JPS58500737A - 植物の葉から蛋白質の単離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 広い面においては、本発明は植物の葉から蛋白質の単離法に関する。別の面にお いては、本発明は植物の緑葉からりブロース１，５−ニリン酸カルがキシラーゼ を得る方法に関する。別のさらに特別の面においては、氷見キシラーゼを得る方 法に関する。

参照関連出願 本出願は１９７９年９月２４日提出の本出願者らの係属中の米国特許出願第７８ ，５０５号の一部継続出願であり、上記出願の記載を引用文献とする。

背　景 たばこ、はうれんそう、大豆、こむぎ、綿、むらさきうまごやしを含め、ある種 の植物の多汁葉は固体１０〜２０チからなり、残りは水である。その部分のうち 、固体部分は水溶性部分と水不溶性部分とからなシ、後者は大部分業の繊維状構 造物質から成っている。

水溶性化合物は２群に分けることができる。１群は分子量が約１０．ＯＤＤを越 えない糖、ビタミン、アミノ酸およびその他の化合物のような比較的低分子量の 化合物を含む。第２の群は分子量が約３０，０００以上のほとんどもっばら蛋白 質である。

この蛋白質は２両分に分けることができる。１画分は分子量が約３０．ＯＤＤ〜 １００．［１００の範囲である蛋白質の混合物を含む。この蛋白質は時々「画分 ２蛋白質」と呼ばれる。残りの画分は分子量約５５０，０００を有する単一蛋白 質からなシ、時々「画分１蛋白質」と呼ばれる。

画分１蛋白質は１９４７年にはじめて確認された。次の研究はこの蛋白質が光合 成に含まれる酵素であるという発見に導い、た。そのとき以来、多数の名前がつ けられてきた。これらのなかにはりブロース、１．５−二リン酸カルがキシラー ゼ、カルがキシディスムターゼ、リブロース１１５−ニリン酸カルがキシラーゼ 、リブロース１．５−二リン酸カルざキシラーゼ−オキシゲナーゼがある。

画分１蛋白質は葉の全蛋白質含量の２５％ｉでおよび葉の固体物質の１０係まで を構成できる。１９７０年にたばこの葉から結晶性画分１蛋白質を得ることがで きることが発見された。

画分１蛋白質は純粋なときは無臭、無味、無色で、高い栄養価をもつ。これらの 性質から、および高純度で得られることから、画分１蛋白質は動物および人間に 対する食品補充物として潜在的に価値のある用途をもっと考えられる。人間の場 合、このような添加剤は高蛋白質またはその他の特別な食餌の１成分であること ができる。

たとえば、上記添加剤は腎臓病のため透析を必要とする人の食餌への補充物とし て提案されてきている。

栽培植物中に比較的豊富にあるにもがかわらず、植物から画分１蛋白質を得るた めの当該技術で既知の方法は商業的に可能では々いから１画分１蛋白質は商業上 重要な製品ではない。

画分１蛋白質を単離するための三つの基本的方法が公表文献に記載されている。

各公表の方法は植物の葉または葉と茎をノ４ルプにすることからはじまり、つい でノ臂ルゾから緑色ジュースをしぼる。細かい粒状の緑色顔料含有物質を含む緑 色ジュースをたとえば濾過または遠心分離によって澄明にして、液体から細かい 粒状固体物質を分離する。生成液体はかつ色である。

画分１蛋白質単離のための記載の第１の方法は、分子濾過によってかっ色ジュー ス中の低分子量化合物から部分分離すると同時に、画分１蛋白質を濃縮すること を伴なった。細孔が画分１蛋白質を通すことなく一層小さい分子を通すモレキュ ラーシープを使い、小分子がその細孔を通過するようにかっ色ジュースを加圧下 に置いた。

