JP2500335B2 - 植物中または植物体表面上の微量物質の検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物中または植物体表
面上に存在する、例えば各種の菌類、細菌、ウィルスな
どの病原体、生理活性物質などの微量物質を検出するた
めの方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、農業および園芸の分野において、
植物体に存在する微量物質を検出することは、当該植物
体の病気および生活状態などを知る上で非常に有用であ
る。そして、実際上、作物である植物体を検査対象とし
てこれに特定の病原体などの微量物質が存在するか否か
を、圃場において、また誰でも容易にかつ確実に検査す
ることのできる方法が要請されている。

【０００３】従来、このような微量物質の検出方法とし
ては、当該微量物質を抗原とする抗原−抗体反応を利用
するラテックス凝集法、血球凝集法、酵素免疫測定法な
どが広く知られている。

【０００４】ラテックス凝集法は、例えばポリスチレン
ラテックスに抗体を結合し、これを検査対象植物体の粗
汁液と試験管中で混合、撹拌し、３〜４分間の経過後に
ラテックス粒子の凝集の有無を観察する方法である。ま
た、血球凝集法は、ヒツジなどの動物血球をタンニン酸
−グルタールアルデヒドによって処理した後、これに抗
体を結合させ、例えばマイクロプレートのウェル中にお
いて、この血球と検査対象植物体の粗汁液とを混合し、
血球の沈降像により抗原物質の存在を検出する方法であ
る。更に、酵素免疫測定法は、抗体に標識酵素を施して
得られる酵素標識抗体を用い、マイクロプレートあるい
はポリスチレンビーズに固定した抗体と反応させた抗原
物質を当該酵素標識抗体と反応させ、基質を加えたとき
に生ずる発色の状態を観察して抗原物質の存在を検出す
る方法である。

【０００５】また、放射性同位元素や螢光物質からなる
標識物質を用いてこれにより抗体を標識し、この標識抗
体を免疫反応により検査対象植物体の粗汁液中の抗原物
質と結合させ、この結合状態を標識物質を介して検出す
る放射免疫測定法、螢光免疫測定法なども採用されてい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】以上のような従来の測
定法は、各々固有の利点を有するものではあるが、いず
れの方法も高感度の測定を簡単な操作によって迅速に行
うことができず、結局、実際の圃場において、検査対象
植物体に存在する微量物質を好適に検出することができ
ない、という問題点がある。

【０００７】本発明は、以上の事情に基づいてなされた
ものであって、その目的は、植物体を検査対象としてこ
れに存在する微量物質を、圃場などの野外の環境下にお
いても、また誰でも容易にかつ確実に検出することので
きる方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明に係る植物中また
は植物体表面上の微量物質の検出方法は、植物中または
植物体表面上に存在する微量物質（Ａ）と結合する固定
化試薬としての抗体がラテックス粒子を介して固定され
てなる反応部位を有する濾紙よりなるクロマトグラフ媒
体を用い、還元剤および分散安定剤を含有する検査対象
植物体の粗汁液よりなる検査液に前記クロマトグラフ媒
体を接触させて反応部位に到達するまで当該検査液を展
開させ、次に、このクロマトグラフ媒体を、前記微量物
質（Ａ）と結合する抗体を担持させた、着色処理された
ラテックス粒子よりなる着色粒子の分散液に接触させて
反応部位に到達するまで当該分散液を展開させ、前記ク
ロマトグラフ媒体の反応部位の固定化試薬に結合した微
量物質（Ａ）に抗体が結合することによって生ずる、前
記着色粒子の凝集による発色状態を観察することを特徴
とする。また、本発明の方法においては、着色粒子の分
散液に対する濾紙の浸漬レベルを、検査液に対する濾紙
の浸漬レベルより反応部位側に離間した位置とすること
が好ましい。

【０００９】

【作用】本発明の方法によれば、反応部位を形成してな
る濾紙をクロマトグラフ媒体として用い、これに、検査
対象植物体の粗汁液から得られる還元剤および分散安定
剤を含有する検査液、および特定の着色粒子の分散液を
この順に接触させて展開させる操作により、検査液中に
検出すべき微量物質が存在するときには、濾紙の反応部
位に着色粒子が凝集して発色部分が形成される。従っ
て、微量物質の検出を目視によって行うことができ、検
出のために特別な機器を必要としないため、実際の圃場
などの野外の環境下においても、また誰でも容易にかつ
確実に目的とする微量物質の検出を行うことができる。

