DE1907365A1

DE1907365A1 - Verfahren zur Herstellung einer zellfreien Penicillinacylase

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Publication number: DE1907365A1
Application number: DE19691907365
Authority: DE
Inventors: Ekstroem Dr Bertil Ake; Sjoeberg Berndt Olaf Harald; Thelin Karl Hugo; Nathorst-Westfelt Dipl- Soelve; Delin Per Staffan
Original assignee: Astra AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1968-02-15
Filing date: 1969-02-14
Publication date: 1969-09-11
Also published as: DE1966428A1; FR2001977A1; NL6902045A; CS155970B2; SE352643B; FR2081316A1; CH523320A; NO131387B; DK128421B; NO131386B; CA941769A; CH538540A; AT300198B; ES384025A1; DE1966428C3; JPS4833386B1; FR2081316B1; ES384027A1; SE382990B; NO131388C

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6-APA) durch enzymatisehen Abbau eines'Penicillins sowie eine verbesserte Methode zur Herstellung von Penicillinen, besonders von hypoallergenischen Penicillinen. Außerdem betrifft die Erfindung eine verbesserte Methode zur Herstellung, Reinigung und Isolierung eines Enzympräparates, das in der Lage ist, die Seitenketten bestimmter Penicilline unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure zu entfernen. Besonders betrifft sie die Herstellung eines EnzyinpT/lparates aus Eseherichia coli und dessen Verwendung für die Herstellung τοη β-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin.

Is ist bekannt, daß vMe Mikroorganismen, sowohl Bakterien wie auch Pilze 5 Enzyme produzieren die die Amidbindung in der

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6-Position von Penicillinen hydrolysieren und die allgemein als Penicillinaoylasen öder -amidase« l3©a®iclin@t werden (siehe JdL T. Hamilton-Millerj Bacteriological Reviews, 30 (1966), Seite 761). Bei der gegenwärt:-·". ;αι größte -simi sch en Produktion von 6-Aminopenicillansäure werden vorzugsweise Suspensionen von E. coli-Zellen, die eine Äeyläse oder Amidase enthalten^ verwendet. Diese Methoden haben jedoch verschiedene Nachteile» Da das Enzym weitgehend intracellulär ist, muß das Penicillin notwendigerweise zuerst in die Zellkörper eindringen, um mit dem Enzym zu reagieren, was zu einer langsameren Reaktion -führt„ Der Zellstamm kann auch andere Enzyme enthalten, die das Penicillin oder die gebildete 6-Aminopenicillansäure durch Aufspal= tung der /2-Lactambindung inaktivieren oder die die Zellkultur mit den Organismen, die solche Enzyme bilden, verunreinigen= Da die Acylasainur einen sehr kleinen Teil des Zellgehaltes ausmachen, hat das Verfahren unter Verwendung des gesamten Organismus auch insofern einen praktischen Nachteil, als große Materialmengen, die im Verfahren inaktiv sind, verarbeitet wer= den müssen.

Ein weiterer Nachteil infolge der Verwendung der gesamten Organismen besteht darin, daß eine zusätzliche Stufe an den Verfahrensablauf angehängt werden muß, der zur Herstellung' halbsynthetischer Penicilline führt, nämlich die Abtrennung (wie beispielsweise durch Filtration) der Organismen von der Reaktionsflüssigkeit, in der die ursprünglich vorhandene Seitenkette von biosynthetischen Penicillinen abgespalten wurde. Ein weiterer Nachteil ist der Verlust an Penicillansäure, teils durch Adsorption an den Zellen und teils durch Abbau, der durch während des

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Zellstoffwechsels gebildete Materialien eingeleitet wird. Noch ein anderer Paktor, der zu Problemen führt, ist mit der Verwendung der gesamten Zellen für die Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus biosynthetischen Penicillinen verbunden und besteht darin, daß die Abtrennung der Säure von anderen Produkten der Abspaltungsreaktion ziemlich schwierig ist. So berichteten Batchelor et al (Lancet I (I968), Seite 1175), daß unter Verwendung ganzer Zellen erhaltene 6-Aminopenicillansäure proteinhaltige Verunreinigungen enthalten kann, die in der Lage sind, gefährliche Allergie herbeiführende Reaktionen bei Menschen und Tieren hervorzurufen. Wenn Penicilline aus derart verunreinigter 6-Aminopenicillansäure hergestellt werden, können die Verunreinigungen in den Produkten zurückgehalten werden und verantwortlich für viele der allergischen Reaktionen sein, die bei diesen Penicillinen beobachtet werden (G.T. Stewart, Amer. Heart. J. (1968), Seite 429). Um diese Verunreinigungen zu entfernen, müssen die daraus hergestellten Penicilline oder 6-Aminopenicillansäure zusätzlichen Trennverfahren, wie Dialyse oder Gelfiltration, unterzogen werden (Kanadisches Patent 771 662). Dabei werden große Mengen der 6-Aminopenicillansäure oder des Penicillins verloren, wie sich aus einer Gewinnung von nur 12$ Benzylpenicillin (Britische Patentschrift 1 078 847) oder von nur 56$ Phenoxymethylpenicillin (Britische Patentschrift 1 114 311) ergibt.

Alle diese Nachteile werden vermieden, wenn man ein zellfreies oder gereinigtes Enzympräparat nach der vorliegenden Erfindung verwendet. So erhält, man die 6-Aminopenicillansäure unter Verwendung eines zellfreien oder gereinigten Enzympräparates nach

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der vorliegenden Erfindung zur Aufspaltung der Amidbindung in der 6-Position des Penicillins "in guten Ausbeuten und im wesentlichen frei von proteinhaltigen Verunreinigungen. Wenn die auf diese Weise hergestellte 6-Aminopenicillansäure acyliert wird, erhält man hypoallergenische Penicilline in guten Ausbeuten ohne irgendwelche zusätzliche Reinigung. In der Literatur finden sich verschiedene Versuche, gereinigte Enzympräparate aus E. coli-Stäamen herzustellen. Borkar et al(Hindustan Antibiotics Bull. 4· (1961), Seiten 48, 152) behandelten in einem Phosphatpuffer suspendierte Zellen mit Ultraschallwellen und erreichten eine 25-fache Reinigung durch fraktionierte Ausfällung und mit einer Chromatographiersäule. Holt und Stewart (Naure 201 (1964)*, Seite 824)- erhielten ein Enzympräparat geringer Reinheit durch Gefriertrocknung und Dialyse der filtrierten Kulturbrühe. Szentirmai (Acta Microb. Acad. Scient. Hung. 12 (1966), Seite 395) erhielt eine 40-fache Reinigung eines E. coli-Enzyms durch Ammoniumsulfatausfällung und nachfolgende Calciumphosphatgeladsorption und DEAE-Cellulose-Chromatographie eines Phosphatpufferextraktes von E. coli-Zellen, die mit Ultraschallwellen behandelt waren.

Sakaguchi und Marao (Japanische Patentschrift 26 050/64) erhielten eine mäßige Ausbeute an gereinigtem Enzympräparat von E. coli durch Extrahieren der Zellen mit Boratpuffer über längere Zeitdauer oder über kürzere Zeit in Kombination mit Ultraschallwellenbehandlung. Aus dem Extrakt konnte das Enzym in fester Form nach Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse und Gefriertrocknung erhalten werden. Johnson und Hardcastle (USA Patentschrift 3 297 546) erhielten eine Lösung eines Enzyms

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aus E. coli durch Behandlung der Zellkultur mit einer Verbindung MXp, üblicherweise Oa(NO^)n, und quaternären Ammoniumver-

en
bindung, Abfiltrieren der Zellen und Suspendieren derselben in Wasser während einiger Stunden sowie anschließende Entfernung der Zellen durch Filtration mit nachfolgender Behandlung des Filtrats mit Aktivkohle.