画分１蛋白質を含む溶液を約５　に濃縮し、透析して溶液中の小分子をさらに除 去した。コロジオン型透析袋を使い透析を行なった。上記袋の細孔は画分１蛋白 質の通過を許さないが、一層小さい分子を袋を通し水中に逃した。透析中′１画 分１蛋白質の結晶が生成した。画分１蛋白質を単離するため開発された第２の方 法は、葉から得られたかっ色ジュースをセファデックスクロマトグラフィーカラ ムを通すことを伴なった。セファデックδは重合糖の水不溶性の微視的ビードか らなっている。分離を行なうためセファデックスＧ−２５またはＧ−５０が使わ れた。適当なビードを選択すると、一層大きな分子を排除して小分子がビードの 構造の内部に浸透することを可能にする。それ故、一層大きい分子はしつか多充 填されたセファデックスビード間の隙間の液体中にのみ見出される。この隙間空 間は「空げき容積」と呼ばれる。

有効な分離を達成するためには、かっ色ジュースの容積はビードの全容積の約２ ５憾を越えることはでき々い。

ビードをまず緩衝液と平衡にさせ、ついで同一緩衝液を含むかっ色ジュースの所 定容積をセファデックスカラムの頂部に層にしておく。

このかつ免液を緩衝溶液を使ってカラムから溶出する。

ジュースがカラムを下方に動くにつれ、小分子はビードの内部へ浸透するから小 分子の通過は遅延される。他方。

大きな画分１の分子はビード間の隙間によ〕形成された迷路を通りカラムを一層 はやい速度で下方に動き、透明かっ色溶液としてカラムから出る。しかし、溶出 は該溶液を少なくとも２倍希釈する。一層小さい分子の除去は画分１蛋白質の分 子のまわシの環境を変えて、結晶化に導びく。

最も新しく記載の方法は上記のようにセファデックスＧ−２５カラムを通しかっ 色ジュースを一過させる。たばこ以外の全植物の抽出の場合のように、画分１蛋 白質が結晶化しないときは、溶液が３０〜５０％飽和まで硫殿し、これを遠心分 離により集める。分離後、沈殿が析出した容量よりも少ない容量の緩衝液に沈殿 を再溶解し。

これにポリエチレングリコール８憾を添加する。この混合物をシリカグルを含む 別の開放皿忙隣接した開放皿に入れ、二つの皿を密閉容器に閉じ込める。水が蛋 白質溶液から徐々に蒸発し、シリカグルによシ吸収される。時上記の従来の当該 技術の方法は時間を浪費し、費用がかかるか、またはその両者であることは当業 者には明らかである。しかし１本出願人の係属中の米国特許出願第７８．５０５ 号において１葉をノ４ルグに変換し、ノヤルプの液体部分を蛋白質を変性させる 温度以下の温度に加熱し、ついで液体部分を画分１蛋白質、すなわちリブロース １，５−ニリン酸カルがキシラーゼが結晶化する温度に冷す工程からなる画分１ 蛋白質の簡単な単離法が記載されている。

発明の要約 本出願人の係属中の米国特許出願第７８，５０５号に記載の発明以来、緑葉植物 の葉からりブロース１，５−二リン酸カル？キシラーゼを単離する一層簡単な一 層有効さ方法が発見された。この点に関ル、当該方法の必須部分とはじめには考 えられていた加熱工程を大抵の場合はふけることが発見された。この改良法によ ると１葉かわち約ｐＨ５，０で起る等電点よ９上の値までの範囲の値に調節する ことによって、リブロース１，５−ニリン酸カル？キシラーゼを結晶形で得る。

不溶物質を分離後、液体を好ましくは常温以下に冷しながら放置して、画分１蛋 白質を結晶化させる。・ｐＨが減少すると、すなわち等電点近くになると、結晶 化が一層容易に起こることが一般に認め・られた。

