JP3348250B2 - 遊離種アナライト検定 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の分野】本発明は生物学的流体中の遊離アナライ
ト（ｆｒｅｅ ａｎａｌｙｔｅｓ）の直接測定のための
免疫検定技術、特に、試料中に存在する過剰の結合アナ
ライトと結合されていない天然受容体（ｎａｔｕｒａｌ
ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）とにより引起される偏りを克服
する、遊離アナライトの直接測定を達成する免疫検定技
術に関する。
ト（ｆｒｅｅ ａｎａｌｙｔｅｓ）の直接測定のための
免疫検定技術、特に、試料中に存在する過剰の結合アナ
ライトと結合されていない天然受容体（ｎａｔｕｒａｌ
ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）とにより引起される偏りを克服
する、遊離アナライトの直接測定を達成する免疫検定技
術に関する。
【０００２】
【先行技術の説明】本発明の目的には、遊離アナライト
とはそのアナライトと、その試料中に天然に存在する１
つまたはそれ以上の特異的な結合受容体との間に結合平
衡が存在する生物学的試料中の結合されていないアナラ
イトの部分である。通常アナライトはその受容体にしっ
かりとそして可逆的に結合され、その結合アナライト部
分は結合平衡における遊離アナライト部分より有意に過
剰である。
とはそのアナライトと、その試料中に天然に存在する１
つまたはそれ以上の特異的な結合受容体との間に結合平
衡が存在する生物学的試料中の結合されていないアナラ
イトの部分である。通常アナライトはその受容体にしっ
かりとそして可逆的に結合され、その結合アナライト部
分は結合平衡における遊離アナライト部分より有意に過
剰である。
【０００３】生物学的流体例えば血液または血清中に循
環する、多くの生理学的に活性な物質と不活性な物質と
は特異的な蛋白質担体あるいはその流体中に天然に存在
する他の受容体にしっかりとそして可逆的に結合されて
いる。これらの物質は例えばホルモンとステロイドと薬
物と薬物代謝産物と蛋白質とポリペプチドとビタミンと
毒素とアルカロイドとの群に属していてもよい。その流
体中ではその物質とその受容体との間に結合平衡状態が
存在していて、それが結合部分と結合されていない、即
ち遊離部分とにある物質の分布になる。
環する、多くの生理学的に活性な物質と不活性な物質と
は特異的な蛋白質担体あるいはその流体中に天然に存在
する他の受容体にしっかりとそして可逆的に結合されて
いる。これらの物質は例えばホルモンとステロイドと薬
物と薬物代謝産物と蛋白質とポリペプチドとビタミンと
毒素とアルカロイドとの群に属していてもよい。その流
体中ではその物質とその受容体との間に結合平衡状態が
存在していて、それが結合部分と結合されていない、即
ち遊離部分とにある物質の分布になる。
【０００４】大部分の生理学的に活性な物質について
は、遊離部分がその物質に伴われている生理学的応答の
制御に関与していることが知られている。組織による、
遊離の循環している物質の消費をもたらす代謝活動の
間、その遊離の物質の濃度はこの平衡機構により一定に
維持される。従って、生物学的試料中の遊離アナライト
の測定は、遊離部分と結合部分とを含む全アナライトの
測定より臨床的にはしばしばより有意義である。
は、遊離部分がその物質に伴われている生理学的応答の
制御に関与していることが知られている。組織による、
遊離の循環している物質の消費をもたらす代謝活動の
間、その遊離の物質の濃度はこの平衡機構により一定に
維持される。従って、生物学的試料中の遊離アナライト
の測定は、遊離部分と結合部分とを含む全アナライトの
測定より臨床的にはしばしばより有意義である。
【０００５】特異的な試料は甲状腺疾病診断の分野から
与えられるかもしれない。甲状腺ホルモンとチロキシン
（Ｔ４）とトリ−ヨードチロニン（Ｔ３）とは３つの主
要な結合蛋白質、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）
とチロキシン結合プリアルブミン（ＴＢＰＡ）とアルブ
ミン（Ａｌｂ）と結合されて血液中を循環している。Ｔ
４、Ｔ３の何れかの結合部分は全ホルモンの９９．５％
より多く、通常遊離部分は０．０５％あるいは０．３％
より小さい。この場合、遊離のホルモンの測定は全ホル
モンの測定とは全く異る情報を提供することになること
は明らかである。
与えられるかもしれない。甲状腺ホルモンとチロキシン
（Ｔ４）とトリ−ヨードチロニン（Ｔ３）とは３つの主
要な結合蛋白質、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）
とチロキシン結合プリアルブミン（ＴＢＰＡ）とアルブ
ミン（Ａｌｂ）と結合されて血液中を循環している。Ｔ
４、Ｔ３の何れかの結合部分は全ホルモンの９９．５％
より多く、通常遊離部分は０．０５％あるいは０．３％
より小さい。この場合、遊離のホルモンの測定は全ホル
モンの測定とは全く異る情報を提供することになること
は明らかである。
【０００６】甲状腺疾病状態の本性と、しばしばその悪
さとは全体の、あるいは蛋白質結合チロイドホルモン濃
度よりも、遊離チロイドホルモン濃度に一層相関するこ
とはよく知られている。その上、或る他の状態における
チロイド状態の評価は遊離チロイドホルモン水準を用い
ると臨床的に一層有効である。そのような状態の例は全
チロイドホルモンおよび／または結合蛋白質の水準の変
化になるかもしれない妊娠またはエストロゲン療法であ
る。
さとは全体の、あるいは蛋白質結合チロイドホルモン濃
度よりも、遊離チロイドホルモン濃度に一層相関するこ
とはよく知られている。その上、或る他の状態における
チロイド状態の評価は遊離チロイドホルモン水準を用い
ると臨床的に一層有効である。そのような状態の例は全
チロイドホルモンおよび／または結合蛋白質の水準の変
化になるかもしれない妊娠またはエストロゲン療法であ
る。
【０００７】生物学的試料例えば血液、血漿または血清
中のアナライトの全濃度の測定には、競合アナライト結
合法、特に競合結合免疫検定が用いられている。これら
の方法は免疫反応種例えばそのアナライトに対する抗体
および交差反応アナライト抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓ）を適用し測定を可能にしている。或る場合には、試