Es ist außerdem bekannt, daß in Bakterienzellen enthaltene Enzyme beim Extrudieren von Zellsuspensionen unter hohem Druck durch ein enges Mundstück freigegeben werden. Duerre und Ribi (Appl. Microbiol. 11 (1964), Seite 467)> die andere Enzymtypen als Penxcxllinamidasen untersuchten, fanden bei dem untersuchten E. coli, daß Hochdruck über 1.000 Atmosphären (15.000 psi) angewendet werden muß, uin eine maximale Freigabe des Enzyms zu erreichen. Bei solchen Drücken jedoch wurden auch die Zellwände zerstört, und große Mengen des Zellmaterials wurden in Lösung gebracht. Frazer (Nature 167 (1951), Seite 33) fand, daß E. coli-Zellen in kleinem Maßstab zersprengt werden konnten, wenn sie aus einer Bombe dtirch einen Gasdruck von 34-61 Atmosphären (500 — 900 psi) ausgetrieben wurden.

Es wurde nun gefunden, daß die intracelluläre Penicillinacylase in E. coli aus dem Organismus in groß-technischem Maßstab in Wasser extrahiert werden kann, nachdem die Zellen oder deren Suspensionen in Wasser oder einem Gemisch von Wasser und organischen Lösungsmitteln schnell von einem aufgebrachten Druck von wenigstens 34 Atmosphären (500 psi), der jedoch nicht grosser ist als der Druck, bei dem die Zellen übermäßig zerreißen,

befreit werden.

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So liefert die vorliegende Erfindung in einer H insicht ein Verfahren zur Herstellung von Peiiieillinaeylase-Präparaten aus E. coli durch Fermentierung eines solch, ein Enzym produzierenden E. coli-Stämmes in an sicIi bekannter Weise, Entfernung der Kulturflüssigkeit und schnelles Ausstoßen des Zellmaterials durch eine enge.Öffnung oder sinen engen Schlitz unter Aufbringung eines Druckes von wenigstens 34 Atmosphären, der jedoch unter dem Druck liegt,, wo übermäßiges Zerreißen der Zellen auftritt» Noch bei 204 Atmosphären (3.000 psi) werden die Zellen nicht übermäßig zerstört. Das ausgestoßene Material wird dann mit Wasser, gegebenenfalls unter Zugabe eines organischen Lösungsmittels und/oder einer Base, wie Natriumhydroxid oder Triäthylamin, gerührt, um das Enzym in Lösung zu bringen. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Entfernung der Kulturflüssigkeit und das Ausstoßen des Zellmaterials gleichzeitig in einer selbstreinigenden Zentrifugen-Trennvorrichtung, die bei einer Temperatur zwischen 0 - 50° C, vorzugsweise bei 15-40 C, arbeitet, wo das abgetrennte Zellmaterial intermittierend innerhalb von 0,05 -1,0 Sekunden, vorzugsweise innerhalb von 0,1 - 0,5 Sekunden, durch einen ringsum laufenden Schlitz mit einer Breite von 0,1 - 1,5 mm, vorzugsweise 0,3 bis 0,7 mm, durch Aufbringung eines Druckes von 34 - 136 Atmosphären (500 - 2.000 psi), vorzugsweise 61 - 75 Atmosphären (900 bis 1.100 psi), ausgestoßen wird. Wenn erwünscht, wird die Brühe mit einem organischen Lösungsmittel mit geringer Löslichkeit in Wasser gesättigt, wie beispielsweise mit Butylacetat, Isobutylacetat und Amylacetat, um den Organismus abzutöten und den Abtrennprozeß zu unterstützen. In gleicher Weise ist es

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möglich, wenn erwünscht, das Zellmaterial in der Abtrennvorrichtung mit Wasser zu waschen. Das ausgestoßene Zellmaterial wird bei 10 - 50° C, vorzugsweise bei 20 - 4-0° G, während 0,10 bis 5,0 Stunden, zweckmäßigerweise während 0_s25 bis 3,0 Stunden und vorzugsweise während 0,25 - 1,0 Stunden, mit eineiü wirksamen Rührer gerührt, um das Enzym zu lösen, wobei gegebenenfalls in einer Konzentration von 1,0 - 5,0$ ein mit Wasser unmischbares organisches Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, Butylacetat, Isobutylacetat, Amylacetat, Benzol, Oioluol oder Chloroform, zugesetzt wird. TJm die Extraktion des Enzyms aus dem ausgestoßenen Zellmaterial zu erleichtern, kann zu dem Gemisch eine anorganische Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniak, oder eine tertiäre organische Base, wie Triäthylamin oder N-Ithylpiperidin, zugesetzt werden, um den pH-Wert zwischen 6,5 und 9»0, vorzugsweise zwischen 7,0 und 8,5, einzustellen und zu halten.

Die so erhaltene Enzymlösung kann, gegebenenfalls nach Verdünnung mit Wasser, von irgendwelchem zurückgebliebenen Zellmaterial und anderen festen Verunreinigungen nach üblichen Verfahren, wie Filtration oder Zentrifugieren oder gegebenenfalls durch eine Kombination beider Methoden und möglicherweise unter Zusatz von entfärbenden Mitteln, klärenden Mitteln und FiIterhilfsmitteln, wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Cellulosepulver, Diatomeenerde oder anderen festen, schwach adsorbierenden Mitteln, befreit werden. Eine bevorzugte Methode ist die, das meiste Zellmaterial durch Zentrifugieren zu entfernen und die darüberstehende Flüssigkeit zu filtrieren.

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Zusätzliche Reinigung des Enzyms kann man durch Ansäuern der wässrigen Lösung auf pH 3,0 - 6,0, vorzugsweise auf 4,0 - 5,0, Entfernung des ausgefällten inaktiven Materials durch Filtration und erneute Einstellung auf den ursprünglichen pH-Wert erreichen,

Die Penicillinacylase, die in den oben beschriebenen zellfreien und gegebenenfalls teilweise gereinigten wässrigen Lösungen enthalten ist, kann durch Behandlung der Lösungen mit Mitteln, wie Tanninen, die schlecht lösliche Komplexe mit Proteinen bilden, ausgefällt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird die Enzymlösung bei einem pH 4 - 6, zweckmäßigerweise bei pH 4»5 - 5»5, mit Tannin bis zu einer Endkonzentration von 300 -i 900 ppm in Gegenwart eines chelatbildenden Mittels, wie Äthylendiamintetraessigsäure, das mit Exsenionen Komplexe bildet, behandelt. Der gebildete Enzym-Tanninkomplex kann in üblicher Weise, wie beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren, isoliert werden. Er kann gewaschen und getrocknet und von Wasser befreit werden, wie beispielsweise durch Trocknen, besonders durch Gefriertrocknung, oder durch Behandlung mit organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind, wie Aceton. Der Tannin-Komplex ist eine geeignete Form für die ■ ~ Lagerung und den Transport des Enzyms. Er kann auch direkt für die Entfernung der Seitenkette von Penicillinen, wie Benzylpenicillin, verwendet werden, wie in der britischen Patentanmeldung 33 734/67 beschrieben ist.

Die in dem Tannin-Niederschlag enthaltene Penicillinacylase kann durch Auflösen des Komplexes in Wasser bei pH 7 - 9, vor-

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zugsweise 7,5 - 8,5, in wässrige lösung gebracht werden. Wechselweise kann der Komplex auch mit einem Gemisch von Wasser und einem mit Wasser unmischbaren Lösungsmittel, wie n-Butanol, bei pH 4 - 7, vorzugsweise 4,5 - 5,5, behandelt werden. Eine dritte Methode zur Entfernung des Tannins besteht in der Behandlung des in Wasser suspendierten Enzym-Tannin-Komplexes mit einem anionischen Ionenaustauscher, wie DEAE-Cellulose, welcher das Tannin bindet und das Enzym an das Wasser abgibt. Die für diese Methoden notwendigen Wassermengen sind wesentlich kleiner als jene in den ursprünglichen Enzymlösungen, und auf diese Weise erreicht man eine beachtliche Konzentrierung der enzymatischen Aktivität.