本発明の目的は画分１蛋白質の改良単離法を提供するにある。

他の目的は高い収率と純度で画分１蛋白質を得ることである。

これらの目的およびその他の目的を本発明によシ遂行する方式を１次の発明の詳 細な説明で記載する。

発明の詳細な説明 多種類の葉からりブロース１，５−ニリン酸カルがキシラーゼおよび低分子量蛋 白質の単離に本発明の方法を使用できる。しかし、たばこの葉、４１１Ｆに未熟 たばこの葉は特に高い蛋白質源であるから、本発明の方法にこのような葉を使う のが好ましい。したがって１本発明を特にたばこからのりブロース１，５−ニリ ン酸カルがキシラーゼの単離に関し記載する。

たばこ植物から葉を離した後１葉または小さい植物が葉温である場合は葉と茎と を粉砕し、破砕し、または他の方法でｉ４ルプに小さくシ、固体から葉の液体部 分を遊離さす。好ましくは、パルプにする工程は還元剤の存在で実施する。この 点に関し、パルプにする工程は葉中に存在するフェノールオキシダーゼ酵素を葉 の蛋白質と接触させる。これは蛋白質の一次構造の一部分を構成するチロシンの ような芳香族アミノ酸の醇化をまねく。この酸化はかつ色になることにより目で わかるように蛋白質を変性し、その水溶解度を下げる。還元剤は事実この酸化を 抑制する酸化防止剤として作用する。

本発明で使うのに現在好ましい還元剤は２−メルカプトエタノールである。この ものは揮発性で、下記のさらに処理中蒸発して、単離物質中にほとんどまたは全 く残留物を残さないからである。しかし、その他の還元剤も使用できる。このな かにはメタ重亜硫酸ナトリウムおよびジチオトレイトールのような試薬がある。

たとえあっても、これらの試薬の残留物の分離は常法を使い行なえる。酸化を制 御するのに十分な還元剤の量はたとえば選んだ試薬に依存し変化できる。２−メ ルカプトエタノールの場合は、望ましくない酸化を有効に抑制することは、処理 する植物物質１ｋ１１当シ該液体試薬約５−を使って達成できる。

植物物質の液体部分は画分１を含む植物蛋白質および溶解形のその他の固体を含 んでいる。ノ４ルゾの固体部分は粗い容易に分離される物質および液体から分離 困難な細かい粒状の緑色顔料含有物質を含んでいる。粗い物質は葉物質をパルプ に変換した後すばやく液体部分から分離するのが好ましい。たとえば、チーズ布 を使う簡単な濾過がこの分離を達成する。これを行なったとき、なお細かい粒状 の緑色顔料含有物質を含んでいる液体部分を必要なときは酸で、好ましくは塩酸 で処理して、ｐＨを望ましい範囲内に、すなわち約ｐＨ６，０から液体部分中の 蛋白質が変性しそれによって無定形塊として析出する等電点近くだがそれ以上の 点までの範囲内にする。この塊は画分１と画分２の蛋白質物質の両者を含んでい る。

蛋白質の等電点は約ｐＨ’５．０である。そこで、本発明に従いｐＨを調節すべ き実際的下限は約ｐＨ５，３である。液体を酸性にした後、粗い物質の分離を実 施できる。

リン酸および硫酸を含めその他の鉱酸も使用できる。

たばこの葉ノ４ルゾの液体部分のｐＨは植物の年令に従い変化することがわかっ た。著しく若い植物、すなわち約１２インチ高さ以下の植物の場合は、　ｐＨは 約６．０以上の範囲である。植物が成熟するにつれ、液体部分のｐＨは下がシ、 すなわち液体部分は当然一層酸性である。