料中の内因性受容体からアナライトの完全な解放をもた
らすため、特殊な最適化即ち解放剤の添加を必要とす
る。それに比較して、遊離アナライト測定のための免疫
検定法は過剰の結合アナライトおよび結合されていない
内因性受容体の、免疫検定で添加された免疫反応性種と
の相互作用によりしばしば生ずる偏りを避けるために設
計されている。
中のアナライトの全濃度の測定には、競合アナライト結
合法、特に競合結合免疫検定が用いられている。これら
の方法は免疫反応種例えばそのアナライトに対する抗体
および交差反応アナライト抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓ）を適用し測定を可能にしている。或る場合には、試
料中の内因性受容体からアナライトの完全な解放をもた
らすため、特殊な最適化即ち解放剤の添加を必要とす
る。それに比較して、遊離アナライト測定のための免疫
検定法は過剰の結合アナライトおよび結合されていない
内因性受容体の、免疫検定で添加された免疫反応性種と
の相互作用によりしばしば生ずる偏りを避けるために設
計されている。
【０００８】臨床的試料中に遊離の形および結合の形で
存在する物質例えばチロキシンとトリ−ヨードチロニン
との遊離種の検定を公開している多くの特許が発表され
た。
存在する物質例えばチロキシンとトリ−ヨードチロニン
との遊離種の検定を公開している多くの特許が発表され
た。
【０００９】Ｍｉｄｇｌｅｙ等の米国特許第４，３６
６，１４３号は遊離アナライト例えばチロキシン（Ｔ
４）濃度測定のための１段免疫検定法を公開している。
試料はリガンドまたはアナライトの標識されている誘導
体および特異的受容体例えば抗体の既知量と同時に一緒
にされる。培養後受容体を分離し、遊離アナライト濃度
をその受容体と結合するようになる標識されたアナライ
ト量に関連づける。
６，１４３号は遊離アナライト例えばチロキシン（Ｔ
４）濃度測定のための１段免疫検定法を公開している。
試料はリガンドまたはアナライトの標識されている誘導
体および特異的受容体例えば抗体の既知量と同時に一緒
にされる。培養後受容体を分離し、遊離アナライト濃度
をその受容体と結合するようになる標識されたアナライ
ト量に関連づける。
【００１０】そのアナライトの標識された誘導体は添加
される特異的受容体により結合でき、試料中の天然に存
在する受容体とは実質的に非反応性であることが要求さ
れる。この標識された誘導体は、添加される特異的受容
体とは結合できる能力を維持し乍ら内因性受容体とは実
質的に非反応的であるように、アナライトと標識部分と
の間に遮断ブリッジを設けることにより化学的に改質さ
れている。
される特異的受容体により結合でき、試料中の天然に存
在する受容体とは実質的に非反応性であることが要求さ
れる。この標識された誘導体は、添加される特異的受容
体とは結合できる能力を維持し乍ら内因性受容体とは実
質的に非反応的であるように、アナライトと標識部分と
の間に遮断ブリッジを設けることにより化学的に改質さ
れている。
【００１１】Ｐａｒｓｏｎｓの米国特許第４，２９２，
２９６号は遊離アナライト濃度測定のための２段免疫検
定法を公開している。その第１段階で、試料はそのアナ
ライト用の特異的受容体例えば試験管内側に被覆した抗
体と接触させる。その抗体は検定中高い親和恒数と低い
結合飽和量とを持つよう選択される。第１培養期間後、
試料含有液体を除去し、捨て、試験管を洗浄する。第２
段階において、アナライトの標識された誘導体あるいは
そのアナライトの標識された類似体を、洗浄された、被
覆されている試験管に添加し、試験管中に残存する固定
受容体と結合させる。第２培養期間後、液相を分離し、
遊離アナライト濃度を被覆された試験管あるいは除去し
た液体何れかに結合している標識された誘導体量と関連
づける。
２９６号は遊離アナライト濃度測定のための２段免疫検
定法を公開している。その第１段階で、試料はそのアナ
ライト用の特異的受容体例えば試験管内側に被覆した抗
体と接触させる。その抗体は検定中高い親和恒数と低い
結合飽和量とを持つよう選択される。第１培養期間後、
試料含有液体を除去し、捨て、試験管を洗浄する。第２
段階において、アナライトの標識された誘導体あるいは
そのアナライトの標識された類似体を、洗浄された、被
覆されている試験管に添加し、試験管中に残存する固定
受容体と結合させる。第２培養期間後、液相を分離し、
遊離アナライト濃度を被覆された試験管あるいは除去し
た液体何れかに結合している標識された誘導体量と関連
づける。
【００１２】Ｐｅａｒｌｍａｎの米国特許第４，３９
１，７９５号は血清試料中の遊離チロキシン測定のため
の２段免疫検定法を公開している。第１段階において、
血清試料を固定受容体、好ましくは試験管上に被覆され
ている抗チロキシン抗体と接触させて遊離チロキシンホ
ルモンを結合する。第１培養期間後、試料を除去し、標
識したチロキシンホルモン、好ましくは放射標識された
チロキシンホルモンを添加して残存する未結合の受容体
と結合させる。標識したチロキシンホルモンを被覆され
た結合剤の過剰の残存結合点より過剰に添加する。第２
培養期間後、液相を分離し、試料中の遊離チロキシンホ
ルモン濃度を、被覆された試験管中に存在するか、ある
いは分離した液相中に存在するいずれかの標識されたチ
ロキシンホルモン量に関係づける。
１，７９５号は血清試料中の遊離チロキシン測定のため
の２段免疫検定法を公開している。第１段階において、
血清試料を固定受容体、好ましくは試験管上に被覆され
ている抗チロキシン抗体と接触させて遊離チロキシンホ
ルモンを結合する。第１培養期間後、試料を除去し、標
識したチロキシンホルモン、好ましくは放射標識された
チロキシンホルモンを添加して残存する未結合の受容体
と結合させる。標識したチロキシンホルモンを被覆され
た結合剤の過剰の残存結合点より過剰に添加する。第２
培養期間後、液相を分離し、試料中の遊離チロキシンホ
ルモン濃度を、被覆された試験管中に存在するか、ある
いは分離した液相中に存在するいずれかの標識されたチ
ロキシンホルモン量に関係づける。
【００１３】Ｈｅｒｔｌｅ等の米国特許第４，４１０，
６３３号は液体試料中の遊離チロキシンまたはトリ−ヨ
ードチロキシン測定のための１段免疫検定法を公開して
いる。この１段免疫検定法は米国特許第４，３６６，１
４３号で記載されているＭｉｄｇｌｅｙ法と類似してい
