DE3152847T1

DE3152847T1 - Verfahren zum isolieren von proteinen aus pflanzenblaettern

Info

Publication number: DE3152847T1
Application number: DE813152847T
Authority: DE
Inventors: Samuel G. 90403 Santa Monica Calif. Wildman; Prachuab 27511 Cary N.C. Kwanyuen
Original assignee: LEAF PROTEIN Inc
Current assignee: LEAF PROTEIN Inc
Priority date: 1981-05-18
Filing date: 1981-05-18
Publication date: 1983-07-07
Anticipated expiration: 2001-05-19
Also published as: GB2110221B; GB2110221A; JPH03998B2; GB8300606D0; DE3152847C2; JPS58500737A; WO1982004066A1; BR8109020A

Description

HOFFMANN · EITLE & PARTNER 31528^7

PATtHNT-UNDRECHTSANWAUTE

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE ■ DR. FXKR. NAT. K. HOFFMANN . DIPL₁-ING. W. LEHN

DIPL.-ING; K. FÜCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ■ DR. RER. NAT. H.-A. DRAUNS · DIPL.-ING. K. GORG

DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE

38 04 2 o/wa

BESCHREIBUNG

Verfahren zum Isolieren von Proteinen aus Pflanzenblättern

GEBIET DER ERFINDUNG

Gemäss einem breiten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Isolieren von Proteinen aus Pflanzenblättern. Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus gründen Pflanzenblättern. Gemäss einem anderen, spezifischeren Aspekt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus Tabakblättern.
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VERWEIS AUF ÄHNLICHE ANMELDUNGEN

Diese Anmeldung ist eine Coritinuation-in-Part der anhängigen Anmeldung mit der Serial Nr. 78,505, eingereicht am 24. September 1979, deren Offenbarung hiermit eingeschlossen wird.

ARADkI. LASTRASr-.E 4 ■ D-ROOO MONCI-ICN Ol . TEIJION COIV O OI1OOV · TELEX O.V2OÜ1O CPATHE) . TELEKOMERER 91O3E6

HINTERGRUND

Die fleischigen Blätter gewisser Pflanzen, einschliess- ;■ lieh Tabak/' Spinat, Sojabohnen, Weizen, Baumwolle und Luzerne, bestehen aus 10 bis 20 % Feststoffen, wobei der Rest Wasser ist. Der feste Anteil setzt sich aus einem wasserlöslichen Teil und einem wasserunlöslichen '■Teil zusammen, wobei der letztere hauptsächlich aus dem fibrösen Strukturmaterial der Blätter besteht.

Die wasserlöslichen Verbindungen lassen sich in zwei Gruppen aufteilen. Eine Gruppe schliesst Verbindungen mit verhältnismässig niedrigem Molekulargewicht ein, wie Zucker, Vitamine, Aminosäuren und andere Verbindungen, deren Molekulargewicht etwa 10.000 nicht übersteigt, Die zweite Gruppe besteht fast ausschliesslich aus Proteinen, deren Molekulargewichte bei etwa 30.000 oder mehr liegen.

20, Die Proteine können in zwei Fraktionen aufgeteilt werden. Eine Fraktion enthält eine Mischung aus Proteinen mit Molekulargewichtsbereichen von etwa 30.000 bis 100.000. Diese Proteine werden manchmal als "Fraktion-2-Proteine" bezeichnet. Die restliche Fraktion besteht aus einem einzigen Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 550.000 und wird manchmal als "Fraktion-1-Protein" bezeichnet.

Fraktion-1-Protein wurde zum ersten Mal 1947 identifiziert. Anschlicssende Untersuchungen führten zu der Entdeckung, dass dieses Protein ein Enzym, das bei der

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Fotosynthese involviert ist, darstellt. Seitdem hat man ihm eine Anzahl von Namen gegeben. Dazu gehören Ribulose, 1,5-Diphosphatcarboxylase, Carboxydismutase, Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase und Ribulose-1,5-di(oder bis)phosphatcarboxylase-oxygenase.

Fraktion-1-Protein kann bis zu 25 % des Gesamtproteingehaltes eines Blattes und bis zu 10 % des Feststoffgehaltes in einem Blatt ausmachen. 1970 wurde entdeckt, dass kristallines Fraktion-1-Protein aus Tabakblättern erhalten werden kann.

Fraktion-1-Protein ist in. reiner Form geruchlos, geschmacksfrei und farblos und hat einen hohen Nährwert.

Aufgrund dieser Eigenschaften, und weil man es in hoher Reinheit gewinnen kann, kann man Fraktion-1-Protein als eine potentielle wertvolle Anwendungsmöglichkeit für ein Nährzusatzmittel für Tiere und Menschen ansehen. Im Falle der Menschen könnte das Additiv eine Komponente für hochproteinhaltige oder andere spezielle diätetische Nahrungsmittel sein. So wurde es beispielsweise als Ergänzung für eine Diät für solche Personen, die wegen einer Nierenerkrankung eine Dialyse benötigen, vorgeschlagen.

Trotz seines relativen Überflusses in Kulturpflanzen stellt Fraktion-1-Protein kein wirtschaftliches Produkt dar, weil Verfahren zur Gewinnung aus pflanzlichem Material derzeit nicht wirtschaftlich sind.

Drei Grundverfahren zum Isolieren von Fraktion-1-Protein

sind in der veröffentlichten Literatur bisher beschrieben worden. Jede veröffentlichte Methode beginnt mit einem Einstarapfen der Blätter und der Stengel der Pflanze, worauf man dann einen grünen Saft aus der Pulpe auspresst. Der grüne Saft, der feinteiliges pigmentiertes, grünes Material enthält, wird, beispiels weise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, geklärt, um die feinteiligen Feststoffe von der Flüssigkeit abzutrennen. Die gebildete Flüssigkeit hat eine braune Farbe.