たとえば、１８〜２４インチの範囲の高さの植物からの液体のｐＨは約５．７で あ゛シ、一方２４〜３６インチの植物から得られた液体部分は約５．３のｐＨを 有していたＯ 最上の結果を得るためには、゛好ましくは液体のｐＨ−＋　を約５．４〜５．８ の範囲に、最も好ましくは約５．４〜５．６のｐＨに調節する。ｐＨが約５．８ 以上であると、結晶化は低ｐＨよシも著しく遅い速度で起る。これに対比し、ｐ Ｈを約５．４以下に調節すると、得られる画分１蛋白質は望ましい物質を失なっ ている。ｐＨを等電点近くに調節すると、画分１蛋白質にその変性で生じるもの と類似の変化を起すと考えられる。たとえば、約５．４以下のｐＨで液体から結 晶化する画分１蛋白質を再溶解することは一層困難である。

ｐＨを好ましい臘囲内５．４〜５．６に調節することによって、細かい粒状緑色 物質は一部分凝固するのでその分離が容易になることも見出された。植物葉緑素 を含むこの物質は適当な方法で分離できるが、遠心分離が便利で好ましい方法で ある。

ある場合には、特に一層成熟した植物からのｉ４ルプ物質の場合には、または約 ５．６以上のｐＨを使うときは。

容易に分離するために細かい粒状緑色物質を含む混合物を加熱する必要があシ得 る。加熱工程は細かい粒状物質を上記のように遠心分離によシ分離できる程度壕 で凝固する効果を有する。

緑色の細かい粒状物質の分離を容易にするため、全ノ４ルプを加熱できる。しか し、粗い物質を除去後桟るノ４ルノ部分を加熱することが好ましい。

加熱工程は蛋白質が熱のみによシ変性する温度以下の温度で実施する必要がある 。そこで、一般には加熱工程は約５２℃以下で実施すべきである。はぼこの温度 で加熱すると蛋白質の沈殿を生じるからである。パルプを約４８℃（１１８Ｔ） で多くて約１５分加熱することによできるが、一層長い加熱時間を必要とする。

本出願人の係属中の米国特許第７８．５０５号に記載のように、熱処理を連続式 でまたはバッチ式で実施できる。そこで、パッチ法では、ノヤルノを容器に入れ 、パルプの部分または少なくともその液体部分が蛋白質が変性する温度まで加熱 されない条件下でノ９ルゾに熱を伝導する。上記のように、好ましくはパルプを ５０±１℃に約１５〜約２０分加熱する。

連続法では、・ヤルプの特定容量が５０±１℃に約１５〜約２０分熱交換にょシ 加熱されるような温度に加熱された液体に浸漬したコイルを通し下洛にかくはん することなくパルプをポンプ送シし、ついで・ぐルプの温１１ｔ−下げるため５ ０℃以下の温度の液体と接触しているコイルを通しポンプ送りする。

細かい粒状物質を凝固さすための上記のようなｉ４ルゾの加熱は、単にｐＨを調 節するよりも一層有効である。

しかし、細かい粒状物質・を除去するため必要な場合にだけ加熱法を使うべきで ある。加熱は画分１蛋白質の結晶化が起る時間を長くし、ある場合には得られる 蛋白質の量を減らす実際的効果を有するからである。

示したように、凝固後たとえば遠心分離によって液体部分から細かい粒状物質を 分離できる。得られる上澄液体はかっ色ジュースである。このジュースを結晶化 が起る温度に、ふつうは室温またはそれよシ低い温度で貯蔵し、画分１蛋白質の 結晶を得る。かっ色ジュースを約８℃に冷却することにより特に良好な結果が得 られた。必要な最大貯蔵時間は多くて約１６時間である。１６時間を越える貯蔵 はふつう収率を改善しないことを経験した。

結晶化したりブロース１，５−ニリン酸カルボキシラーゼを濾過または遠心分離 （３０００ＰＰＭ、５分）によシ上澄液から分離する。

リブロース１．５−ニリン酸カルボキシラーゼの結晶形は従来の当該技術の方法 を使って得られる３形態とは異なっている。形態！結晶は十二面体形を有し、モ レキュラーシーブまたはセファデックスクロマトグラフィーを使う上記方法によ り製造される。形態旺結晶は極度に薄い板形を有し、著しく特別な条件下でのみ またＸ線結晶学研究のためにはごく少Ｉでしか製造されていない。

