JP2675676B2 - 生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分析方法とその方法を実施するキット - Google Patents
生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分析方法とその方法を実施するキットInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的液体中の抗体を決定する免疫学的分
析方法に関するものであり、特に自己免疫疾患を診断す
る自己抗体を検出する分析方法である。
析方法に関するものであり、特に自己免疫疾患を診断す
る自己抗体を検出する分析方法である。
種々の免疫学的分析方法は、医学的な診断の中で非常
に重要な役割を果している。加えて、これらの分析方法
は抗原又はハプテン（例えばホルモン）の質的な及び／
又は定量的な決定を目指しており、生物学的流体、特に
人の血清中の抗体を決定するためのこの種の方法には多
くの分析方法がある。
に重要な役割を果している。加えて、これらの分析方法
は抗原又はハプテン（例えばホルモン）の質的な及び／
又は定量的な決定を目指しており、生物学的流体、特に
人の血清中の抗体を決定するためのこの種の方法には多
くの分析方法がある。
抗体は、免疫グロブリン（Ig）と称され、抗原に対す
る応答として産生されるタンパク質である。抗原は通常
多くの抗原決定基を有しており、抗体はポリクローナル
であり、またそれ故に、それらが指示されるものに対す
る抗原に関し異なる結合特性を有する蛋白質の集団を生
じる。それらは、、通常の状態では相当する抗原決定基
を有する物質から体を保護するために外因性の抗原を妨
害するものである。もし、体内の免疫機能が誤って内因
性の細胞または細胞構造を外因性のものとして認識して
しまったならば、その内因性の要素の抗原決定基に対し
ても抗体を形成することが可能である。このような内因
性の要素は自己抗原と称され、それらに対して生成され
た抗体は、自己抗体と称される。
る応答として産生されるタンパク質である。抗原は通常
多くの抗原決定基を有しており、抗体はポリクローナル
であり、またそれ故に、それらが指示されるものに対す
る抗原に関し異なる結合特性を有する蛋白質の集団を生
じる。それらは、、通常の状態では相当する抗原決定基
を有する物質から体を保護するために外因性の抗原を妨
害するものである。もし、体内の免疫機能が誤って内因
性の細胞または細胞構造を外因性のものとして認識して
しまったならば、その内因性の要素の抗原決定基に対し
ても抗体を形成することが可能である。このような内因
性の要素は自己抗原と称され、それらに対して生成され
た抗体は、自己抗体と称される。
既知の抗体の分析方法は、１つの形態又は別のものに
おいていくつかの基本的な原理が実現されており、その
うち２つの概要、例えば、米国特許第3654090号の第３
欄の最初の記載が示されている。その変法に従えば、古
典的なラジオイムノアッセイ（RIA）と一致し、不充分
な固定化抗原を使用し、そして標識された状態の決定す
るべき抗体が検査するべき試料に既知の量加えられる。
所望の抗体の存在もしくは濃度についての情報は、固定
された抗原に対する標識された抗体の結合の度合いから
得られる。抗原は、この試験においては競合原理に基づ
いて必要に応じて高純度化される。
おいていくつかの基本的な原理が実現されており、その
うち２つの概要、例えば、米国特許第3654090号の第３
欄の最初の記載が示されている。その変法に従えば、古
典的なラジオイムノアッセイ（RIA）と一致し、不充分
な固定化抗原を使用し、そして標識された状態の決定す
るべき抗体が検査するべき試料に既知の量加えられる。
所望の抗体の存在もしくは濃度についての情報は、固定
された抗原に対する標識された抗体の結合の度合いから
得られる。抗原は、この試験においては競合原理に基づ
いて必要に応じて高純度化される。
第２の原理に従えば、既知量の決定すべき抗体又はそ
れから派生する適当なものが固体気質上に固定化され、
そして検査すべき試料中に存在する抗体と固定された抗
体を、反応システムに添加された標識された抗原と競合
させる。その決定すべき抗体の存在又は量は、固定され
た抗体、すなわち固相に対する標識された抗原の結合の
減少から得られる。
れから派生する適当なものが固体気質上に固定化され、
そして検査すべき試料中に存在する抗体と固定された抗
体を、反応システムに添加された標識された抗原と競合
させる。その決定すべき抗体の存在又は量は、固定され
た抗体、すなわち固相に対する標識された抗原の結合の
減少から得られる。
この決定方法においては、高純化抗原の標識された状
態が必要とされ、またその決定すべき抗体と固定された
抗体とが、固定された抗体と調査するべき試料中の抗体
との両方の間に競合作用が起こり得るような量で存在す
る必要があり、実際には標識された抗原に親和するもの
は完全な同一性を持つとは考えられない。
態が必要とされ、またその決定すべき抗体と固定された
抗体とが、固定された抗体と調査するべき試料中の抗体
との両方の間に競合作用が起こり得るような量で存在す
る必要があり、実際には標識された抗原に親和するもの
は完全な同一性を持つとは考えられない。
更なる原理に従えば、抗原決定に関して周知のサンド
イッチ試験に類似する操作では、通常は固定化された状
態の過剰の抗原を最初に調製し、それに対して決定すべ
き抗体の総量が結合し、そして、第一の段階で結合した
抗体に対する第二の標識された“抗原”を用いた第二の
免疫反応を行い、サンドイッチ状免疫複合体が形成され
るとともに標識される。上記第２の「抗原」はしばし
ば、抗−抗体である（二重抗体法）か又はそれは標識さ
れたいわゆるプロテインＡの標識のために使用され、タ
ンパク質は細菌から得られ、多くのIgG抗体に非特異的
に結合する。この方法にあっては、要求される抗原の量
は試料中に存在する全ての抗体を結合するのに充分な量
とされる。もし、決定するべき抗体が大量であると予測
されると、試料は一般的に高度に希釈しなければなら
ず、その後でこの試験に使用され得る。これは特に被覆
チューブ技法に適用し、実用的な理由により度々好適に
用いられ、また微小滴下プレート技法では、抗原被覆さ
れた試験管が人の抗原約１〜２μｇの結合容量を有する
のみである。
イッチ試験に類似する操作では、通常は固定化された状
態の過剰の抗原を最初に調製し、それに対して決定すべ
き抗体の総量が結合し、そして、第一の段階で結合した
抗体に対する第二の標識された“抗原”を用いた第二の
免疫反応を行い、サンドイッチ状免疫複合体が形成され
るとともに標識される。上記第２の「抗原」はしばし
ば、抗−抗体である（二重抗体法）か又はそれは標識さ
れたいわゆるプロテインＡの標識のために使用され、タ
ンパク質は細菌から得られ、多くのIgG抗体に非特異的
に結合する。この方法にあっては、要求される抗原の量
は試料中に存在する全ての抗体を結合するのに充分な量
とされる。もし、決定するべき抗体が大量であると予測
されると、試料は一般的に高度に希釈しなければなら
ず、その後でこの試験に使用され得る。これは特に被覆
チューブ技法に適用し、実用的な理由により度々好適に
用いられ、また微小滴下プレート技法では、抗原被覆さ
れた試験管が人の抗原約１〜２μｇの結合容量を有する
のみである。
外因性抗原に相対する抗体の決定において、様々な試
験の機能的な要求は、しばしば大した困難もなく行われ
る。外因性抗原に対する抗体濃度は通常は比較的に低
く、また関連する抗原又はハプテンは化学的又は正化学
的方法により十分な量に合成することが度々あり、或い
は自然材料から分離し、そして濃縮することができる。
験の機能的な要求は、しばしば大した困難もなく行われ
る。外因性抗原に対する抗体濃度は通常は比較的に低
く、また関連する抗原又はハプテンは化学的又は正化学
的方法により十分な量に合成することが度々あり、或い
は自然材料から分離し、そして濃縮することができる。
しかしながら、上記原理の一つによって自己抗体を決
定するつもりであるならば、それには多数の困難があ
