DE19527160C1 - Verfahren zur Messung der Konzentration eines Enzyms durch photometrische Absorptionsmessung eines enzymatisch gebildeten Farbstoffs in einer Meßlösung - Google Patents
Verfahren zur Messung der Konzentration eines Enzyms durch photometrische Absorptionsmessung eines enzymatisch gebildeten Farbstoffs in einer MeßlösungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Mes
sung der Konzentration eines Enzyms, bei dem man die Konzen
tration des Enzyms dadurch bestimmt, daß man in einer Meßlö
sung die Konzentration eines durch die Umsetzung des Enzyms
mit einer Substratlösung enzymatisch gebildeten Farbstoffs
photometrisch durch eine Lichtabsorptionsmessung bestimmt.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Bestimmung eines
Enzyms, das aus einer biologischen Probe stammt oder als
Label eines Reaktionspartners eines Enzym-Immunoassays vor
liegt, mit dessen Hilfe physiologisch wichtige Biomoleküle
in biologischen Proben bestimmt werden.
Gemäß einem ihrer wichtigsten Aspekte betrifft die Erfindung
das Gebiet der Enzym-Immunoassays, und zwar insbesondere
solche Enzym-Immunoassays, bei denen das an einen Reaktions
partner des Nachweissystems gebundene Enzymlabel alkalische
Phosphatase ist, die bei ihrer kontrollierten Einwirkung auf
ein p-Nitrophenylphosphat-Substrat zur Bildung des gelben
Farbstoffs p-Nitrophenol führt, dessen Anwesenheit und Menge
photometrisch bei einem Absorptionsmaximum von 405 nm gemes
sen wird, nachdem die enzymatische farbstoffbildende Reak
tion durch Zugabe einer wäßrigen Stopplösung, üblicherweise
einer 2n oder 3n Natriumhydroxidlösung oder einer wäßrigen
EDTA-Lösung, beendet wurde. Die Erfindung betrifft jedoch in
gleichem Maße die Bestimmung von Enzymen ihn biologischen
Proben, insbesondere, wenn diese eine vergleichbare Farb
stoffbildung für die Enzymmessung nutzen.
Die Erfindung betrifft auch eine Stopplösung als Bestandteil
eines Kits für eine Enzymbestimmung in biologischen Proben
oder eine nach dem Prinzip eines Enzym-Immunoassays arbei
tende Bestimmung eines Analyten, wenn diese Lösung den Farb
stoff Amaranth gelöst enthält.
Nachfolgend wird die Erfindung insbesondere unter Bezugnahme
auf ihre Anwendung zur Verbesserung von Enzymimmunoassays
näher beschrieben, es ist dem Fachmann jedoch ohne weiteres
klar, daß sie auch bei anderen Bestimmungsverfahren genutzt
werden kann, z. B. bei Verfahren zur Bestimmung von organ
spezifischer alkalischer Phosphatase in biologischen Proben,
wie sie z. B. in der Patentschrift DE 44 42 460 C1 und der
darin zitierten Literatur beschrieben sind.
Enzym-Immunoassays im Sinne der vorliegenden Beschreibung
sind alle Immunoassays zur Bestimmung von Antigenen, Hapte
nen, Antikörpern, einschließlich von Autoantikörpern, sowie
anderen Biomolekülen, bei denen zur Markierung einer als
Tracer dienenden Testkomponente ein Enzymlabel verwendet
wird, wobei die vorliegende Anmeldung speziell die bevor
zugte Verwendung von alkalischer Phosphatase als Enzymlabel
beschreibt. Die als Tracer dienende Komponente des Testsy
stems kann ein markiertes Antigen sein, das beispielsweise
mit dem zu bestimmenden Antigen um die Bindungsstellen eines
an einer Festphase immobilisierten Antikörpers konkurriert,
die Tracerkomponente kann jedoch auch ein markierter spezi
fischer Antikörper oder universeller Anti-Spezies-Antikörper
oder ein markiertes Antikörperfragment oder ein markierter
unspezifischer Binder oder ein markierter Partner eines
Binderpaares wie z. B. Biotin/Avidin sein. Ergänzend wird auf
die einschlägige Fachliteratur zu Enzym-Immunoassays oder
ELISA-Assays verwiesen, z. B. auf das Buch "ELISA - Anwendung
des Enzyme Linked Immunosorbent Assay im biologisch/medizi
nischen Labor", von D.M. Kemeny, Gustav Fischer Verlag,
1994. Von den genannten Enzym-Immunoassays sind auch dieje
nigen, bei denen irgendeine Art von markierten Antikörpern
oder Antikörperfragmenten zum Einsatz kommt, dem Fachmann in
verschiedenen Versionen gut bekannt. Die bekanntesten der
artigen Assays sind die sogenannten Sandwich- oder Zwei
seiten-Assays. Daß Assays, wie sie in den Patenten
DE 41 20 412 C1 sowie 42 43 375 C1 der Anmelderin anhand von
Ausführungsformen mit radioaktiv markierten Tracerkomponen
ten beschrieben werden, auch als Enzym-Immunoassays durch
geführt werden können, und daß daher die vorliegende Erfin
dung auch bei derartigen Verfahren zur Anwendung kommen
kann, wird ergänzend ausdrücklich hervorgehoben.
