら、ビタミンB12の間接的測定を可能にするものであるこ
とが報告されている。しかしながら、生理学的に活性な分析物のクラスの総濃度
を測定するために、依然として他の技術が必要とされている。
発明の概要
従って、上述の欠点を解消することが本発明の−の目的である。
特に、本発明は、特異的結合蛋白質と抗結合蛋白質抗体との組合せを使用する、
競合的結合蛋白質捕捉アッセイを提供する。より具体的には、本発明は、該結合
蛋白質に結合する一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを
実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質と結合する未知量の
分析物を含むものであり、該方法が、 分析物を内因性の結合蛋白質から遊離す
るために該液体サンプルを処理し1分析物−結合蛋白質−−次抗体複合体及び結
合蛋白質−一次抗体複合体の混合物を形成するために、結合条件下において遊離
の分析物と、−次抗体とそして結合蛋白質とを合わせ、結合条件下において該液
体混合物を該複合体を選択的に保持する固体支持体に適用し;当該指示薬が該固
体支持体に結合した該結合蛋白質−−一次抗体複合体未占有の結合部位に結合す
る結合条件下において、指示薬を該固体支持体に適用し、該指示薬が該固体支持
体上に存在する程度を観察し:該指示薬が存在する該程度を該サンプル中の未知
の分析物の量とを関係づけることを伴うものである方法を提供する。結合条件は
、更にP、 Tijssen、 Laboratory Techniques
in Biochemistry、 Mo1ecular Biology、
Practiceand Theory of Enzyme Immuno
assay 123−145. (4版1987) (参照によりここに導入す
る)に記述されている。加えて、本発明の文脈において、術語「指示薬」は、標
識された接合体を意味する。該接合体は、分析物である。該標識は、接合体と直
接的又は間接的に結合する蛍光的、酵素的、比色的又は放射測定的化合物である
。該標識は、基質との接触に際して蛍光を発生する酵素的化合物よりなることが
できる。指示薬が固体支持体上に存在する程度は、未知の分析物の量に関係づけ
ることができる。P、 Tijssen、 Laboratory Techn
iques in Biochemistry、 Mo1ecular Bio
logy、 Practice and Theory of Enzyme
[mmunoassay 173−217及び368−376 (4版1987
) (参照によりここに導入する)。
本発明は更に、結合蛋白質に結合する一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋
白質捕捉アッセイを実施する方法であって、該液体サンプルが結合タンパク質に
結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が: −次抗体又は修飾
された一次抗体を選択的に保持する第1の試薬及び−次抗体の十分な量を固定化
し;該分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体サンプルを処理
し:分析物−結合蛋白質複合体及び遊離の結合蛋白質の混合物を形成するために
、結合条件下において遊離の分析物と該結合蛋白質とを組み合わせ、結合条件下
において該液体混合物を該複合体及び遊離の蛋白質を選択的に保持する該固体支
持体に適用し;該固体支持体に結合した該結合蛋白質の未占有の結合部位と結合
させるために、結合条件下において指示薬を該固体支持体に適用し:該指示薬が
該固相上に存在する程度を観察し:該結合した指示薬が存在する程度を該サンプ
ル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うものである方法を提供する。
本発明は更に、結合蛋白質に対する一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋白
質捕捉アッセイを実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質が
結合する未知量の分析物を含むものであり、該方法が: 当核種又は相同種から
の抗体に結合させるために特定の動物種に対する抗体の十分量を固体支持体に固
定化し2分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体混合物を処理
