JPH05113443A

JPH05113443A - 酵素免疫測定方法

Info

Publication number: JPH05113443A
Application number: JP9973792A
Authority: JP
Inventors: Hiroichi Okudaira; 博一奥平; Wataru Oshihara; 渉押原; Sukiko Hosaka; 透子保坂
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1991-04-26
Filing date: 1992-04-20
Publication date: 1993-05-07

Abstract

(57)【要約】【構成】抗体量を測定する酵素免疫法においてウミホ
タル由来のルシフェラーゼを標識酵素として用いる。【効果】従来、酵素免疫測定法による抗体測定法にお
いて使用できなかった生物発光酵素が、本発明により適
用可能になった。さらに本発明により、迅速で血清使用
量が少なく、簡便で高度の情報処理装置を必要としない
ＩｇＥの酵素免疫測定法が可能になり、また同時に多項
目の特異的な抗体量を測定することが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素免疫測定法に関す
る。さらに詳しくは、高感度に検出可能な生物発光酵素
ウミホタルルシフェラーゼを用いた酵素免疫測定法にお
いて、測定対象抗体として特に血液中のＩｇＥ抗体量を
測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体成分の微量分析法として、化学発光
や生物発光を用いることは、一般に高感度であり、ＮＡ
Ｄ、ＮＡＤＨ、ＡＴＰ、過酸化水素などを生成する酵素
系と組み合わせることにより、臨床化学分析に多用され
ている。最近では測定機器の開発が進み、多数の生体成
分をピコモルからフェムトモル、アットモルのレベルで
分析することが可能になってきた。また、これらの溶液
系での発光分析に加えて、その高感度ゆえに画像解析、
固定化酵素、酵素免疫測定法、ＤＮＡプローブ法、生物
試験、バイオマスの測定、生体からの発光分析等の適用
例が増加している（今井編「生物発光と化学発光」
廣川書店 1990）（笠井、渡辺；蛋白質・核酸・酵素
３２，1234(1987)）。

【０００３】発光分析のうち、生物発光は、酵素系を触
媒する化学発光と定義されているが、その量子収量は通
常の化学発光より圧倒的に高く、生物発光分析は、化学
発光分析よりも感度の点で優れており、検出感度の鋭敏
さでは、放射性同位元素を用いる分析法に匹敵してい
る。さらに、安全性や操作の手軽さ、測定装置として光
電子増倍管があれば良く特殊な設備を必要としない事、
危険な廃棄物を伴わないことなどの点からも非常に有益
な方法である。

【０００４】一方、免疫測定法は複雑な組成の混合物の
中から免疫反応で特異的に選別できることから、通常の
定量法に必要な対象物を試料から分離する前処理が不要
であり、しかも高感度・高精度に定量できる特長を持
つ。また免疫測定法のうち、酵素標識を特徴とする酵素
免疫測定法は、放射性同位元素を用いる放射免疫測定法
に比べて廉価で危険な廃棄物を伴なわず、測定の感度と
精度の面でも遜色はない事からしだいに汎用されつつあ
る。この酵素免疫測定法に発光酵素を標識として用いた
場合、高感度であり微量成分の検出が可能で、定量
性の範囲の幅が広く、数オーダーにわたり、光源が不
要であるから迷光がなく、発色法に比べて、酵素反応
が迅速で秒単位の短時間で分析できる特長を有すると考
えられる。

【０００５】また近年とみに増加しているアレルギー性
疾患は、アレルゲン（原因物質）とそれに対応するＩｇ
Ｅ抗体との反応による、いわゆるＩ型アレルギー反応に
よって発症し、その診断には血液中のＩｇＥ抗体を検査
してアレルゲンを同定する必要がある。以前はプリック
反応、スクラッチ反応、皮内反応あるいはＰ−Ｋ反応と
いった患者の皮膚を用いる検査が主として行われていた
が、患者に対する苦痛が大きく、現在では血清などの検
体を用いる試験管内検査が並行して行われる（中島重
徳、メビオ６，62(1989)）。

【０００６】試験管内ＩｇＥ抗体検査法としては、アレ
ルゲンを結合させた濾紙に血清を反応させ、反応したＩ
ｇＥ抗体を放射性物質でラベルした抗ＩｇＥで検出する
放射免疫測定法が行われてきた。この方法は放射性物質
を用いることから前述のような欠点があり、放射性物質
のかわりに酵素で標識した抗ＩｇＥを用いる酵素免疫測
定法が開発された。当初これらの免疫測定法では結果が
出るのに約２日を要していたが、最近さらに改良された
方法として数時間で結果の出るシステムもいくつか開発
されている。