Nach einem anderen Aspekt dieser Erfindung kann die in irgendeiner oben beschriebenen-Lösung enthaltene Penicillinacylase mit Hilfe eines Ionenaustauschers konzentriert und gereinigt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Enzym auf einem kationischen Ionenaustauscher mit einer offenen Struktur, wie SE-Sephadex^-^ , CM-Cellulose oder OM-Sephadex^*durch Überleiten der auf pH 3,5 - 6, vorziigsweise 4,0 - 5,0, eingestellten Lösung des Enzyms durch eine Ionenaustauschersäule adsorbiert werden. Wechselweise kann auch der Austauscher zu der gerührten Enzymlösung zugegeben werden. Die Acylase kann aus dem Ionenaustauscher durch Eluieren bei pH 6,0 - 8,0 mit schwachen Pufferlösungen, wie 0,2 m Ammoniumacetat oder Trishydroxymethylammoniumaeetat, freigesetzt werden.

Um reinere Präparate des Enzyms zu erhalten, können anorganische Ionen und niedermolekulare Verunreinigungen aus den Enzymlösungen durch Dialysieren gegen Wasser entfernt werden. Wechselweise

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werden die Lösungen, wenn nötig nach. Konzentrierung durch Verdampfen bei einer■Temperatur unterhalb 50° C auf eine geeignete Konzentration von 25 - 100 sig !Trockengewicht je ml, der Gelfiltration unterzogen.

Die so in irgendeiner der obigen Stufen erhaltenen wässrigen Enzymlösungen sind sehr zweckmäßig, direkt für die Entfernung der Seitenketten von natürlichen Penicillinen, besonders für die Entfernung der Seitenkette von Benzylpenicillin, verwendet zu werden.

Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die das wie bisher hergestellte Enzym aus wässriger lösung in festem Zustand durch Gefriertrocknung, Flotationstrocknung, Sprühtrocknung oder Konzentrierung im Vakuum oder durch Ausfällung gemäß bekannten Verfahren isoliert. Das Isolierungsverfahren führt zu einem festen Enzym, das eine hohe spezifische Aktivität besitzt und das in einer für die lagerung und den Transport sehr geeigneten Form vorliegt. Die Verwendung solcher festen, wasserlöslichen Enzympräparate hat auch verschiedene technische Vorteile, da es möglich ist, mit konzentrierteren Lösungen als jenen zu arbeiten, die bei bekannten Verfahren unter. Verwendung von Zellsuspensionen benutzt werden.

Die bevorzugte Methode zur Isolierung des Enzyms besteht entweder in einer Gefriertrocknung einer Enzymlösung bei einer Temperatur zwischen -10° und +50° 0, vorzugsweise zwischen 0° und 50° C, oder durch Flotationstrocknung in einem Luftstrom

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bei 10° - 55° C, vorzugsweise bei 35° - 45° C.

Die nach der Erfindung erhaltenen gereinigten Enzyme und Enzymlösungen sind sehr geeignet und vorteilhaft für die Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch Entfernung der Seitenkette von Penicillinen, speziell von Benzylpenicillin. Die Ausbeuten und Reinheiten der Produkte sind wesentlich besser als jene, die man mit bekannten Verfahren bei Benutzung von Suspensionen von E. coli-Zellen erreicht.

Es wurde auch gefunden, daß nach dieser Erfindung hergestellte 6-Aminopenicillansäure sehr wenig, wenn überhaupt, proteinhaltige Verunreinigungen mit Allergie erzeugenden Eigenschaften enthält gegenüber jener, die man unter Verwendung von Suspensionen von E. coli-Zellen herstellt. Dies ist von großer technischer Wichtigkeit, da es so möglich ist, Penicilline mit hypo-allergenischen Eigenschaften direkt aus der nach der Erfindung hergestellten 6-Aminopenicillansäure ohne zusätzliche Beinigungsverfahren zu gewinnen. Beispiele von Penicillinen mit hypo-allergenischen Eigenschaften, die auf diese Weise hergestellt werden können, sindi ©C-Phenoxyäthylpenicillin, C?C -Phenoxypropylpenicillin, 2,6-Dimethoxyphenylpenicillin, 3-(o-Chlorphenyl)-S-methyl-^-isoxazolylpenicillin, C<-Carbonylbenzylpenicillin, (X^-Azidobenzylpenicillin und oC-Aminobenzylpenicillin.

Die Penicillinacylase von E. coli kann auch zur Entfernung der Seitenkette von Penicillinestern, besonders von Estern von Benzylpenicillin verwendet werden, wie in der britischen Patent-

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anmeldung 33 734/67 beschrieben ist. Es wurde nun gefunden, daß die nach der Erfindung erhaltenen Enzympräparate sehr geeignet für dieses Verfahren und wirksamer als die bisher verwendeten Suspensionen von E. coli-Zellen sind. Außerdem wurde gefunden, daß die Enzympräparate nach der Erfindung besser als die bisher benutzten Zellsuspensionen bei der enzymatischen Synthese von Penicillinen aus 6-Aminopenicillansäure und Vorläufern mit Seitenketten sind (W.K. Kaufmann et al., Antimicrobial Agents Ann. 1960, Seite 1).

Die nach der Erfindung erhaltenen gereinigten Enzympräparate sind geeignete Ausgangsmaterialien für eine chemische Modifizierung des Enzyms und führen zu Präparaten mit besseren Eigenschaften hinsichtlich der Aktivität und/oder der technischen Leistung. So kann das Enzym mit aktivierten Polymermaterialien,

wie beispielsweise mit Bromcyan behandelten Polysachariden reagieren, um Produkte zu ergeben, in denen das Enzym an einem polymeren Trägermaterial fixiert ist. Die enzymatische Aktivität wird in solchen Produkten erhalten, die für die Verwendung zur Spaltung von Penicillinen von Vorteil sind, da sie aus der Beaktionslösung mit einfachen Mitteln, wie beispielsweise durch Filtration, gewonnen werden können. Die Präparate aus Polymermaterial und Enzym können auch in Säulen für die kontinuierliche Herstellung von 6-Aminopenicillansäure benutzt werden, indem man Penicillinlösungen durch diese Säulen leitet.

Die Herstellung und Renigung eines zellfreien Enzymproduktes, die Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus natürlichen Penicillinen (wie beispielsweise Benzylpenicillin) und die Her-

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stellung von synthetischen Penicillinen aus 6-Aminopenicillansäure werden durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von E. coli-Bakterienzellen

Maiseinweichflüssigkeit (3 kg), Sojabohnenöl (135 ml), Paraffin (12 ml) und Cetanol (3 ml) in Wasser (150 l) wurden auf pH 6,0 mit 45$iger Natronlauge (165 ml) eingestellt und dann "bei 124° G 30 Minuten in einem Fermentationsbehälter sterilisiert. Die Lösung wurde mit 100 ml einer 20 - 24 Stunden-KuItür von E. coli (Astra 1339) geimpft und bei 25° C unter Belüftung und Rühren 18 Stunden inkubiert.

Maiseinweichflüssigkeit (300 kg), Sojabohnenöl (13,8 kg), Paraffin (1,22 kg), Cetanol (0,3 kg), Phenylessigsäure (21 kg) und Natriumchlorid (112 kg) in Wasser (14.000 X) wurden mit 45$iger

Natronlauge'(40 kg) auf pH 6,6■eingestellt, und die Lösung wurde in einem Fermentations "behälter "bei 124° 0 30 Minuten sterilisiert. Die Lösung wurde gekühlt und mit der oben erwähnten Impfkultur geimpft und anschließend bei 25° C unter Rühren und Belüftung inkubiert. 24 Stunden nach der Impfung und, wenn der pH-Wert auf 8,2 angestiegen war,'wurden die Bakterienzellen durch Zugabe von Butylacetat (180 l) abgetötet, und das Gemisch wurde anschließend gekühlt.