し:結合条件下において、分析物−結合蛋白質一一次抗体複合体及び結合蛋白質
−一次抗体複合体を形成するために、遊離の分析物、該結合蛋白質、及び特定の
動物種の一次抗体を合わせ:結合条件下において該液体混合物を該固体支持体に
適用し;該固体支持体に結合した該結合蛋白質−抗体複合体の未占有の結合部位
と結合させるため、結合条件下において該固体支持体に指示薬を適用し;該指示
薬が該固体支持体上に存在する程度を観察し:酸指示薬が存在する該程度を該サ
ンプル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うものである方法を提供する
。
本発明は更に、固体の、不活性な多孔性媒体中において結合蛋白質に対する一次
抗体を用いて、液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方
法であって、該液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含んでお
り、該方法が: 該マトリクスの隙間の有限の区域内に当核種又は相同種からの
抗体を結合させるために特定の動物種に対する抗体の十分量を固定化し;分析物
を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該液体サンプルを処理し;結合条件
下において、分析物−結合蛋白質一一次抗体複合体及び結合蛋白質−一次抗体複
合体の混合物を形成するために、遊離の分析物と、該特定の動物種の一次抗体と
そして該結合蛋白質を合わせ;該複合体を特定種に対する該固定化抗体に結合さ
せるために、結合条件下において該液体混合物を該有限な区域の中心に適用し:
該固体支持体に結合した該結合蛋白質−抗体複合体の未占有の結合部位と結合さ
せるために、結合条件下において指示薬を該固体支持体に適用し;該指示薬が該
反応区域の限定された領域内に存在する程度を観察し:そして該結合した指示薬
が該限定された領域内に存在する程度を該サンプル中の未知の分析物の量と関係
づけることを伴うものである方法を提供する。
本発明は更に、結合蛋白質に対する一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋白
質捕捉アッセイを実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質に
結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が: 固体支持体に結合
した一次抗体によって結合蛋白質の十分量を固定化し:分析物を内因性の結合蛋
白質から遊離させるために該液体サンプルを処理し:結合条件下において該遊離
の分析物を該固体支持体に適用し:該固体支持体に結合した結合蛋白質−抗体複
合体の未占有の結合部位と結合させるために、結合条件下において指示薬を該固
体支持体に適用し;該指示薬が存在する程度を観察し;そして該指示薬が存在す
る該程度を該サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うものである
方法を提供する。
本発明は更に、固体の、不活性な多孔性媒体の隙間中において結合蛋白質に対す
る一次抗体による液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための
方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有す
るものであり、該方法が: 該結合蛋白質に対する抗体によって一定量の結合蛋
白質を固定化しくここに該抗体は特定種又は相同種のものであり、該抗体は該媒
体の隙間の有限な区域内に固定化されたその種又は相同種に対する抗体によって
結合されるものである):分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために該
液体混合物を処理し:酸結合蛋白質を結合させるために、結合条件下において該
分析物を該有限な区域の中心に適用し、未占有の結合蛋白質と結合させるために
、結合条件下において指示薬を該固体支持体に適用し:酸指示薬が該反応領域の
限定された領域内に存在する程度を観察し:そして該限定された領域に存在する
指示薬の程度を該サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることを伴うもので