Bei der ersten zur Isolierung von Fraktion-1-Protein beschriebenen Methode wird das Fraktion-1-Protein gleichzeitig mit seiner partiellen Abtrennung von niedrigmolekulargewichtigen Verbindungen in dem braunen Saft durch Molekularfiltration konzentriert...Unter Verwendung eines Molekularsiebes, dessen Poren kleinere Moleküle hindurchlassen, ohne dass Fraktion-1-Protein hindurchgeht, wurde auf den braunen Saft Druck einwirken gelassen, so dass die kleinen Moleküle durch die Poren hindurchgehen.

Die das Fraktion-1-Protein enthaltende Lösung wurde auf etwa das 10-fache konzentriert und dann zur Entfernung von weiteren kleinen Molekülen in der Lösung dialysiert. Die Dialyse wurde unter Verwendung eines Dialysesacks vom Collodion-Typ durchgeführt. Die Poren dieses Sackes Hessen das Fraktion-1-Protein nicht hindurch, ermöglichten aber, dass die kleinen Moleküle

3'0 durch den Sack in das Wasser gelangten. Während der Pialyse bildeten sich Kristalle des Fraktion-1-Proteins

Bei der zweiten, zur Isolierung des Fraktion-1-Proteins entwickelten Methode wurde der aus den Blättern erhaltene braune Saft durch eine Sephadex-Chromatografierkolonne geleitet. Sephadex besteht aus wasserunlöslichen mikroskopischen Perlen aus polymerisiertem Zucker. Sowohl Sephadex G-25 als auch G-50 wurden zur Durchführung der Trennung verwendet. Durch die Auswahl von geeigneten Perlen wurde es ermöglicht, dass kleine Moleküle in das Innere der Struktur eindringen, während die grösseren Moleküle ausgeschlossen bleiben. Die grösseren Moleküle findet man deshalb nur in der Flüssigkeit in den Zwischenräumen zwischen den dichtgepackten Sephadexperlen. Dieser Zwischenraum wird als "Hohlraumvolumen" bezeichnet.

Um eine wirksame Trennung zu erzielen, kann das Volumen des braunen Saftes nicht etwa 25 % des Gesamtvolumens der Perlen übersteigen. Die Perlen werden zunächst mit einem Puffer und einem Volumen des braunen Saftes, enthaltend den gleichen Puffer, ins Gleichgewicht gebracht und werden dann oben auf eine Sephadexkolonne aufgegeben. . .

Die braune Flüssigkeit wird aus der Kolonne unter Verwendung der Pufferlösung eluiert. In dem Masse, wie der Saft nach unten in die Kolonne lauft, wird der · Durchgang der kleinen Moleküle verhindert, weil sie in das Innere der Perlen eindringen. Die grossen Fraktion-1-Moleküle bewegen sich andererseits mit einer schnelleren Rate nach unten durch die Kolonne durch das durch die Zwischenräume zwischen den Perlen gebildete Labyrinth

und treten aus der Kolonne als klare braune Lösung aus. Eine Eluierung ergibt jedoch wenigstens 2-fachen Verdünnung der Lösung. Die Entfernung der kleineren Moleküle verändert die Umgebung um die Moleküle des Fraktion-1-Proteins, was zur Kristallisation führt.

Die jüngst beschriebene Methode sieht den Durchgang "des braunen Saftes durch eine Sephadex G-25 Kolonne der vorher beschriebenen Art vor. Wenn Fraktion-1-Protein nicht kristallisiert, wie das für die Extrakte aller Pflanzen, ausgenommen Tabak, der Fall ist, gibt man Ammoniunisulfat hinzu bis die Lösung zu 30 bis 50 % gesättigt ist. Dies führt zum Ausfällen eines amorphen Materials, das dann durch Zentrifugieren gesammelt wird. Nach dem Abtrennen wird der Niederschlag in einem kleineren Volumen des Puffers als dem aus dem es ausgefällt wurde, wieder aufgelöst und dazu wird 8 %-iges Polyethylenglykol gegeben. Diese Mischung wird in eine offene Schale, die zu einer anderen offenen Schale, enthaltend Kieselgel, benachbart ist, gelegt und die beiden Platten werden in ein geschlossenes Gefäss gestellt. Wasser verdampft allmählich aus der Proteinlösung und wird von dem Kieselgel absorbiert.

Nach einiger Zeit entwickeln sich dann Kristalle des Fraktion-1--Proteins.

Für den Fachmann ist es klar, dass die vorerwähnten Verfahren des Standes der Technik entweder eine lange Zeit beanspruchen, teuer sind oder diese beiden Eigenschaften haben. In unserer anhängigen Anmeldung mit der

Serial Nr. 78 505 beschreiben wir ein einfaches Verfahren zum Isolieren von Fraktion-1-Protein mit den Stufen: Überführen der Blätter in eine Pulpe, Erhitzen des flüssigen Anteils der Pulpe auf eine Temperatur unterhalb welcher das Protein denaturisiert wird, anschliessendes Kühlen des flüssigen Teils auf eine Temperatur, bei welcher Fraktion-1-Protein, d.h. Ribu- _ lose-1,5-diphosphatcarboxylase, kristallisiert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Nach der Erfindung, die in der anhängigen Patentanmeldung Serial Nr. 78 505 beschrieben wird, haben wir ein noch einfacheres und noch wirksameres Verfahren zum Isolieren von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus den Blättern von grünen Pflanzen gefunden. Wir haben nämlich festgestellt, dass die Erwärmungsstufe, von

der wir ursprünglich annahmen, dass sie einen wesentli-0 chen Teil des Verfahrens darstellt, in den meisten Fällen fortgelassen werden kann. Bei unserem verbesserten Verfahren erhält man Ribulose-1,5-diphosphatcarboxy lase in kristalliner Form, indem man den pH des flüssigen Teils einer Pulpe aus den Blättern auf einen Wert im Bereich zwischen etwa 6 bis zu einem pH oberhalb dessen das Protein denaturisiert wird und eine amorphe Masse ausfällt, einstellt, z.B. auf einen Wert oberhalb des isoelektrischen Punktes, der bei etwa pH 5,0 liegt. Die Flüssigkeit lässt man dann, nach der Abtrennung des unlöslichen Materials, stehen, vorzugsweise unter Kühlung unterhalb der Umgebungstemperatur, um die

Kristallisierung des Fraktion-1-Proteins zu ermöglichen. Es wurde von uns allgemein festgestellt, dass die Kristallisation leichter abläuft, wenn der pH abnimmt, d.h. wenn er sich dem isoelektrischen Punkt nähert.