Beispiel 2

Isolierung und Reinigung der Acy läse 909837/1300 ~~

a) Zur Isolierung der Balcterienmass® wurde das Gemisch in einer seIbstr·einigendem Zenfe!fadentrennvorrichtung (De Laval, Typ BRPI 213-35B) getrennt. Die Bakterienzellenpaste wurde in 100 - 120 kg-Anteilen gesammelt. Zu jedem Anteil wurden 3,0$ Metliylisob.utylketon zugesetzt, und das Gemisch wurde dann mit Hilfe eines Ultra-Turrax-Rühreis (Typ T 110/211) 25 Minuten lang homogenisiert. Die Gesamtausbeute an Bakterienmasse betrug 325 kg«

Analyse des Enzyms in den verschiedenen Produktionsstufen ergab die folgenden Werte in Acylase-Einheiten_s die entscheidend für die während der betreffenden Stufe zurückbleibende Enzymmenge sind (eine Acylase-Einheit entspricht der Enzymmenge, die in der Lage ist, in 1,5 Stunden bei pH 8,5 und 37° -C eine Menge an Benzylpenicillin aufzuspalten, die einem mg 6-Aminopenicillansäure äquivalent ist):

Fermentationskultur 5 E/ml

Überstehende Flüssigkeit 0,33 E/ml

Flüssiger Auslauf der Zentrifugen- _Q ^q E/ml trennvorrichtung ' '

Bakterienzellenpaste 212 E/g

Überstehende Flüssigkeit in der _ηί- _Ε/ Paste vor der Homogenisierung ^/ö

Überstehende Flüssigkeit in der

Paste nach der Homogenisierung 123 E/g

b) Die in Beispiel 2a) erhaltene Bakterienzellenpaste wurde bei Untersuchungen der Enzymlöslichkeit verwendet. Zu 100 g Zellpaste wurden 100 ml entionisiertes Wasser zuge-

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Die erhaltene Suspension "besaß einen pH-Wert τοη 5»9 und wurde zu einer Reihe von folgenden Behandlungen benutzt*

I. Die Suspension wurde 20 Minuten bei 5.000 G- (Zentrifugalkraft, gemessen in Vielfachen der Erdschwere) zentrifugiert, und die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit wurde bestimmt.

II. Die Suspension wurde einer Homogenisierung mit Hilfe eines Ultra-Turrax-Rührers während 5 Minuten zugeführt. Während dieser Behandlung wurde die Probe in einem Eisbad gekühlt, um Temperaturen oberhalb 35° 0 in der Probe özu vermeiden. Die Probe wurde dann wie unter I. zentrifugiert, und die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde bestimmt.

III. Der pH-Wert der Suspension wurde auf 8,5 mit Natronlauge unter Rühren eingestellt, worauf die Probe wie oben homogenisiert und zentrifugiert und die Aktivität in der überstehenden Phase bestimmt wurde.

IV. 3$ Methylisobutylketon wurden zu der Suspension zugesetzt, deren pH-Wert wie in Versuch III. eingestellt wurde. Diese Probe wurde dann wie oben homogenisiert und zentrifugiert, und die Enzymaktivität in der überstehenden Phase wurde bestimmt.

Das Verfahren eines Löslichmachens kann durch folgende Tabelle demonstriert werden.

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Enzymlösliehkeit

E/g $ der

Gesamtmenge

Bakteriensuspension .106

Überstehende Flüssigkeit aus I₀ 29

Überstehende Flüssigkeit aus II. 62

Überstehende Flüssigkeit aus III» 73

Überstehende Flüssigkeit aus 17. - 83

loo:

59 69

-IQ.

c) Homogenisierte Bakterienpaste (175 kg, Aktivität 190.E/g) wurde mit Wasser (175 kg) verdünnt, und unter Rühren des Gemisches wurde Hyflo (22,7 kg), Gelite 50-5 (22,7 kg) und Fibraflo (10,2 kg) zugesetzt. Die Wasserphase wurde durch Filtration auf einem Funda^—'-Filter abgetrennt, und der Filterkuchen wurde mit Wasser (50 l) gewaschen» Die vereinigten Lösungen (290 kg) besaß^en eine Aktivität von, ; 48

d) Homogenisierte Bakterienpaste (1 kg ,Aktivität 212 E/g) wurde mit Wasser (2,0 1) verdünnt, mit Hilfe von 0,5 η Natronlauge (220 ml) auf pH-8,5 eingestellt und dann 30 ., Minuten bei 20° C gerührt. Das Gemisch wurde mit 13_o200 Gv (Serwall, !Typ RC-2, Automatic Superspeed Refrigerated:-.Centrifuge) 30 Minuten bei 0° C zentrifügierto Die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen, durch Filtration ~ geklärt und ergab 2,7 kg Lösung ait einer Aktivitätvon 50 E/g. Erneutes zweimaliges Suspendieren des Sedimentesin Wasser (1 1) während 5 Minuten bei pH 8,-5 und nachfolgen-

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des Zentrifugieren ergab eine zusätzliche Enzymlösung (2 kg, Aktivität 11 E/g). Dies entspricht einer gesamten

Aktivitätsausbeute von 74$ wasserlöslicher Acylas.e.

e) Klare Acylaselösung (2 kg, Aktivität 50 E/g), wie in Beispiel 2d) erhalten, wurde lyophilisiert und ergab 98,5 g feste Acylase mit einer Aktivität von 950 E/g«

f) Klare Acylaselösung (2 kg, Aktivität 50 E/g), erhalten wie in Beispiel 2d), wurde sprühgetrocknet und ergab 92 g feste Acylase mit einer Aktivität von 920 E/g.

g) Klare Acylaselösung (1 kg, Aktivität 52 E/ml), wie in" Beispiel 2d) erhalten, wurde 8 Stunden gegen strömendes Leitungswasser diälysierto Die dialysierte Lösung wurde lyophilisiert und ergab 20,5 g feste Acylase mit einer Aktivität von 2„400'E/g.

h) Klare Acylaselösung (245 ^g₃ Aktivität 48 E/g), gemäß Bei spiel 2c) erhalten, wurde gerührt und mit Hilfe von 9-m Essigsäure (2,2 kg) auf pH 4,5 eingestellt» Das Rühren wurde 1 Stunde fortgesetzt, und danach wurde das Gemisch filtriert und die klare Lösung mit 7-m Ammoniak (4_S5 kg) unter Bewegen auf pH 8,0 eingestellt« Wach einer Stunde wurde das Gemisch filtriert und die Lösung mit Hilfe von 9-m Essigsäure (2,0 kg) auf pH 5 eingestellt. Die Aktivi tät der Lösung (220 kg) betrug 47,5 E/g.