【００１０】以下、本発明について具体的に説明する。
本発明においては、例えば図１に示すように、細長い帯
状の濾紙１０における一端１２から適宜の距離だけ離れ
た位置に反応部位１４が形成されたものをクロマトグラ
フ媒体として用いる。このクロマトグラフ媒体と共に特
定の着色粒子の分散液が用意され、これらによって、検
査対象植物体の粗汁液について、微量物質（Ａ）の検出
が行われる。

【００１１】クロマトグラフ媒体である濾紙の反応部位
は、検出すべき微量物質（Ａ）と結合可能な抗体（イ）
が固定化試薬として当該濾紙に例えばライン状に固定さ
れることによって形成される。この反応部位の位置は、
通常、濾紙１０の一端１２から例えば１〜３ｃｍ程度離
間した位置とすることが好ましい。

【００１２】 濾紙に反応部位を形成するために、固定
化試薬とされる抗体はラテックス粒子を介して濾紙に固
定される。具体的には、濾紙と同様の白色のラテックス
粒子（Ｓ）に抗体（イ）を結合させ、このラテックスの
分散液を例えば筆などによって濾紙に塗布することによ
って反応部位を形成することができ、この場合には抗体
（イ）の所望の形伏で濾紙に固定することができる。ラ
テックス粒子を介して抗体が固定されることにより、濾
紙上における反応部位の位置および形状が確実に固定さ
れ、発色部分の判定を確実に行うことができる。

【００１３】反応部位を形成するための固定化試薬とさ
れる抗体（イ）は、微量物質（Ａ）を抗原とする抗体で
あれば、それが由来する動植物の種類が制限されるもの
ではなく、またポリクローナル抗体であっても、あるい
はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。しか
し、高い測定感度を得るために、当該抗原物質に対する
結合力が強い抗体を固定化試薬として用いることが好ま
しい。

【００１４】反応部位を形成するために好適なラテック
ス粒子としては、市販のポリスチレン形ラテックス粒子
を好ましいものとして使用することができる。このラテ
ックス粒子の粒径があまり小さいと、容易に濾紙上を移
動するようになるので好ましくなく、一方、粒径が大き
いラテックス粒子によれば反応の場となる表面積が小さ
くなる。従って、当該ラテックス粒子の粒径は、通常、
０．２〜５．０μｍ、特に０．３〜１．０μｍであるこ
とが好ましい。当該ラテックス粒子の組成は、抗体
（イ）を確実に結合させることのできるものであればよ
く、その結合は、物理的吸着による結合であっても、ま
た化学的結合であってもよい。

【００１５】クロマトグラフ媒体を構成する濾紙は、毛
細管現象によって液体を吸収し展開させることのできる
ものであればよいが、測定に供される物質と物理的また
は化学的に反応するものであってはならない。濾紙のポ
アサイズは、後述する着色粒子の展開を確保するため
に、当該着色粒子の粒径より大きいものであることが必
要である。具体的には、市販されている化学分析用濾
紙、ガラスやシリカなどの無機繊維よりなる濾紙をなど
を好適に使用することができる。

【００１６】本発明における検査液は、検査対象植物体
の粗汁液から調製される。この検査液には、検査対象植
物体の粗汁液の他に、還元剤および分散安定剤が含有さ
れていることが必要である。検査液を調製するために
は、例えば、検査対象植物体の葉、その他の部分を緩衝
液の存在下において磨砕し、この粗汁液を適宜の分散安
定剤を含有する緩衝液によって希釈する方法を利用する
ことができる。そして、粗汁液の調製のための緩衝液中
に還元剤を添加しておくことが好ましいが、調製された
直後の粗汁液に還元剤を添加してもよい。ここに、還元
剤としては、例えば亜硫酸ナトリウム、メルカプトエタ
ノールなどを用いることができ、その濃度は０．１〜１
重量％程度で十分である。