ある方法を提供する。
本発明は更に、結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋
白質捕捉アッセイを実施するための方法であって、該液体サンプルが結合蛋白質
に結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が: 固体支持体上に
十分量の一次抗体を固定化し1分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるため
に該液体混合物を処理し、液体混合物を形成するために結合条件下において結合
蛋白質と遊離の分析物とを合わせ、結合条件下において該液体混合物を該固体支
持体に適用し;該固体支持体に結合した結合蛋白質−抗体複合体の未占有の結合
部位と結合させるために結合条件下において該固体支持体に指示薬を適用し:酸
指示薬が存在する程度を観察し:酸指示薬が存在する該程度を該サンプル中の未
知の分析物の量と関係付けることを伴うものである方法を提供する。
本発明は更に、結合蛋白質に対する一次抗体によって結合蛋白質に結合する未知
量の分析物を含有する液体サンプルをの固相法を実施するための方法であって、
該方法が: 結合蛋白質に対する十分量の抗体を固定化しくここに該抗体は特定
の種又は相同種のものであり、該抗体は該特定の種又は相同種に対する抗体によ
って固体支持体上に固定されており);分析物を内因性の結合蛋白質から遊離さ
せるために該液体混合物を処理し:液体混合物を形成するために結合条件下にお
いて結合蛋白質と遊離の分析物とを合わせ;結合条件下において該液体混合物を
該固体支持体に適用し:未占有の結合蛋白質と結合させるために結合条件下にお
いて該固相に指示薬を適用し、該固相上に該指示薬が存在する程度を観察し;そ
して該指示薬が存在する程度とサンプル中の未知の分析物の量とを関係づけるこ
とを伴うものである方法を提供する。
該指示薬はまた、液体サンプルに加えてもよく、これは、各成分を同時に加える
ことによっても又は該指示薬の添加前に該分析物と抗体とを短時間インキュベー
トさせることによっても行うことかでe tmmunoassay 123−1
45. (4版1987) (参照によりここに導入する)に記述されている。
図面の簡単な説明
図1は、QUANTAPHASE (Bio−Rad) BI2ラジオアッセイ
と本開示の812酵素結合アッセイとの比較を示す。
図2は、QUANTAPHASE(Bio−Rad)葉酸塩ラジオアッセイと本
開示の葉酸塩酵素結合アッセイとの比較を示す。
発明の詳細な説明
本発明の結合蛋白質捕捉アッセイは、特異的な結合蛋白質、及び抗結合蛋白質抗
体との組合せを伴う。該結合蛋白質に対する抗体を、ここに「−次抗体」という
。ここに記述の該抗結合蛋白質抗体は、分析物の結合に必要でない該結合蛋白質
の部位を認識し、従って、該結合蛋白質又は該結合蛋白質分析物複合体のいずれ
にも結合する。該抗結合蛋白質抗体は、固体表面上に該結合蛋白質を捕捉し配向
させる機能をする。
より具体的には、本発明は、二次抗体より作られる免疫化学的試薬を提供する。
該免疫化学的試薬は、特定の種に対する抗血清から作られることができる。該抗
血清は例えば、ヤギ抗マウス、山羊抗家兎、ヤギ抗ヒツジ、ヒツジ抗ヤギ、家兎
抗ヤギ、ロバ抗ヤギ、又はより一般的に、第2種抗第1種であることができる。
本発明の目的のため、抗血清は、ここに「二次抗体」と呼ぶことができる。該二
次抗体は、精製されていても未精製でもよい。ある具体例においては、該不活性
の多孔性媒体に対して種々の抗血清の組合せもまた適用される。
一次抗体のある系統間に存する相同性のため、−の種に対して作られた二次抗体
はまた、他の密接に関係した種とも反応するであろう。例えば、ヤギ抗マウスは
、ラットより調製された一次抗体としばしば反応する。本発明の目的にため、こ
れらの種はここに「相同種」と呼ぶ。
本発明の方法は、B12又は葉酸塩のような生理学的に活性な一部の代謝物を検
出するために、特異的な結合蛋白質及びこれらの結合蛋白質に対する抗体を使用
する。B12及び葉酸塩の血中濃度は、巨歩芽球性貧血の診断に有用である。こ
れらのアッセイの文脈において、「分析物」とは、結合蛋白質に対して高い親和
性を有する低分子量の、弱抗原性の物質を意味する。これらの分析物には、B1
2、葉酸塩、T4、T3、エストラジオール及びテストステロンが包含されるが
これらに限定されない。本アッセイはまた、特異的な結合蛋白質と関連する分析