【０００７】しかしながらこれらの検査は感度や操作性
の面で不満な点を残しており、前述の発光酵素を標識と
して用いた酵素免疫法の長所を生かした検査法の開発が
望まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウミホタル
由来のルシフェラーゼを酵素免疫測定法の標識酵素とし
て利用した酵素免疫測定方法を提供する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記の目的は以下の本発
明による達成できる。すなわち本発明はａ）測定対象抗体を含む試料と、測定対象抗体と特異的
に反応し得る抗原を固体担体に固定させた固定化抗原
と、測定対象抗体と特異的に反応し得る標識化抗体とを
反応させる過程、ｂ）過程ａ）で生じた固定化抗原−測定対象抗体−標識
化抗体複合体を、未反応の標識化抗体と分離する過程、
およびｃ）固体担体に固定された複合体を該複合体に含まれる
標識を利用して検出する過程とを含む免疫測定法におい
て、標識酵素としてウミホタル由来のルシフェラーゼを使用
することを特徴とする酵素免疫測定方法である。

【００１０】本発明によって使用されるウミホタル・ル
シフェラーゼは、ＷＯ９０／０１５４２によって開示さ
れたアミノ酸配列を有する蛋白質であるが、それと同等
の生物活性が保持されているならば、該アミノ酸配列に
部分的な置換、欠失、挿入などがなされていてもかまわ
ない。

【００１１】本発明に用いるウミホタルルシフェラーゼ
を生産する方法としては、いかなる方法でも良く、例え
ば自然界より採集したウミホタルあるいは人工的に養殖
したウミホタルによって生産する方法、遺伝子組換え技
術や細胞培養技術によりウミホタル以外の宿主細胞によ
って生産する方法、あるいは蛋白質合成技術により生産
する方法などが挙げられる。

【００１２】次いで上記の方法により得られるルシフェ
ラーゼ活性を含む酵素液より必要に応じてルシフェラー
ゼを精製する。該ルシフェラーゼの精製は、Thompson
らにより開示された方法（Thompson, E. M. et al : Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA,８６, 6567(1989)）を用い
て実施できるが、より好ましくは最終生成物をさらにＤ
ＥＡＥ−ＨＰＬＣに掛け、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
電気泳動により純度を確認したものを用いる。

【００１３】本発明で用いる標識化抗体を作製するには
ウミホタル由来ルシフェラーゼを各種の官能基あるいは
分子で修飾するのが好ましい。一般に、精製された蛋白
質を適当な官能基や分子で修飾する方法は数多く報告さ
れており、蛋白質分子上のアミノ基、カルボキシル基、
水酸基、ＳＨ基、糖鎖などを用いて実施できる（石川栄
治「酵素免疫測定法」第３版、石川ら編，医学書
院、75(1987)、石橋嘉一郎「酵素免疫測定法」第３
版、石川ら編，医学書院、127(1987) ）。修飾したい
分子によって方法が異なるものの、これらの方法を適用
する際に注意すべきことは、修飾物の有する活性とルシ
フェラーゼの活性を保持したまま結合できる選択的な修
飾反応を選び、しかもその反応は不用意なルシフェラー
ゼの失活を避けるために緩和な条件下で完結させること
である。

【００１４】抗体とウミホタル由来ルシフェラーゼを結
合させる好ましい方法としては、スペーサーをはさんで
両端に同反応性あるいは異反応性の反応性基を持つ二価
性試薬を使用して蛋白質蛋白質の複合体を形成させるこ
とができる。二価性試薬の反応性基としては、数多くあ
るが代表的なものとして、ルシフェラーゼ上のアミノ基
と反応するN-ヒドロキシサクシンイミド・イミドエステ
ル・ニトロアリールハライドなどが、チオール基と反応
するマレイミド・ピリジンジスルフィド・チオフタルイ
ミド・活性ハロゲン、紫外線照射によってアミノ基・チ
オール基いずれとも非選択的に反応するフェニルアジド
やジアゾアルカンなどが利用できる（喜納兼勇「酵素
免疫測定法」北川ら編，共立出版、335(1987) ）。中
でも好ましくはＮ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート等
の二価性試薬を利用してルシフェラーゼ上のアミノ基に
マレイミドを導入しておき、還元ＩｇＧあるいはＦａｂ
のチオール基と反応させて複合体を形成させることがで
きる。この時ルシフェラーゼと還元抗体の重量比はとく
に制限されず、広範囲に変えることができるが、一般に
100:1〜1:100 、好ましくは5:1 〜1:5 である。