形態■結晶は四角肉離であり、上記の＠酸アンモニウムおよびＩリエチレングリ コール処理により製造される。

これに対比し、ここに記載の方法で製造された画分１蛋白質結晶は、当該技術で 既知の他の三つの結晶形と異なシ第４の形態をとる。そこで１本発明の方法を使 うと、顕微鏡検査によシ明らかな六角形をもつ画分１蛋白質結晶Ａ％高収率で高 純度で得られる。

食塩（Ｎａα）を含む水に再溶解する形態Ｉ結晶に対比し、六角形結晶は未溶解 で残るが、結晶を水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でｐＨ７，５またはそれよシ高 いｐＨに調節した水に懸濁すると一般に溶液になる。かっ色ジュースが当然５． ３のｐＨを有する着しく成熟した植物、すなわち高さ２４〜３６インチの植物か ら得られた蛋白質は水（ＮａＯＨの添加によりｐＨ８，５）　に再溶解できない 。再溶解した画分１蛋白質を緩衝液に対し透析しく３回％Ｉ）８７．５）、つい でセファデックスカラムを通すと、再結晶するが、形態！結晶となる。

かっ色ジュースから得られる画分１結晶は、汚染物を除くため水洗することによ シ典利に精製できる。また遠心分離によシ上澄液から結晶の分離が最もよく達成 される。５分間の低速遠心分離（３，ＯＯＯＲＰＭ）で足りる。

画分１蛋白質のこの結晶化法はかっ色ジュースから上記蛋白質を実質上完全に除 去する。得られる上澄液は画分２蛋白質、その他の可溶性固体、およびあったと しても未結晶化画分１蛋白質を含んでいる。等電点以下に、すなわちｐＨ，５、 ０以下に酸性にすることによって１画分２蛋白質を上澄液から除去できる。これ は溶液中の蛋白質を沈殿させる。塩酸またはその他の適当な酸の添加によシｐＨ を約４．０〜４．５に調節することにより、蛋白質の最高収率が得られる。得ら れる沈殿を遠心分離（３０００ＲＰＭ、５分）によシ集めることができる。

沈殿を水洗し、ふたたび遠心分離によ）集めるときは、汚染物を除去できる。

葉を刈入れ、これを／４′−ルノに変換しく粉砕、破砕、ｔたはその他の適当な 方法によることができる）、ｐＨを調節し、必要ならば加熱工程を行ない、液体 部分から固体物質を分離する間の時間経過は、できるだけ刈入れ後すぐに遂行す る必要がある。これらの工程の遂行における遅延は得られるリゾロース１，５− ニリン酸カルがキシラーゼの収率を下げる。そこで、葉を刈入れる場所またはそ の付近でこれらの操作を行なうのが好ましい。

次の実施例は本発明のさらに詳細を示す。

実施例１ 型ＮＣ９５のたばこ植物を作物当９０．５平方フィートの作物密度で、１８〜２ ４インチの高さに達するまで栽培した。葉が濃緑色となるように該植物を栽培し た。

植物の全空気中部分を刈入れ、１ガロンの大きさのウオーリングプレンダーに導 入するのに十分小さい片に切断した。プレンダーの羽根を水約２００ｍで蔽った 。（ウォーリングプレンダーは羽根を液体中に沈めなければ植物物質を砕解しな い。しかし、リーラディスイッチグレーターのような他の装置では、水の添加は 不必要である。）刈シ入れた植物物質から得られた粗く切シ刻んだ茎と葉の１１ ℃ｇパッチを、２−メルカプトエタノール５−と共に水に添加し、滑らかなパル プにまで配合した。濃いホットターキノぐターのコンシスチンシーを有する得ら れた・ぐルテは約１．２ｔの容量からなっていた。・やルデ中の粗い物質を８イ ンチ直径の３２メツシユふるい上に支持された２　４／２０メツシユチーズ布の ２層の上にあけた。