り、そのうちのいくつかは甚大であるが、自己抗体濃度
と自己抗原の性質の両方に原因がある。
定するつもりであるならば、それには多数の困難があ
り、そのうちのいくつかは甚大であるが、自己抗体濃度
と自己抗原の性質の両方に原因がある。
自己抗体の決定は自己免疫疾患の存在を検査する上で
非常に重要であり、殊に徴候を観察して正確に診断し、
また有害な誤った治療を避ける上で非常に重要である。
既知の自己免疫疾患のうちいくつかは極端に重症とな
り、例えばリウマチ様関節炎、糖尿病タイプ１、重症筋
無力症及び甲状腺と連合したいくつかの自己免疫疾患、
バゼドウ病と同種の甲状腺機能亢進症（またグレーブス
病を参照）、貧血性粘液水腫及び橋本病である。甲状腺
自己免疫疾患の場合、チレオグロブリン、THSレセプタ
ー及び／又はチロイドペルオキシダーゼ（TPO）が自己
抗原のように作用し、依存する疾患のタイプであり、ま
た後者のものはミクロソーム抗体と呼称されるものと同
一であることが最近見出された。本発明は以下の記載、
特に甲状腺の自己抗体の決定に関するもので、特にhTPO
に対する抗体、しかし本発明は新規な原理に基づいたも
のであり、それら特殊な決定法に限定されることはない
が、しかし他の自己抗体の決定に同じく有用に適用でき
る。他の抗体の決定においては、特殊のケースにおいて
も、周知の原理に基づいた分析方法よりも有利な点を有
している。
非常に重要であり、殊に徴候を観察して正確に診断し、
また有害な誤った治療を避ける上で非常に重要である。
既知の自己免疫疾患のうちいくつかは極端に重症とな
り、例えばリウマチ様関節炎、糖尿病タイプ１、重症筋
無力症及び甲状腺と連合したいくつかの自己免疫疾患、
バゼドウ病と同種の甲状腺機能亢進症（またグレーブス
病を参照）、貧血性粘液水腫及び橋本病である。甲状腺
自己免疫疾患の場合、チレオグロブリン、THSレセプタ
ー及び／又はチロイドペルオキシダーゼ（TPO）が自己
抗原のように作用し、依存する疾患のタイプであり、ま
た後者のものはミクロソーム抗体と呼称されるものと同
一であることが最近見出された。本発明は以下の記載、
特に甲状腺の自己抗体の決定に関するもので、特にhTPO
に対する抗体、しかし本発明は新規な原理に基づいたも
のであり、それら特殊な決定法に限定されることはない
が、しかし他の自己抗体の決定に同じく有用に適用でき
る。他の抗体の決定においては、特殊のケースにおいて
も、周知の原理に基づいた分析方法よりも有利な点を有
している。
甲状腺自己免疫疾患の分野における知識の現況の批評
は科学的な文献中に見出され、例えばMaran LudgateとG
ilbert Vassartの論説中:Autommunity,1990,Volume 7,2
01−211頁;Jadwiga FurmaniakとBernard Rees Smithの
批評の中:Autoimmunity,1990,Volume 7,63−80頁；及び
P.M.Schmm−Drager,H.J.C.Wenischの論説中:Akt.Endok
r.Stoffw.10（1989）,9−102頁（特別版）、これらには
甲状腺自己抗体を決定する方法の考察が与えられてい
る。
は科学的な文献中に見出され、例えばMaran LudgateとG
ilbert Vassartの論説中:Autommunity,1990,Volume 7,2
01−211頁;Jadwiga FurmaniakとBernard Rees Smithの
批評の中:Autoimmunity,1990,Volume 7,63−80頁；及び
P.M.Schmm−Drager,H.J.C.Wenischの論説中:Akt.Endok
r.Stoffw.10（1989）,9−102頁（特別版）、これらには
甲状腺自己抗体を決定する方法の考察が与えられてい
る。
そこには甲状腺自己抗体または一致する通常の自己抗
体の免疫疾患の決定に使用される一つの決定形式につい
て基礎的な困難との最初の出会いについて、自己抗体が
細胞膜中に停止される自己抗体に対して高い頻度で向け
られ、そして高純度でしかも平素な操作の必要量を得る
ことが困難であることが述べられている。人の甲状腺ペ
ルオキシダーゼ（hTPO）のケースにおいては、自己抗原
と同じようなその酵素は、橋本病によって感応し、それ
は、例えばグリコシレートヘム蛋白質であり、甲状腺膜
組織に結合されている。その抗原性特性は、エピトープ
の表面に存在する様式を包含し、それについて、P.Cara
yonら:Endocrinology,Vol.125,No.3,1211−1218頁の論
説中に記載されている。この甲状腺ペルオキシダーゼは
周知の原理に基づいた免疫疾患の決定のための抗原のよ
うな十分な純度と量があり、その甲状腺ペルオキシダー
ゼは、膜組織から蛋白的方法、または洗浄剤の手助けと
免疫吸着剤を経た純化、または通常のクロマトグラフィ
ー法に関するさまざまの分離段階によって分離せねばな
らず、例えば、ゲル瀘過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、水和相互作用を経たクロマトグラフィー、芳香族の
相互作用を経たクロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィーとコンカナバリンＡを用いたクロマトグラフィー
である。これらの方法は複雑であり、また酵素の分離の
際に故意でない交換の危険が課せられ、また高い材料ロ
スがある。高純度の自然甲状腺ペルオキシダーゼ（TP
O）はそれ故に小量であり、高価格である。それに代わ
るような甲状腺の腺組織からの甲状腺ペルオキシダーゼ
の分離する手法として、その試みは結果的にまた生産と
方法とが一般的な工学によりTPOの産生品を認可するこ
とに発展した。しかし、TPOを得るこの手法にあって
は、また制限された量と高価格のみに役立ち、そして一
般的に工学によって得られた自然甲状腺ペルオキシダー
ゼの同一性、特に抗原的特性に関しては、あらゆるケー
スについては保証できない。
体の免疫疾患の決定に使用される一つの決定形式につい
て基礎的な困難との最初の出会いについて、自己抗体が
細胞膜中に停止される自己抗体に対して高い頻度で向け
られ、そして高純度でしかも平素な操作の必要量を得る
ことが困難であることが述べられている。人の甲状腺ペ
ルオキシダーゼ（hTPO）のケースにおいては、自己抗原
と同じようなその酵素は、橋本病によって感応し、それ
は、例えばグリコシレートヘム蛋白質であり、甲状腺膜
組織に結合されている。その抗原性特性は、エピトープ
の表面に存在する様式を包含し、それについて、P.Cara
yonら:Endocrinology,Vol.125,No.3,1211−1218頁の論
説中に記載されている。この甲状腺ペルオキシダーゼは
周知の原理に基づいた免疫疾患の決定のための抗原のよ
うな十分な純度と量があり、その甲状腺ペルオキシダー
ゼは、膜組織から蛋白的方法、または洗浄剤の手助けと
免疫吸着剤を経た純化、または通常のクロマトグラフィ
ー法に関するさまざまの分離段階によって分離せねばな
らず、例えば、ゲル瀘過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、水和相互作用を経たクロマトグラフィー、芳香族の
相互作用を経たクロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィーとコンカナバリンＡを用いたクロマトグラフィー
である。これらの方法は複雑であり、また酵素の分離の
際に故意でない交換の危険が課せられ、また高い材料ロ
スがある。高純度の自然甲状腺ペルオキシダーゼ（TP
O）はそれ故に小量であり、高価格である。それに代わ
るような甲状腺の腺組織からの甲状腺ペルオキシダーゼ
の分離する手法として、その試みは結果的にまた生産と
方法とが一般的な工学によりTPOの産生品を認可するこ
とに発展した。しかし、TPOを得るこの手法にあって
は、また制限された量と高価格のみに役立ち、そして一
般的に工学によって得られた自然甲状腺ペルオキシダー
ゼの同一性、特に抗原的特性に関しては、あらゆるケー
スについては保証できない。