物又はホルモンに関しても有用である。加えて、この方法を使用して酵素を測定
することが可能であろう。本発明おいて有用な他の結合蛋白質には、サイロキシ
ン結合グロブリン(TBG) 、性ホルモン結合グロブリン(SHBG) 、酵
素が包含される。加えて、結合蛋白質自体は本方法及び標識された分析物を用い
て測定できることを認識しなければならない。
固体支持体は、ガラス繊維マトリクス「タブ」、マイクロスフイア、又は試験管
等であってよい。該固体支持体は、抗体、又はアビジン接合抗体(ここでは該固
相はビオチンを含有する)若しくはレクチンに接合した抗体(ここでは該固相は
糖を含有する)のような修飾された抗体を選択的に保持する、プロティンA又は
プロティンGのような、試薬を含んでいてよい。該固体支持体は、結合蛋白質に
対する抗体、結合蛋白質及び当該種または相同種に対する抗体によって固体支持
体に取り付けられた特定の種の結合蛋白質抗体、又は当該種又は相同種に対する
抗体によって該固体支持体に取り付けられた特定種の抗体に結合した結合蛋白質
を含むことができる。
好ましくは、該固体支持体は、ヤギ抗マウスIgG/Fc (Gam/Fc)又
はヤギ抗マウスIgG/Fc、結合蛋白質及び該結合蛋白質に対するモノクロー
ナル抗体で被覆される。加えて、酵素を測定することが可能である。この方法に
おいては、該固相上に該酵素を固定化するために抗酵素抗体(それは活性部位に
対し末梢に結合する)を使用することができ、固定化された酵素の量は特定の基
質を加えることによって定量できよう。
本アッセイの第1段階は、分析物を遊離させ内因性の結合蛋白質を破壊するため
に、サンプルを変性させることを伴う。該サンプルは、分析物を遊離させるため
に、水酸化ナトリウム処理、煮沸、力オトロフィック(chaotrophic
)な試薬(尿素、チオシアン酸カリウム、グアニジン、過塩素酸塩)、特異的阻
害剤(8−アニリノ−■−ナフタリソースルホン酸又はジヒドロテストステロン
)で処理することにより、及びpHによって、サンプルを変性させることができ
る。分析物が一旦内因性の結合蛋白質から遊離されると、該変性されたサンプル
は、外因性の結合蛋白質の非結合性配列に対する抗体及び外因性結合蛋白質を含
有する溶液と組み合わされる。液中の拡散が唯一の律速段階であることから、こ
の混合物中においては分析物の結合は改善される。
この液体混合物は、当該タブに吸収されたヤギ抗マウス[gG/Fcを有するガ
ラス繊維紙(「タブ」)よりなる固体支持体に加えられる。結合蛋白質抗体複合
体は、該固体支持体上に吸収されたヒツジ抗マウスIgG/Fc抗体によって固
定化される。
本発明の文脈において術語「指示薬」は、標識された接合体を意味する。該接合
体は、アッセイ方式に応じて、抗体又は分析物である。標識は、蛍光的、酵素的
、若しくは比色的な、該接合体と直接又は間接に結合する化合物である。該標識
は、基質と接触したとき蛍光を生ずる酵素化合物よりなるものであってよい。固
体支持体上に該指示薬が存在する程度は、該サンプル中の未知量の分析物と関係
づけることができる。
実施例1−812のアッセイ
タブの調製= 3%(v / v )のGam/Fc及び50 mmol/Lの
トリスを含有するpH8,0の溶液を、GF/Fガラス繊維紙に適用し、そして
乾燥させた。
酵素標識接合体の調製: 100mmolルのガラクトース及びO11%v /
vのZQNYL FSN (Du Pontによる界面活性剤)を含有する5
0mmolルのトリスマレイン酸緩衝液(pH7,2)中において、酸加水分解
B12をスクシンイミジルエステル結合を介して哺乳類のアルカリ性フォスファ
ターゼと結合させた。
アッセイ較正標準の調製二 本アッセイのための較正標準は、5%(w/v)B
12不含ヒト血清アルブミンを含有する1 0 mmol/Lリン酸緩衝液(p
H7,2)にB12を加えることによって調製した。較正標準セットの最終濃度
は0,100.200.400.500及び2000 pg B12/mLであ
った。
阻害剤の調製二 本アッセイのための阻害剤は、150 mmol/Lの塩化ナ
トリウム及び1.2μmol凡のコビナミドジシアニドを含有する、50 mm
olルホウ砂(pH9,2)であった。
抽出剤の調製: 本アッセイのための抽出剤は、12%(V / V)のエタノ
ール及び1 mmol凡のシアン化カリウムを含有する500 mmolルの水
酸化ナトリウムである。
中和剤の調製二0.2%(W/V)のB12不含ヒト血清アルブミン及び0.