Bei Enzym-Immunoassays, wie sie durch die vorliegende Erfin
dung verbessert werden, liegt am Ende der Umsetzung aller
Reaktionspartner des immunologischen Testsystems ein Teil
der eingesetzten Tracerkomponente, die mit dem Enzym alkali
sche Phosphatase markiert ist, an eine feste Phase gebunden
vor. Die feste Phase kann dabei irgendeine auf dem vorlie
genden Fachgebiet verwendete feste Phase sein, d. h. sie kann
teilchenförmig oder mikrodispers vorliegen oder sie kann die
Wand des Testgefäßes, z. B. des Teströhrchens oder der Kavi
tät einer Mikrotiterplatte, sein. Diese feste Phase wird
nach der Durchführung der immunologischen Umsetzung von der
flüssigen Phase der Reaktionsmischung abgetrennt und gewa
schen. Um festzustellen, ob und wieviel Enzymtracer an die
feste Phase gebunden ist, wird die feste Phase mit einer
Substratlösung versetzt, die im Falle der Verwendung eines
Enzymlabels in Form von alkalischer Phosphatase in der Regel
eine p-Nitrophenylphosphat-Lösung ist. Die feste Phase wird
mit der Substratlösung für eine vorgegebene Zeit inkubiert,
und danach wird die farbstoffbildende Reaktion durch Zugabe
einer Stopplösung gestoppt. Nach Zugabe der Stopplösung wird
die Menge des enzymatisch gebildeten Farbstoffs photome
trisch gemessen.
Im Falle der enzymatischen Umwandlung von p-Nitrophenylphos
phat unter der Einwirkung alkalischer Phosphatase erfolgt
das Abstoppen der Reaktion durch Zugabe einer wäßrigen
Natriumhydroxidlösung, die überlicherweise eine Konzentra
tion von 2n oder 3n aufweist, oder einer wäßrigen EDTA-
Lösung (EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure). Durch die
Zugabe der Stopplösung wird zwar die farbstoffbildende
Reaktion beendet, aber da die Stopplösung farblos ist und es
bei ihrer Zugabe zu der enzymatisch entwickelten Substratlö
sung zu keiner Farbveränderung kommt, muß die mit der Assay-
Durchführung betraute Person stets einen genauen Überblick
darüber behalten, ob die Reaktion in einem bestimmten Te
ströhrchen oder einer bestimmten Kavität einer Mikrotiter-
Platte abgestoppt wurde oder nicht. Es kommt jedoch immer
wieder vor, daß die Aufmerksamkeit der den Test durchführen
den Person gestört wird oder die Bestimmung von einer ande
ren Person zu Ende geführt werden muß, so daß Unsicherheiten
auftreten können, zu welchen Teströhrchen bzw. Kavitäten der
Mikrotiter-Platte bereits Stopplösung zugesetzt wurde bzw.
ob die Reaktion überhaupt bereits abgestoppt wurde. Eine
Überprüfung z. B. durch eine pH-Messung kann nur dann erfol
gen, wenn man einen möglichen Fehler rechtzeitig vermutet,
und sie kann die Durchführung der Bestimmung stören.