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i) Gemäß Beispiel 2d) erhaltene überstehende Flüssigkeit

(50Og, Aktivität 52 E/g) wurde auf pH 4 eingestellt und 15 Minuten bei O⁰ C gerührt, um Proteinverunreinigungen auszufällen. Nach dem Zentrifugieren und Einstellen auf pH 7,5 wurde die erhaltene klare Lösung (500 g, Aktivität 40 E/g) gegen Leitungswasser über Nacht dialysiert und so-dann gefriergetrocknet und ergab 4 g mit einer-Aktivität von 4»900 E/g.

j) Homogenisierte Bakterienpaste (1 kg mit einer Aktivität von 128 E/g) wurde mit 13»200 G (Serwall, Typ EO-2, Automatic Superspeed Refrigerated Centrifuge) JO Minuten bei 0° C. zentrifugiert« Die überstehende Flüssigkeit ( 500 g. Aktivität 80 E/g) wurde abgegossen^ durch Filtration geklärt und als solche für enzymatische Penicillinspaltung zur Bildung von 6-Aminopenicillansäure verwendete

Beispiel 3

Herstellung von Acyläse mit Tannin

Gemäß Beispiel 2h) gewonnene AcylaselÖsung,. (185 kg₅ Aktivität 47j5 E/g) wurde gerührt und mit Ätüylendiamintetraessigsäure (50 g) und anschließend mit einer Tanninlösung (166 g) und Natriumsulfit (55 g) in Wasser (5₉5 1) behandelt-, Nach einstündigem Rühren wurde Celite 505 (1».5 kg) und Matriumsulfit (700 g) zugesetzt und die Suspension filtriert, wobei man 3=950 g feuchten, festen Sanninacylase-liederschlag mit einer Aktivität von 1„930 E/g erhielt. .

; -"■, '_/. 9Ό9837/Ί3Ο0 ..'. - .

Beispiel 4

Gewinnung von Acyläse aus dem Tannin-Niederschlag

a) Gemäß Beispiel 3 erhaltener feuchter Tanninacylase-iiiederschlag (30,4 g, Aktivität 1.930 E/g) wurde mit kaHrem Aceton (30 ml, -10 "bis -30^p G) behandelt, welches langsam un- · ter Rühren zugesetzt wurde. Nachdem der Niederschlag teilweise gelöst war, wurde eine zusätzliche Menge kaltes Aceton (200 ml) auf einmal zugesetzt und das Gemisch filtriert. Der Peststoff wurde mit kaltem Aceton gewaschen und an Luft bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet. Ausbeute 15,4 g» Aktivität 3'.65O E/g.

b) Feuchter Tanninacylase-Niederschlag,(3.750 g, Aktivität 1.930 E/g) gemäß Beispiel.3 wurde in 0,1 molarem Ammoniumacetat mit pH 5,0 (5_SQ 1) und Butanol (2,5Ί) suspendiert. Natriumsulfit (50 g) wurde zugesetzt₉ und der pH-Wert wurde mit Hilfe von Essigsäure auf 5_s0 eingestellt» Bas Rühren wurde 20 Minuten fortgesetzt und das Gemisch filtriert. Die Wasserphase (6.650 ml, Aktivität 800 E/ml) wurde abgetrennt.

c) Acylaselösung (1.000 ml, Aktivität 48 E/ml) wurde nach einer

wie . ";'"-

pH-Fraktionierung in Beispiel 2h7 mit Tannin gemäß Beispiel 3 behandelt. Der Tanninacy.lase-Niederschlag wurde filtriert und unter Rühren in 0„1-m Ammoniumacetatpuffer mit pH 8,0 (100 ml) suspendiert. Das Rühren wurde eine Stunde fortgesetzt, und der pH-Wert wurde auf 8₉0 eingestellt und kontrolliert. Das Gemisch wurde filtriert und ergab 100 ml

Acylaselösung mit 220 E/ml.

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■:; - .20-, : ^y

d) In Pufferlösung mit pH 8 (100 ml) suspendierter feuchter Tanninacylase-lTiederschlag wie in Beispiel 4c) wurde aiit DEAE-Cellulose (2 g-, Kapazität 1,0 m-lguivalentXg)^ behandelt. Das Gemisch wurde 15 läinuten gerührt und filtriert. und ergab eine Äcylaselösung (90 ml) mit 4-94 E/ml ,..;■;";

e) Wie in Beispiel 3 erhaltener feuchter Tanninacyläse-lieder-^ schlag (36,6 g, Aktivität Ί.250 E/g) wurde in 0₉2-m Ammoni»; umacetatpuffer mit pH 8 (150 ml) suspendiert und aiifpK8₉ö eingestellt. Nach 10-minütigem Rühren wurde Butanol (60 ml) und" anschlieiSend 9-m Essigsäure Ms pH 5,0 zugesetzt. Das Rühren wurde 10 Minuten fortgesetzt und das Gemisch dann ; "filtriert. Die Wasserschieht (166 ml ρ Aktivität 140 E/ml) wurde abgetrennt. : '

Beispiel 5 - ; "

Lyophilisierung von Tanninacy las ©«Nieder schlag; -";.-,",".-."

Wie in Beispiel 3 erhaltener Tanninacylase-Ni.edersehlag (86,,1: g₉ Aktivität 1.600 E/g) wurde auf -30° C gekühlt und im YalEUum bei 25° C und 0,1 - 0,2 Torr getrocknet ο Die. Ausbeute betrug 28,5. g eines trockenen Produktes mit einer Aktivität von 2_o340 E/g_β

Beispiel 6 . _: ..,-■ .- '

Isolierung des Ensyas durch Trocknung

a) Sprühtrocknung ;

Wie in Beispiel 2h) erhaltene Äcylaselösung (5 I ' · 9 0 9 8-3 7/t 3.-0 0 ^{; :} Γ ^: .

- ²¹ - 1907363"'

47,5 E/ml) wurde bei einer Lufttemperatur von 110 - 115° C am Einlaß und von 70 - 75° 0 am Auslaß während einer Zeit von einer Stunde sprühgetrocknet.

Ausbeute 85 g, Aktivität 380 E/g

b) FIo tationstrocknung

Oellulosepulver (100 g) wurde mit gemäß Beispiel 4b) erhaltener Acylaselösung (200 g, Aktivität 162 E/g) vermischt» Das resultierende Gemisch wurde in einem Luftstrom bei 40° 0 während 90 Minuten flotationsgetrocknet. Es wurden 93,2 g .trockenes Pulver mit einer Aktivität von 284 E/g erhalten«

Beispiel 7

Reinigung der Acylaseaktivität durch Ionenaustauscher-Ohr omatographie

a) Die in Beispiel 2c) erhaltene Acylaselbsung (5 «000 ml_s Aktivität 48 E/ml) wurde mit Hilfe von 9-m Essigsäure auf pH 4j6 eingestellt. Nach Stehen über lacht in der Kälte wurde das G-emisch filtriert und die klare Lösung durch eine Ionenaustauschersäule geschickt (Sulphoethyl Sephadex¹"^ 0 5Oi Durchmesser 8 cm, Länge 15 cm in 0,1-m Ammoniumacetat«, pH 4,6)= Die Säule wurde mit. dem Ammoniumaeetatpuffer von einem pH 4,6 (650 ml) gewaschen. Die Aoylase wurde mit.. 0,2-m Ammoniumacetatpuffer von pH 8,0 eluiert«, Die. erhaltenen 640 ml besaßen eine Aktivität von 326 E/ml.