【００１５】本発明で標識抗体として用いられる抗体
は、ヒト、マウス、ウシ、ウサギ、ラット、ヤギ、イ
ヌ、ネコ、モルモットなど測定対象動物により適宜選択
され、アフィニティ精製されたポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体などが用いられるが、好ましくは分子
が均質で一定の抗原抗体反応が可能なモノクローナル抗
体が望ましい。

【００１６】本発明により測定できる抗体はとくに限定
されるものではないが、アレルギー性疾患の診断のため
には、ＩｇＥ抗体を測定することが好ましい。

【００１７】本発明により測定できるＩｇＥ抗体の項目
としては、例えば気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アト
ピー性皮膚炎などの高ＩｇＥを示すＩ型アレルギーの原
因となる、吸入性アレルゲン、食物アレルゲンなどであ
り、例えばコナヒョウダニ、ヤケヒョウダニ、ハウスダ
スト、スギ、スズメノヒエ、ブタクサ、オオアワガエ
リ、ハルガヤ、ライムギ、ネコ、イヌ、カニ、コメ、卵
白など各種アレルゲンに対するＩｇＥ抗体量を測定する
ことができる。

【００１８】また抗原を固定化する担体としては、生物
発光を検出する機器により適宜選択され、市販されてい
るプラスチック試験管、マイクロタイタープレート、ガ
ラスビーズ、プラスチックビーズ、メンブレン、磁気ビ
ーズ等が用いられる。

【００１９】また本発明の酵素免疫測定方法は固定化す
る抗原として１種のみを用いることも勿論可能である
が、２種以上を固定化することにより同時に多項目の抗
体を測定することができる。例えば、少なくとも２種以
上の抗原を１つの固体担体に固定化することにより、２
種以上の抗原のいずれか一つかそれ以上の幾つかの抗原
のどれかに対する抗体の存在を検出することもできる
し、互いに異なった一種類の抗原が固定化された少なく
とも２つ以上の固体担体を使用することにより、少なく
とも２つ以上の抗原に対するそれぞれの抗体の存在を検
出することもできる。

【００２０】一方、酵素免疫測定法の測定系は、測定対
象、抗原抗体反応の形式、酵素標識物、標識方法、酵素
活性の測定法あるいは結合型／遊離型の分離方法などの
違いにより多くの方法に分かれる（遠藤雄一、宮井潔
「酵素免疫測定法」北川ら編，共立出版、13(1987)）
が、本発明の酵素免疫測定法はいわゆる１ステップ法、
２ステップ法どちらにも使用できるが、迅速な測定が行
える点で１ステップ法が、非特異的なＩｇＥの影響を受
けることが少ない点で２ステップ法が、好ましく用いら
れる。

【００２１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。［実施例１］ルシフェラーゼ／抗ヒトＩｇＥ抗体複合
体による抗ダニＩｇＥの検出１．ウミホタル・ルシフェラーゼの取得千葉県館山湾で採集したウミホタルを生理的食塩水で洗
浄することにより、天然型のルシフェラ−ゼを得た。１
０ｇのウミホタルを洗浄したところ、３．０×１０^１３
ｃｐｓ活性に相当する粗精製のルシフェラ−ゼが得られ
た。

【００２２】溶液中のルシフェラ−ゼ活性は、適当量の
酵素を３００μｌの測定用緩衝液中に希釈した後に、２
μｌの３３μＭウミホタル・ルシフェリンとポリスチ
レン製の試験管（１．２×３ｃｍ）内で混合し、直ちに
ルミノメーター（西ドイツＬｕｍａｃ社製，バイオカウ
ンターＭ２０１０）を用いて、フォトン数を１０秒間測
定した。発光強度は１秒あたりの平均フォトン数（ｃｐ
ｓ）として示した。

【００２３】２．ウミホタル・ルシフェリンの合成ウミホタル・ルシフェリンは、 S. Inoue, S. Sugiur
a, H. Kakoi, T. Goto: Tetrahedron Lett., 1609(196
9) で開示された方法に基づいて合成して用いた。