上記ふるいは捕集フラスコ内へ流出する大きなＦ斗のなかに置かれていた。

このように処理し、パルプ１．２ｔから緑色顔料含有　−物質を含む液体約１． Ｏｔが得られた。この「、緑色ジュース」は異なる調製物において約５．７〜５ ．９のｐＨを有していた。

この緑色ジュースを各々５００−の等しい試料に分割した。１試料を２５℃に保 ち、他の試料は５０℃に１０分加熱した。ついで両試料をペックマン超遠心機で ／８．ＯＯＯＲＰＭのＲ−２１回転子で５０分同時に遠心分離した。この高い遠 心力は全ての緑色を沈殿として除去し、透明な「かっ色ジュース」を残した。か っ色ジュースの各試料、すなわち加熱試料と加熱してな匠試料を等しい部分に分 割し、一つを８℃で貯蔵し、他を２５℃で放置した。各試料から画分１蛋白質の 等しい量が結晶化した。結晶化はすべての場合２６時間以内に完結したが、かっ 色ジュースを冷凍した場合結晶が一層迅速にあられれた。この実施例はりブロー ス１１５−二リン酸カルがキシラーゼの結晶を得るのに、液体部分の加熱は必須 ではなかったことを示している。

実施例２ 実施例１の操作を使い、高さ１８〜２４インチのたばこ植物からｐＨ５−７を有 する緑色ジュースを得た。こノ緑色ジュースを二つの等しい部分に分割した。一 つの部分のｐＨを水酸化ナトリウムを使いｐＨ，６，２に調節した。両部会を５ ０℃に１０分加熱して、適当な遠心分物質を除去後、かっ色ジュースの２試料を ８℃で貯蔵した。数時間以内に、ｐＨ’　５　、７のかっ色・ジュースでは結晶 があられれた。ｐＨ６，２を有する試料では２４時間後でさえ結晶はあられれな かった。同様の実験で、ｐＨ５，３を有する高さ２４〜３６インチのたばこ植物 から得られたかっ色ジュースは３０分以内に結晶を生じ、結晶が最初にあられれ た後３時間以内に完全な結晶化が起った。しかし、得られた画分１蛋白質はｐＨ ８〜８．５で再溶解しなかった。かつ免液がｐ）１５．８である高さ１８〜２４ インチのたばこ植物を使った別の実験で、画分１蛋白質の結晶は１２時間ではあ られれなかった。結晶化は１６時間以内に完結した。これらのデータから画分１ 蛋白質の結晶の生成は一層低いｐＨで一層迅速に起ることがわかる。

実施例６ 実施例１の方法を使い、１２インチ以下の高さの著しく若いたばこ植物から緑色 ジュースを得た。こうして得たジュースは１）Ｈ６，０を有していた。得られた 全ジュースを二つの等しい部分に分割し、各部分をさらに処理するために四つの 等しい試料にさらに分割した。ｐＨ６，０を有するもとの部分の各々から１試料 を対照として使った。各部分からの１試料を塩酸で処理してｐＨ−＋５．８にし 、別のものをｐＨ５，６に調節し、別のものをｐＨ５，４に調節した。一つの部 分の４試料を５０℃に１０分加熱゛した。これらの４試料および他の部分からの ４試料を遠心分離して細かい粒状の緑色物質を分離した。

全試料を８℃で放置して画分１蛋白質の結晶を生成させた。結晶が最初にあられ れた時間を記録し、結晶化が完結したとき、得られた結晶の量を記録した。かっ 色ジュースを分光測光的に分析し、かっ色ジュースを汚染している微粉砕緑色粒 状物質の量を測定した。結果を次の第１表に示す。