更なる困難がTPOの抗原的特性を化学的な影響によっ
て非常に大きく損ねるという事実から生じ、特にもし、
その結果、３次元的構造は変換及び／またはそのジスル
フィドの橋構造が壊れたような場合である（P.Caroyon
により論説の記載参照）。しかし、TPOを用いることが
可能とするために抗体法による古典的な方法における標
識された抗体、その標識はTPOに化学的に結合させなけ
ればならない。純粋なTPOを得ることの困難に加え、こ
のような状態にはリスクがあり、標識と連合させる反応
の結果として、TPOの抗原的特性はもはや自然TPOに一致
しないことにより影響されるであろうし、自己抗体を決
定するための抗原として適当な大きさの範囲でない。例
えば、分離操作により変換が引き起こされ及び／または
TPOの標識はこの方法におけるTPO標識とただいくつかの
ポリクローナルなTPO自己抗体との反応が起こり得る。
て非常に大きく損ねるという事実から生じ、特にもし、
その結果、３次元的構造は変換及び／またはそのジスル
フィドの橋構造が壊れたような場合である（P.Caroyon
により論説の記載参照）。しかし、TPOを用いることが
可能とするために抗体法による古典的な方法における標
識された抗体、その標識はTPOに化学的に結合させなけ
ればならない。純粋なTPOを得ることの困難に加え、こ
のような状態にはリスクがあり、標識と連合させる反応
の結果として、TPOの抗原的特性はもはや自然TPOに一致
しないことにより影響されるであろうし、自己抗体を決
定するための抗原として適当な大きさの範囲でない。例
えば、分離操作により変換が引き起こされ及び／または
TPOの標識はこの方法におけるTPO標識とただいくつかの
ポリクローナルなTPO自己抗体との反応が起こり得る。
少なくともいくつかの問題を避けるには分離操作とTP
Oの標識とを連合することであり、試験におけるTPOに高
純度化しない粗の状態のTPOが、抗原の分析のための最
初に記述されたサンドイッチ試験の変法と同じような発
達した固定化抗原が使用される。この試験にあっては、
しかしながら、固定化された粗TPOはやはり求める抗体
より他の抗体の固定化に導くところの抗原的特性を有す
る他の物体を含む可能性についての危険性があり、そし
てそれらは標識することに続いて起こり、相関的に二重
抗体法またはプロテインＡ標識による非特殊性標識と虚
偽の明確な結果を与えるであろう。
Oの標識とを連合することであり、試験におけるTPOに高
純度化しない粗の状態のTPOが、抗原の分析のための最
初に記述されたサンドイッチ試験の変法と同じような発
達した固定化抗原が使用される。この試験にあっては、
しかしながら、固定化された粗TPOはやはり求める抗体
より他の抗体の固定化に導くところの抗原的特性を有す
る他の物体を含む可能性についての危険性があり、そし
てそれらは標識することに続いて起こり、相関的に二重
抗体法またはプロテインＡ標識による非特殊性標識と虚
偽の明確な結果を与えるであろう。
実際的な観点からすると、特に要求される作業と決定
を性格に達成することに関して、自己抗体の決定におけ
る更なる問題は、自己免疫の疾患が存在する時、生物学
的液体中に非常に大量にそれが見出されることであり、
特別の患者の血清である。例えば、人の自己抗体20μｇ
は血清20μｌの試料の液量中から予期される。それによ
れば決定が可能となり、特に被覆管技法または微量滴下
プレート技法によって、それは結果的に患者の血清をい
くつかの液体に薄めることが通常必要となり、それは労
働強化と時間消費と誤差の加入源となる。
を性格に達成することに関して、自己抗体の決定におけ
る更なる問題は、自己免疫の疾患が存在する時、生物学
的液体中に非常に大量にそれが見出されることであり、
特別の患者の血清である。例えば、人の自己抗体20μｇ
は血清20μｌの試料の液量中から予期される。それによ
れば決定が可能となり、特に被覆管技法または微量滴下
プレート技法によって、それは結果的に患者の血清をい
くつかの液体に薄めることが通常必要となり、それは労
働強化と時間消費と誤差の加入源となる。
既知の免疫疾患の分析方法による自己免疫の決定にお
ける困難性の開示については、生物学的液体中の免疫疾
患性自己抗体のために斬新な方法が緊急に必要とされ、
生物学的液体中の抗体の安全な質的決定を認め、その結
果として適当な測定と方法のパラメーターの最適条件
は、抗体の信頼できる正確な決定のために適当なもので
あり、血清を希釈しないで用いることが可能であり、ま
た決定するべき抗体のために高純度な抗原の意味のある
量を用いることを不要とすることである。
ける困難性の開示については、生物学的液体中の免疫疾
患性自己抗体のために斬新な方法が緊急に必要とされ、
生物学的液体中の抗体の安全な質的決定を認め、その結
果として適当な測定と方法のパラメーターの最適条件
は、抗体の信頼できる正確な決定のために適当なもので
あり、血清を希釈しないで用いることが可能であり、ま
た決定するべき抗体のために高純度な抗原の意味のある
量を用いることを不要とすることである。
本発明の目的はそのような方法を提供することにあ
る。
る。
この目的は請求の範囲１項に記載されたような免疫学
的分析方法により達成される。
的分析方法により達成される。
好適な実施態様はその他の請求項中に含まれている。
本発明による分析方法にあっては、抗体（Ak）を決定
するための手続きが採用され、特に自己抗体について、
最初の固定された抗体（Ak imm）、抗原（Ag）、特に粗
抗原の添加、そして検出可能な標識を運ぶ更なる項た
（Ak＊）のサンドイッチ複合体の構造を妨害することを
検出する。この妨害は生物学的流体中に検出するべき抗
体（Ak）が存在するためである。前述の形式のサンドイ
ッチ複合体の妨害は、固相に対する標識された抗体（Ak
＊）の結合が減少したことを示すものである。試料中に
存在する決定すべき抗体もしくは自己抗体（Ak）による
サンドイッチ構造形成の妨害は、原理的に、サンドイッ
チ構造の合成のための各結合部位、または両方の結合部
位に同時に起こることができる。自己抗原のように振舞
い、自己抗体に対抗するのが可能な物質は、概して大き
な分子量の複合体であり、一般的にタンパク質であり、
それは抗体結合に関して少なくとも２つの領域またはエ
ピトーブを有しており、生成された抗体はポリクローナ
ルである。試験のために選択された、固定された抗体も
しくは標識された抗体の選択に依存して、異なるタイプ
のサンドイッチ複合体の構築が可能で、その結合および
妨害も関係し、自己抗体（Ak）の存在に基づいて非常に
異なった振舞をするであろう。特に固定された抗体（Ak
imm）と標識された抗体（Ak＊）の両方が適当なモノク
ローナル抗体の場合には、ある自己抗体（Ak）の検出に
適切な特性を備えたサンドウィッチを作製することがで
きる。TPOに関する自己抗体の決定の場合、この抗原に
存在するエピトープは比較的よく調べられており、この
抗原の特定のエピトープに向けられた様々なモノクロー
ナル抗体が利用できる。この結合に関しては上述した論
説（P.Carayonら、Endocrinology,Volume 125,No.3,112
1−1218頁）が参考となる。
するための手続きが採用され、特に自己抗体について、
最初の固定された抗体（Ak imm）、抗原（Ag）、特に粗
抗原の添加、そして検出可能な標識を運ぶ更なる項た
（Ak＊）のサンドイッチ複合体の構造を妨害することを
検出する。この妨害は生物学的流体中に検出するべき抗
体（Ak）が存在するためである。前述の形式のサンドイ
ッチ複合体の妨害は、固相に対する標識された抗体（Ak
＊）の結合が減少したことを示すものである。試料中に
存在する決定すべき抗体もしくは自己抗体（Ak）による
サンドイッチ構造形成の妨害は、原理的に、サンドイッ
チ構造の合成のための各結合部位、または両方の結合部
位に同時に起こることができる。自己抗原のように振舞
い、自己抗体に対抗するのが可能な物質は、概して大き
な分子量の複合体であり、一般的にタンパク質であり、
それは抗体結合に関して少なくとも２つの領域またはエ
ピトーブを有しており、生成された抗体はポリクローナ