【００２４】３．ウミホタル・ルシフェラーゼの精製上記の方法によって得られた粗精製のルシフェラーゼ
は、Tsuji, F.I. : Methods Enzymol. ５７， 364(198
7)）にしたがって部分精製を行い、さらにThompson ら
により開示された方法（Thompson, E. M. et al : Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, ８６, 6567(1989)）を用い
て精製を進め、最終的には東ソー社製ＤＥＡＥ５ＰＷ
（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）カラムを用いたＨＰＬＣに
かけ、２５ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ５．８、０．５Ｍ
ＮａＣｌで溶出させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法によって単一の蛋白質であることを確認し
た。２．０×１０^１３ｃｐｓ／ｍｇ蛋白質の比活性を有
していた。

【００２５】４．ルシフェラーゼ／抗体複合体の調製表題の複合体のＥＩＡ系への適用例として、ヒト抗ダニ
ＩｇＥの検出例を挙げる。本例に用いた粗精製のダニ抗
原は、宮本らにより開示された方法（Miyamoto, T. et
al : J. Allergy,４２, 14 (1968))を用いてコナヒョウ
ヒダニ（ Dermatophagoides farinae ）より調製した。
またルシフェラーゼによる標識化に用いた抗ヒトＩｇＥ
モノクローナル抗体は、ヤマサ醤油株式会社製を購入し
て使用した。

【００２６】４−ａ．マレイミド化ルシフェラーゼの作
製１００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０、１００ｍ
ＭＮａＣｌに溶解した０．５８ｍｇ／ｍｌの精製され
たルシフェラーゼ溶液１ｍｌに、N,N-ジメチルホルムア
ミドに溶解した１０ｍｇ／ｍｌのピアス社製 N-succini
midyl 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxyl
ate 溶液４μｌを添加し、室温下で３０分間ゆっくりと
攪拌した。反応後に同緩衝液を用いてファルマシア社製
ＰＤ−１０カラムにかけ、未反応の N-succinimidyl 4-
(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate を除
いた。Ishikawaの方法（Ishikawa E., et al; J. Immun
oassay, ４, 209(1983) ）を参考にして求めたルシフェ
ラーゼ１分子当たりのマレイミド基導入量は、１．３で
あった。このときルシフェラ−ゼの比活性は２．０×１
０^１３ｃｐｓ／ｍｇ蛋白質であった。

【００２７】４−ｂ．抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体
の還元１００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ６．０、１００ｍ
ＭＮａＣｌ、５ｍＭエチレンジアミン４酢酸ナトリウ
ムに溶解した１．３ｍｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＥモノクロ
ーナル抗体：Ｅ０１溶液７５０μｌに、同緩衝液に溶解
した０．１Ｍメルカプトエチルアミン７５μｌを添加し
て、３７℃下で６０分間保温した。反応後に同緩衝液を
用いてファルマシア社製ＰＤ−１０カラムにかけ、未反
応のメルカプトエチルアミンを除いた。

【００２８】４−ｃ．ルシフェラーゼ／抗体複合体の作
製上記の方法で作製したマレイミド化ルシフェラーゼおよ
び還元化した抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体をそれぞ
れアミコン社製セントリコン−１０を用いて０．３４ｍ
ｇ／ｍｌ、０．６２ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。
１．３ｍｌの該マレイミド化ルシフェラーゼ溶液と１．
０ｍｌの該還元化抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体溶液
を混合して、４℃下で一夜ゆっくりと攪拌した。反応後
の溶液をアミコン社製セントリコン−３０を用いて５０
０μｌ以下に濃縮した後、東ソー社製Ｇ３０００ＳＷカ
ラム（０．７８ｍｍ径×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過Ｈ
ＰＬＣにかけ、ルシフェラーゼ活性を有する大分子量分
画を分取した。

【００２９】４−ｄ．ルシフェラーゼ／抗体複合体を用
いたＩｇＥの検出粗精製したダニ抗原を１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐ
Ｈ７．２、１００ｍＭＮａＣｌを用いて５０μｇ／ｍｌ
に調製して、２００μｌをルシフェラーゼ活性測定用の
ポリスチレンチューブに添加し、４℃下で一夜保温し
た。使用直前に３ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム，
ｐＨ７．２、１００ｍＭＮａＣｌ、０．２５％（Ｗ／
Ｖ）牛血清アルブミンで１回洗浄してから用いた。この
チューブに１０μｌの第１表記載の臨床所見を持つ患者
血清と、１０μｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ
７．２、１００ｍＭＮａＣｌ、０．２５％（Ｗ／Ｖ）
牛血清アルブミンに溶解した１×１０^８ｃｐｓ相当の上
記ルシフェラーゼ／抗体複合体を添加して、室温下で１
０分間攪拌した。３ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム，ｐＨ７．２、１００ｍＭＮａＣｌ、０．０５％
（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で２回、３ｍｌの１０ｍＭ
リン酸ナトリウム，ｐＨ７．２、１００ｍＭＮａＣｌ
で４回洗浄した後に、３００μｌの１０ｍＭリン酸ナ
トリウム，ｐＨ７．２、１００ｍＭＮａＣｌを添加し
てルシフェラーゼ活性を測定した結果、第１表に示すよ
うに患者の抗体量に応じた発光量が得られた。