Ähnliches gilt für die direkte Bestimmung von z. B. knochen
spezifischer alkalischer Phosphatase (BAP) in einer biolo
gischen Probe durch Umsetzung einer Fraktion der Probe mit
einem p-Nitrophenylphosphatsubstrat. Auch in diesem Falle
wird die enzymatische Reaktion durch Zugabe einer Stopp
lösung abgestoppt, ohne daß sich das Aussehen der Meßlösung
dadurch ändert.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die praktische
Durchführung von Verfahren zur Bestimmung von Enzymen,
einschließlich einer Bestimmung von Enzymen, die als Label
an einen Reaktionspartner eines Enzym-Immunoassays gebunden
sind, so zu verbessern, daß eine einfache und unmittelbare
Kontrolle über das ordnungsgemäße Abstoppen der farbstoff
bildenden enzymatischen Reaktion möglich ist, ohne daß die
Meßgenauigkeit des Bestimmungsverfahrens beeinträchtig wird.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zur Messung der
Konzentration eines Enzyms, bei dem man die Konzentration
des Enzyms dadurch bestimmt, daß man die Konzentration eines
durch die Umsetzung des Enzyms mit einer Substratlösung
enzymatisch gebildeten Farbstoffs in einer Meßlösung photo
metrisch durch eine Lichtabsorptionsmessung bestimmt, erfin
dungsgemäß dadurch gelöst, daß man die photometrische Be
stimmung in Gegenwart eines weiteren Farbstoffs durchführt,
der der Meßlösung zusammen mit einer Stopplösung zum Ab
stoppen der enzymatischen farbstoffbildenden Reaktion zu
gesetzt wird und dessen Anwesenheit die Messung der Konzen
tration des enzymatisch gebildeten Farbstoffs nicht stört.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn man den zugesetzten
weiteren Farbstoff der Meßlösung mit einer üblichen wäßrigen
Stopplösung zum Stoppen der Farbstoffbildung in einem p-
Nitrophenylphosphat-Substrat unter der Einwirkung von alka
lischer Phosphatase, die als Label eines Reaktionspartners
eines Enzym-Immunoassays vorliegt, zugibt.
Vorzugsweise ist dann, wenn das Enzym alkalische Phosphatase
ist und das Substrat p-Nitrophenylphopshat ist, der ver
wendete Farbstoff Amaranth. Amaranth (auch Naphtholrot S)
ist die Trivialbezeichnung für den roten Azofarbstoff mit
der chemischen Bezeichnung 1-(4-Sulfo-1-naphthylazo)-2-
naphthol-3,6-disulfonsäure. Seine Colour-Index Nr. ist C.I.
16 185, die Chemical Abstracts Service Nr. ist CAS-Nr. 915-
67-3. Die Lösung des Farbstoffs Amaranth in einer Natriumhy
droxidlösung ist tiefrot.
Verwendet man eine Amaranth enthaltende Stopplösung, ist
aufgrund der Farbveränderung sofort zu erkennen, ob einer
entwickelten Substratlösung bereits eine Stopplösung zu
gesetzt wurde oder nicht. Ohne Stopplösung ist die Substrat
lösung gelb, nach Zugabe der Stopplösung ist sie dunkel
orange bis rot.
Es ist zwar an sich im Zusammenhang mit Immunoassays be
kannt, einzelnen Bestandteilen eines Kits zur Durchführung
eines Enzym-Immunoassays Farbstoffe zuzusetzen, damit eine
sofortige visuelle Kontrolle möglich ist, ob bestimmte
Testkomponenten, z. B. bestimmte Puffer o. ä., einer Reak
tionsmischung anleitungsgemäß zugesetzt wurden oder nicht.
Derartige Farbstoffzusätze erfolgten jedoch bisher aus
schließlich zu den Komponenten des eigentlichen Reaktions
systems, jedoch nie zu Reagenzien für die Stufe der Farbent
wicklung in einer Substratlösung. Der vorliegenden Erfindung
liegt die Erkenntnis zugrunde, daß es möglich ist, die
photometrische Auswertung der farbstoffbildenden enzymati
schen Reaktion störungsfrei auch in Anwesenheit eines Fremd
farbstoffs durchzuführen, wenn gewährleistet ist, daß dieser
Licht einer Wellenlänge, wie sie für die photometrische
Auswertung verwendet wird, unter den Testbedingungen nicht
oder nicht nennenswert absorbiert. Das wird dadurch gewähr
leistet, daß man einen Farbstoff verwendet, dessen Absorp
tionsspektrum unter den Bedingungen, die nach Zugabe der
Stopplösung in der entwickelten Substratlösung herrschen,
ein ausgeprägtes Absorptionsminimum bei der Wellenlänge des
Meßlichts aufweist. Bei Verwendung einer NaOH-Stopplösung
bedeutet das, daß sein Absorptionsspektrum im stark Alkali
schen, d. h. bei einem pH von verdünnter NaOH, z. B. pH 10 bis
14, die geforderten Eigenschaften aufweisen muß. Außerdem
darf der Farbstoff nicht mit dem Substrat, einem der enzyma
tisch daraus gebildeten Produkte oder dem Enzym selbst in
irgendeine störende reaktive oder sonstige Wechselwirkung
treten.