【００１７】このようにして得られる検査液を、クロマ
トグラフ媒体である濾紙の一端から吸収させてペーパー
クロマトグラフの場合と同様に展開させる。具体的に
は、濾紙１０の一端１２側の部分をレベルＬ１まで検査
液中に数分間程度以下の時間浸漬させ、濾紙１０の反応
部位１４に到達するまで展開させる。

【００１８】然るに、この濾紙１０の反応部位１４に
は、微量物質（Ａ）と結合可能な抗体（イ）が固定され
ているから、検査液中の微量物質（Ａ）は、反応部位１
４において当該抗体（イ）と反応してそこに固定され
る。

【００１９】次にこの濾紙の同じ一端側から、微量物質
（Ａ）と結合する抗体（ロ）が担持された着色粒子
（Ｐ）の分散液を吸収させて展開させる。具体的には、
濾紙１０の一端１２側における、前記レベルＬ１から反
応部位１４側に例えば３ｍｍ以上離間したレベルＬ２ま
での部分を、着色粒子（Ｐ）の分散液中に数分〜５分間
程度の時間浸漬させ、これにより、当該着色粒子（Ｐ）
を濾紙１０の反応部位１４に到達させる。

【００２０】着色粒子に結合させる抗体（ロ）は、微量
物質（Ａ）と結合可能なものであれば特に制限されるも
のではなく、例えば抗体（イ）と同一の抗体を用いるこ
ともできる。

【００２１】 本発明において、着色粒子としては、着
色処理されたラテックス粒子（以下「着色ラテックス粒
子」ともいう）が用いられる。着色ラテックス粒子を用
いることにより、目視判定に適する色彩を自由に調整す
ることができる。この着色粒子の平均粒径は、０．０５
〜０．５μｍ、特に０．０５〜０．３μｍであることが
好ましい。平均粒径が０．５μｍより大きい場合には、
当該着色粒子１個が有するシグナル強度が大きくなる点
では好ましいが、濾紙上での展開速度が小さくなる。一
方、平均粒径が０．０５μｍより小さい場合には、この
粒子に抗体（ロ）を結合させたものが凝集し易いものと
なる。

【００２２】特に合成高分子よりなるラテックス粒子
は、通常、粒径が十分に均一なものが比較的容易に得ら
れることから、このようなラテックス粒子を基礎粒子と
して用いてこれを着色処理したものを着色粒子として用
いることが好ましく、この場合には当該着色粒子が濾紙
上を均一にクロマトグラフ的に移動するので好適な展開
状態が得られる。具体例には、当該ラテックス粒子の粒
径のＣＶ値（粒径の平均値に対する標準偏差の商×１０
０（単位：％））が１０％以下、特に５％以下であるこ
とが好ましい。

【００２３】抗体（ロ）が結合された合成着色ラテック
ス粒子は、特定のものが市販されており、これを有利に
用いることができる。このラテックス粒子は、その凝集
を防止するために、適宜の分散安定剤を含有していても
よい。

【００２４】而して、上記着色粒子（Ｐ）には、微量物
質（Ａ）と結合する抗体（ロ）が担持されているため、
反応部位１４に固定された微量物質（Ａ）とこの抗体
（ロ）が反応して、抗体（イ）−微量物質（Ａ）−抗体
（ロ）の結合体が形成される結果、当該着色粒子が反応
部位に凝集した状態で固定されることとなる。従って、
濾紙１０の反応部位１４においては、凝集した着色粒子
（Ｐ）によって発色部分が形成される。

【００２５】以上において、検査対象植物体の粗汁液中
に微量物質（Ａ）が存在しない場合には、着色粒子は反
応部位に固定されることがないため、発色部分は形成さ
れない。

【００２６】検査対象植物体の粗汁液においては、通常
酸化酵素が含有されているために、例えば検出すべきウ
ィルスなどの抗原性が失われるおそれがある。然るに、
本発明においては、検査液として還元剤が含有されてい
るため、この還元剤の作用によって酸化酵素の作用が封
じられ、従って所期の微量物質の検出を確実に行うこと
ができる。