Ein Ziel der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zum Isolieren von Fraktion-1-Protein zur Verfügung zu stellen.

' . ; ■ ·■■■■■ ' . , ' '■ '■■ ■ · · ,■ .; " - ^: Ein weiteres Ziel ist es, Fraktion-1-Protein in hoher Ausbeute und Reinheit zu gewinnen;

Die Art in welcher diese und weitere Ziele durch die vorliegende Erfindung erreicht werden, wird in der nach folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung erläutert.

20 AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das erfindungsgemässe Verfahren kann zum Isolieren von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase und von niedrigmolekulargewichtigem Protein aus Blättern zahlreicher Art verwendet werden. Da jedoch Tabakblätter und insbesondere die Blätter von unreifem Tabak eine besonders reiche Quelle für das Protein sind, wird bevorzugt, solche Blätter beim erfindungsgemässen Verfahren zu verwenden. Infolgedessen wird die Erfindung unter besonderer Bezugnahme auf die Isolierung von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus Tabak beschrieben.

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Nach dem Ablösen der Blätter von der Tabakpflanze werden die Blätter, oder die Blätter und die Stengel zusammen, wenn kleine Pflanzen die Quelle für die Blätter sind, gemahlen, zerstossen oder in anderer Weise zu einer Pulpe zerkleinert, um den flüssigen Anteil in den Blättern von den Feststoffen zu befreien. Vorzugsweise wird das Zerkleinerungsverfahren in Gegenwart eines Reduktionsmittels vorgenommen. Dabei wird bei dem Zerkleinerungsverfahren es ermöglicht, dass das in den Blättern vorhandene Phenoloxidaseenzym die Blattproteine kontaktiert. Dadurch ergibt sich eine Oxidation der aromatischen Aminosäuren, wie Tyrosin, die einen Teil der Primärstruktur des Proteins ausmachen. Diese Oxidation modifiziert das Protein, was für

1.5 das Auge dadurch manifestiert wird, dass es braun wird und sich seine Löslichkeit in Wasser verringert. Das Reduktionsmittel wirkt tatsächlich als ein Antioxidationsmittel zur Unterdrückung dieser Oxidation.

Das derzeit bevorzugte Reduktionsmittel für die Anwendung bei der Erfindung ist 2-Mercaptoethanol, weil es flüchtig ist und während der weiter unten beschriebenen Weiterverarbeitung verdampft und wenig oder gar keinen Rückstand in dem isolierten Material zurücklässt. Man kann jedoch auch andere Reduktionsmittel verwenden.

Zu diesen Mitteln gehören Natriummetabisulfit und Dithiothreitol.. Die Abtrennung von Resten dieser Mittel, sofern solche vorhanden sind, kann in üblicher Weise erfolgen. Die Menge des zur Kontrolle der Oxidation ausreichenden Reduktionsmittels kann variieren und hängt z.B. von dem ausgewählten Mittel ab. Im Falle von

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2-Mercaptoethanol kann man eine wirksame Unterdrückung der unerwünschten Oxidation erzielen, wenn man etwa 5 ml des flüssigen Mittels pro kg des"zu verarbeitenden Pflanzenmaterials verwendet.

^; ',.■.■: ■ - ■■■. '. ■ ' . :^: ■ ■■■ · ■ , ■■' . ' ' · Der flüssige Teil des Pflanzenmaterials enthält die Pflanzenproteine, einschliesslich Fraktion—1, und andere Feststoffe in gelöster Forrru Der feste Anteil der Pulpe schliesst grobes, leicht abtrennbares Material und feinteiliges grünpigmentiertes Material, das sich nur schwer aus der Flüssigkeit abtrennen lässt, ein. Das grobe Material wird vorzugsweise aus dem flüssigen Anteil direkt nachdem man das Blattmaterial in eine Pulpe überführt hat., abgetrennt. Eine einfache Filtrierung, z.B. unter Verwendung eines Käsetuchs, ist für diese Abtrennung geeignet. Wenn dies- getan ist, wird der flüssige Anteil der noch das feinteilige grünpigmentierte Material enthält, in dem Masse wie es erforderlich ist, mit Säure, vorzugsweise mit Salzsäure, behandelt, um den.pH auf den gewünschten Bereich zu bringen, z.B. auf einen Bereich zwischen pH 6,0 bis zu einem Punkt in der Nähe des isoelektrischen Punktes, bei welchem das Protein in dem flüssigen Anteil denaturisiert und wodurch es als eine amorphe Masse ausfällt. Diese Massen enthalten Fraktion-1·-.. und Fraktion-2-Proteinmaterial. Der isoelektrische Punkt der Proteine liegt bei etwa pH 5,0. Deshalb besteht eine praktische Grenze, auf welche der pH eingestellt werden soll, gemäss der Erfindung bei etwa pll 5.3. Die Abtrennung des groben Materials kann nach dem Ansäuern der Flüssigkeit durchgeführt werden. Andere Mineralsäuren, einschliesslich Phosphor- und Schwefelsäure, können

verwendet werden.