る。この方法は受容体として固体相上に固定された抗チ
ロキシン抗体を用いる。標識したチロキシン誘導体は、
試料中に存在するチロキシン結合グロブリンまたはチロ
キシン結合プリアルブミンとは有意には相互作用しない
チロキシン結合ワサビペルオキシダーゼである。ワサビ
ペルオキシダーゼ標識の酵素活性を測定する。
６３３号は液体試料中の遊離チロキシンまたはトリ−ヨ
ードチロキシン測定のための１段免疫検定法を公開して
いる。この１段免疫検定法は米国特許第４，３６６，１
４３号で記載されているＭｉｄｇｌｅｙ法と類似してい
る。この方法は受容体として固体相上に固定された抗チ
ロキシン抗体を用いる。標識したチロキシン誘導体は、
試料中に存在するチロキシン結合グロブリンまたはチロ
キシン結合プリアルブミンとは有意には相互作用しない
チロキシン結合ワサビペルオキシダーゼである。ワサビ
ペルオキシダーゼ標識の酵素活性を測定する。
【００１４】一般に、チロキシン酵素抱合体を包含する
ハプテン−酵素抱合体は先行技術でよく知られている。
これらの抱合体を利用する特異的酵素免疫検定法は生物
学的試料中の全アナライト濃度の数量化に適用される。
例えば、米国特許第３，８３９，１５３と３，８５０，
７５２と３，８７９，２６２と４，０４０，９０７号と
を見よ。
ハプテン−酵素抱合体は先行技術でよく知られている。
これらの抱合体を利用する特異的酵素免疫検定法は生物
学的試料中の全アナライト濃度の数量化に適用される。
例えば、米国特許第３，８３９，１５３と３，８５０，
７５２と３，８７９，２６２と４，０４０，９０７号と
を見よ。
【００１５】しかし、これらの特許中と共に競合免疫検
定に関する一般的文献中において、これらの方法が遊離
ハプテン濃度並に確に遊離でないチロキシンの測定に適
していると云うことの示唆も開示もない。
定に関する一般的文献中において、これらの方法が遊離
ハプテン濃度並に確に遊離でないチロキシンの測定に適
していると云うことの示唆も開示もない。
【００１６】
【本発明の要約】本発明は免疫検定の間に、試料中の天
然に存在する結合蛋白質による、抱合体の妨害結合を除
去するため、洗浄段階あるいは特別な遮断抱合体ブリッ
ジ化学の使用の何れも必要としない、遊離アナライト濃
度の直接測定のための免疫検定法を提供する。驚くべき
ことに、我我は、管理された時間に、管理された濃度で
規則的に順次に検定試薬を添加することにより、予期さ
れる妨害結合が実質的に減少あるいは除去されてもよい
ことを発見した。
然に存在する結合蛋白質による、抱合体の妨害結合を除
去するため、洗浄段階あるいは特別な遮断抱合体ブリッ
ジ化学の使用の何れも必要としない、遊離アナライト濃
度の直接測定のための免疫検定法を提供する。驚くべき
ことに、我我は、管理された時間に、管理された濃度で
規則的に順次に検定試薬を添加することにより、予期さ
れる妨害結合が実質的に減少あるいは除去されてもよい
ことを発見した。
【００１７】本方法は天然に存在する受容体と結合平衡
にある、遊離および結合の部分のアナライトを含有する
生物学的流体試料中の遊離アナライト濃度例えば遊離チ
ロキシンの測定に用いることができる。この本法は
（ａ）試料を試料中の遊離アナライトより過剰に、可溶
性抗アナライト受容体を含有する既知の第１液体量と一
緒にし、（ｂ）その得られた混合物を遊離アナライトと
抗アナライト受容体との結合反応が実質的完結に到達さ
れるに充分な時間培養して第１培養混合物を形成し
（ｃ）その段階（ｂ）の培養混合物に、段階（ｂ）で結
合されなかった抗アナライト受容体と抱合体とが結合で
きるよう標識されたアナライトまたは標識されたその類
似体を包含する可溶性抱合体を含有する既知の第２液体
量を、得られる混合物中の試料部分が１０ｖ／ｖ％より
大きくない程に低下させるに充分な程添加して第２培養
混合物を形成し、（ｄ）その段階（ｃ）の第２培養混合
物に、その培養混合物中の凡ての抗アナライト受容体と
実質的に結合するため、その抗アナライト受容体より過
剰に存在する第１の受容体のための固定化結合剤により
被覆された固体相を包含する分離手段を導入し、（ｅ）
段階（ｄ）の混合物からその固体相を分離し、洗浄し、
（ｆ）段階（ｅ）の固体相に結合された前記抱合体量を
測定し、そして（ｇ）試料中の遊離アナライト濃度を決
定するためにその測定値を用いる段階を包含する。
にある、遊離および結合の部分のアナライトを含有する
生物学的流体試料中の遊離アナライト濃度例えば遊離チ
ロキシンの測定に用いることができる。この本法は
（ａ）試料を試料中の遊離アナライトより過剰に、可溶
性抗アナライト受容体を含有する既知の第１液体量と一
緒にし、（ｂ）その得られた混合物を遊離アナライトと
抗アナライト受容体との結合反応が実質的完結に到達さ
れるに充分な時間培養して第１培養混合物を形成し
（ｃ）その段階（ｂ）の培養混合物に、段階（ｂ）で結
合されなかった抗アナライト受容体と抱合体とが結合で
きるよう標識されたアナライトまたは標識されたその類
似体を包含する可溶性抱合体を含有する既知の第２液体
量を、得られる混合物中の試料部分が１０ｖ／ｖ％より
大きくない程に低下させるに充分な程添加して第２培養
混合物を形成し、（ｄ）その段階（ｃ）の第２培養混合
物に、その培養混合物中の凡ての抗アナライト受容体と
実質的に結合するため、その抗アナライト受容体より過
剰に存在する第１の受容体のための固定化結合剤により
被覆された固体相を包含する分離手段を導入し、（ｅ）
段階（ｄ）の混合物からその固体相を分離し、洗浄し、
（ｆ）段階（ｅ）の固体相に結合された前記抱合体量を
測定し、そして（ｇ）試料中の遊離アナライト濃度を決
定するためにその測定値を用いる段階を包含する。
【００１８】
【好ましい態様の説明】本方法の重要な特長は、遊離な
らびに結合アナライトの両方を含有する試料中の遊離ア
ナライト水準の測定のための免疫検定において、いかな
る免疫結合段階に先立っても試料含有混合物を除去する
必要のない、標識されたアナライト抱合体の使用であ
る。
らびに結合アナライトの両方を含有する試料中の遊離ア
ナライト水準の測定のための免疫検定において、いかな
る免疫結合段階に先立っても試料含有混合物を除去する
必要のない、標識されたアナライト抱合体の使用であ
る。
【００１９】他の重要な特長は試薬添加の逐次順序であ
る。抱合体の遅れた添加は、受容体とリガンドとの間の
第１結合反応が減少した体積と時間とで進行することを