ルである。試験のために選択された、固定された抗体も
しくは標識された抗体の選択に依存して、異なるタイプ
のサンドイッチ複合体の構築が可能で、その結合および
妨害も関係し、自己抗体（Ak）の存在に基づいて非常に
異なった振舞をするであろう。特に固定された抗体（Ak
imm）と標識された抗体（Ak＊）の両方が適当なモノク
ローナル抗体の場合には、ある自己抗体（Ak）の検出に
適切な特性を備えたサンドウィッチを作製することがで
きる。TPOに関する自己抗体の決定の場合、この抗原に
存在するエピトープは比較的よく調べられており、この
抗原の特定のエピトープに向けられた様々なモノクロー
ナル抗体が利用できる。この結合に関しては上述した論
説（P.Carayonら、Endocrinology,Volume 125,No.3,112
1−1218頁）が参考となる。
もし、TPOに対する自己抗体も結合する領域でTPOと結
合する抗体、特にモノクローナル抗体が、TPOに対する
固定された抗体として選択され、かつ、標識された抗体
Ak＊が、自己抗体によって影響されない結合をするよう
に選択されれば、サンドイッチの形成の妨害は、間接的
に標識された抗原のように見なせる抗原−標識された抗
体との複合体（Ag−Ak＊）に関する、決定すべき抗体Ak
と固定された抗体Ak immの間の競合による。もし、その
反対の試みが採用され、固定化された抗体Ak immが、決
定べき抗体（Ak）により妨害されることなく抗原に結合
されるように選択され、一方、標識された抗体Ak＊が、
調べられる抗体もしくは自己抗体も結合できる抗原の領
域またはエピトープに結合するなら、標識された抗体Ak
＊を含むサンドウィッチの形成の妨害は、間接的に固定
化された抗体に対する,Ak＊とAkとの間の競合によるも
のである。もし、両方の抗体Ak immとAk＊が、自己抗体
（Ak）も結合する抗体の領域に結合するなら、自己抗体
（Ak）の存在は、サンドイッチ構造および固定化を二重
に妨害し、感度強化の向上が与えられるであろう。
合する抗体、特にモノクローナル抗体が、TPOに対する
固定された抗体として選択され、かつ、標識された抗体
Ak＊が、自己抗体によって影響されない結合をするよう
に選択されれば、サンドイッチの形成の妨害は、間接的
に標識された抗原のように見なせる抗原−標識された抗
体との複合体（Ag−Ak＊）に関する、決定すべき抗体Ak
と固定された抗体Ak immの間の競合による。もし、その
反対の試みが採用され、固定化された抗体Ak immが、決
定べき抗体（Ak）により妨害されることなく抗原に結合
されるように選択され、一方、標識された抗体Ak＊が、
調べられる抗体もしくは自己抗体も結合できる抗原の領
域またはエピトープに結合するなら、標識された抗体Ak
＊を含むサンドウィッチの形成の妨害は、間接的に固定
化された抗体に対する,Ak＊とAkとの間の競合によるも
のである。もし、両方の抗体Ak immとAk＊が、自己抗体
（Ak）も結合する抗体の領域に結合するなら、自己抗体
（Ak）の存在は、サンドイッチ構造および固定化を二重
に妨害し、感度強化の向上が与えられるであろう。
本発明に係る方法の非常に意味のある有利性は、今日
までに知られる分析方法のような高純度の状態の抗原Ag
を必要とせず、粗抗原のようなもの、例えば臓器抽出物
のような状態のものを使用し得ることである。標識を含
むサンドウィッチの形成に必要な二重の抗体特異は、粗
な抗原と共にアッセイ系に導入される外的化合物による
試験の非特異的妨害が困難無く除去されることを意味
し、サンドウィッチの形成は所望の免疫学的結合パート
ナーに限られる。上述したケースにあっては、その粗抗
原は付随の基質とともに固定化されており、固定された
抗原に対する抗体ばかりでなく、粗抗原中の他の抗原性
物質の免疫学的結合パートナーも固相に結合し、標識さ
れた危険性があるが、このような妨害は本発明による方
法では起こり得ない。適当な臓器抽出物の状態である粗
抗原を用いることは、抗原の比較的温和な回収方法を使
用すること及び抗原の自然な構成が攻撃される純化工程
を省くことによる更なる有利性を有している。抗原はそ
れゆえ、生体中に存在する抗原をより一層正確に表現す
ることができるとともに、それは免疫学的な結合スペク
トルを完全なものにする。生体中に形成されたほんの少
しの自己抗体のみが調べられる危険性は、ごく少量であ
る。
までに知られる分析方法のような高純度の状態の抗原Ag
を必要とせず、粗抗原のようなもの、例えば臓器抽出物
のような状態のものを使用し得ることである。標識を含
むサンドウィッチの形成に必要な二重の抗体特異は、粗
な抗原と共にアッセイ系に導入される外的化合物による
試験の非特異的妨害が困難無く除去されることを意味
し、サンドウィッチの形成は所望の免疫学的結合パート
ナーに限られる。上述したケースにあっては、その粗抗
原は付随の基質とともに固定化されており、固定された
抗原に対する抗体ばかりでなく、粗抗原中の他の抗原性
物質の免疫学的結合パートナーも固相に結合し、標識さ
れた危険性があるが、このような妨害は本発明による方
法では起こり得ない。適当な臓器抽出物の状態である粗
抗原を用いることは、抗原の比較的温和な回収方法を使
用すること及び抗原の自然な構成が攻撃される純化工程
を省くことによる更なる有利性を有している。抗原はそ
れゆえ、生体中に存在する抗原をより一層正確に表現す
ることができるとともに、それは免疫学的な結合スペク
トルを完全なものにする。生体中に形成されたほんの少
しの自己抗体のみが調べられる危険性は、ごく少量であ
る。
一方、試験に用いるモノクローナル抗体を適当に選択
すると、ある自己抗体に対してのみ非常に特異的に反応
するようにも、より選択的にするようにもできる。も
し、免疫疾患に関する徴候が、生体により形成されたポ
リクローナルな自己抗体の非常に特殊なクローンに起因
するなら、その自己抗体クローンを決定する方法は、モ
ノクローナル又は任意に選ばれたポリクローナル抗体を
使用することにより行われる。
すると、ある自己抗体に対してのみ非常に特異的に反応
するようにも、より選択的にするようにもできる。も
し、免疫疾患に関する徴候が、生体により形成されたポ
リクローナルな自己抗体の非常に特殊なクローンに起因
するなら、その自己抗体クローンを決定する方法は、モ
ノクローナル又は任意に選ばれたポリクローナル抗体を
使用することにより行われる。
本発明による方法においては、過度に高価な試験とす
ること無く、粗な抗原、例えば粗hTPOを、自己抗体の量
に比較して十分な量で使用することができるので、自己
抗体濃度が高いことが予想されても問題とならない。粗
抗原を使用することが可能であるので、本発明による方
法では２つの添加抗体（Ak imm,Ak＊）が必要である
が、唯一の抗体でも高純度の抗原が作用する方法に比較
してコスト上昇を与える不利益がないので、コストの点
において有利である。
ること無く、粗な抗原、例えば粗hTPOを、自己抗体の量
に比較して十分な量で使用することができるので、自己
抗体濃度が高いことが予想されても問題とならない。粗
抗原を使用することが可能であるので、本発明による方
法では２つの添加抗体（Ak imm,Ak＊）が必要である
が、唯一の抗体でも高純度の抗原が作用する方法に比較
してコスト上昇を与える不利益がないので、コストの点
において有利である。
本発明による分析方法または、予期される量の抗原Ag
又は標識された抗体Ak＊又は固定された抗体Ak immが入
る広い範囲の試験条件に適合させることによる選択の要
求に基づいて最適化するために非常に適している。これ
は重要な問題を無くする可能性があり、その良好な有用
性により、また粗抗原の低価格に関した自然の抗原を使
用した。この抗原の量は予期され又は自己抗体の量を可
能性と直接に対応させることができ、それは生物学的液
体と同じ手段であり、即ち、特に血清を希釈せずに使用
し得る。
又は標識された抗体Ak＊又は固定された抗体Ak immが入
る広い範囲の試験条件に適合させることによる選択の要
求に基づいて最適化するために非常に適している。これ
は重要な問題を無くする可能性があり、その良好な有用