Im Falle der enzymatischen Bildung von p-Nitrophenol aus
p-Nitrophenylphosphat erfolgt die photometrische Auswertung
üblicherweise bei einer Wellenlänge von 405 nm, die einem
ausgeprägten Maximum das Absorptionsspektrums von p-Nitro
phenol entspricht. Indem der Stopplösung ein Farbstoff wie
Amaranth zugesetzt wird, dessen Absorptionsspektrum im
gleichen Bereich ein ausgeprägtes Minimum aufweist und der
daher das Meßlicht bestenfalls in einem vernachlässigbaren
Ausmaß absorbiert und der auch nicht mit den in der Sub
stratlösung enthaltenen Substanzen reagiert, ist die photo
metrische Messung des entwickelten Substrats wie im Falle
der Zugabe einer ungefärbten Stopplösung möglich, obwohl die
vermessene Lösung sich für das Auge aufgrund einer anderen
Farbe deutlich von einer üblichen entwickelten und/oder
abgestoppten Substratlösung unterscheidet.
Der Gehalt des Farbstoffs Amaranth in der Stopplösung muß
dabei hoch genug sein, so daß noch ein deutlicher Farbeffekt
erhalten wird, sollte jedoch andererseits auch nicht zu hoch
sein, damit sich die geringe Eigenabsorption von Amaranth
bei der Meßwellenlänge von 405 nm nicht störend auswirken
kann und die Amaranth-Konzentration keinen Einfluß auf die
Meßergebnisse hat. Geeignete Amaranth-Konzentrationen in 2n
NaOH liegen beispielsweise zwischen 5 und 50 µg/ml, wobei
sich eine Konzentration von 20 µg/ml, wie sie bei den nach
folgend beschriebenen Kontrollversuchen verwendet wurde, als
sehr geeignet erwiesen hat.
Die Verwendung einer gefärbten Stopplösung gemäß der vor
liegenden Erfindung gewährleistet auf einfache und sichere
Weise eine sofortige visuelle Kontrolle der korrekten Assay-
Durchführung, ohne daß die Korrektheit der Ergebnisse des
Bestimmungsverfahrens negativ beeinflußt wird.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Beispiels noch
näher erläutert.
Die Figur zeigt in einem einzigen Diagramm die Spektren des
Farbstoffs Amaranth in einer 2n NaOH-Stopplösung sowie ein
typisches Spektrum einer p-Nitrophenylphosphat-Substratlö
sung nach der Entwicklung durch alkalische Phosphatase, die
an eine immobilisierte Tracerkomponente eines Enzym-Immunoas
says gebunden ist.
Zur Prüfung der Frage, ob es möglich ist, einer Stopplösung
zum Abstoppen der enzymatischen Umwandlung eines p-Nitro
phenylphosphat-Substrats einen Farbstoff zuzusetzen, ohne
die Meßergebnisse zu verfälschen, wurde ein Kontrollversuch
unter Verwendung von Bestandteilen eines handelsüblichen
quantitativen Enzym-Immunoassays zur Bestimmung von Neopte
rin in Serum, Plasma und Urin (ELItest® Neopterin der
B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH) durchgeführt.
Bei dem ELItest® Neopterin erfolgt die Bestimmung der Neop
terin-Konzentration in einer biologischen Probe dadurch, daß
man das zu bestimmende Neopterin aus der Probe mit einem
Enzymkonjugat aus Neopterin und alkalischer Phosphatase um
die Bindungsstellen von Anti-Neopterin-Antikörpern konkur
rieren läßt, die an einer festen Phase, üblicherweise die
Wände der Kavitäten einer Mikrotiter-Platte, immobilisiert
sind.