5%(v / v ) Bri j−30を含有するILの50 mmol/L
ホウ砂緩衝液(’pH9,2)中において、4001Uの内因子を6mgのマウ
ス抗内因子抗体と混合した。
基質洗浄溶液の調製: 蛍光原性アルカリ性フォスファターゼ基質は、IL当た
り3 mmolの酢酸マグネシウム及びl mmolの硫酸亜鉛を含有する、1
mol/L(pH9,0)のジェタノールアミン緩衝液中の1 mmol凡の
4−メチルウンベリフェリルホスフェートよりなる。10 mmol凡のレバミ
ゾールが、残りの血清アルカリ性フォスファターゼ活性を阻害するために加えら
れた。
アッセイ手順: アッセイに先立ち、60μLの各較正標準、対照及び臨床標本
が、20μLの阻害剤及び50μLの抽出剤で逐次的に希釈された。短いインキ
ュベーションの後、200μLの中和剤が各希釈サンプルに加えられ、サンプル
中の812は該中和剤中に含有される内因子/杭内因子に結合する。次いで、固
体支持体、固定化CAM/Fcを含有するガラス繊維タブが、固定された負荷ス
テーションにおいて5TRATUS @ (Baxter Diagnosti
cs、 [nc、)分析器中に導入される。間欠的駆動システムが最上タブを加
熱されたコンベア上に押しやり、これは該タブを4つの異なるステーションへと
移動させる。ステーションNo、 lにおいては、希釈されたサンプルがタブに
加えられる。内因子/杭内因子複合体(結合したB12を有し又は有しない)は
、固定化CAM/Fcに結合させられる。この反応の後、タブはステーションN
O12へと移動される。ここで、接合体がタブに加えられる。該接合体は、未占
有の内因子結合部位に結合する。この反応の間、タブはステーションN003に
輸送される。接合体の結合が完了したとき、過剰の基質洗浄液がタブに加えられ
る。未結合の接合体及びサンプル構成成分が放射状溶出によって除去され、酵素
活性が開始される。米国特許第4.517.288.4.752.562.4.
774.174及び4.786.606を参照(参照によりここに導入する)。
タブは、ステーションNo、 4へ移動されそこで測定が行われる。QUANT
APHASE (Bio−Rad)と本発明との812法の比較の結果を、図1
に示す。
実施例11−葉酸のアッセイ
タブの調製: 26μLのGAM/Fc、45μgの葉酸結合蛋白質、500μ
gのマウス抗葉酸塩結合蛋白質及び25mLのマウス血清が、s o mmol
ルの塩化ナトリウム及びO,1%(v/v)のZONYL FSN (DuPo
nt)を含有する5 0 mmolルのトリス(pH8,0)IL中において混
合された。
酵素標識された接合体の調製二 葉酸は、0.3%(w/v)の葉酸不含牛血清
アルブミン、2 mmolルのMgC1及び0.2mm。
l凡の硫酸亜鉛を含有する5 0 mmolルのトリス(pH7,1)中におい
て、スクシンイミジルエステル結合を介して哺乳類のアルカリ性ホスファーター
ゼに結合された。
アッセイ較正標準の調製: 本アッセイのための較正標準は、5.5%(W/V
)の葉酸不含牛血清アルブミン、150 mmol凡の塩化ナトリウム、o、i
%(v / v )のBr1j−35及び0.35%(v / v )のFSN
を含有する5 0 mmol凡のリン酸緩衝液(pH7゜2)に葉酸を加えるこ
とによって調製された。較正標準セットの最終濃度は、0.1.2.4.8及び
15%g葉酸/mLとした。
還元剤の調製: 本アッセイのための還元剤は、1.50 mmol、/Lの塩
化ナトリウム、2 mmol/LのEDTA、 40 mmolルのジチオスレ
イトール(DTT) 及び275 mmol凡のマンニトールを含有する1、0
mmol凡のリン酸ナトリウム(pH6,5)である。
抽出剤の調製二 本アッセイのための抽出剤は、25%(V / V)のエタノ
ールを含有する1、Ommolルの水酸化ナトリウムであ中和剤の調製・ 本ア
ッセイのための中和剤は、50mmolルホウ砂(pH9,0)である。
基質洗浄溶液の調製 蛍光原性のアルカリ性ホスファターゼ基質は、IL当たり
3 mmolルの酢酸マグネシウム及び1 mmolルの硫酸亜鉛を含有する、
1 mmol/L (pH9,O)のジェタノールアミン緩衝液中の1 mmo
l凡の4−メチルウンベリフェリルホスフェートよりなる。残存する血清アルカ
リ性ホスファターゼ活性を阻害するために、10 mmol凡のレバミゾールが
加えられた。
アッセイ手順: アッセイに先立ち、各50μLの較正標準、対照及び臨床標本
が、20μLの還元剤で希釈された。短いインキュベーションの後、20μLの
抽出剤が混合物に加えられた。第2のインキュベーションの後、200μLの中
和剤が各希釈サンプルに加えられた。次いて、固定化されたヤギ抗マウス/ F
c /抗葉酸塩結合蛋白質抗体/葉酸塩結合蛋白質を含有するタブが、固定さ
れた負荷ステーションにおいて5TRATUS @ (Baxter Diag
nostics、[nc。
)分析器内に導入された。間欠的駆動システムが、最上タブを加熱されたコンベ
ア上へと押しやり、これは該タブを4つの異なるステーションへと移動させる。
ステーションNo、 1においては、タブにサンプルが加えられる。サンプル中
の葉酸塩は、固定化された葉酸塩結合蛋白質に結合させられる。次いて、タブは
ステーションNO32に移動される。ここにおいて、接合体がタブに加えられる
。接合体は、未占有の結合蛋白質結合部位に結合する。この反応の間、タブはス
テーションN013へ輸送される。接合体の結合が完了したとき、過剰の基質洗