Wir haben festgestellt, dass der pH des Flüssiganteils der Tabakblätterpulpe je nach dem Alter der Pflanzen variiert. Bei sehr jungen Pflanzen, d.h. bei Pflanzen, die weniger als etwa 12 inch gross sind, liegt der pH im Bereich von etwa 6,0 oder höher. Wenn die Pflanzen älter werden, nimmt der pH des Flüssiganteils ab, d.h. der Flüssiganteil wird natürlich saurer. Beispielsweise liegt der pH der Flüssigkeit von Pflanzen im Bereich von 18 bis 24" Höhe bei etwa pH 5,7, während der Flüssiganteil von Pflanzen mit 24 bis 36" einen pH von etwa 5,3 hat.

Für beste Ergebnisse wird der pH des Flüssiganteils vorzugsweise auf einen Bereich von etwa 5,4 bis 5,8 und besonders bevorzugt auf einen pH von etwa 5,4 bis 5,6 eingestellt. Wenn der pH oberhalb etwa 5,8 liegt, findet die Kristallisation mit einer merklich geringeren Rate statt als bei einem niedrigeren pH. Wenn dagegen der pH auf etwa unterhalb 5,4 eingestellt wurde, hat das Fraktion-1-Protein, welches man erhält, wünschenswerte Eigenschaften verloren. Wir nehmen an, dass durch das Einstellen des pH·s nahe dem isoelektrischen Punkt eine Veränderung des Fraktion-1-Proteins in Richtung zu dem, welches bei dessen Denaturisierung auftritt, erfolgt. Beispielsweise ist es schwieriger, ein Fraktion-1-Protein, das aus einer Flüssigkeit bei einem pH unterhalb etwa 5,4 kristallisiert, wieder aufzulösen.

Wir haben gefunden, dass durch Einstellung des pH's

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innerhalb des bevorzugten Bereiches von 5,4 bis 5,6 die Abtrennung des feinteiligen Grünmaterials erleichtert wird, da es zum Teil koaguliert. Dieses Material, welches Pflanzenchlorophyll enthält, kann auf jede geeignete Weise abgetrennt werden, wobei ein Zentrifugieren, eine praktische und bevorzugte Weise ist.

In einigen Fällen, insbesondere im Falle, dass ein Pulpematerial aus reiferen Pflanzen verwendet wird oder wenn ein pH oberhalb etwa 5,6 angewendet wird, ist es erforderlich, die Mischung, enthaltend feiriteillges Grünmaterial, zu erwärmen, um eine einfache Abtrennung zu erzielen. Die Erwärmungsstufe bewirkt das Koagulieren des feinteiligen Materials in einem solchen Masse, dass man es durch Zentrifugieren in der vorerwähnten Art abtrennen kann.

Die gesamte Pulpe kann erwärmt werden, um die Abtrennung des grünen, feinteiligen Materials zu erleichtern. Es ist jedoch bevorzugt, den Teil der Pulpe, der nach der Entfernung des Grobmaterials zurückbleibt, zu erwärmen. i

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Die Erwärmungsstufe kann bei einer Temperatur, unter-2:| halb welcher das Protein durch Wärme allein denaturiert wird, durchgeführt werden. Im allgemeinen sollte deshalb die Erwärmungsstufe unterhalb etwa 52⁰C erfolgen, weil ein Erwärmen oberhalb dieser Temperatur die Ausfällung des Proteins bewirkt. Wir haben gute Resultate erzielt, indem wir die Pulpe auf etwa 48°C (118°F) für nicht länger als etwa 15 Minuten erwärmten.

Man kann Temperaturen unterhalb etwa 48⁰C anwenden, jedoch sind dann längere Erwärmungszeiten erforderlich.

Die Wärmebehandlung kann entweder kontinuierlich oder absatzweise erfolgen, wie in unserer anhängigen Patentanmeldung Serial Nr. 78 505 beschrieben ist. In einem absatzweisen Verfahren wird die Pulpe in ein Gefäss gegeben und Wärme wird auf die Pulpe so übertragen, dass kein Teil der Pulpe oder zumindest der Flüssiganteil davon auf eine Temperatur erwärmt wird, bei welcher das Protein denaturiert wird. Wie vorher angegeben, wird die Pulpe vorzugsweise auf eine Temperatur von 50⁰C + 1⁰C während etwa 15 Minuten bis etwa

15 20 Minuten erwärmt.

Bei einem kontinuierlichen Verfahren wird die Pulpe ohne zu starke Bewegung durch in eine Flüssigkeit eingetauchte Schlange gepumpt, wobei die Flüssigkeit auf eine Temperatur erwärmt wird, dass durch Wärmeaustausch ein spezifiziertes Volumen der Pulpe auf 50⁰C + 1⁰C während etwa 15 Minuten bis etwa 20 Minuten erwärmt wird und anschliessend durch Schlangen in Kontakt mit einer Flüssigkeit bei einer Temperatur unterhalb 5O⁰C, um die Temperatur der Pulpe zu vermindern , gepumpt.

Das Erwärmen der Pulpe in der vorerwähnten Art zum Koagulieren des feinteiligen Materials ist wirksamer als die alleinige Einstellung des pH's. Die Wärmebehandlung sollte jedoch nur angewendet werden, wenn es

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erforderlich ist, das feinteilige Material zu entfernen, weil es tatsächlich die Erhöhung der Zeit, bei welcher die Kristallisation des Fraktion-1-Proteins eintritt, und in einigen Fällen die Menge des erhaltenen Proteins beeinflusst.