【００３０】また比較例１としてPharmacia 社製ＲＡＳ
Ｔによる値を記載した。ダニ（ Dermatophagoides fari
nae ）抗原を固定化したpaper disc に５０μｌの患者
血清を加えて３時間反応させて検体中の特異ＩｇＥを結
合・洗浄した後、この結合物に一夜¹²⁵Ｉ標識抗ＩｇＥ
抗体を反応させた。反応後に洗浄し、paper discの残存
放射能を計測し、同時に操作した標準対照血清による計
測値と比較して検体中のＩｇＥ量を表現した。

【００３１】第１表に記載した通り、比較例１と比べる
と、本発明のルシフェラーゼ／抗ヒトＩｇＥ抗体複合体
によるＩｇＥの検出方法により、より少ない血清量でよ
り迅速かつ簡便に、比較例と同様の結果が得られること
が明らかである。

【００３２】

【表１】

【００３３】［実施例２］種々のアレルゲンを用いたＩ
ｇＥの検出５．アレルゲンの粗精製米ＩＢＩ社製コナヒョウヒダニ（ Dermatophagoides fa
rinae ）、ヤケヒョウヒダニ（ Dermatophagoides pter
onyssinus ）、ネコ毛（ Cat hair ）、ブタクサ花粉
（ Ragweed）、ヨモギ花粉（ Mugwort）、スギ花粉（ C
eder）、米（ Rice ）、エビ（ Shrimp ）、アルテルナ
リア（ Alternaria ）、ペニシリウム（ Penicillum
）、アスペルギルス（ Aspergillus）の１ｇの脱脂粉
末を、それぞれ１０ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム，ｐＨ７．２、１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭメルカ
プトエタノールに懸濁して４℃下で一夜ゆっくり攪拌し
ながら抽出した。アトー社製“みずぶとりくん”を用い
て濃縮した後、ファルマシア社製ＰＤ−１０カラムにか
けて色素を初めとする低分子成分を除いた物を粗精製ア
レルゲンとして用いた。

【００３４】６．ルシフェラーゼ／抗体複合体を用いた
ＩｇＥの検出１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２、１００ｍＭ
ＮａＣｌを用いて５０μｇ／ｍｌに調製された粗精製
アレルゲン溶液３０μｌにイムノケミカル社製３．５ｍ
ｍ径ポリスチレンビーズを添加し、４℃下で一夜保温し
た。使用直前に１ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム，
ｐＨ７．２、１００ｍＭＮａＣｌ、０．２５％（Ｗ／
Ｖ）牛血清アルブミンで３回洗浄してから用いた。この
ビーズに３０μｌのアレルギー患者血清を添加し、室温
下で２時間攪拌して特異ＩｇＥを捕捉した。血清を廃棄
後、１ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．
２、１００ｍＭＮａＣｌ、０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗ
ｅｅｎ−２０で１回洗浄した後に、３０μｌの１０ｍＭ
リン酸ナトリウム，ｐＨ７．２、１００ｍＭＮａＣ
ｌ、０．２５％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミンに溶解した
１×１０^８ｃｐｓ相当のルシフェラーゼ／抗体複合体を
添加して、室温下で１時間攪拌した。１ｍｌの１０ｍＭ
リン酸ナトリウム，ｐＨ７．２、１００ｍＭＮａＣ
ｌ、０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で２回、１
ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２、１０
０ｍＭＮａＣｌで３回洗浄した後に、ビーズをルシフ
ェラーゼ活性測定用のポリスチレンチューブに移して３
００μｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２、
１００ｍＭＮａＣｌを添加してルシフェラーゼ活性を
測定した。同時に、臨床的にアレルギーの所見を示さな
い血清を陰性血清として用いて対照実験を行なった。