浄液がタブに加えられる。未結合の接合体及びサンプル成分は、放射状溶出によ
って除去され、酵素活動が開始される。タブは、ステーションN004へと移動
され、そこで測定が行われる。
QUANTAPHASE (Bio−Rad)と本発明との葉酸塩法との比較結
果を、図2に示す。
本発明は、主として特定の且つ好ましい具体例との関連において記述されたか、
本発明の範囲から外れることなく修正が可能であることは理解されるであろう。
以下の請求の範囲は、一般的に本発明の原理に従う本発明の全ての変形、用途、
又は適合を包含し、且つ、本発明の関係する分野の既知の又は慣用の手法内に入
るような又は該分野の当業者に明らかであるような本開示からの逸脱を含むこと
が意図されている。
Fig、 1
0 200 400 600 11G0100012001400160018
002000Fig、 2
国際調査報告 +11”T/IIc O)/++フ轟1フロントページの続き
(72)発明者 モンティチェロ、ジエイムス、イーアメリカ合衆国33157
フロリダ、マイアミ、サウスウエスト88アベニュー 15815(72)発明
者 スミス、デニス、イーアメリカ合衆国95148カリフォルニア、サンホセ
、フィンビーロード 3739
Claims (31)
- 1.当該結合蛋白質に結合する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質 捕捉アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に 結合する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が: a)前記分析物を内因性の待合蛋白質から遊離させるために前記液体サンプルを 処理し、 b)分析物一結合蛋白質−一次抗体複合体及び結合蛋白質−一次抗体複合体の混 合物を形成するために結合条件下において遊離の分析物と、前記一次抗体と、そ して前記結合蛋白質とを合わせ、c)前記複合体を選択的に保持する固体支持体 に結合条件下において前記液体混合物を適用し、 d)前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一次抗体複合体の未占有の結合部 位と結合させるために結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、 e)該指示薬が前記固体支持体上に存在する程度を観察し、f)前記指示薬が存 在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるも のである方法。
- 2.前記分析物がB12でありそして前記結合蛋白質が内因子である、請求項1 に記載の方法。
- 3.前記分析物が葉酸塩でありそして前記結合蛋白質が棄酸塩結合蛋白質である 、請求項1に記載の方法。
- 4.前記固体支持体が、プロテインA、プロテインG、ビオチン、アビジン、レ クチン及び糖又は二次抗体よりなる群より選ばれる、抗体、修飾された抗体を選 択的に保持する試薬を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 5.結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉ア ッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に緒合す る未知量の分析物を含有するものであり、該方法が: a)前記一次抗体又は修飾された一次抗体を選択的に保持する第1の試薬及び前 記一次抗体の十分量を固定化し、b)前記分析物を内因性の結合蛋白質から遊離 させるために前記液体サンプルを処理し、 c)分析物一結合蛋白質複合体と遊離の結合蛋白質との混合物を形成するために 結合条件下において遊離の分析物と前記結合蛋白質とを合わせ、 d)前記複合体及び遊離の結合蛋白質を選択的に保持する前記固体支持体に、結 合条件下において前記液体混合物を適用し、e)前記固体支持体に結合した前記 結合蛋白質の未占有の結合部位と結合させるために結合条件下において指示薬を 前記固体支持体に適用し、 f)前記指示薬が前記固相上に存在する程度を観察し、g)前記結合した指示薬 が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりな るものである方法。
- 6.前記分析物がB12であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項5に記載 の方法。
- 7.前記分析物が葉酸塩であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求 項5に記載の方法。
- 8.前記固体支持体がプロテインA、プロテインG、ビオチン、アビジン、レク チン又は糖よりなる群より選ばれる試薬を含むものである、請求項5に記載の方 法。