Wie angegeben, kann das feinteilige Material nach dem Koagulieren aus dem flüssigen Teil abgetrennt werden, z.B. durch Zentrifugieren. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit ist ein brauner Saft. Dieser Saft wird bei einer Temperatur gelagert, bei welcher Kristallisation eintritt, im allgemeinen bei oder unterhalb Raumtemperatur, um das Fraktion-1-Protein zu kristallisieren. Wir haben besonders gute Ergebnisse erzielt, wenn wir den braunen Saft auf etwa 8°C kühlten. Die maximale erforderliche Lagerzeit beträgt nicht mehr als etwa 16' Stunden. Gemäss unserer Erfahrung bewirkt eine Lagerung von mehr als 16 Stunden im allgemeinen keine Verbesserung der Ausbeute. Die kristallisierte Ribulose-1 ,5-diphosphatcarboxylase wird von der überstehenden Flüssigkeit durch Filtrieren oder Zentrifugieren (3.000 Upm, 5 Minuten) abgetrennt.

Die kristalline Form der Ribulose-1,5-diphosphat-2$> carboxyläse unterscheidet sich von den drei Formen, die man nach den Verfahren des Standes der Technik erhielt.'Form-I-Kristalle haben die Form eines Dodecaeders und werden gebildet gemäss dem vorher erwähnten Verfahren, unter Verwendung von Molekularsieben oder Sephadex-Chromatografie. Form-II-Kristalle haben die Form von ausserordentlich dünnen Plättchen und sind bisher nur

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unter sehr speziellen Bedingungen und in extrem geringen Mengen für röntgenstrahlkristallografische Untersuchungen hergestellt worden. Form-III-Kristalle sind tetragonale Doppelpyramiden und werden durch .5 die vorher erwähnte Ammoniumsulfat- und Polyethylenglykolbehandlung erhalten.

Hierzu im Gegensatz haben die Fraktion-1-Protein-Kristalle, die nach dem hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, eine vierte Form, die sich von den drei Kristallformen, die man bisher kennt, unterscheidet. Unter Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens erhält man Fraktion-1-Protein-Kristalle mit einer, wie sich durch mikroskopische Untersuchung ergibt, scheinbaren octagonalen Form, in hoher Ausbeute und in hoher Reinheit.

Im Gegensatz zu den Form-I-Kristallen, die sich in einfaches Salz (NaCl) enthaltendem Wasser wieder auflösen, bleiben die octagonalen Kristalle ungelöst, gehen jedoch im allgemeinen in Lösung, wenn man die Kristalle in.Wasser, dessen pH-Wert auf pH 7,5 oder höher mittels Natriumhydroxid (NaOH) eingestellt wurde, suspendiert. Wir haben gefunden, dass das aus sehr reifen Pflanzen, d.h. von solchen einer Höhe von 24 bis 36", deren brauner Saft einen natürlichen pH von 5,3 aufweist, erhaltene Protein sich nicht in Wasser (pH 8,5 durch Zugabe von NaOH) wieder auflöst. Durch Dialyse des wiederaufge-östen Fraktion-1-Proteins gegen einen Puffer (Tris, pH 7,5) und anschliessendes Durchlaufenlassen 'durch eine Sephadex-Kolonne erfolgt

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eine Umkristallisation, jedoch in Kristallen der Form

Die aus dem braunen Saft erhaltenen Fraktion-1-Kristalle können in üblicher Weise durch Waschen mit

Wasser zur Entfernung von Verunreinigungen gereinigt werden. Das Abtrennen der Kristalle aus der überstehenden Flüssigkeit wird wiederum aiii besten durch Zentrifugieren erzielt. Ein Zentrifugieren mit niedriger
Geschwindigkeit (3.000 Upm) während 5 Minuten reicht aus.

Dieses Kristallisationsverfahren des Fraktion-1-Proteins ergibt im wesentlichen dessen vollständige Entfernung aus dem braunen Saft. Die anfallende überstehende Flüssigkeit enthält Fraktion-2-Proteine, andere lösliche Feststoffe und unkristallisiertes Fraktion-1-Protein, falls solches vorhanden ist. Fraktion-2-Protein kann aus der überstehenden Flüssigkeit durch Ansäuern auf über oder unter den isoelektrischen Punkt, d.h. auf

einen pH von 5,0 oder weniger, entfernt werden. Dadurch wird das Ausfällen der Proteine in der Lösung verursacht. Die höchsten Ausbeuten an Protein erhält man, indem man den pH auf etwa 4,0 bis 4,5 durch Zugabe von

&5 Salzsäure oder anderen geeigneten Säuren einstellt. Den gebildeten Niederschlag kann man durch Zentrifugieren (3.000 Upm, 5 Minuten) sammeln. Die Verunreinigungen kann man entfernen, indem man den Niederschlag mit Wasser wäscht und dann wiederum durch Zentrifugieren sam-

30 melt.

- Α8-

Der Zeitablauf zwischen der Ernte der Blätter, dereil überführung in eine Pulpe (z.B. durch Mahlen, Stampfen oder auf eine andere geeignete Weise), Einstellen des pH-Wertes, Durchführung der Erwärmungsstufe, falls erfor derlich, und Abtrennung des festen Materials aus dem flüssigen Anteil sollte möglichst bald nach der Ernte liegen. Eine Verzögerung bei der Durchführung dieser Stufen vermindert die Ausbeute an erhältlicher Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase. Deshalb werden diese Massnahmen vorzugsweise bei oder in der Nähe der Stelle, an welcher die Blätter geerntet werden, durchgeführt.

Die nachfolgenden Beispiele geben weitere Einzelheiten der Erfindung an.
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Beispiel 1 .