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19Q7365

b) Eine gemäß Beispiel 4 b) erhaltene gereinigte Acylaselösung (5.55O ml,- Aktivität 800 E/ml) wurde auf pH 4,6 eingestellt und in gleicher Weise wie in Beispiel 7a) feehandelt* Man erhielt 2.350 ml mit einer Aktivität von 1.610

c) ,Auf SE-Sephadex wie in Beispiel 7b) gereinigte Acylaselösung (250 ml,'Aktivität 1.610 E/ml) wurde auf -40° C gekühlt und im Vakuum bei 0,1 - 0,2 Torr und einer Temperatur von 25° C getrocknet» Die Ausbeute betrug 2,11 g gereinigte Aeylase mit einer Aktivität von 190»ö00 E/g.

d) Die in Beispiel 7b) gereinigte Acylaselösung (230 ml, Aktivität Τ*610 E/ml) wurde durch Eindampfen im Vakuum auf ein Volumen von.24 ml konzentriert. 15 ml des lonsentrats mit. einer Aktivität von 15 ■> 000 E/ml wurden durch eine Sephadex. .. ■ ■ "G 75-Säule . (Durchmesser 2,5 cm, Länge 100 cm) geschickt. ]■ ' '. Die-Aeylase wurde mit entionisiertem Wasser oluiertv - Man' erhielt die Aeylase in 108 ml, Aktivität "To.710 E/ml.. G-e- ' friertrocknung dieser Lösung ergab 1_S8 g mit einer/Aktivität von 92.500 E/g. ■ .

e) Aus einer Sulphoethyl Sephadex &s50~Säule geiiiäß.Baispiei-7a) gewonnene und gefriergetrocknete Acylasezuberyitung;" (72. mg) wurde in 0,005-m Natriumphosphatpuff er mit pH 6,30 (.2,7. ml·) gelöst, und gegen den gleichen Puff er dialysier-t und sodann durch eine Säule geschickt, die Carboxymethylcellulose*enthielt (Whatman Cl-32s klein in der Kapazitätsi Milliäqui- valent/g? Säulenlänge 13?5 cm. Durchmesser O₉9 cm), nachdem

- 9 09837/1 tÖO . - ; . .:.■'- ■■

BADORiGiNAL

₉ - !907365 :

die Carboxymethylcellulose vorher mit dem Puffer ins Gleich- .-gewicht gebracht worden war.. Die Säule wurde mit den: folgenden Puffern eluierts .

0,005 m Natriumphosphatpuffer, pH 6,30 (etwa 17 ml) 0,02 m Natriumphosphatpuffer., pH 6,35 (etwa 17 ml) und 0,1 m Natriumphosphatpuffer, pH 6,35 .

Fraktionen von 1,3 ml wurden gesammelt, und die Extinktion bei 280 m/U wurde gemessen. Die gesamte Enzymaktivität wurde mit dem 0,1 m-Puffer eluiert und enthielt nur TÖ$ des ursprünglichen Proteingehaltes. Etwa 90$ der Gesamtextinktion fand man als inaktives Protein in Fraktionen, die 0,005 m Puffer enthielten,» . - .-

f) Eine gemäß Beispiel 2h) erhaltene Lösung (1OQ ml) wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und sodann während 24*5-Stunden gegen 0,005 m-Phosphatpuffer mitveinem pH von 6,Oo Diäthylaminoäthylcellulose (Whatman DE-32, klein in der Kapazität, 1,0 Milliaquivalent je g) (12₉5 mg/ml), die mit dem oben erwähnten Puffer ins G-leichgewiGht gebracht worden waren, wurde zugesetzte Die Ionenaustauschcellulose wurde nach 30 Minuten abgetrennt» Es wurde keine Yerminderung der Acyläse-Aktivität beobachtet, doch die Extinction bei 280. m/U betrug nur noch 10$ des Ursprungswertes. Die Enzymaktivität wurde dann durch Carboxymethylcellulose (Whatman CM-32) adsorbiert₉ mit HCl behandelt und gewaschen oder mit 0,005 m~Uatriuis.se β tat mit pH 5*5 äq,uilibriert. In beiden Fällen wurden zwei verschiedene Ionenaustauschermengen

■ , . ■ 9U99 j // iaUV - - ..-'.-.■

benutzt, nämlich 12,5 mg und 3»2 mg je ml. Nach Abtrennung des Ionenaustauschers wurde die Bnzymaktivität nach Dispergieren des Ionenaustauschers in Wasser eluiert, indem man den pH-Wert auf 6 -7 und die Ionenstärke durch Zugabe'von 0,1 m Phosphatpuffer erhöhte. Die Ausbeute betrug etwa

g) Eine gemäß Beispiel 2h) erhaltene Lösung (100 ml) wurde

gegen destilliertes Wasser und dann 22 Stunden gegen 0,005 m Phosphatpuffer von pH 6,0 dialysiert. Die Lösung wurde zweimal mit Diäthylaminoäthylcellulose (Whatman DB--52.) (12,4- mg je ml) behandelt,' die mit dem oben erwähnten Puffer äquilibriert worden war. Die Lösung wurde dann mit dem gleichen Ionenaustauscher (13 mg je ml) in der OH-Form ohne Verlust an Acylase-Aktivität behandelt. Der Ionenaustauscher wurde 30 Minuten nach seiner Zugabe abgetrennt«»: Fach dem letzten Zusatz war der pH-Wert auf 8,31 gestiegen. Das Enzym wurde dann vollständig nach Zugabe des Ionenaustauschers in der OH-Form (50 mg je ml) adsorbiert. Der pH betrug 9_S 1.1. Nach ; Abtrennung des Ionenaustauschers und seinem Dispergieren iii Wasser wurde das Enzym durch Einstellung des pH-Wertes auf etwa 6 eluiert. Die Ausbeute betrug etwa 60$, und .die Reinheit des Enzyms, gemessen als das Verhältnis-von Aktivität zu Extinktion bei 280 nyu, wurde auf das Zwanzigfaehe erhöht. - . ' '.'■-.■ ^: ; ; /;■ ν

h) Eine gemäß Beispiel 2c) erhaltene Lösung (100 ml) wuräe,:. .

durch Dialyse gegen destilliertes. Wasser während einer ": \-'^::^: Stunde teilweise entsalzt und sodann mit

909837/1300

cellulose in der H -Form (Whatman CH-32, kleine Ionenkapazität, 1 Milliäquivalent je g) (etwa 40 mg je ml) behandelt, Der pH-Wert wurde auf 4,0 - 4,5 eingestellt. Der Ionenaustauscher wurd% abgetrennt und die adsorbierte Acylase durch Erhöhung des pH-Wertes auf etwa 6 und Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von Phosphatpuffer eluiert.

i) Das Verfahren gemäß Beispiel 7h) wurde wiederholt, doch wurde als Ausgangsmaterial'eine gemäß Beispiel 2h) erhaltene Lösung verwendet»

j) Eine gemäß Beispiel 2c) erhaltene .Lösung (100 ml) wurde durch Behandlung mit etwa 25 mg je ml Carboxymethylcellulose (Whatman OM-32) in der H⁺-lorm und dann mit der gleichen Menge an Diäthylaminoäthylcellulose (Whatman DE-32) in der 0H"-iOrm entsalzt und von Proteinen befreit. Der pH-Wert wurde so kontrolliert, daß er innerhalb des Bereiches von 5-7 abfiel. (Die Behandlung kann wiederholt werden₉ sollte aber beendet werden, bevor wesentliche Mengen an Acyia-se adsorbiert werden). Das Enzym wurde dann mit Hilfe von Carboxymethylcellulose adsorbiert und wie in Beispiel 7a) eluiertο

k) Eine gemäß Beispiel 2c) oder 2h) erhaltene Lösung (100 ml) wurde wie in Beispiel 7j) mit der Ausnahme behandelt, daß keine Diäthylaminoäthylcellulose verwendet wurde»

0 9 8 3 7/1300

Beispiel 8

Konzentration und Reinigung der Acylase-Aktivität durch

Ultrafiltration ·

Eine gemäß Beispiel 2c) erhaltene Lösung (10 ml), die durch Behandlung mit Ionenaustauscher gemäß Beispiel 7 j),: jedoch unter Weglassung der letzten Stufe eines Adsorbierens mit Carboxymethylcellulose teilweise entsalzt und von Proteinen "befreit worden war, wurde mit destilliertem Wasser (40 ml) verdünnt und unter Druck durch eine Membran filtriert, die Moleküle mit. einem Molekulargewicht von mehr als 50=000 vollständig zurückhielt (Diaflo^^Membran der Amicon Corporation, Cambridge, ." Mass, USA) ο Das Konzentrat ( 2 ml), das den Hauptteil· der .-"■■"" Acylase enthielt, wurde gefriergetrocknet»

Beispiel 9 ' .