- 9.結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉ア ッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合す る未知量の分析物を含有するものであり、該方法が: a)固体支持体上に当該積又は相同種からの抗体を結合させるために特定の動物 種に対する抗体の十分量を固定化し、b)分析物を内因性の結合蛋白質から遊離 させるために前記液体混合物を処理し、 c)分析物一結合蛋白質−一次抗体複合体及び結合蛋白質−一次抗体複合体を形 成するために、結合条件下において遊離の分析物と、前記結合蛋白質と、そして 前記特定の動物種の一次抗体とを合わせ、 d)結合条件下において前記液体混合物を前記固体支持体に適用し、 e)前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一抗体複合体の未占有の結合部位 と結合させるために結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、 f)該指示薬が前記固相上に存在する程度を観察し、g)前記指示薬が存在する 該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものであ る方法。
- 10.前記分析物がB12であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項9に記 載の方法。
- 11.前記分析物が葉酸塩であり前記結合蛋白質が棄酸塩結合蛋白質である、請 求項9に記載の方法。
- 12.固体の、不活性な多孔性媒体内において、結合蛋白質に対する一次抗体に よって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であっ て、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するもので あり、該方法が:a)前記マトリクスの隙間の有限な区域内に当該種又は相同種 からの抗体を結合させるために特定の動物種に対する抗体の十分量を固定化し、 b)分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体混合物を処理し 、 c)分析物一結合蛋白質−一次抗体複合体及び結合蛋白質−一次抗体複合体を形 成するために、結合条件下において遊離の分析物と、前記特定の動物種の一次抗 体と、そして前記結合蛋白質とを合わせ、 d)前記複合体を特定種に対する前記固定化された抗体に結合させるために、結 合条件下において前記有限な区域の中心に前記液体混合物を適用し、 e)前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一抗体複合体の未占有の結合部位 と結合させるために、結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、 f)該指示薬が前記反応区域の限定された領域内に存在する程度を観察し、 g)前記結合した指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量 と関係づけることよりなるものである方法。
- 13.前記分析物がB12であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項12に 記載の方法。
- 14.前記分析物が葉酸塩であり前記結合蛋白質が秦酸塩結合蛋白質である、請 求項12に記載の方法。
- 15.前記固体支持体が固定化されたヤギ抗マウスlgG/Fcを有するガラス 繊維マトリクスよりなるものである、請求項12に記載の方法。
- 16.結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉 アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合 する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が: a)固体支持体に結合した一次抗体によって十分量の結合蛋白質を固定化し、 b)分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液体サンプルを処理 し、 c)結合条件下において遊離の分析物を前記固体支持体に適用し、 d)前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一抗体複合体の未占有の結合部位 と結合させるために、結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、 e)該指示薬が存在する程度を観察し、f)前記指示薬が存在する程度を前記サ ンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
- 17.前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求 項16に記載の方法。
- 18.前記分析物がB12であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項16に 記載の方法。
- 19.固体の、不活性な多孔性媒体内において、結合蛋白質に対する一次抗体に よって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉アッセイを実施するための方法であっ て、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合する未知量の分析物を含有するもので あり、該方法が:a)一定量の結合蛋白質を該結合蛋白質に対する抗体によって 固定化し、(ここに前記抗体は特定種又は相同種のものであり、前記抗体は前記 媒体の隙間の有限な区域内に固定された該種又は相同種に対する抗体によって結 合されている)、b)分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるために前記液 体混合物を処理し、 c)前記結合蛋白質を結合するために結合条件下において前記分析物を前記有限 な区域の中心に適用し、d)未占有の待合蛋白質と結合させるために、結合条件 下において指示薬を前記固体支持体に適用し、e)該指示薬が前記反応区域の限 定された領域内に存在する程度を観察し、そして f)前記指示薬が前記限定された領域内に存在する該程度を前記サンプル中の未 知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