性により、また粗抗原の低価格に関した自然の抗原を使
用した。この抗原の量は予期され又は自己抗体の量を可
能性と直接に対応させることができ、それは生物学的液
体と同じ手段であり、即ち、特に血清を希釈せずに使用
し得る。
使用する免疫学的反応体の量に関しては、当業者にと
って自明であるように、添加すべき抗原の量は、決定す
べき全ての抗体Akと、全ての標識された抗体Ak＊又は飽
和されそして抗原によりそれらの間にいくらかの特有な
競合がもはや存在しない全ての固定された抗体Ak immの
両方について非常に大きくすることはないであろう。同
様なケースにおいて、固定化の意味のある状態である標
識されたサンドイッチ状は確かな状況中で抑えることが
でき、そして定量的な決断でない自己抗体のおよその実
際量が試料中に存在する可能性が有る。
って自明であるように、添加すべき抗原の量は、決定す
べき全ての抗体Akと、全ての標識された抗体Ak＊又は飽
和されそして抗原によりそれらの間にいくらかの特有な
競合がもはや存在しない全ての固定された抗体Ak immの
両方について非常に大きくすることはないであろう。同
様なケースにおいて、固定化の意味のある状態である標
識されたサンドイッチ状は確かな状況中で抑えることが
でき、そして定量的な決断でない自己抗体のおよその実
際量が試料中に存在する可能性が有る。
もし、例えば、標識された抗体Ak＊の不足が、加えら
れた抗原の量に関連して用いられ、抗原の一部のみが免
疫複合体Ag−Ak＊の状態で標識されるならば、その標識
されたAk＊の量は、複合体の最終的な結合の量が小さい
ために、それが固定された抗体Ak immにより無標識の抗
原と競合するので、当然極端に小さくしてはならない。
別に開示された変法においては、固定された抗体Ak imm
の量として類似の状況に適合させる。
れた抗原の量に関連して用いられ、抗原の一部のみが免
疫複合体Ag−Ak＊の状態で標識されるならば、その標識
されたAk＊の量は、複合体の最終的な結合の量が小さい
ために、それが固定された抗体Ak immにより無標識の抗
原と競合するので、当然極端に小さくしてはならない。
別に開示された変法においては、固定された抗体Ak imm
の量として類似の状況に適合させる。
必要もしくはある試験に最も有利とされる抗原Ag、固
定された抗体Ak immおよび標識された抗体Ak＊の濃度
は、例えば抗原の添加量を介した試験（検量線）の感度
を変えることによって、慣例的な最適化で困難無しに、
測定される抗体Akの予想される量を考慮して決めること
ができる。
定された抗体Ak immおよび標識された抗体Ak＊の濃度
は、例えば抗原の添加量を介した試験（検量線）の感度
を変えることによって、慣例的な最適化で困難無しに、
測定される抗体Akの予想される量を考慮して決めること
ができる。
本発明による方法において使用され得る抗体は、本質
的は免疫学的な分析方法に適している全ての抗体であろ
う。それらの親和力の定数は通常1012〜108l/molの範囲
とされる。
的は免疫学的な分析方法に適している全ての抗体であろ
う。それらの親和力の定数は通常1012〜108l/molの範囲
とされる。
固定された抗体Ak immのために使用可能な固体基質
と、免疫学的な反応条件（pHが４〜９、緩衝液である;0
℃〜約55℃の温度中；反応時間）に関して、その操作
は、他の通常の免疫学的な分析方法と基本的に異なって
いない。その免疫学的な反応は、届けられた全ての反応
物の間に平衡が保たれるような条件の下で実行すること
が可能である。しかし、それは原則としてまた早い予備
検査時間で反応を停止すること及びその比率をより早い
時間で決定することが可能である。本発明による方法
は、以下の詳細な説明と実施態様では、人の甲状腺ペル
オキシダーゼ（hTPO）に相対する自己免疫の決定に関す
るとともにそれに用いられるhTPOに相対する２つの添加
されるモノクローナル抗体及び添加される抗原のような
人の甲状腺からの抽出物の状態にある粗hTPOに関してお
り、またその効力は、同様の自己免疫の決定のための周
知の方法と比較される。
と、免疫学的な反応条件（pHが４〜９、緩衝液である;0
℃〜約55℃の温度中；反応時間）に関して、その操作
は、他の通常の免疫学的な分析方法と基本的に異なって
いない。その免疫学的な反応は、届けられた全ての反応
物の間に平衡が保たれるような条件の下で実行すること
が可能である。しかし、それは原則としてまた早い予備
検査時間で反応を停止すること及びその比率をより早い
時間で決定することが可能である。本発明による方法
は、以下の詳細な説明と実施態様では、人の甲状腺ペル
オキシダーゼ（hTPO）に相対する自己免疫の決定に関す
るとともにそれに用いられるhTPOに相対する２つの添加
されるモノクローナル抗体及び添加される抗原のような
人の甲状腺からの抽出物の状態にある粗hTPOに関してお
り、またその効力は、同様の自己免疫の決定のための周
知の方法と比較される。
図面の詳細 第１図は本発明による方法の第１の変形の概要図で、
固定された抗体Ak immが抗原Agの領域に結合され、それ
が抗体Akによってまた認識され、それが検出され、また
それはむしろましな抗体であり、抗原と固相の表面に固
定されたそれを干渉することにより抗体Akは固定された
抗体Ak immと競合する；その妨害は抗体Akがここに表現
されたまま以下の第２図及び第３図に象徴されるように
抗体Akの間に入る運動により引き起こされ、実質上当該
技術分野で明確であっても、挙行された妨害は抗原によ
る競合のためである。
固定された抗体Ak immが抗原Agの領域に結合され、それ
が抗体Akによってまた認識され、それが検出され、また
それはむしろましな抗体であり、抗原と固相の表面に固
定されたそれを干渉することにより抗体Akは固定された
抗体Ak immと競合する；その妨害は抗体Akがここに表現
されたまま以下の第２図及び第３図に象徴されるように
抗体Akの間に入る運動により引き起こされ、実質上当該
技術分野で明確であっても、挙行された妨害は抗原によ
る競合のためである。
第２図は本発明による方法の更なる変形を示すもの
で、ここでは検出すべき抗体Akと標識された抗体Ak＊が
抗原Agの領域のために競合し、それはAk immを経た間接
的な固定化であり、またそれは自己抗体Akにより認識さ
れる。
で、ここでは検出すべき抗体Akと標識された抗体Ak＊が
抗原Agの領域のために競合し、それはAk immを経た間接
的な固定化であり、またそれは自己抗体Akにより認識さ
れる。
第３図は本発明による方法の第３の変形であり、ここ
では固定化された抗体Ak immと標識された抗体Ak＊の双
方が抗原Agの領域に結合され、自己抗体Akによって同様
に認識され、試料中の抗体Akが存在するように２重の妨
害が引き起こされる。
では固定化された抗体Ak immと標識された抗体Ak＊の双
方が抗原Agの領域に結合され、自己抗体Akによって同様
に認識され、試料中の抗体Akが存在するように２重の妨
害が引き起こされる。
第４図は、抗原に用いる（粗hTPO）の量の作用のよう
に、人の甲状腺ペルオキシダーゼ（hTPO）に対する人の
自己免疫の検出のための分析における標準曲線を表すグ
ラフを示す。
に、人の甲状腺ペルオキシダーゼ（hTPO）に対する人の
自己免疫の検出のための分析における標準曲線を表すグ
ラフを示す。
実施例 以下の実施例は、本発明による方法を実現する分析操
作とその原理的な有効性を記載しており、人の甲状腺ペ
ルオキシダーゼ（hTPO）に対する人の自己抗体の検出に
関係する実施態様に関する。
作とその原理的な有効性を記載しており、人の甲状腺ペ
ルオキシダーゼ（hTPO）に対する人の自己抗体の検出に
関係する実施態様に関する。
1.固相表面へのモノクローナル抗−hTPO抗体（Ak imm）
の固定化 hPOに対する人の自己抗体により認識されるhTPOの領
域に結合する純粋なモノクローナル抗体は、固相に結合
する抗体のように選択された。その純粋なモノクローナ
ル抗体は、モノクローナルなマウスの抗−hTPO抗体が用
いられ、それはP.Carayonの文献中:Endocrinology,Vol.