可能とし、効率をよくする。また、競合結合免疫検定に
おいて許される程度と比べて、試料のさらなる希釈なら
びにより濃い抱合体濃度の両方を可能にする。これらの
有利さの最終的効果は新規の方法により試料干渉の最小
化あるいは除去することである。
る。抱合体の遅れた添加は、受容体とリガンドとの間の
第１結合反応が減少した体積と時間とで進行することを
可能とし、効率をよくする。また、競合結合免疫検定に
おいて許される程度と比べて、試料のさらなる希釈なら
びにより濃い抱合体濃度の両方を可能にする。これらの
有利さの最終的効果は新規の方法により試料干渉の最小
化あるいは除去することである。
【００２０】アナライトはホルモン、生化学的メツセン
ジャー、ステロイド、薬物、薬物代謝産物、ポリペプチ
ド、蛋白質、ビタミン、アルカロイド、単糖、二糖、ま
たは多糖であり得る。好ましくはそれを甲状腺ホルモ
ン、コルチゾール、プロゲステロンまたはテストステロ
ンである。
ジャー、ステロイド、薬物、薬物代謝産物、ポリペプチ
ド、蛋白質、ビタミン、アルカロイド、単糖、二糖、ま
たは多糖であり得る。好ましくはそれを甲状腺ホルモ
ン、コルチゾール、プロゲステロンまたはテストステロ
ンである。
【００２１】特異的受容体はそのアナライトの抗体また
はそのような抗体に基く試薬であることができる。
はそのような抗体に基く試薬であることができる。
【００２２】アナライトの標識された誘導体は非同位体
通報団例えばケイ光体（ｆｌｕｏｒ）、発色体（ｃｈｒ
ｏｍｏｐｈｏｒｅ）、酵素または化学ルミネセンス体で
あり得る。アナライトがチロキシンまたはトリ−ヨード
チロニンである場合、アナライトの標識された誘導体は
好ましくは、カルボキシル基とアミノ基との一つあるい
は両方で修飾されている。
通報団例えばケイ光体（ｆｌｕｏｒ）、発色体（ｃｈｒ
ｏｍｏｐｈｏｒｅ）、酵素または化学ルミネセンス体で
あり得る。アナライトがチロキシンまたはトリ−ヨード
チロニンである場合、アナライトの標識された誘導体は
好ましくは、カルボキシル基とアミノ基との一つあるい
は両方で修飾されている。
【００２３】以下は遊離アナライトのための免疫検定に
ついての説明である。
ついての説明である。
【００２４】我我の逐次免疫検定の第１培養段階（ｂ）
においては、抗アナライト受容体例えば抗体を試料に導
入し、それと共に培養して試料中の遊離アナライトと結
合させる。その抗アナライト受容体は後でその免疫検定
を特徴づけるために導入する抱合体と結合することがで
きる。その抗アナライト受容体は、後で、固体相上の抗
−フルオレセイン抗体により結合されるために、また妨
害しないハプテン例えばフルオレセインと抱合もしてい
る。この段階で試料と共に培養される抗アナライト受容
体の量は試料中の全アナライトの０．１〜５％当量にわ
たることができる。この限定の下では培養物中の抗アナ
ライト受容体量は遊離アナライトには過剰であり、全ア
ナライトと結合あるいは、そのアナライトと試料中に天
然に依存する受容体との間に存在する平衡を有意に変え
るには不充分である。抗アナライト受容体量対試料量と
の比並に培養時間は遊離アナライトと抗アナライト受容
体との間の結合反応が実質的に完全に進行することがで
きるように選択される。例えば試料量は約２〜２０μｌ
の範囲、好ましくは５μｌであることができる。抗アナ
ライト受容体試薬量は２０〜１００μｌ、好ましくは６
５μｌであることができる。試料対試薬の比は（１：１
０）〜（１：２０）の範囲、好ましい量では１：１３ｖ
／ｖであることができる。この段階での培養時間は２〜
１２０分の範囲、好ましくは１５分である。
においては、抗アナライト受容体例えば抗体を試料に導
入し、それと共に培養して試料中の遊離アナライトと結
合させる。その抗アナライト受容体は後でその免疫検定
を特徴づけるために導入する抱合体と結合することがで
きる。その抗アナライト受容体は、後で、固体相上の抗
−フルオレセイン抗体により結合されるために、また妨
害しないハプテン例えばフルオレセインと抱合もしてい
る。この段階で試料と共に培養される抗アナライト受容
体の量は試料中の全アナライトの０．１〜５％当量にわ
たることができる。この限定の下では培養物中の抗アナ
ライト受容体量は遊離アナライトには過剰であり、全ア
ナライトと結合あるいは、そのアナライトと試料中に天
然に依存する受容体との間に存在する平衡を有意に変え
るには不充分である。抗アナライト受容体量対試料量と
の比並に培養時間は遊離アナライトと抗アナライト受容
体との間の結合反応が実質的に完全に進行することがで
きるように選択される。例えば試料量は約２〜２０μｌ
の範囲、好ましくは５μｌであることができる。抗アナ
ライト受容体試薬量は２０〜１００μｌ、好ましくは６
５μｌであることができる。試料対試薬の比は（１：１
０）〜（１：２０）の範囲、好ましい量では１：１３ｖ
／ｖであることができる。この段階での培養時間は２〜
１２０分の範囲、好ましくは１５分である。
【００２５】我我の発明の逐次免疫検定の第２培養段階
（ｃ）においては、液体抱合体試薬を段階（ｂ）の第１
培養混合物に導入する。この抱合体は、アナライト誘導
体あるいはそのアナライトの交叉反応する類似体と抱合
し、第１培養物中の残存している結合していない抗アナ
ライト受容体により結合されるようになることができる
通報基例えば酵素を包含する。抱合体の量は要求される
検定に信号と選択性とを与えるように最適化される。抱
合体含有試薬の量は、得られる培養混合物中の試料が全
体として１０ｖ／ｖ％より大きくならないまで更に希釈
されるよう選択される。この段階のための培養時間は１
〜３０分の範囲であることができ、好ましくは５分であ
る。
（ｃ）においては、液体抱合体試薬を段階（ｂ）の第１
培養混合物に導入する。この抱合体は、アナライト誘導
体あるいはそのアナライトの交叉反応する類似体と抱合
し、第１培養物中の残存している結合していない抗アナ
ライト受容体により結合されるようになることができる
通報基例えば酵素を包含する。抱合体の量は要求される
検定に信号と選択性とを与えるように最適化される。抱
合体含有試薬の量は、得られる培養混合物中の試料が全
体として１０ｖ／ｖ％より大きくならないまで更に希釈
されるよう選択される。この段階のための培養時間は１
〜３０分の範囲であることができ、好ましくは５分であ
る。
【００２６】我我の逐次免疫検定の第３培養段階（ｄ）