【００３５】また比較例２としてPharmacia 社製ＲＡＳ
Ｔによる測定を行なった。アレルゲンを固定化したpape
r disc に５０μｌの患者血清を加えて３時間反応させ
て検体中の特異ＩｇＥを結合・洗浄した後、この結合物
に一夜¹²⁵Ｉ標識抗ＩｇＥ抗体を反応させた。反応後に
洗浄し、paper discの残存放射能を計測して検体中の特
異ＩｇＥ量を定量した。定量値はＰＲＵ：Phadebas RAS
T Unitまたはそれにに基づくクラスで示した。

【００３６】図１および図２に、アレルギー患者３９名
について、本発明によるルシフェラーゼを用いる方法と
ＲＡＳＴ法との間のダニに対する特異ＩｇＥ検出の相関
を示す。また第２表に、９名のアレルギー患者につい
て、ダニ以外の９アレルゲン特異ＩｇＥ検出例を示す。

【００３７】

【表２】どちらの場合もＲＡＳＴ値に応じたルシフェラーゼ活性
が得られており、患者血清中の特異ＩｇＥ量を反映して
いると考えられる。

【００３８】［実施例３］多項目アレルゲン特異ＩｇＥ
の同時測定コナヒョウヒダニ（ Dermatophagoides farinae ）、ヤ
ケヒョウヒダニ（ Dermatophagoides pteronyssinus
）、ネコ毛（ Cat hair ）、ブタクサ（ Ragweed）、
ヨモギ（ Mugwort）、スギ花粉（ Ceder）、米（ Rice
）、エビ（ Shrimp）、アルテルナリア（ Alternaria
）、ペニシリウム（ Penicillum ）、アスペルギルス
（ Aspergillus）の１１のアレルゲンについて、それぞ
れの粗精製アレルゲンを実施例２の方法でポリスチレン
ビーズに固定化した。上述の各アレルゲンが固定された
１１個のビーズを４ｍｍ径×４ｃｍのポリスチレンチュ
ーブに移し、３００μｌの患者血清を添加後、封をして
ゆっくりと室温下２時間振盪した。血清を廃棄後、１ｍ
ｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２、１００ｍ
ＭＮａＣｌ、０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０
で１回洗浄した後に、３００μｌの１０ｍＭリン酸ナ
トリウム，ｐＨ７．２、１００ｍＭＮａＣｌ、０．２
５％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミンに溶解した１×１０^９
ｃｐｓ相当のルシフェラーゼ／抗体複合体を添加して、
封をしてゆっくりと室温下１時間振盪した。１ｍｌの１
０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．２、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、０．０５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０で２
回、１ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．
２、１００ｍＭＮａＣｌで３回洗浄した後に、ビーズ
をそれぞれルシフェラーゼ活性測定用のポリスチレンチ
ューブに移してルシフェラーゼ活性を測定した。

【００３９】第３表に、アレルギー患者３名について１
１項目のアレルゲン特異的ＩｇＥを同時に検出した例を
示した。その結果、患者血清中に存在するＩｇＥのう
ち、アレルゲンに特異的なＩｇＥのみを検出できること
が判明した。

【００４０】

【表３】

【００４１】

【発明の効果】本発明によって、生物発光酵素であるウ
ミホタル由来のルシフェラーゼを測定対象抗体量を測定
するための酵素免疫測定法に利用することが可能にな
り、迅速で血清使用量が少なく、簡便で高度の情報処理
装置を必要としないＩｇＥ測定法が提供された。また本
発明により、同時に多項目の特異的な抗体量を測定する
方法も提供された。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による方法と従来法（ＲＡＳＴ）による
コナヒョウヒダニ特異的ＩｇＥの検出の相関関係を示
す。

【図２】本発明による方法と従来法（ＲＡＳＴ）による
ヤケヒョウヒダニ特異的ＩｇＥの検出の相関関係を示
す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）測定対象抗体を含む試料と、測定対
象抗体と特異的に反応し得る抗原を固体担体に固定させ
た固定化抗原と、測定対象抗体と特異的に反応し得る標
識化抗体とを反応させる過程、ｂ）過程ａ）で生じた固定化抗原−測定対象抗体−標識
化抗体複合体を、未反応の標識化抗体と分離する過程、
およびｃ）固体担体に固定された複合体を該複合体に含まれる
標識を利用して検出する過程とを含む免疫測定法におい
て、標識酵素としてウミホタル由来のルシフェラーゼを使用
することを特徴とする酵素免疫測定方法。
【請求項２】固定化抗原が少なくとも２種以上の抗原
を固体担体に固定化してなることを特徴とする請求項１
記載の酵素免疫測定方法。