125,No.3,1212頁，左欄の下行、右欄上段に開示された
プロセスにより調整され、そして選択基準に従って選択
することについて同じ文献に、領域中のhTPOを認定する
ためのものとして同じく人の抗−hTPO自己抗体により認
識することが開示されている。
の固定化 hPOに対する人の自己抗体により認識されるhTPOの領
域に結合する純粋なモノクローナル抗体は、固相に結合
する抗体のように選択された。その純粋なモノクローナ
ル抗体は、モノクローナルなマウスの抗−hTPO抗体が用
いられ、それはP.Carayonの文献中:Endocrinology,Vol.
125,No.3,1212頁，左欄の下行、右欄上段に開示された
プロセスにより調整され、そして選択基準に従って選択
することについて同じ文献に、領域中のhTPOを認定する
ためのものとして同じく人の抗−hTPO自己抗体により認
識することが開示されている。
そこに述べられたモノクローナルなマウスの抗−hTPO
抗体と試験管の壁中に形成された同相とのカップリング
は以下のような既知の方法で実施される。
抗体と試験管の壁中に形成された同相とのカップリング
は以下のような既知の方法で実施される。
試験管（NUNC製STAR Tubes 12×75mm、カタログNo.47
0/319）に１μｇの抗−マウス−IgG（シグマ社製，カタ
ログNo.MA 8642）の入った300μｌのpH7.8の水系緩衝液
を入れ、その緩衝液は10mmolのトリス塩酸と10mmolのNa
Clの濃度を有する。ついで室温下20時間インキュベート
しその試験管を２度洗浄した。その試験管は0.5％のBSA
（bovine serum albumin;シグマ社製、カタログNo.A 32
94）の溶液を十分に浸漬させ、即ちその試験管に浸漬液
を入れ、室温下で２時間インキュベートし、ついで中身
を他に移した。それに続く第３の工程においては、加え
られたモノクローナルなマウスの抗−hTPO抗体はその述
べられたモノクローナル抗原から免疫的な抽出物により
固相に結合され、上述した緩衝液の300μｌ中に0.2μｇ
の量を後者は含有し、この操作によれば室温下で20時間
のインキュベーションが実行される。その後、その試験
管を洗浄し、上記と同一の浸漬液を用いて最終的な浸漬
が実行される。その試験管に含有される固定化モノクロ
ーナル抗体はそれから凍結乾燥される。
0/319）に１μｇの抗−マウス−IgG（シグマ社製，カタ
ログNo.MA 8642）の入った300μｌのpH7.8の水系緩衝液
を入れ、その緩衝液は10mmolのトリス塩酸と10mmolのNa
Clの濃度を有する。ついで室温下20時間インキュベート
しその試験管を２度洗浄した。その試験管は0.5％のBSA
（bovine serum albumin;シグマ社製、カタログNo.A 32
94）の溶液を十分に浸漬させ、即ちその試験管に浸漬液
を入れ、室温下で２時間インキュベートし、ついで中身
を他に移した。それに続く第３の工程においては、加え
られたモノクローナルなマウスの抗−hTPO抗体はその述
べられたモノクローナル抗原から免疫的な抽出物により
固相に結合され、上述した緩衝液の300μｌ中に0.2μｇ
の量を後者は含有し、この操作によれば室温下で20時間
のインキュベーションが実行される。その後、その試験
管を洗浄し、上記と同一の浸漬液を用いて最終的な浸漬
が実行される。その試験管に含有される固定化モノクロ
ーナル抗体はそれから凍結乾燥される。
2.人の甲状腺hTPO抽出物の処理 凍結された人の甲状腺（60g）を細かく砕き、緩衝液
（200mlのリン酸塩性緩衝液、PBS）を加え、ホモジナイ
ザー（IKA Werke製 Ultraturrax）を用いてホモジナイ
ズを実行した。10万Ｇで１時間の遠心分離を実行し、つ
いでその上清を分離し、また得られた塊状物を細片化し
た甲状腺と同じように再度ホモジナイザズした。これに
ついて次にさらに10万Ｇで１時間遠心分離した。ここで
得られた塊状物は再度PBS（200ml）中にその上に洗剤と
して、PIERCE社製0.5％トリトンX100（カタログNo.2831
4）を含んだ液中でホモジナイズし、４℃で１時間撹拌
を実行した。最後に、得られたホモジネートを10万Ｇで
２時間遠心分離した。その結果得られた上清はhTPO抽出
物であり、それはhTPOに対する自己抗体の決定であるた
めの本発明による方法における粗自然抗原Agとして使用
されるものである。
（200mlのリン酸塩性緩衝液、PBS）を加え、ホモジナイ
ザー（IKA Werke製 Ultraturrax）を用いてホモジナイ
ズを実行した。10万Ｇで１時間の遠心分離を実行し、つ
いでその上清を分離し、また得られた塊状物を細片化し
た甲状腺と同じように再度ホモジナイザズした。これに
ついて次にさらに10万Ｇで１時間遠心分離した。ここで
得られた塊状物は再度PBS（200ml）中にその上に洗剤と
して、PIERCE社製0.5％トリトンX100（カタログNo.2831
4）を含んだ液中でホモジナイズし、４℃で１時間撹拌
を実行した。最後に、得られたホモジネートを10万Ｇで
２時間遠心分離した。その結果得られた上清はhTPO抽出
物であり、それはhTPOに対する自己抗体の決定であるた
めの本発明による方法における粗自然抗原Agとして使用
されるものである。
3.化学発光体標識により標識された抗−hTPO抗体（A
k＊）の調整 モノクローナルなマウスの抗−hTPO抗体は、上記1.の
下部に記載したモノクローナル抗体と一致するような同
じ方法による原理において得られた。しかし、それを選
択することはその領域の外部にhTPOが結合することによ
って、既知の方法によりアクリジニウムエステルととも
に標識されるhTPOに対する人の自己免疫によりやはり認
識される。この目的のために、純粋なモノクローナル抗
体（PBS100μｌ中に100μｇ）がアクリジニウムエステ
ル（アセトニトリル２μｌ中に２μｇ）と室温下、10分
間反応せしめられる。アクリジニウムエステルとともに
標識される抗体は、次にHPLCにより反応しなかった遊離
のアクリジニウムエステルから分離される。
k＊）の調整 モノクローナルなマウスの抗−hTPO抗体は、上記1.の
下部に記載したモノクローナル抗体と一致するような同
じ方法による原理において得られた。しかし、それを選
択することはその領域の外部にhTPOが結合することによ
って、既知の方法によりアクリジニウムエステルととも
に標識されるhTPOに対する人の自己免疫によりやはり認
識される。この目的のために、純粋なモノクローナル抗
体（PBS100μｌ中に100μｇ）がアクリジニウムエステ
ル（アセトニトリル２μｌ中に２μｇ）と室温下、10分
間反応せしめられる。アクリジニウムエステルとともに
標識される抗体は、次にHPLCにより反応しなかった遊離
のアクリジニウムエステルから分離される。
4.hTPOに対する人の自己抗体の決定 ａ）hTPOに対する人の自己抗体の決定のために、本例に
おける標識された抗体Ak＊が最初に反応せしめられ、1:
1のモル比で、抗原AgとしてhTPO抽出物を用いた。その
反応は緩衝液中、４℃で20時間行なわれ、その緩衝液は
次の組成:50mmolのリン酸ナトリウム、0.1重量％のTrit
on X、0.2重量％のEDTA、0.3％のBSA（bovine serum al
bumin）、100μｇのマウスIgG（シグマ社製、No.I 538
1）と10μg/mlのボビンIgG（シグマ社製、NO.5506）の
ものを用いた。その緩衝液のpHは7.8であった。
おける標識された抗体Ak＊が最初に反応せしめられ、1:
1のモル比で、抗原AgとしてhTPO抽出物を用いた。その
反応は緩衝液中、４℃で20時間行なわれ、その緩衝液は
次の組成:50mmolのリン酸ナトリウム、0.1重量％のTrit
on X、0.2重量％のEDTA、0.3％のBSA（bovine serum al
bumin）、100μｇのマウスIgG（シグマ社製、No.I 538
1）と10μg/mlのボビンIgG（シグマ社製、NO.5506）の
ものを用いた。その緩衝液のpHは7.8であった。
ｂ）hTPOに対する人の自己抗体の検出のため又はその測
定のため、次の操作を各々用いた。
定のため、次の操作を各々用いた。
1.検査するべき試料20μｇ、又は標準品、又は血清を、