Das Ausmaß der Bindung des Enzymkonjugats aus Neopterin und
alkalischer Phosphatase an die feste Phase ist umgekehrt
proportional zur Neopterin-Konzentration in einer Patienten
probe. Hohe Neopterin-Werte in der Probe äußern sich somit
nach der nachfolgenden Substratentwicklung bei der photome
trischen Vermessung der erhaltenen Substratlösung als nied
rige optische Dichte (OD).
Die optische Dichte wird dabei in einem Plattenphotometer
bei einem Absorptionsmaximum von 405 nm gemessen. Die Aus
wertung der Ergebnisse der Messung der optischen Dichte
einer Probe erfolgt unter Bezugnahme auf eine Standardkurve
(optische Dichte gegen Konzentration von Neopterin-Stan
dards), aus der die Neopterin-Konzentration einer Patienten
probe direkt ablesbar ist.
Bezüglich weiterer Einzelheiten der Testdurchführung und der
üblichen Reagenzien wird auf die Arbeitsanleitung ELItest®
Neopterin der Anmelderin verwiesen.
Es wurden 16 Patientenseren nach der Vorschrift der Arbeits
anleitung zum ELItest® Neopterin vermessen, wobei für jedes
Serum zu Vergleichszwecken die erhaltene optische Dichte in
der Substratlösung einmal nach Zugabe der üblichen ungefärb
ten Stopplösung und einmal nach Zugabe einer erfindungs
gemäßen Stopplösung, die Amaranth enthielt, gemessen wurde.
Die übliche Stopplösung war eine wäßrige 2n NaOH-Lösung.
Die eingefärbte Stopplösung wurde dadurch hergestellt, daß
man 0,2 g eines handelsüblichen Amaranth-Farbstoffs (Sico
pharm-Amaranth 85 E 123; BASF) in 40 ml einer 2n NaOH-Lösung
(Stopplösung ELItest® Neopterin) auflöste. Die erhaltene
Lösung wurde mit 2n NaOH 1 : 250 weiter verdünnt. Sie wies
eine Konzentration von 20 µg Amaranth/ml 2n NaOH auf.
Zur Messung von 16 Patientenseren wurden gemäß Arbeitsanlei
tung zuerst 50 µl jedes Patientenserums mit jeweils 150 µl
einer Lösung eines Konjugats aus Neopterin und alkalischer
Phosphatase in den Kavitäten einer unbeschichteten Mikroti
ter-Platte gemischt. 150 µl der erhaltenen Mischung wurden
dann in eine mit Neopterin-Antikörpern beschichtete Mikroti
ter-Platte überführt.
Nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur im
Dunkeln wurde die flüssige Phase abgesaugt, und es wurden
350 µl einer Waschlösung zugegeben und abgesaugt. Der Wasch
schritt wurde dreimal wiederholt.
Nach dem Entfernen der letzten Waschlösung wurden jeweils
100 µl einer p-Nitrophenylphosphat-Substratlösung zugegeben.
Zur Farbentwicklung inkubierte man 30 ± 5 min bei Raumtem
peratur und stoppte dann die Reaktion durch Zugabe von 100
µl einer 2n NaOH Stopplösung, und zwar entweder einer unge
färbten oder einer erfindungsgemäßen eingefärbten Stopp
lösung.
Danach wurde die optische Dichte in einem Plattenphotometer
(Titertek Multiscan Plus MKII) bei 405 nm Wellenlänge gemes
sen, und die Meßergebnisse wurden anhand einer Standardkurve
ausgewertet, die unter gleichen Bedingungen unter Verwendung
von Standards bekannter Neopterin-Konzentration erstellt
worden war.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammen
gefaßt, wobei die Meßergebnisse jeweils für Versuch unter
Verwendung einer farbstofffreien und einer farbstoffhaltigen
Stopplösungen mit und ohne Abzug des Blindwerts ("Blank":
Messung der Substratlösung plus Stopplösung ohne Enzym)
angegeben werden.
Es ist klar zu erkennen, daß die Anwesenheit von Amaranth in
der Stopplösung keinen signifikanten Einfluß auf die Meß
ergebnisse hatte, die für die einzelnen Patienten erhalten
wurden.
In ähnlicher Weise konnte festgestellt werden, daß die
Anwesenheit von Amaranth in der Stopplösung keinen signifi
kanten Einfluß auf die Form und Lage der Standardkurve
ausübte.