加熱せず　６．０　８　１０　６ ５．８　６　５　’　６ ５．６　３　１　６ ５．４　３．、　０　’　６ ５０℃に加熱　６．０　’４８　０　３５．８　４８　０’　３ ５．６　１６　０　５ ５．４　３　０　に れらのデータから、画分１蛋白質の結晶化を起すのに加熱は必要ではなくて、事 実大抵の場合結晶化速度を遅らせ、得られる蛋白質の量を減らすことがさらにわ かる。ｐＨを下ける効果は結晶化が起る速度を明らかに増すことである。さらに 、試料の加熱は細かい粒状の緑色物質の分離を容易にしたが、ｐｉ−１を５．４ 〜５．６に調節すると未加熱試料でも緑色物質の完全な分離が起った。

緑色ジュースおよび画分１蛋白質の結晶化後のかっ色ジュースの分析遠心分離か ら得られたシュリーラン模様を比較することによシ、ｐＨを望む範囲に調節した 緑色ジュースからの画分１蛋白質の分離効率を決定した。前者は２本のよく分離 したピークを示し、その一つは画分１蛋白質に相当し、他は画分２蛋白質に相当 する。後者では、画分２蛋白質に相当する単一のピークのみ観察される。分析遠 心分離法は画分１蛋白質の０’、１ｍｙ／−程度の少量を検出できるから、結晶 化完結後は、溶液中に残っている画分１蛋白質の濃度は１チ以下であると確信を もって言える。これに対比し、セファデックスカラムを使う従来の当該技術のク ロマトグラフィー法から得られた母液は、画分２蛋白質のほかに、未結晶化画分 １蛋白質約３０チを含んでいた。

上記から、本発明は植物物質から蛋白質、特に画分１蛋白質を得る便利な方法を 提供することがわかる。こうして、本発明の方法は従来の当該技術の方法で必要 としたような費用のかかる精巧な分、子濾過およびセファデックスカラムの必要 性を回避する。さらに、還元剤および液体のｐＨの調節に使う酸以外の化学試薬 を必要としない。還元剤が２−メルカゾトエタノールの場合は、両分加熱工程中 追出される。該液体をうすめる必要がないから、画分２蛋白質の回収も簡単であ る。最後に、液体部分から画分２蛋白質および未結晶化画分１蛋白質の除去後、 液体部分は従来の当該技術の方法で得られる残留物を使う場合よりも一層経済的 に回収できる価値ある低分子量化合物をなお含んでいる。これらは天然形で未希 釈だからである。これに対比し、従来の当該技術の方法で得られた残留物はその 方法で使われる化学薬品により汚染されてお９、また画分１蛋白質の分離中希釈 されており、さらに回収を複雑にする。本改良法はまた大抵の場合本出願人の係 属中の米国特許出願第７８．５０５号に記載の加熱工程を使うことを不必要とす る。