Tabakpflanzen vom Typ NC95 v/erden mit einer Pflanzdichte von 0,5 Quadratfuss/Pflanze bis zu einer Höhe von 18 bis 24 inches kultiviert. Die Pflanzen werden derart kultiviert, dass die Blätter eine tiefgrüne Farbe haben. Der gesamte über dem Boden stehende Teil . der Pflanzen wird geerntet und in Stücke geschnitten, die klein genug sind, um in einen 1-Gallonen-Waringmischer eingeführt zu werden. Die Schaufeln des Mischers werden mit etwa 200 ml Wasser bedeckt. (Der Waringmischer zerteilt das Pflanzenmaterial nicht, wenn die Schaufeln nicht in eine Flüssigkeit eintauchen. Mit anderen Vorrichtungen, z.B. einem Rietz-Zerkleinerer, ist die Zugabe von Wasser nicht erforderlich.)

_ ua _

Ein 1-kg-Ansatz der grob geschnitzelten Stengel und Blätter aus dem geernteten Pflanzenmaterial wird zu dem Wasser mit 5 ml 2-Mercaptoethanol gegeben und zu einer glatten Pulpe vermischt. Die gebildete Pulpe, die die Konsistenz eines dicken Pfannkuchenteiges hat, besteht aus einem Volumen von etwa 1,2 1. Das grobe Material in der Pulpe wird auf zwei Schichten eines 24/20 mesh-Käsetuches, getragen von einem 32 mesh-Sieb mit einem Durchmesser von 8 inch, das über einen grossen Trichter gelegt ist, der in eine Sammelflasche abläuft, gegossen. Bei einer Verarbeitung auf diese Weise ergeben die 1,2 1 der Pulpe annähernd 1,0 1 flüssiges grünpigmentiertes Material. Dieser "Grünsaft" hat einen pH von etwa 5,7 bis 5,9 bei ver-

15 schiedenen Zubereitungen.

Der Grünsaft wird in gleiche Aliquote von jeweils 500 ml aufgeteilt. Ein Aliquot wird bei 25°C gehalten, während der anderen während 10 Minuten auf 50⁰C erwärmt wird.

Dann werden beide Aliquote gleichzeitig in einer Beckmann-Ultrazentrifuge in einem R-21-Rotor mit 18.000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert. Diese hohe Zentrifugalkraft entfernt die gesamte grüne Farbe als Niederschlag und es bleibt ein klarer "Braunsaft"

J|5 zurück. Jeder Aliquot des Braunsaftes, d.h. die erwärmten und die unerwärmten Aliquote werden in gleiche Teile aufgeteilt und ein Teil wird bei 8°C und der andere bei 25⁰C gelagert. Gleiche Mengen an Fraktion-1-Protein kristallisieren aus jedem Aliquot. Die Kristalli sation war in allen Fällen innerhalb 26 Stiliden beendet, Obwohl die Kristalle schneller auftraten, wenn der

-AO-

Braunsaft gekühlt wurde. Dieses Beispiel zeigt, dass das Erwärmen des flüssigen Teils nicht erforderlich ist, um die Kristalle von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase zu gewinnen.

Beispiel 2

Unter Anwendung des Verfahrens gemäss Beispiel 1 wurde ein Grünsaft mit einem pH von 5,7 aus Tabakpflanzen einer Höhe von 18 bis 24" gewonnen. Der Grünsaft wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt. Der pH des einen Teils wurde unter Verwendung von Natriumhydroxid auf pH 6,2 eingestellt. Beide Teile wurden 10 Minuten auf 50⁰C erwärmt, um die Entfernung des feinteiligen Grünmaterials durch massiges Zentrifugieren zu bewirken. Nach der Entfernung des Grünmaterials wurden die beiden Proben des Braunsaftes bei 8⁰C gelagert. Innerhalb weniger Stunden traten, bei dem Braunsaft mit einem pH von 5,7 Kristalle auf. Keine Kristalle traten in der Probe mit einem pH von 6,2 auf, auch nicht nach 24 Stunden. In einem ähnlichen Versuch traten aus einem Braunsaft aus Tabakpflanzen einer Höhe von 24 bis 36" mit einem pH von 5,3 Kristalle innerhalb 30 Minuten auf und eine vollständige Kristallisation erfolgte innerhalb von 3 Stunden nach dem ersten Auftreten der Kristalle. Das gebildete Fraktion-T-Protein löste sich jedoch nicht bei einem pH von 8 bis 8,5 wieder auf. In einem weiteren Versuch, unter Verwendung von Tabakpflanzen einer Höhe von 18 bis 24", die eine braune Flüssigkeit mit

einem pH von 5,8 ergaben, traten Kristalle von Fraktion-1-Protein nicht innerhalb von 12 Stunden auf. Die Kristallisation war vollständig nach 16 Stunden. Diese Daten zeigen, dass die Bildung von Kristallen von Fraktion-1-Protein schneller bei einem niedrigen pH erfolgt.

10 Beispiel 3

Unter Anwendung des Verfahrens gemass Beispiel 1 wurde ein Grünsaft aus sehr jungen Tabakpflanzen einer Höhe von weniger als 12" gewonnen. Der auf diese Weise gewonnene Saft hatte einen pH von 6,0. Der gesamte erhaltene Saft wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt und jeder Teil wurde in vier gleiche Aliquote für die weitere Verarbeitung unterteilt. Ein Aliquot von jedem der ursprünglichen Teile mit einem pH von 6,0 wurde als Kontrolle verwendet. Ein Aliquot aus jedem Teil wurde mit Salzsäure behandelt, bis zu einem pH von 5,8; ein anderer wurde auf einen pH von 5,6 und ein noph anderer auf einen pH von 5,4 eingestellt. Die vier Aliquoten eines Teils wurden während 10 Minuten auf 50⁰C erwärmt. Diese

2| vier Aliquote und die vier Aliquote des anderen Teils wurden zentrifugiert, um das feinteilige Grünmaterial abzutrennen.