においては、分離固体相が段階（ｃ）の第２培養混合物
に導入される。その固体相例えば磁気粒子の懸濁液は過
剰の抗ハプテン結合剤例えば抗フルオレセイン抗体で被
覆されていて、その培養混合物中のハプテン抱合抗アナ
ライト受容体と結合することができる。その固体相と一
緒の培養はその培養混合物中の、実質的に凡てのハプテ
ン抱合抗アナライト受容体と結合できるのに充分な時間
の間進行させる。この培養時間は約５〜２０分の間であ
ることができ、好ましくは１０分である。それからその
固体相は培養混合物から分離され、洗浄される。抱合体
段階（ｃ）の導入から固体相段階（ｅ）の分離段階まで
の全時間は約５〜４０分の範囲であることができ、好ま
しくは１５分である。
においては、分離固体相が段階（ｃ）の第２培養混合物
に導入される。その固体相例えば磁気粒子の懸濁液は過
剰の抗ハプテン結合剤例えば抗フルオレセイン抗体で被
覆されていて、その培養混合物中のハプテン抱合抗アナ
ライト受容体と結合することができる。その固体相と一
緒の培養はその培養混合物中の、実質的に凡てのハプテ
ン抱合抗アナライト受容体と結合できるのに充分な時間
の間進行させる。この培養時間は約５〜２０分の間であ
ることができ、好ましくは１０分である。それからその
固体相は培養混合物から分離され、洗浄される。抱合体
段階（ｃ）の導入から固体相段階（ｅ）の分離段階まで
の全時間は約５〜４０分の範囲であることができ、好ま
しくは１５分である。
【００２７】洗浄された固体相に結合される通報基即ち
抱合体の量は段階（ｆ）−（ｇ）の試料中の遊離アナラ
イト濃度に関連させて秤量される。そのような調節と関
連づけ段階は免疫検定の技術に熟達した人達にはよく知
られていて、ここに詳細に記載する必要はない。例え
ば、標識が酵素の場合関連する基質を添加してもよく、
そして酵素反応速度を測定する。
抱合体の量は段階（ｆ）−（ｇ）の試料中の遊離アナラ
イト濃度に関連させて秤量される。そのような調節と関
連づけ段階は免疫検定の技術に熟達した人達にはよく知
られていて、ここに詳細に記載する必要はない。例え
ば、標識が酵素の場合関連する基質を添加してもよく、
そして酵素反応速度を測定する。
【００２８】総免疫検定時間の短縮は臨床部署（ｓｅｔ
ｔｉｎｇｓ）における効率と処理仕事量の増加の点で関
心事である。重要な関心事は自働化された臨床装置への
使用に適合できるような免疫検定の開発にある。逐次的
試薬添加と共に、固体相分離、洗浄、基質添加並に測定
を前記のような好ましい培養時間で行って、多試料に就
いて、兼務して、任意抽出的に均一および不均一分析を
行うことができる自働化診断装置が１９８９年７月２４
日出願の同時係属米国出願第０７／３８４，５９４号で
公開されていて、そこに記載されている自働化分析装置
並に方法の全開示は参考資料によりここに組入れられて
いる。その装置は、周辺に設置された多数の反応セルを
支持する円形の反応トレーと分析される試料支持用の試
料取扱い装置と多数の液体試薬源を支持する試薬トレー
とを包含する。個個の試料と液体試薬とは選択的無作為
方式で（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ−ｒａｎｄｏｍ ｍｏｄ
ｅ）適当な吸引−分配装置により、連続的におよび試薬
添加場所に位置させられる反応トレー上の反応セル中
に、それぞれ輸送される。その反応トレーは、その反応
混合物の混合と培養とをし、各セルを分析場所に位置さ
せるために試薬添加場所からまわされる。不均一検定の
場合には、磁化できる粒子懸濁液を磁化できる粒子添加
場所の適当なセルに導入する。粒子洗浄場所は磁化でき
る粒子添加場所と分析場所との間に設けられ、そこでは
反応後未結合材料除去のため、固体相が反応セル中で洗
浄される。そのような洗浄に引つづき、基質が、再懸濁
されている酵素−結合の磁化できる粒子との反応のため
反応セル中に添加される。それから反応セルは分析場所
に進められ、そこで磁化できる粒子は光路から取除か
れ、液体相の適当な光学的読み出しが行われる。不均一
および均一検定の両方において、反応トレーの回転方式
は、各セルの数多くの時間の読み出しを与え、即ち、反
応速度を提供するために処理したデータを得るため、２
方向可能である。
ｔｉｎｇｓ）における効率と処理仕事量の増加の点で関
心事である。重要な関心事は自働化された臨床装置への
使用に適合できるような免疫検定の開発にある。逐次的
試薬添加と共に、固体相分離、洗浄、基質添加並に測定
を前記のような好ましい培養時間で行って、多試料に就
いて、兼務して、任意抽出的に均一および不均一分析を
行うことができる自働化診断装置が１９８９年７月２４
日出願の同時係属米国出願第０７／３８４，５９４号で
公開されていて、そこに記載されている自働化分析装置
並に方法の全開示は参考資料によりここに組入れられて
いる。その装置は、周辺に設置された多数の反応セルを
支持する円形の反応トレーと分析される試料支持用の試
料取扱い装置と多数の液体試薬源を支持する試薬トレー
とを包含する。個個の試料と液体試薬とは選択的無作為
方式で（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ−ｒａｎｄｏｍ ｍｏｄ
ｅ）適当な吸引−分配装置により、連続的におよび試薬
添加場所に位置させられる反応トレー上の反応セル中
に、それぞれ輸送される。その反応トレーは、その反応
混合物の混合と培養とをし、各セルを分析場所に位置さ
せるために試薬添加場所からまわされる。不均一検定の
場合には、磁化できる粒子懸濁液を磁化できる粒子添加
場所の適当なセルに導入する。粒子洗浄場所は磁化でき
る粒子添加場所と分析場所との間に設けられ、そこでは
反応後未結合材料除去のため、固体相が反応セル中で洗
浄される。そのような洗浄に引つづき、基質が、再懸濁
されている酵素−結合の磁化できる粒子との反応のため
反応セル中に添加される。それから反応セルは分析場所
に進められ、そこで磁化できる粒子は光路から取除か
れ、液体相の適当な光学的読み出しが行われる。不均一
および均一検定の両方において、反応トレーの回転方式
は、各セルの数多くの時間の読み出しを与え、即ち、反
応速度を提供するために処理したデータを得るため、２
方向可能である。
【００２９】
【実施例】次の実施例は我我の発明の免疫検定手続きを
説明する。可能な場合はいつでも標準的な、市場で入手
出来る試薬級材料を用いた。次の試薬と手続きとは単に