In weiteren Versuchen konnte sichergestellt werden, daß auch
bei anderen handelsüblichen Assays, bei denen mit alkali
scher Phosphatase als Enzymlabel gearbeitet wird, durch die
Verwendung einer gefärbten Stopplösung keine Beeinträchti
gung der Meßergebnisse erhalten wird. Das gilt beispiels
weise für die Bestimmung von Anti-TPO-Autoantikörpern, Anti-
Tg-Autoantikörpern sowie des Hormons ACTH mit Hilfe handels
üblicher Assay-Kits der Anmelderin.
In jedem der Fälle wurden nicht nur weitgehend identische
und reproduzierbare Ergebnisse erhalten, sondern in jedem
der Fälle war der Unterschied zwischen Substratlösungen mit
und ohne Zusatz der eingefärbten Stopplösung sofort visuell
erkennbar.
Claims (13)
1. Verfahren zur Messung der Konzentration eines Enzyms, bei
dem man die Konzentration des Enzyms dadurch bestimmt, daß man
die Konzentration eines durch die Umsetzung des Enzyms mit
einer Substratlösung enzymatisch gebildeten Farbstoffs in
einer Meßlösung photometrisch durch eine Lichtabsorptions
messung bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man die photome
trische Bestimmung in Gegenwart eines weiteren Farbstoffs
durchführt, der der Meßlösung zusammen mit einer Stopplösung
zum Abstoppen der enzymatischen farbstoffbildenden Reaktion
zugesetzt wird und dessen Anwesenheit die Messung der Konzen
tration des enzymatisch gebildeten Farbstoffs nicht stört.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der zugesetzte weitere Farbstoff so ausgewählt ist, daß er
Licht der Wellenlänge des für die photometrische Absorptions
messung verwendeten Lichts nicht oder nur unwesentlich ab
sorbiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Konzentration des zugesetzten Farbstoffs so gewählt
wird, daß einerseits seine Anwesenheit in der Meßlösung visu
ell deutlich feststellbar ist, daß sich aber andererseits eine
eventuelle geringfügige Absorption von Licht der Wellenlänge
des für die photometrische Absorptionsmessung verwendeten
Lichts nicht auf die Bestimmung der Konzentration des enzyma
tisch gebildeten Farbstoffs auswirkt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym einer biologischen Probe ent
stammt oder an einen Reaktionspartner eines Enzymimmunoassays
gebunden ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym eine organspezifische alkalische
Phosphatase, insbesondere knochenspezifische alkalische Phos
phatase (BAP), aus einer biologischen Probe ist und die Sub
stratlösung eine p-Nitrophenylphosphat-Lösung ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym alkalische Phosphatase ist, die
als Label eines Reaktionspartners eines Enzym-Immunoassays
vorliegt, und daß die Substratlösung eine p-Nitrophenylphos
phat-Lösung ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch
gekennzeichnet, daß die photometrische Bestimmung des enzyma
tisch gebildeten Farbstoffs mit Licht einer Wellenlänge von
405 nm erfolgt und der zugesetzte Farbstoff ein Absorptions
minimum im Bereich von 390 bis 420 nm aufweist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
als Farbstoff Amaranth verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
Amaranth in einer 2 bis 4n NaOH-Stopplösung oder einer EDTA-
Stopplösung mit einer Konzentration von 5-50 µg Amaranth/ml
Stopplösung verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
die alkalische Phosphatase als Label an ein Antigen oder einen
Antikörper gebunden ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
die alkalische Phosphatase als Label eines Bestandteils eines
Enzymimmunoassays zur Bestimmung von Neopterin, ACTH, anti-
TPO-Autoantikörpern und anti-Thyreoglobulin-Autoantikörpern
vorliegt.
12. Stopplösung zum Stoppen der farbstoffbildenden Umwand
lungsreaktion eines p-Nitrophenylphosphat-Substrats unter der
Einwirkung von alkalischer Phosphatase, die einer biologischen
Probe entstammt oder an einen Reaktionspartner eines Enzym-
Immunoassays gebunden ist, in Form einer 2n bis 4n NaOH-
Lösung oder einer EDTA-Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß in
der Stopplösung der Farbstoff Amaranth aufgelöst ist.
13. Stopplösung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
sie 5 bis 50 µg Amaranth/ml Stopplösung enthält.
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