Ausfällung der Acylase-Aktivität mit Hilfe von Ammonium-

sul-fat ^:

a) Zu einer gemäß Beispiel 4b) erhaltenen gereinigten Acylaselösung (Io000 ml, Aktivität 358 E/ml) wurde Ammoniumsulfat (570 g).zugesetzt» Das Gemisch wurde gerührt^ bis sich das Salz gelöst hatte» Uach zwei-stündigem Stehen bei 5° C ' wurder der gebildete Niederschlag abfiltriert. Die Ausbeute betrug 52,5 g feuchte Verbindung mit einer Aktivität von 5.160 E/g.

b) Die gemäß Beispiel 9a) erhaltene fleucht© Verbir;,iur,._, (47,0 g, Aktivität 5.160 E/g) wurde an der Iuft über

9 0 9837/ 15ÖÖ- ■

- 27 -

Nacht bei 25° C getrocknet. Ausbeute "19,85 g, Aktivität-7.580 E/g, '■■".. '■--'.

Beispiel 10

Reinigung der Acylase-Aktivität durch Dialyse

Gemäß Beispiel 2c) erhaltene Acylase-Lösung (11 ml,, Aktivität.' 48 E/ml) wurde über Nacht gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde wie in Beispiel 5 lyophilisiert. Ausbeute 0,06 g mit einer Aktivität von 8_β000 E/g.

BeJSpJeI₁ 11 \

Reinigung der= Acy läse-Aktivität durch Gelfiltration

Gemäß Beispiel 4b) erhaltene Acylaselösung (150 g, Aktivität 166 E/g) wurde durch Eindampfen im Vakuum auf ein Volumen von ^ ^^. ^„.„^**.^,. „, „^.^^ M--^-*«*«,«*«^ «.«.* ww^^««.^* G 75 in einer Säule von 3 x 80 cm zugeführt und mit entionisiertem Wasser eluierto Die Aktivität (21.200 E) wurde in 80 ml erhalten, · die.15»2$ des zugeführten Materials enthielten, wie auf der Grundlage der Adsorption "bei 280 m/u bestimmt wurde.-·

Beispiel 12 . ...-'' -

Bindung von E. coli-Acylase an Polymere

^ a) Bine Agar ο selb" sung (SepJaarose 4B^, 4$ig, 2,5 ml) wurde

**«k. .■■■■--■

.„j, filtriert, und der isolierte feuchte Feststoff wurde 8 ^v ο Minuten bei pH 11,5 - 12,0 in einer eiskalten wässrigen Bromcyanlösung (5$ig, 2 ml) gerührt. Das feste Gel wurde

durch Filtration-gewonnen „und" auf dem Filter gut mit Eiswasser und eiskalter 1,0 molarer Boraxlösung gewaschen. Das Gel wurde dann in 0,1 m-Borax (4 ml) suspendiert und mit E. coli-Acylase (Aktivität 159.000 E/gJ 0,106 g), erhalten nach Beispiel 7d), 24 Stunden bei +4° C gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das gewonnene feste Material sorgfältig auf dem Filter mit Wasser gewaschen, um 1,2 g festes Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 679 E/g zu ergehen.

b) Sephadex^G 25 (0,100 g) wurde 8 Minuten bei pH 11,5 mit einer eiskalten wässrigen Lösung von Bromcyan (5%ig, 2 ml) gerührt und filtriert. Das gewonnene Gelwurde gut mit Eiswasser und eiskalter 0,1 m- Boraxlösung (4 ml) gewaschen. Gemäß-Beispiel 7d) erhaltene E. coli-Acylase (Aktivität 159.000 E/g, 0,106 g) wurde zugesetzt, und das _; Gemisch" wurde 24 Stunden bei +4° 9 gerührt. Dann wurde das Gemisch auf pH 7,5 eingestellt und filtriert. Das feste Material wurde auf dem Filter mit Wasser gut gewaschen und ergab 0,3 g Polymer mit einer spezifisehen Aktivität von

212 E/g. ,;,.,^: :■'■ , ■;

α) Das: Experiment b) wurde mit DEAE-SephadexS^ A 50 (0,1 g) anstelle von Sephadex^G 25 wiederholt. Die Ausbeute be-. trug 1,25 g feuchtes Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 435 E/g. .

909037/1300

d) Das Experiment To) wurde mit Cellulosepulver (Machery, Nagel & Go, MN-300; 0,1 g) anstelle von Sephadex*^ G- 25 wiederholt. Die Ausbeute betrug 0,35 g Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 261 E/g.

Beispiel 13

Herstellung von 6-Aminopenicillansäure

Zu einer Enzymlösung (283 g, Aktivität*42 E/g) wurde eine Lösung von Benzylpenicillin (20 g) als Kaliumsalz in Wasser (3.17 ml) zugestzt.

Das Gemisch wurde bei 37° C inkubiert, und der pH-Wert wurde durch periodische .Zugabe von 2,5 η-Natriumhydroxid auf 7,8 gehalten. Nach 6 Stunden enthielt das Reaktionsgemisch 10,7 g 6-Aminopenicillänsäure '(-92$) und wurde filtriert. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 5 η Salzsäure auf 3 eingestellt, und es wurde mit einem halben Volumenteil Methylisöbutylketon extrahiert, um restliches Benzylpenicillin und die Phenylessigsäure aus der Seitenkette, die während der Bildung der 6-Aminopenicil- !ansäure abgespaltet wurde, zu entfernen. Nach der Extraktion wurde die Wasserlösung vom Methylisöbutylketon abgetrennt.

Der pH-Wert der Wasserlösung wurde auf 7,5 eingestellt und das Volumen im Vakuum auf 120 ml vermindert. Die konzentrierte Lösung wurde auf 5° C abgekühlt und filtriert. Wenn die filtrierte Lösung mit 5 η Salzsäure auf pH 4,3 angesäuert wurde, fiel die kristalline 6-Aminopenicillansäure aus.

9 0 9 81 7 / 1 "3 0 Ö

Nach der Filtration wurden die Kristalle mit etwas kaltem -Wasser und danach mit trockenem Aceton gewasehjen und im Takaum getrocknet, um eine Ausbeute von 8,84 gö-lninopenicillansätrre'zu-ergeben. Die Reinheit des Produktes !betrug 95% und die-Ge samt ausbeute, berechnet auf das Benzylpenicillin,_: betrug

Beispiel 14

Herstellung von 6-Ami2iO]penieillansäure

a) Zu einer Enzymlösung ( 375 g, Aktivist" 33,8 E/g), die wie in Beispiel 2c) erhalten worden, war, wurde Benzylpenicillin als .Kaliumsalz (21 g)_s gelöst in Wasser (:325 ml), zugesetzt.

Die Lösung wurde bei 37° C inkubiert, und der pH—Wert wurde durch periodische Zugabe von 2,5 n Natriumhydroxid auf 7,8 gehalten. Nach 6 Stunden wurde die Lösung auf 10° G gekühlt und mit Methylisobuty!keton (200 ml) bei pH 2 extrahiert, um das restliche Benzylpenicillin und die Phenylessigsäure aus der Seitenkette zu entfernen, die während der Bildung der 6-Aminopenicillansäure abgespaltet worden war. liach der Extraktion wurde die Wasserlösung .von dem Methylisobuty 1-keton abgetrennt. "

Der pH-Wert der Wasserlösung wurde auf 7i5 eingestellt und das Volumen auf 110 ml im Vakuum vermindert. Die skonzentrier te Lösung wurde auf 5° "C albgekühlt und filtrier ΐ>. Wenn die filtrierte Lösung mit 5 η Salzsäure auf pH 4,3 ange-"'"_v säuert wurde, fiel die kristalline 6-Aminopenicillansäure

q no 6..3"7 j ι "9IVQ ' ■

Nach der Filtration wurden die Kristalle zweimal mit kaltem Wasser (5 ml) und anschließend mit trockenem Aceton (zweimal mit 5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um eine Ausbeute von 8,51 g 6-Aminopenicillansäure zu ergeben. Die Reinheit des Produktes betrug 99$, und die Gesamtausbeute, berechnet auf das Benzylpenicillin, betrug 69$·

In analoger Weise wurde 6-Aminopenicillansäure hergestellt, wobei man gemäß den vorausgellenden Beispielen hergestellte Enzympräp^ate verwendete. Ausbeute und" Reinheit der erhaltenen Säure sind in der folgenden Tabelle I zusammengestell-t.