説明の目的で提供されていること、他の成分と割合と手
続きとはこの発明の開示に従って採用できることは理解
されるであろう。
説明する。可能な場合はいつでも標準的な、市場で入手
出来る試薬級材料を用いた。次の試薬と手続きとは単に
説明の目的で提供されていること、他の成分と割合と手
続きとはこの発明の開示に従って採用できることは理解
されるであろう。
【００３０】１．人血清中の遊離チロキシン（ＦＴ４）
の測定 材料と試薬 試薬１：抗Ｔ４単クローン抗体を含有するマウス腹水は
Ｍｅｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。その
抗体をＨＰＬＣにより腹水から精製し、イソチオシアン
酸フルオレセインと抱合させる。その抱合抗体を適当な
緩衝液中に溶解し１ｌ当り抗体４５μｇの濃度を得る。
の測定 材料と試薬 試薬１：抗Ｔ４単クローン抗体を含有するマウス腹水は
Ｍｅｌｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。その
抗体をＨＰＬＣにより腹水から精製し、イソチオシアン
酸フルオレセインと抱合させる。その抱合抗体を適当な
緩衝液中に溶解し１ｌ当り抗体４５μｇの濃度を得る。
【００３１】試薬２：トリ−ヨードチロニン（Ｔ３）を
橋かけ剤スベリン酸ジスクシニミジル（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用
い、酵素アルカリ性ホスファターゼに抱合させる。その
抱合酵素をＧ−２５Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製し、
適当な緩衝液に溶解して、検定において最適の信号を生
じさせる濃度とする。
橋かけ剤スベリン酸ジスクシニミジル（Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用
い、酵素アルカリ性ホスファターゼに抱合させる。その
抱合酵素をＧ−２５Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製し、
適当な緩衝液に溶解して、検定において最適の信号を生
じさせる濃度とする。
【００３２】磁気粒子（ＭＰ）：ポリアクリルアミド粒
子１４〜２４μｍはＢｉｏ−ＲａｄＩｎｃ．，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａから得た。この粒子を磁鉄鉱を用いて含浸
させ、山羊抗フルオルセイン抗体で被覆する。この活性
磁気粒子を適当な緩衝液中に懸濁させ、１ｍｌ当り粒子
約１００ｍｇとする。
子１４〜２４μｍはＢｉｏ−ＲａｄＩｎｃ．，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａから得た。この粒子を磁鉄鉱を用いて含浸
させ、山羊抗フルオルセイン抗体で被覆する。この活性
磁気粒子を適当な緩衝液中に懸濁させ、１ｍｌ当り粒子
約１００ｍｇとする。
【００３３】基質：トリエタノールアミン含有緩衝液中
ｐＨ＝９．８で溶解しているリン酸ｐ−ニトロフェニ
ル。
ｐＨ＝９．８で溶解しているリン酸ｐ−ニトロフェニ
ル。
【００３４】標準：ＦＴ４標準は種種な水準のＴ４を加
えたＴ４／Ｔ３除去人血清から調製する。これらのＦＴ
４標準はＡｍｅｒｓｈａｍ ＦＴ４ ＲＩＡキットおよ
びＣｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ ＦＴ４（２段）Ｒ
ＩＡキットを用いて検定して値をきめる。
えたＴ４／Ｔ３除去人血清から調製する。これらのＦＴ
４標準はＡｍｅｒｓｈａｍ ＦＴ４ ＲＩＡキットおよ
びＣｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓ ＦＴ４（２段）Ｒ
ＩＡキットを用いて検定して値をきめる。
【００３５】装置：前記の１９８９年７月２４日出願米
国出願第０７／３８４，５９４号に記載のように、多数
の試料試験、試薬添加と培養、磁気粒子の分離、洗浄、
基質添加並に酵素活性の測定を行うことができる自働化
診断装置。
国出願第０７／３８４，５９４号に記載のように、多数
の試料試験、試薬添加と培養、磁気粒子の分離、洗浄、
基質添加並に酵素活性の測定を行うことができる自働化
診断装置。
【００３６】検定手順 ＦＴ４免疫検定は自働化装置により３７℃で次のごとく
行う。人血清試料５μｌをセル中試薬１ ６５μｌと混
合し、その混合物を１５分間培養する。それから（分時
刻１５）に試薬２ ６５μｌを加え、得られた混合物の
培養を更に５分間行う。この時磁気粒子を導入する。
行う。人血清試料５μｌをセル中試薬１ ６５μｌと混
合し、その混合物を１５分間培養する。それから（分時
刻１５）に試薬２ ６５μｌを加え、得られた混合物の
培養を更に５分間行う。この時磁気粒子を導入する。
【００３７】試料中の凡ての遊離Ｔ４と実質的に結合す
るため充分量のフルオレセイン抱合抗Ｔ４抗体が試薬１
により使用される。試薬２によりつづいて加えられたＴ
３−ＡＬＰ抱合体は残存している結合していない抗Ｔ４
抗体により取り込まれ、その量は試料と試薬との同時添
加による競合結合免疫検定に関し制定される量よりも大
きい。
るため充分量のフルオレセイン抱合抗Ｔ４抗体が試薬１
により使用される。試薬２によりつづいて加えられたＴ
３−ＡＬＰ抱合体は残存している結合していない抗Ｔ４
抗体により取り込まれ、その量は試料と試薬との同時添
加による競合結合免疫検定に関し制定される量よりも大
きい。
【００３８】分時刻２０に、磁気粒子２０μｌを加え、
得られる混合物の培養を常に混合し乍ら更に１０分間進
行させる。この間、抗フルオレセイン抗体で被覆された
磁気粒子は、その培養混合物中に存在する実質的に凡て
のフルオレセイン抱合抗Ｔ４抗体と結合する。
得られる混合物の培養を常に混合し乍ら更に１０分間進
行させる。この間、抗フルオレセイン抗体で被覆された
磁気粒子は、その培養混合物中に存在する実質的に凡て
のフルオレセイン抱合抗Ｔ４抗体と結合する。
【００３９】分時刻３０に、固定磁石によりその磁気粒
子を止め置いている培養セルから上澄液を吸引すること
によりその反応を終らせる。それからその磁気粒子を数
回洗浄し、基質３００μｌを添加する。
子を止め置いている培養セルから上澄液を吸引すること
によりその反応を終らせる。それからその磁気粒子を数
回洗浄し、基質３００μｌを添加する。