【００２７】また、検査対象植物体の粗汁液中には着色
粒子の分散状態を阻害して凝集を生じさせる成分が含有
されていることが多く、このため、当該粗汁液をそのま
ま検査液として濾紙上で展開させると、その後に着色粒
子の分散液を展開させたときに当該着色粒子が展開の途
中で凝集し、当該着色粒子が濾紙の反応部位にまで展開
されないおそれがある。

【００２８】然るに本発明においては、分散安定剤が、
例えば希釈液を介して添加されることによって検査液中
に含有されるため、検査液と接触したときにも着色粒子
が凝集することが防止される。この希釈液の分散安定剤
としては適宜の水溶性ポリマーを用いることができ、特
に非イオン性の水溶性ポリマーが好ましい。

【００２９】本発明の実施に供される濾紙には、その取
扱いを容易にするため、反応部位が表面に形成されてい
る濾紙の裏面に、プラスチックなどの剛性の材質よりな
る支持体を設けることが好ましい。更に、この支持体
は、反応結果を目視判定することの要請から透明である
ことが好ましい。すなわち、この場合には、操作後の濾
紙を透かして見ることによって反応結果の判定が容易と
なる。そして、支持体の色は、着色粒子の色と同系色で
なく、無色または白色であると目視判定が容易となる。

【００３０】 本発明においては、検査液の展開と、着
色粒子の分散液の展開をこの順に分けて行うことが必要
とされる。このように、検査液を展開させた後に着色粒
子の分散液を展開させるので、着色粒子の凝集が生ずる
ことがなく、当該着色粒子は濾紙上を十分に展開するこ
とができる。検査液と着色粒子の分散液との混合液を濾
紙に接触させて展開させる場合には、この混合液におい
て、着色粒子の凝集が生ずるおそれが大きく、凝集が生
ずると着色粒子は濾紙上を展開することができない。特
に着色粒子に結合されている抗体がポリクローナル抗体
である場合には、当該着色粒子が凝集し易く、実際に展
開が十分に行われないおそれがある。

【００３１】また、本発明においては、異なる抗原物質
に対する複数の抗体を固定化試薬として用い、その各々
による反応部位をクロマトグラフ媒体である濾紙上にお
いて互いに異なる位置に形成することができる。この場
合には、同一の検査対象植物体から得られる検査液につ
いて、予想される複数の抗原物質の検出を、１回の操作
によって行うことができるので、非常に便利である。そ
して、この場合においては、各抗体を結合させる着色粒
子の色を異なる色とすることにより、複数の抗原物質の
存在を異なる色によって検出することができ、一層明確
な検出を行うことができる。

【００３２】また、検査液中には、通常当該植物体の葉
緑素および繊維物質が含有されており、このため検査液
が浸漬された濾紙の一端部には、緑色乃至褐色の呈色部
分が形成され、この部分では、着色粒子の展開が円滑に
行われないことが多い。然るに上述のように、着色粒子
の分散液に対する濾紙の浸漬レベルＬ２を、検査液に対
する濾紙の浸漬レベルＬ１より反応部位１４側に離間し
た位置とすることにより、濾紙における葉緑素あるいは
繊維物質などが存在する部分を回避して着色粒子の分散
液を展開させることができ、従って確実に所期の検査を
実行することができる。

【００３３】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００３４】実施例１ キュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ）に対する抗体を固
定化試薬として用い、この抗体をポリスチレン系ラテッ
クス粒子に結合させたラテックス分散液を、濾紙の一端
から１．５ｃｍの位置に塗布して乾燥させて当該濾紙に
ライン状の反応部位を形成した。

【００３５】一方、ＣＭＶに感染したタバコの葉１ｇを
乳鉢に採り、０．１重量％の亜硫酸ナトリウムを含有す
るリン酸緩衝液３ミリリットルの存在下において乳棒に
よって磨砕し、得られた粗汁液を、ポリビニルピロリド
ンよりなる分散安定剤を添加した緩衝液によって希釈し
て検査液を調製した。そして、この検査液中に前記濾紙
の一端側の長さ１ｍｍの部分を１分間浸漬させ、検査液
を反応部位に到達するまで展開させた。なお、この濾紙
の一端側の長さ３ｍｍまでの部分には葉緑素による緑色
が見られた。