- 20.前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求 項19に記載の方法。
- 21.前記分析物がB12であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項19に 記載の方法。
- 22.前記固体支持体が、ガラス繊維マトリクスに取り付けられたヤギ抗マウス lgG/Fcに結合されたマウス抗葉酸塩結合蛋白質に結合された棄酸塩結合蛋 白質よりなるものである、請求項19に記載の方法。
- 23.結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉 アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合 する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が: a)固体支持体上に一次抗体の十分量を固定化し、b)分析物を内因性の結合蛋 白質から遊離させるために前記液体混合物を処理し、 c)液体混合物を形成するために結合条件下において結合蛋白質及び遊離の分析 物を合わせ、 d)結合条件下において前記液体混合物を前記固体支持体に適用し、 e)前記固体支持体に結合した前記結合蛋白質一抗体複合体の未占有の結合部位 と結合させるために、結合条件下において指示薬を前記固体支持体に適用し、 f)該指示薬が存在する程度を観察し、g)前記指示薬が存在する該程度を前記 サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものである方法。
- 24.前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求 項23に記載の方法。
- 25.前記分析物がB12であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項23に 記載の方法。
- 26.結合蛋白質に対する一次抗体によって結合蛋白質に結合する未知量の分析 物を含有する液体サンプルの固相を実施するための方法であって、該方法が: a)結合蛋白質に対する十分量の抗体を固定化し(ここに前記抗体は特定の種又 は相同種のものであり、前記抗体は該種又は相同種に対する抗体によって固体支 持体上に結合されている)、b)分析物を内因性の結合蛋白質から遊離させるた めに前記液体混合物を処理し、 c)液体混合物を形成するために結合蛋白質と遊離の分析物とを結合条件下にお いて合わせ、 d)結合条件下において前記液体混合物を前記固体支持体に適用し、 e)未占有の結合蛋白質と結合させるために結合条件下において指示薬を前記固 相に適用し、 f)前記指示薬が前記固体支持体上に存在する程度を観察し、そして g)前記指示薬が存在する該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づ けることよりなるものである方法。
- 27.前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求 項26に記載の方法。
- 28.前記分析物がB12であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項26に 記載の方法。
- 29.前記固体支持体が、ガラス繊維マトリクスに取り付けられたヤギ抗マウス lgG/Fcに結合されたマウス抗葉酸塩結合蛋白質に緒合された葉酸塩結合蛋 白質よりなるものである、請求項26に記載の方法。
- 30.結合蛋白質に対する一次抗体によって液体サンプルの固相結合蛋白質捕捉 アッセイを実施するための方法であって、前記液体サンプルが結合蛋白質に結合 する未知量の分析物を含有するものであり、該方法が: a)固体支持体上に当該種又は相同種からの抗体を結合させるために、特定の動 物種に対する十分量の抗体を固定化し、b)分析物を内因性の結合蛋白質から遊 離させるために前記液体混合物を処理し、 c)結合蛋白質−一次抗体複合体及び指示薬一結合蛋白質−一次抗体複合体の混 合物を形成するために、結合条件下において遊離の分析物と、前記結合蛋白質と 、そして前記特定動物種の一次抗体とそして前記結合蛋白質を結合させるための 指示薬とを合わせ、d)結合条件下において前記液体混合物を前記固体支持体に 適用し、 e)該指示薬が前記固相上に存在する程度を観察し、f)前記指示薬が存在する 該程度を前記サンプル中の未知の分析物の量と関係づけることよりなるものであ る方法。
- 31.前記分析物がB12であり前記結合蛋白質が内因子である、請求項30に 記載の方法。 32,前記分析物が葉酸であり前記結合蛋白質が葉酸塩結合蛋白質である、請求 項30に記載の方法。
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