【００４０】その磁気粒子を基質溶液と混合し、培養す
る。酵素によるその基質の転化速度を、光路から粒子を
取除くため磁石を用い、４０５ｎｍで周期的に吸光度の
読みを取ることにより分光測光的に測定する。
る。酵素によるその基質の転化速度を、光路から粒子を
取除くため磁石を用い、４０５ｎｍで周期的に吸光度の
読みを取ることにより分光測光的に測定する。
【００４１】それから、その酵素反応速度を使って、既
知の標準ＦＴ４水準より構成される標準曲線を用いて試
料中の遊離Ｔ４を計算する。
知の標準ＦＴ４水準より構成される標準曲線を用いて試
料中の遊離Ｔ４を計算する。
【００４２】
【結果】異った試料量（ＳＶ）を用いての、本方法の適
用量−応答の様子を表１に示す。このデータはＲｏｄｂ
ａｒｄの曲線あてはめ法を用いてあてはめ、優れた曲線
あてはめ相関を与えた。
用量−応答の様子を表１に示す。このデータはＲｏｄｂ
ａｒｄの曲線あてはめ法を用いてあてはめ、優れた曲線
あてはめ相関を与えた。
【００４３】
【表１】 表 １ 検定応答（ｍＡ／分） ＦＴ４標準（ｕｇ／ｄＬ） ＳＶ： ５ｕＬ １０ｕＬ ２０ｕＬ ０．０ １８１ １７８ １６５ ０．２６ １５２ １４３ １３５ ０．６２ １３２ １１９ １１４ １．５４ １００ ８８ ７７ ２．７３ ８０ ６７ ５７ ８．８４ ４９ ３８ ３２ Ｒ＝０．９９６６ ０．９９８５ ０．９９８２
【００４４】２．患者血清試料の分析：ＦＴ４結果の、
市場で入手出来るＲＩＡキット［Ａｍｅｒｌｅｘ−Ｍ(T
M)、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｕ．
Ｓ．Ａ］との相関 ２３の人血清試料を実施例１に記載の自働化装置で分析
した。得られたＦＴ４値を、これらの試料を製品に添付
の説明書に従ってＡｍｅｒｓｈａｍ ＲＩＡキットを用
いて検定することにより得られた値と比較した。しか
し、自働化装置での試料量は変更することができた。１
つの実験において、選択した試料量は２０μｌであり、
第２の実験においてはそれが５μｌであった。
市場で入手出来るＲＩＡキット［Ａｍｅｒｌｅｘ−Ｍ(T
M)、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｕ．
Ｓ．Ａ］との相関 ２３の人血清試料を実施例１に記載の自働化装置で分析
した。得られたＦＴ４値を、これらの試料を製品に添付
の説明書に従ってＡｍｅｒｓｈａｍ ＲＩＡキットを用
いて検定することにより得られた値と比較した。しか
し、自働化装置での試料量は変更することができた。１
つの実験において、選択した試料量は２０μｌであり、
第２の実験においてはそれが５μｌであった。
【００４５】
【結果】相関データは線型回帰分析を行うことで得られ
た。その分析は自働化装置では試料量が２０μｌと比較
して５μｌである場合、Ａｍｅｒｌｅｘ−Ｍ(TM) ＲＩ
Ａキットとの相関が改良されることを示している。試料
量の減少は最終培養混合物中における試料の希釈が大き
くなることおよび試料基準（試料干渉）の不要と云う結
果になる。相関結果を以下に要約し、図１及び図２に示
す。
た。その分析は自働化装置では試料量が２０μｌと比較
して５μｌである場合、Ａｍｅｒｌｅｘ−Ｍ(TM) ＲＩ
Ａキットとの相関が改良されることを示している。試料
量の減少は最終培養混合物中における試料の希釈が大き
くなることおよび試料基準（試料干渉）の不要と云う結
果になる。相関結果を以下に要約し、図１及び図２に示
す。
【００４６】 本方法（２０μｌ）＝１．０６３５ ＲＩＡ−０．０８５６（Ｒ＝０．９３６
６） 本方法（５μｌ）＝１．１２３１ ＲＩＡ−０．００２３（Ｒ＝０．９７１８）
６） 本方法（５μｌ）＝１．１２３１ ＲＩＡ−０．００２３（Ｒ＝０．９７１８）
【００４７】３．患者血清試料の分析：ＦＴ４結果の、
市場で入手できるＲＩＡキットＣｌｉｎｉｃａｌ Ａｓ
ｓａｙｓ２段法，Ｇａｍｍａｃｏａｔ(TM)，Ｂａｘｔｅ
ｒ−Ｔｒａｖｅｎｏｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｕ．
Ｓ．Ａ） ８２個の人血清試料を実施例１に記載の自働化装置で分
析した。得られたＦＴ４値を製品に添付の説明書に従
い、Ｇａｍｍａｃｏａｔ(TM) ＲＩＡキットを用いて、
これらの試料を検定して得た値と比較した。この自働化
装置で使用のために選ばれた試料量は５μｌである。
市場で入手できるＲＩＡキットＣｌｉｎｉｃａｌ Ａｓ
ｓａｙｓ２段法，Ｇａｍｍａｃｏａｔ(TM)，Ｂａｘｔｅ
ｒ−Ｔｒａｖｅｎｏｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｕ．
Ｓ．Ａ） ８２個の人血清試料を実施例１に記載の自働化装置で分
析した。得られたＦＴ４値を製品に添付の説明書に従
い、Ｇａｍｍａｃｏａｔ(TM) ＲＩＡキットを用いて、
これらの試料を検定して得た値と比較した。この自働化
装置で使用のために選ばれた試料量は５μｌである。
【００４８】
【結果】相関データは線型回帰分析を行って得た。優れ
た相関が得られた。その結果を以下に要約し、図３に示
す。
た相関が得られた。その結果を以下に要約し、図３に示
す。
【００４９】 本方法＝１．０９８３ ＲＩＡ＋０．００４（Ｒ＝０．９８７４）
【００５０】実施例１と実施例２との相関結果は本発明
の方法が妥当なＦＴ４値を与え、人血清試料中のＦＴ４
値測定に適当であることを示している。
の方法が妥当なＦＴ４値を与え、人血清試料中のＦＴ４
値測定に適当であることを示している。
【００５１】前記の記載から明らかな、本発明の幾つか
の有利さは技術が、試料中に存在する過剰な結合アナラ
イトと未結合の天然の受容体とによって生ずる偏りを克
服する、生物学的流体中の遊離アナライトの直接測定に
関する改良された免疫検定手順を包含している。
の有利さは技術が、試料中に存在する過剰な結合アナラ
イトと未結合の天然の受容体とによって生ずる偏りを克
服する、生物学的流体中の遊離アナライトの直接測定に
関する改良された免疫検定手順を包含している。
【００５２】前記の点から見て、本発明の種種な目的が
達成され、他の有利な結果が得られていることが判るで
あろう。
達成され、他の有利な結果が得られていることが判るで
あろう。
【００５３】本発明の種種な特徴を有利さとは前記の記
載から明らかであると考えられる。しかし、特別に述べ