Alle Aliquote wurden bei 8⁰C stehen gelassen, um die Bildung von Kristallen von Fraktion-1-Protein zu ermöglichen. Die Zeit, bei welcher Kristalle zuerst

erschienen, wurde notiert und, wenn die Kristallisation vollständig war, die Menge der erhaltenen Kristalle notiert. Der Braunsaft wurde spektrofotometrisch analysiert um die Menge an feinverteiltem grünen feinteiligen Material, welches den Braunsaft verschmutzte, festzustellen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1- unten gezeigt.

10 15 20 25 30

Tabelle 1

Zustand des Grünsaftes	pK des Grün saftes	Stunden vor. Auftreten der Kristalle .	μ9/πι1 an Grün material im Braunsaft	mg/ml'Protein- Kristalle aus dem Braunsaft
nicht er wärmt	6,0	8	10	6 ■
11	5,8	β	5	■6
Il	5,6	3	1	' '- 6
Il	5,4	3	0	6
erwärmt auf 50⁰C	6,0	48	0	3
11	5,8	48	0	3.
Il	5,6	16	0	5
Il	5,4	3	0.	6

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Diese Daten zeigen weiterhin, dass ein Erwärmen nicht erforderlich ist, um die Kristallisation von Fraktion-1-Protein zu erzielen, dass es aber tatsächlich die . Kristallisationsrate verzögert und in den meisten Fällen die Menge des erhaltenen Proteins verringert. Die Wirkung der pH-Erniedrigung ist deutlich darin, dass die Rate, bei welcher die Kristallisation eintritt, erhöht wird. Während das Erwärmen der Proben die Abtrennung des feinteiligen Grünmaterials erleichtert, fand eine vollständige Abtrennung des Grünmaterials bei den nicht erwärmten Proben, deren pH auf 5,4 bis 5,6 eingestellt worden war, statt.

Wir haben auch die Wirksamkeit der Abtrennung von Fraktion-1-Protein aus Grünsaft, dessen pH auf den gewünschten Bereich eingestellt worden war, festgestellt, indem wir die Schlieran-Muster, die durch eine analytische Zentrifugierung des Grünsaftes und des Braunsaftes nach dem Kristallisieren des Fraktion-1-Proteins erhalten wurden, untersuchten. Die ersten zeigten zwei gut aufgelöste Peaks, von denen eines dem Fraktion-1-Protein und das andere dem Fraktion-2-Protein entspricht. Im letzteren wurde nur ein einziges Peak, entsprechend den Fraktion-2-Proteinen festgestellt. Da die analytische Zentrifugierungsmethode in der Lage ist, so wenig wie 0,1 mg/ml an Fraktion-1-Protein nachzuweisen, kann mit Sicherheit festgestellt werden, dass nach vollständiger Kristallisation die Konzentration des in Lösung bleibenden Fraktion-1-Proteins weniger als 1 % ausmacht. Im Gegensatz hierzu enthielt die Mutterlauge, die man bei dem chromatografischen Verfahren

unter Verwendung von Sephadex-Säulen nach dem Stand der Technik erhielt, zusätzlich zu den Fraktion-2--Proteinen etwa 30 % an nicht-kristallisiertem Fraktion-1-Protein.

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Aus der vorhergehenden Beschreibung geht hervor,, dass die vorliegende Erfindung ein einfaches Verfahren zur Gewinnung von Protein und insbesondere Fraktion-1-Protein aus Pflanzenmaterial zur Verfügung stellt. Das erfindungsgemässe Verfahren vermeidet die Notwendigkeit einer kostspieligen und mühseligen Molekularfiltration und von Sephadex-Säulen, wie sie bei den Verfahren des Standes der Technik erforderlich sind. Weiterhin ist kein chemisches Agens erforderlich ausser dem Reduktionsmittel, welches im Falle von 2-Mercapto™ ethanol während der Verarbeitung verdampft oder in der Erwärmungsstufe, falls diese angewendet wird_f abgetrieben wird, um das Fraktion-1-Protein zu erhalten, und der Säure, die zur Einstellung des pH's der Flüssigkeit.

gebraucht wird. Da es nicht erforderlich ist, die Flüssigkeit zu verdünnen, wird die Gewinnung der Fraktion-2-Proteine ebenfalls vereinfacht. Schliesslich enthält der Flüssiganteil, nach Entfernung der Fraktion-2~ Proteine und von unkristallisiertem Fraktion-1-Protein daraus noch niedrigmolekulargewichtige wertvolle Verbindungen, die wirtschaftlicher gewonnen werden können, als dies der Fall war bei der Verwendung der Reste, die man bei den Verfahren des Standes der Technik erhielt, weil sie in ihrer natürlichen Form und unverdünnt vorliegen. Im Gegensatz dazu sind die Rückstände, die man nach den Verfahren des Standes der Technik erhielt,

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durch die bei den Verfahren verwendeten Chemikalien
verunreinigt und sind während der Abtrennung des Fraktion- 1 -Proteins verdünnt worden, wodurch deren weitere Wiedergewinnung kompliziert wird. Bei unserem verbesser ten Verfahren ist es auch in den meisten Fällen nicht
erforderlich, die Wärmeanwendung, wie sie in der anhängigen Patentanmeldung Serial Nr. 78 505 beschrieben wird, anzuwenden.

Die Erfindung wurde unter Berücksichtigung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Aus der
vorhergehenden Beschreibung der Erfindung geht jedoch
für den Fachmann hervor, dass Modifizierungen des Verfahrens möglich sind, ohne dass man vom Umfang der Erfindung, die lediglich durch die anhängenden Ansprüche begrenzt ist, abweicht.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

. ■ 1. Verfahren zum Erhalten von Ribulose-1,5-diphosphat™ carboxylase aus Pflanzenmaterial, enthaltend die Blätter von grünen Pflanzen, dadurch g e k e η η -zeichnet , dass das Verfahren folgende Stufen umfasst:

(a) überführen der Blätter in eine Pulpe

aus einer Mischung eines festen Anteils und eines flüssigen Anteils, wobei der flüssige Anteil gelöste Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase enthält;

(b) Einstellen, falls erforderlich, des pH's des flüssigen Anteils auf einen Bereich von pH 6,0 bis zu einem pH, der ausreichend über dem isoelektrischen Punkt der in dem flüssigen Anteil gelegenen Proteine liegt, so dass die Proteine nicht ausfallen;
. '

},c) Abtrennen des flüssigen Anteils von dem festen Anteil; und

(d) Lagern des flüssigen Anteils bei einer Temperatur, bei welcher die Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase kristallisiert.