【００３６】次に、固定化試薬と同一の抗体を結合した
ポリスチレン系の赤色の着色ラテックス粒子（平均粒径
０．３μｍ）の分散液を用意し、この分散液中に上記濾
紙の一端側の長さ６ｍｍの部分を３分間浸漬させた。

【００３７】その結果、反応部位の位置に着色ラテック
ス粒子の凝集による赤色のラインの形成が認められた。
この結果の検出感度は、酵素免疫測定法による結果と同
等のものであった。

【００３８】比較例１ 検査対象植物体として、健全なタバコの葉を用いたほか
は、実施例１と同様の処理操作を行った。その結果、濾
紙には赤色のラインの形成は全く認められなかった。

【００３９】実施例２ キュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ）に対する抗体、タ
バコモザイクウィルス（ＴＭＶ）に対する抗体およびジ
ャガイモＹウィルス（ＰＶＹ）に対する抗体の各々を固
定化試薬として用い、各抗体をポリスチレン系ラテック
ス粒子に結合させたラテックス分散液を、濾紙の一端か
ら２．１ｃｍ、１．８ｃｍおよび１．５ｃｍの３つのレ
ベルの位置に塗布して乾燥させて当該濾紙に３本のライ
ン状の反応部位を形成した。

【００４０】一方、植物体として、ＣＭＶ、ＴＭＶおよ
びＰＶＹの３種のウィルスに複合感染したタバコとトマ
トの葉を用いたほかは、実施例１と同様にして検査液を
調製し、この検査液を実施例１と同様にして展開させ
た。また、各固定化試薬と同一の抗体を結合した合計３
種のポリスチレン系の着色ラテックス粒子の分散液を用
意し、各分散液を実施例１と同様にして展開させた。そ
の結果、濾紙上には、３本の着色粒子によるライン状の
シグナルが明瞭に観察された。

【００４１】そして、ＣＭＶは球形のウィルス、ＴＭＶ
は棒状のウィルス、ＰＶＹはひも状のウィルスである
が、この実施例２の結果から、形態的に全く異なる複数
のウィルスであっても、その各々を同時に検出すること
が可能であることが明らかである。

【００４２】

【発明の効果】本発明の方法によれば、クロマトグラフ
媒体として濾紙を用いると共に、標識物として着色粒子
を用いるので操作がきわめて簡単であって圃場のような
野外の環境下においても実施することが容易であり、ま
た、特異性の高い抗体−抗原反応を利用するので検出結
果が信頼性の高いものとなり、従って検査対象植物体に
ついてこれに存在する微量物質を短時間のうちに高い感
度で、しかも安価に検出することができる。また、着色
粒子の色彩を人為的に選択することも可能であるため、
優れた目視判定性を得ることが容易である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明において用いられる濾紙の一例を示す説
明図である。

【符号の説明】

１０ 濾紙 １２ 一端 １４ 反応部位

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物中または植物体表面上に存在する微
   量物質（Ａ）と結合する固定化試薬としての抗体がラテ
   ックス粒子を介して固定されてなる反応部位を有する濾
   紙よりなるクロマトグラフ媒体を用い、還元剤および分
   散安定剤を含有する検査対象植物体の粗汁液よりなる検
   査液に前記クロマトグラフ媒体を接触させて反応部位に
   到達するまで当該検査液を展開させ、次に、このクロマ
   トグラフ媒体を、前記微量物質（Ａ）と結合する抗体を
   担持させた、着色処理されたラテックス粒子よりなる着
   色粒子の分散液に接触させて反応部位に到達するまで当
   該分散液を展開させ、前記クロマトグラフ媒体の反応部
   位の固定化試薬に結合した微量物質（Ａ）に抗体が結合
   することによって生ずる、前記着色粒子の凝集による発
   色状態を観察することを特徴とする植物中または植物体
   表面上の微量物質の検出方法。
2. 【請求項２】 着色粒子の分散液に対する濾紙の浸漬レ
   ベルを、検査液に対する濾紙の浸漬レベルより反応部位
   側に離間した位置とすることを特徴とする請求項１記載
   の植物中または植物体表面上の微量物質の検出方法。