ていない種種な他の特徴と有利さとは好ましい態様の多
くの変形と変更とが例証されるように、技術に精通する
人人には疑いもなく生ずるであろうが、その凡ては次の
請求範囲により定義されるごとき、本発明の精神と範囲
とから逸脱せずに達成されてもよい。
載から明らかであると考えられる。しかし、特別に述べ
ていない種種な他の特徴と有利さとは好ましい態様の多
くの変形と変更とが例証されるように、技術に精通する
人人には疑いもなく生ずるであろうが、その凡ては次の
請求範囲により定義されるごとき、本発明の精神と範囲
とから逸脱せずに達成されてもよい。
【図１】ＦＴ４測定に関する、本発明の方法と市場で入
手できるＡｍｅｒｓｈａｍ免疫検定キットとの間の、実
施例２に報告された比較を説明するグラフである。
手できるＡｍｅｒｓｈａｍ免疫検定キットとの間の、実
施例２に報告された比較を説明するグラフである。
【図２】ＦＴ４測定に関する、本発明の方法と市場で入
手できるＡｍｅｒｓｈａｍ免疫検定キットとの間の、実
施例２に報告された比較を説明するグラフである。
手できるＡｍｅｒｓｈａｍ免疫検定キットとの間の、実
施例２に報告された比較を説明するグラフである。
【図３】本発明の方法とＦＴ４用の市場で入手できるＣ
ｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓキットとの間の、実施例
３に報告された比較を説明するグラフである。
ｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｓａｙｓキットとの間の、実施例
３に報告された比較を説明するグラフである。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−10590（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543
Claims (15)
- 【請求項１】 （ａ）試料を、試料中の遊離アナライト
より過剰なそして試料中の全アナライトの０．１〜５％
当量にわたる量の可溶性抗アナライト受容体を含有する
既知の第１液体量と一緒にし、 （ｂ）その得られた混合物を、遊離アナライトと抗アナ
ライト受容体との結合反応が実質的完結にまで到達させ
るに充分な時間培養して、第１培養混合物を形成し、 （ｃ）その段階（ｂ）の第１培養混合物に、段階（ｂ）
で結合されなかった抗アナライト受容体と抱合体が結合
できるよう標識されたアナライトまたは標識されたその
類似体を包含する可溶性抱合体を含有する既知の第２液
体量を、得られる混合物中の試料部分が１０ｖ／ｖ％よ
り大きくない程に減少させるに充分に添加して、第２培
養混合物を形成し、これを培養し、 （ｄ）その段階（ｃ）の第２培養混合物に、その培養混
合物中の凡ての抗アナライト受容体と実質的に結合する
ためその抗アナライト受容体より過剰に存在する、抗ア
ナライト受容体のための固定化結合剤により被覆された
固体相を包含する分離手段を導入して、第３培養混合物
を形成し、これを培養し、 （ｅ）その段階（ｄ）の第３培養混合物から固体相を分
離し、洗浄し、 （ｆ）その段階（ｅ）の固体相に結合された前記抱合体
量を測定し、そして （ｇ）試料中の遊離アナライト濃度を決定するのに、段
階（ｆ）の測定値を用いる逐次段階を包含する、流体試
料中に天然に存在するアナライト受容体と結合平衡にあ
る遊離並に結合部分両方のアナライトを含有する生物学
的流体試料中の遊離アナライト水準の測定方法。 - 【請求項２】 アナライトが、ホルモン、生化学的メッ
センジャー、ステロイド、薬物、薬物代謝産物、ポリペ
プチド、蛋白質、ビタミン、アルカロイド、単糖、二糖
または多糖よりなる群から選択される、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項３】 アナライトが、甲状腺ホルモン、コルチ
ゾール、プロゲステロンまたはテストステロンからなる
群から選択される、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 抗アナライト受容体が単クローン抗体を
包含する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 アナライトが酵素、ケイ光体、発色体ま
たはルミネセンス発光体で標識されている、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項６】 アナライトがチロキシンまたはトリ−ヨ
ードチロニンであり、抱合体が、カルボキシル基および
アミノ基の１つまたはその両方で改質または標識されて
いるチロキシンまたはトリ−ヨードチロニンの誘導体で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 段階（ｂ）が約２〜１２０分の培養時間
を包含している、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 段階（ｂ）が約２〜３０分の培養時間を
包含している、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 段階（ｂ）が約１５分の培養時間を包含
する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 段階（ｃ）が約１〜３０分の培養時間
を包含する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 段階（ｃ）が約２〜１０分の培養時間
を包含する、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 段階（ｃ）が約５分の培養時間を包含
する、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 段階（ｄ）が約１〜６０分の培養時間
を包含する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 段階（ｄ）が約５〜２０分の培養時間
を包含する、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 段階（ｄ）が約１０分の培養時間を包
含する、請求項１４に記載の方法。
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