本発明を現在好ましい具体化に関して記載してきた。

しかし、本発明の上記記載から、請求の範囲によってのみ限定される本発明の範 囲から離れることなく当該方法の変形が可能なことは当業者には明らかである。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（ａ）緑葉植物の葉、を固体部分と液体部分との混合物からなる／ＩＰルデに 変換し、ただし該液体部分が溶解しているリブロース１．５−二リン酸カルがキ シラーゼを含んでおり、 （ｂ）　必要に、より、液体部分のｐＨをｐＨ６，０から該蛋白質が析出しない 液体部分中の蛋白質の等電点より十分上のｐＨまでの範囲内に調節し、（ｃ）　 固体部分から液体部分を分離し、（ｄ）　該液体部分を該リブロース１，５−二 リン酸カル諸工程からなることを特徴とする緑葉植物の葉からなる植物物質から りブロース１，５−ニリン酸カルがキシラーゼを得る方法。 ２、　リブロース１．５−二リン酸カルがキシラーゼの結晶を該液体から分離す る請求の範囲第１項記載の方法。 ６、植物物質がたばこ植物の葉からなる請求の範囲第１項および第２項記載の方 法。 ４、　９ＨをｐＨ５−３〜６．０の、範囲内に調節する請求の５、　１）Ｈを５ ６．６〜６．０の範囲内に調節する請求の範囲第３項記載の方法。 ６、ｐＨを５．４〜６．５の範囲内に調節する請求の範囲第１項および第２項記 載の方法。 ７、ｐＨを５．４〜５．６の範囲内に調節する請求の範囲第３項記載の方法。 ８、　リブロース１．５−二リン酸カルがキシラーゼの分またはそれ以下のｐＨ に調節して該蛋白質を析出さ、せ間第８項記載の方法。 １０、リブロース１．５−二リン酸カルがキシラーゼが六角形結晶として結晶化 する請求の範囲第１項間は第２項記載の方法。 １１、（ａ）　たばこ植物の葉部分を固体部分と液体部分とからなるノｆルグに 変換し、該固体部分が粗い粒状物質と細かい粒状物質とからなシ、該液体部分が 溶解しているリブロース１，５−ニリン酸カルボキシラーゼを含んでおり、 （ｂ）　必要により、液体部分のｐＨをｐＨ６，，０から該蛋白質が析出しない 該液体部分中の蛋白質の等電点よシ十分上のｐＨまでの範囲内に調節し、（ｃ） 　固体部分から液体部分を分離１、（ｄ）　液体部分をリブロース１，５−ニリ ン酸カルがキシラーゼが結晶化する温度に貯蔵し、 （ｅ）　液体部分からりブロース１，５−ニリン酸カルがキシラーゼを分離する ことを特徴とするたばこ植物からりブロース１，５−ニリン酸カルがキシラーゼ を得る方法。 １２、ｐＨを調節する前に、粗い粒状物質を液体部分から分離する請求の範囲第 １１項記載の方法。 １６、該固体部分の分離前にｐＨを調節する請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、ｐＨを５．３〜６．０の範囲内に調節する請求の範囲第１１項、第１２項 、および第１３項記載の方法。 １５、ｐＨを５．４〜５．６の範囲内に調節する請求の範囲第１１項、第１２項 、および第１３項記載の方法。 １６、パルプを約４８〜５２℃の温度に加熱して該細かい粒状の緑色物質を凝固 させる請求の範囲第１１項、第１２項、および第１３項記載の方法。 １Ｚ　粗い粒状物質を液体部分から分離し、残留物を約４８〜５２℃の温度に加 熱して該細かい粒状の緑色物質を凝固させる請求の範囲第１１項、第１２項、お よび第１３項記載の方法。 １日、該リブロース１，５−ニリン酸カルがキシラーゼの分離後、液体部分を溶 解している蛋白質の等電点以下に酸性にして該蛋白質を析出させる請求の範囲第 １１項、第１２項、および第１３項記載の方法。 １９、　９Ｈを４．０〜４．５の範囲内に調節する請求の範囲第１８項記載の方 法。 ２０、たばこ植物の葉および茎部分をパルプに変換する請求の範囲第１１項、第 １２項、および第１３項記載の方法。 ２１、該液体部分中の蛋白質の構造の一部を構成しているアミノ酸置換基の酸化 を抑制するのに十分な量で、還元剤を該植物物質に添加する請求の範囲第１１項 、第１２項、および第１６項記載の方法。 ２２該還元剤が２−メルカゾトエタノールである請求の範囲第２１項記載の方法 。 ２３、該パルプに変換前に植物物質に該還元剤を添加する請求の範囲第２１項記 載の方法。 ２４、該リブロース１，５−ニリン酸カルボキシラーゼが六角形結晶として析出 する請求の範囲第１１項、第１２項、および第１３項記載の方法。 ２５、六角形結晶形のりブロース１，５−ニリン酸カルがキシラーゼ。