試験管内に注入した。この試験管は上記１項に開示され
たプロセス工程により、管壁面にコートしたマウスの抗
−hTPOを有している。
試験管内に注入した。この試験管は上記１項に開示され
たプロセス工程により、管壁面にコートしたマウスの抗
−hTPOを有している。
2.上記4a）により調製した混合体300μｌと、人の甲状
腺から抽出した状態の抗原hTPOを含んでおり、また反応
された標識マウス抗−TPOのそれぞれをピペットで移送
した。
腺から抽出した状態の抗原hTPOを含んでおり、また反応
された標識マウス抗−TPOのそれぞれをピペットで移送
した。
3.その添加が終了した後、振り混ぜながら室温下で３時
間、インキュベートし、その反応混合物を得た。その試
験管は、それから洗浄し、そして試験管の壁に結合した
アクリジニウムエステルのトレーサの量を、Berthold A
utoclinilumat LB 952/16により周知の光反応の手段に
より測定した。
間、インキュベートし、その反応混合物を得た。その試
験管は、それから洗浄し、そして試験管の壁に結合した
アクリジニウムエステルのトレーサの量を、Berthold A
utoclinilumat LB 952/16により周知の光反応の手段に
より測定した。
第４図は、検査するべき試料又は用いた標準品におけ
る自己抗体の量の変化により得られた測定曲線であり、
人の甲状腺抽出物の状態にある添加抗原（hTPO）の量を
変えて分析し、その“TPO希釈”のデータは上記２項の
記載にある甲状腺膜の抽出物に関係している。第４図か
ら明らかなように、曲線の形状とそれゆえの感度の測定
法は使用した抗原の量（hTPOの量）を変化させることに
より変えることが可能であることを示している。
る自己抗体の量の変化により得られた測定曲線であり、
人の甲状腺抽出物の状態にある添加抗原（hTPO）の量を
変えて分析し、その“TPO希釈”のデータは上記２項の
記載にある甲状腺膜の抽出物に関係している。第４図か
ら明らかなように、曲線の形状とそれゆえの感度の測定
法は使用した抗原の量（hTPOの量）を変化させることに
より変えることが可能であることを示している。
5.臨床データ 臨床的研究において、開示された新規な方法で得られ
た結果は、hTPOに対する自己抗体の決定のための現存の
免疫学的な分析方法を用い、陽性反応の患者29名によっ
て得られたそれらの結果と比較した。
た結果は、hTPOに対する自己抗体の決定のための現存の
免疫学的な分析方法を用い、陽性反応の患者29名によっ
て得られたそれらの結果と比較した。
その結果は表１に要約される。
この表１においてａ）、ｂ）、及びｃ）項は、以下に
詳述する従来技術の分析方法の結果に関し、またｄ）項
は上述したような新規方法を実施して得られた結果を示
している。
詳述する従来技術の分析方法の結果に関し、またｄ）項
は上述したような新規方法を実施して得られた結果を示
している。
比較の方法として用いた従来技術の方法と本発明によ
る方法を比較した場合の特徴を述べると、 ａ）は固相上に抗−hTPO抗体を用いた方法である。放
射性標識と純粋なhTPOは人の自己抗体により固相から置
換される。この試験には、出願人のDYNOtest Anti−TPO
のように有用な市販の市販試験品を用いた。
る方法を比較した場合の特徴を述べると、 ａ）は固相上に抗−hTPO抗体を用いた方法である。放
射性標識と純粋なhTPOは人の自己抗体により固相から置
換される。この試験には、出願人のDYNOtest Anti−TPO
のように有用な市販の市販試験品を用いた。
ｂ）の試験は、プロテインＡが固相上に固定化されて
いる。試料中の抗体は固相に結合されて検出され、また
それに続き標識され純化されたhTPOの助力により検出さ
れる。特有のケースにあっては、放射線沃素−標識hTPO
が出願人のIMMUtest Anti−TPO中のものを用いた。
いる。試料中の抗体は固相に結合されて検出され、また
それに続き標識され純化されたhTPOの助力により検出さ
れる。特有のケースにあっては、放射線沃素−標識hTPO
が出願人のIMMUtest Anti−TPO中のものを用いた。
ｃ）の試験では、粗TPO（いわゆるミクロゾーム抗原
のような）が固相上に固定化された状態で用いた。結合
抗体の結合と検出は、標識されたプロテインＡの助力に
より実行された。その比較試験は出願人のPROMAK assey
である。
のような）が固相上に固定化された状態で用いた。結合
抗体の結合と検出は、標識されたプロテインＡの助力に
より実行された。その比較試験は出願人のPROMAK assey
である。
表１における比較結果より明らかなように、比較試験
ａ）（トレーサとして純粋な標識hTPO）と、比較試験
ｂ）（固相上にプロテインＡ、トレーサとして純粋な標
識hTPO）の各ケースは、ｃ）の分析方法と本発明による
新規方法ｄ）に比べて低い値となっている。即ち、分析
方法ａ）は、個々の患者試料（患者７、16、28）によっ
て他の方法より実質的に低い値が与えられ、分析方法
ｂ）は他の試験によりわずかに陽性（患者１、29）の一
定の患者に陰性の結果を与え、また他の分析方法より低
い値を一定の患者（患者４、８、11、12、17、19、20、
27）に与えた。それについて指摘せねばならず、患者
１、29のケースについて、それら試料は分析方法ｂ）に
より自己抗体がないものと誤って一様に検出されたもの
である。患者７、28のケースについて分析方法ａ）では
極端に微量な陽性でしかないが、それらは他の方法では
強い陽性である。
ａ）（トレーサとして純粋な標識hTPO）と、比較試験
ｂ）（固相上にプロテインＡ、トレーサとして純粋な標
識hTPO）の各ケースは、ｃ）の分析方法と本発明による
新規方法ｄ）に比べて低い値となっている。即ち、分析
方法ａ）は、個々の患者試料（患者７、16、28）によっ
て他の方法より実質的に低い値が与えられ、分析方法
ｂ）は他の試験によりわずかに陽性（患者１、29）の一
定の患者に陰性の結果を与え、また他の分析方法より低
い値を一定の患者（患者４、８、11、12、17、19、20、
27）に与えた。それについて指摘せねばならず、患者
１、29のケースについて、それら試料は分析方法ｂ）に
より自己抗体がないものと誤って一様に検出されたもの
である。患者７、28のケースについて分析方法ａ）では
極端に微量な陽性でしかないが、それらは他の方法では
強い陽性である。
方法ｃ）はhTPOに対する抗体の添加において不利益が
あり、付随の蛋白質に対する多数の別の自己免疫が測定
され、それが読み取られ、例えば、患者10ではhTPOに対
する自己抗体が検出されているが、別の全ての方法によ
れば、hTPOに対する自己抗体が無いものとされている。
あり、付随の蛋白質に対する多数の別の自己免疫が測定
され、それが読み取られ、例えば、患者10ではhTPOに対
する自己抗体が検出されているが、別の全ての方法によ
れば、hTPOに対する自己抗体が無いものとされている。
本発明による方法での原理は、最初に詳細に説明した
ように、多くの関係の中で変化し易いことに基づかれて
いる。抗原が標識されて以来、標識化のためにいくつか
の現用の既知の標識を用いることが可能である。抗原
（粗hTPO）と標識された抗体との上述した反応に変え
て、開示されたような特有のケースでは、それはまた同
時に反応するような方法を実行する可能性があり、即
ち、粗抗原（hTPO）に代えて、調査するべき試料の添加
に先だって、間接的に予備標識されたものと標識された
抗体を分離する工程があり、そのインキュベーションは
次のように実行される。
ように、多くの関係の中で変化し易いことに基づかれて
いる。抗原が標識されて以来、標識化のためにいくつか
の現用の既知の標識を用いることが可能である。抗原
（粗hTPO）と標識された抗体との上述した反応に変え
て、開示されたような特有のケースでは、それはまた同
時に反応するような方法を実行する可能性があり、即
ち、粗抗原（hTPO）に代えて、調査するべき試料の添加
に先だって、間接的に予備標識されたものと標識された
抗体を分離する工程があり、そのインキュベーションは
次のように実行される。
自己抗体を調査するべき試料は、第１のピペット移送
で固定化された抗体が被覆された試験管内に移され、そ
の標識された抗体Ak＊はその時に添加され、また最終的