2, Verfahren'gemüse Anspruch 1, dadurch g e k e η η - ζ e lehnet , dass die Kristalle von Ribulose-1 ι5-diphosphatcarboxylase aus der Flüssigkeit abgetrennt werden.

3. Verfahren gemäss Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet , dass das Pflanzenmaterial die Blätter von Tabakpflanzen umfasst.

4. Verfahren gemäss Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet , dass der pH auf einen Bereich von 5,3 bis 6,0 eingestellt wird.

5. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch g e k e η η zeichnet, dass der pH auf einen Bereich

von 5,3 bis 6,0 eingestellt wird.

6. Verfahren gemäss Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet , dass der pH auf einen Bereich von 5,4 bis 6,5 eingestellt wird.

7. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass der pH auf einen Bereich von 5,4 bis 5,6 eingestellt wird.

8. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass nach Abtrennung der Ribulose 1 , 5-diphosphatcarboxylase der pH des flüssigen Anteils auf einen pH bei oder unterhalb des isoelektrischen Punktes der gelösten Proteine zur Ausfällung der Proteine eingestellt wird.

9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass der pH auf einen Bereich

30 von 4,0 bis 4,5 eingestellt wird.

10. Verfahren gemäss Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ribulose-1 ,5-diphosphatcarboxylase in Form von octogoJialen Kristallen kristallisiert.

11. Verfahren zur Gewinnung von Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus Tabakpflanzen, dadurch gekennzeichnet s dass man

fa) ' den Blatteil der Pflanzen in eine Pulpe, die einen Festteil und einen Flüssigteil enthält, überführt, wobei der Festteil sich aus groben feinteiligem Material und feinem feinteiligem Material zusammensetzt und worin der Flüssigteil gelöste

15 Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase enthält;

(b) den pH des Flüssiganteils, falls erforderlich, auf einen ,Bereich von pH 6,0 bis zu einem pH , der ausreichend oberhalb, des isoelektrischen Punktes der Proteine in dem Flüssiganteil liegt, einstellt, so dass die Proteine nicht ausfällen,-

(c) den Flüssiganteil von dem Festanteil abtrennt ;

(d) den Flüssiganteil bei einer Temperatur lagert, bei weicher Ribulose™1,S-diphosphatcarboxyläse kristallisiert; und

(e) die Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase aus dem Flüssiganteil abtrennt.

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12. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch g e k e η η zeichnet, dass das grobe feinteilige Material von dem Flüssiganteil vor dem Einstellen des pH's abgetrennt wird.

13. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , dass der pH vor der Abtrennung des Festanteils eingestellt wird.

14. Verfahren gemäss Ansprüchen 11, 12 und 13, dadurch gekennzeichnet , dass der pH auf einen Bereich von 5,3 bis 6,0 eingestellt wird.

15. Verfahren gemäss Ansprüchen 11, 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass der pH auf einen Bereich von 5,4 bis 5,6 eingestellt wird.

16. Verfahren gemäss Ansprüchen 11, 12 und 13, dadurch gekennzeichnet , dass, die Pulpe auf eine Temperatur von etwa 48⁰C bis 52⁰C erwärmt wird, um das feinteilige Grünmatcrial zu koagulieren.

17. Verfahren gemäss Ansprüchen 11, 12 und 13, dadurch gekennzeichnet , dass das grobe feinteilige Material von dem Flüssiganteil abgetrennt wird und der Rückstand auf eine Temperatur von etwa 48⁰C bis 52⁰C zum Koagulieren des feinteiligen Grünmaterials erwärmt wird.

18. Verfahren gemäss Ansprüchen 11, 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem

Abtrennen der■ R.ibulose-1 , 5-di.phosphatcarboxylase der flüssige Anteil auf oder unterhalb des isoelektrischen Punktes der gelösten Proteine zur.Ausfällung der Proteine angesäuert wird,,

19. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch, g e k e η η zeichnet , dass der pH auf einen Bereich von 4,0 bis 4,5 eingestellt wird.

20. Verfahren gemäss Ansprüchen 11, 12 und 13, dadurch gekennzeichnet , dass die Blätter und die Stengel der Tabakpflanzen in die Pulpe überführt werden.

21. Verfahren gemäss Ansprüchen 11, 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Reduktionsmittel zu dem Pflanzenmaterial in einer ausreichenden Menge gibt, um die Oxidation von Aminosäure-Substituentengruppen, die einen Teil der Struk tür der Proteine in dem Flüssiganteil ausmachen, zu unterdrücken.

22. Verfahren gemäss Anspruch 21, dadurch g e k e η η ζ e i c h net, dass das Reduktionsmittel 2-Mercaptoethanol ist.

ο Verfahren gemäss Anspruch 21, dadurch g e k e η η -ζ ei c h η e t , dass das Reduktionsmittel zu dem Pflanzenmaterial gegeben wird bevor es in die Pulpe überführt wird.

24. Verfahren gemäs Ansprüchen 11, 12 und 13, dadurch gekennzeichnet , dass die Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase in Form von octagonalen Kristallen ausfällt.

25. Ribulose-1,5-diphosphatcarboxylase in Form von
octagonalen Kristallen.

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