な抗原溶液（hTPO溶液）が添加され、その結果反応が始
められる。
で固定化された抗体が被覆された試験管内に移され、そ
の標識された抗体Ak＊はその時に添加され、また最終的
な抗原溶液（hTPO溶液）が添加され、その結果反応が始
められる。
そのような手続は結合状態が人の自己抗体のようにや
はり影響を及ぼし、また標識された抗体Ak＊とその抗原
Ag（hTPO）の間の相互作用が弱くなる時に有効であり、
第３図による組立てと相似的である。
はり影響を及ぼし、また標識された抗体Ak＊とその抗原
Ag（hTPO）の間の相互作用が弱くなる時に有効であり、
第３図による組立てと相似的である。
他のピペット移送の組立ては同じく可能である。例え
ば、試験容器内に固相と一緒にAk immによるバインダー
を配置しそしてその時にピペット移送する間の分析手続
までに第１の抗体Ak immを固定化しないこともまた可能
であり、例えば、Ak immとAk＊の混合物に、抗原Agを添
加することにより反応を最終的に始動させることであ
る。
ば、試験容器内に固相と一緒にAk immによるバインダー
を配置しそしてその時にピペット移送する間の分析手続
までに第１の抗体Ak immを固定化しないこともまた可能
であり、例えば、Ak immとAk＊の混合物に、抗原Agを添
加することにより反応を最終的に始動させることであ
る。
試料は予備希釈の必要を欠いているけれども、それは
本発明による方法の重要な有効性であり、それはまた当
然の可能性として、予備希釈された状態の試料を用いる
ことにより試験が変化することが要求される。
本発明による方法の重要な有効性であり、それはまた当
然の可能性として、予備希釈された状態の試料を用いる
ことにより試験が変化することが要求される。
最初に述べているように、その方法の新規な原理はhT
POに対する自己抗体の決定にのみ限定されることはな
い。類似の有効性は、膜連合物や他の自己抗原に対して
形成されるところの他の自己抗体の決定においてもまた
予想される。この情況において、それは、ニコチン様式
のアセチルコリンレセプターに対する自己抗体の決定に
ついて言及する可能性があり、その発生は重症自己免疫
疾患の筋無力症に特有のものであると一般的に信じられ
ている。
POに対する自己抗体の決定にのみ限定されることはな
い。類似の有効性は、膜連合物や他の自己抗原に対して
形成されるところの他の自己抗体の決定においてもまた
予想される。この情況において、それは、ニコチン様式
のアセチルコリンレセプターに対する自己抗体の決定に
ついて言及する可能性があり、その発生は重症自己免疫
疾患の筋無力症に特有のものであると一般的に信じられ
ている。
しかし本発明による方法は、自己抗体ではなく、また
生物学的液体中に自己抗体に比べて非常に低い濃度で発
生するであろうその抗体の決定のためにも当然に使用で
きる。ここでまた、本発明による方法は、純粋な状態で
やっと入手可能な抗原が粗の状態で使用可能であり及び
／又は敏感な抗原の直接標識及び／又は標識することを
避けることができる困難性のある個々のケースにおいて
有利な点を持たせることができる。
生物学的液体中に自己抗体に比べて非常に低い濃度で発
生するであろうその抗体の決定のためにも当然に使用で
きる。ここでまた、本発明による方法は、純粋な状態で
やっと入手可能な抗原が粗の状態で使用可能であり及び
／又は敏感な抗原の直接標識及び／又は標識することを
避けることができる困難性のある個々のケースにおいて
有利な点を持たせることができる。
Claims (12)
- 【請求項１】自己免疫疾患の疑いがある患者から得られ
た生物学的流体中における、自己免疫疾患を示唆する自
己抗体の検出のための免疫学的分析方法であって、以下
の工程、すなわち 抗体が抗原と特異的に結合できる条件下で所定の時間
で、前記生物学的流体を、 ヒトもしくは動物の器官由来の、未精製抽出物形態をと
る、少なくとも第一の結合部位と第二の結合部位とを備
えた所定量の抗原、 前記抗原の前記第一の結合部位に特異的に結合する所定
量の固定された抗体を備えた固相もしくは微小固相、お
よび 検出可能な標識を備え、前記抗原の前記第二の結合部位
に特異的に結合する所定量の標識された抗体と共にイン
キュベートする工程； 前記固定された抗体を備えた前記固相もしくは微小固相
を、固定されていない物質から分離する工程； 前記固定された抗体を備えた前記固相もしくは微小固相
における前記検出可能な標識の存在もしくは量を調べる
工程、および 前記固相もしくは微小固相における検出可能な標識の存
在もしくは量から、生物学的流体中における自己抗体の
存在もしくは量を導く工程を含み、 前記生物学的流体中に存在する自己抗体が、前記第一の
結合部位と固定された抗体との特異的結合および／また
は前記第二の結合部位と前記標識された抗体との特異的
結合を競合阻害によって妨げることを特徴とする方法。 - 【請求項２】固定された抗体もしくは標識された抗体の
少なくとも一方がモノクローナル抗体であることを特徴
とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】固定された抗体および標識された抗体の両
方がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求
項１記載の方法。 - 【請求項４】固相が固定された抗体で被覆された容器で
あることを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】検出可能な標識が、放射性同位元素、酵
素、蛍光体標識、化学発光体標識、および酵素検出反応
の基質からなる群から選択されたことを特徴とする、請
求項１記載の方法。 - 【請求項６】固定された抗体もしくは標識された抗体の
少なくとも一方がポリクローナル抗体であることを特徴
とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項７】自己免疫疾患の疑いがある患者から得られ
た生物学的流体中における、甲状腺ペルオキシダーゼに
対する自己免疫疾患を示唆する自己抗体の検出のための
免疫学的分析方法であって、以下の工程、すなわち 抗体が抗原と特異的に結合できる条件下で所定の時間
で、前記生物学的流体を、 ヒトもしくは動物の器官由来の、未精製抽出物形態をと
る、少なくとも第一の結合部位と第二の結合部位とを備
えた所定量の抗原、 前記抗原の前記第一の結合部位に特異的に結合する所定
量の固定された抗体を備えた固相もしくは微小固相、お
よび 検出可能な標識を備え、前記抗原の前記第二の結合部位
に特異的に結合する所定量の標識された抗体と共にイン
キュベートする工程； 前記固相もしくは微小固相を、固定されていない物質か
ら分離する工程； 前記固相もしくは微小固相における前記検出可能な標識
の存在もしくは量を調べる工程、および 前記固相もしくは微小固相における検出可能な標識の存
在もしくは量から、生物学的流体中における自己抗体の
存在もしくは量を導く工程を含み、 前記生物学的流体中に存在する自己抗体が、前記第一の
結合部位と固定された抗体との特異的結合および／また
は前記第二の結合部位と前記標識された抗体との特異的
結合を競合阻害によって妨げることを特徴とする方法。 - 【請求項８】固定された抗体もしくは標識された抗体の
少なくとも一方がモノクローナル抗体であることを特徴
とする、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】固定された抗体および標識された抗体の両
方がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求
項７記載の方法。 - 【請求項１０】固相が固定された抗体で被覆された容器
であることを特徴とする、請求項７記載の方法。 - 【請求項１１】検出可能な標識が、放射性同位元素、酵
素、蛍光体標識、化学発光体標識、および酵素検出反応
の基質からなる群から選択されたことを特徴とする、請
求項７記載の方法。 - 【請求項１２】固定された抗体もしくは標識された抗体
の少なくとも一方がポリクローナル抗体であることを特
徴とする、請求項７記載の方法。
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