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!Tabelle I

Beispiel	Benzylpenicillin- kaliumsalz g	Enzym	Menge g	Aktivität E/g	6-Aminopenicillansäure	Reinheit	Ausbeute* $
Hb)	21	hergestellt wie in Beispiel	6.3	1,600	Ausbeute g	98.2	82
Hc)	21	3	4.2	2.920	10.1	96.0	78 -
Hd)	500	4a)	450	800	9.8	98.5	89
He)	21	4b)	5.4	2.340	261.3	97.0	60
Hf)	21	5	145	87	7.55	100	81
Hg)	2.100 .	7a)	780	1.610	9.9	100	88
Hh)	21	7b)	0.1	128.000	1.064	98.0	75
Hi)	21	7c)	0.11	116.500	9.3	100	85
Uj)	21	7d)	5.4	2.400	10.35	100	75
Hk)	21	9b)	2.4	6.000	9.1	100	72
Hl)	21	10	0.9	14.000	8.82	100	76
9a)	9.23

CO O (O OO

* auf reines Produkt korrigiert

Vj) IV)

CO CD

CO cn cn

Beispiel 15

Herstellung von p-Nitrobenzylester der 6-Aminopenicillansäure

Eine wie in Beispiel 7b) erhaltene Enzymlösung (18,6 g, Aktivität 1.610 E/g) wurde mit Wasser (700 ml) und Methanol (120 ml) verdünnt und durch Zugabe von 0,1 m-Natronlauge auf pH 7,8 eingestellt. Eine Lösung von p-Nitrobenzyl-benzylpenicillinat (3,1 g, 6,6 Mol) in Methanol (60 ml), wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 37° 0 gerührt und durch Zugabe von 0,1 m-Natronlauge auf pH 7,8 gehalten. Nach 2,5 Stunden wurde das Gemisch gekühlt und mit Äthylacetat (500 ml) extrahiert. Die saure Schicht wurde abgetrennt und mit einer weiteren Menge Äthylacetat (250 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt und mit wasäerfreiem Natriumsulfat eine Stunde getrocknet. Nach der Filtration wurde, die organische Lösung in zwei gleiche Teile geteilt. Ein Teil'wurdeim Vakuum bei Raumtemperatur konzentriert und ergab den freien p-Nitrobenzylester von 6-Aminopenicillansäure als öligen Rückstand (1,1 g). Das Produkt ergab im IR-Spektrum Banden bei 3.250, 1.756 und 1.720 cm"¹, die die Anwesenheit einer NHp-Gruppe, eines j3-Lactamr ing es und einer Estergruppe anzeigten.

In Aceton (20 ml) gelöste Benzolsulphonsäure (0,58 g) wurde zu dem anderen Teil der Äthylacetatlösung zugesetzt, die dann im Vakuum auf ein Volumen von etwa 30 ml konzentriert wurde. Bei Zugabe von Äther (10 ml) und Stehen über Nacht im Eisschrank fiel das Benzplsulphonsäuresalz von p-Ni±robenzyl-6-aa?^J iaopeni-

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cillinat (0,8 g) als weiße Kristalle aus, S. 148 - 151° C. Dieses Produkt war mit dem in der britischen Patentschrift 33 734/67, Beispiel 4, beschriebenen Produkt identisch.

Beispiel 16

Herstellung von 6-(d-ö(-Azidophenylaeetsiii±do)-penieillan-

säure

Zu einer Enzymlösung (283 g, Aktivität 42 E/g) wurde eine Lösung von Benzylpenicillin (20 g) als Kaliumsalz in Wasser (317 ml) zugesetzt.

Das Gemisch wurde 37° 0 inkubiert, und der pH-Wert wurde durch periodische Zugabe von 2,5 η Natronlauge auf 7_t8 gehalten. Nach 6 Stunden enthielt das Reaktionsgemisch 10,7 g 6-Aminopenicillansäure (92?6) und wurde filtriert.

Die Lösung wurde auf 5° 0 abgekühlt und mit 10 η Schwefelsäure auf pH 3,0 angesäuert, unter Rühren wurde Methylisobutylketon (300 ml), das d-oC-Azidophenylacetylchlorid (62 mM) enthielt, zugesetzt. Das Rühren wurde 3.0 Hinuten fortgesetzt, und der pH-Wert wurde durch periodische Zugabe von 2,5 η Natronlauge auf 3>0 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde durch Gelite 505 * (10 g) filtriert, und das Methylisobutylketon wurde von der Wasserphase abgetrennt.

Die Methylisobutylketon-Lösung wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat (25 g) getrocknet.

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Nach der Filtration wurde die 6-(d-oC-Azidophenylacetamido)-penieillansäure als Natriumsalz durch Zugabe von 41 ml einer 2 η-Lösung des Natriumsalzes von 2-lthylcapronsäure in Methylisobutylketon ausgefällt.

Das Natriumsalz von 6-(d-oC-Azidophenylacetamido)-penicillansäure wurde filtriert. Die Kristalle wurden mit 50 ml Methylisobutylketon (50 ml) gewaschen und im Vakuum bei 50° C getrocknet, um eine Ausbeute von 16,5 g zu ergeben. Die Reinheit des Produktes betrug 9696 und die Gesamtausbeute, berechnet auf daa Benzylpenicillin, 75$.

In analoger Weise wurde e-id-o^-AzidophenylaeetamidoJ-rpenicillansäure-Natriumsalz unter Verwendung anderer Enzympräparate gewonnen, die nach den obigen Beispielen hergestellt worden waren. Ausbeute und !Reinheit des Penicillins sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengestellt.

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Tabelle II

	BenzyIp eni cillin- Kaliumsalz g	Enzyme	Menge g	Aktivität E/g	6-( d-pC-Azidophenylacet- amido)-penicillansäure	Reinheit	Ausbeute* f
Beispiel	21	ner'ges^e'lli Wie in Beispiel	6.3	1.600	Ausbeute S	95.8	81
16b)	21	3.	4.2	2.920	18.9	94.0	76
1qc)	21	4a)	5.4	2.340	18.0	89.7	65
16d)	21	5	145	87	16.2	95.8	87
I6e)	21	7a)	6	1.890	20.4	96.6	86
I6f)	21	7b)	0.1	128.000	19.7	96.0	79
16«)	21	7c)	5.4	2,400	18.5	92.7	85
16h)	21	9b)	2.4	6.000	20.5	95.5	79
16i)	21	10	0.9	14.000	18.5	91.4	82
I6j)	9a)	20.0

CO

CO OO c*> -4

iä» O O

auf reines Produkt korrigiert

CO O

GO CD (Jl

Beispiel 17

Enzymatischem Synthese von Benzylpenicillin

6-Aminopenicillansäure (175 mg) und Phenylessigsäure (111 mg) wurden in Kaliumphosphatpuffer (10 ml) bei pH 7,0 gelöst. Die in Beispiel 7c) hergestellte Acylase (3,6 mg, Aktivität 128.000 E/g) wurde in Wasser (5 ml) gelöst und zu der oben bereiteten Lösung zugesetzt.

Der pH-Wert wurde mit 1 m Η,ΡΟ. auf 5,0 eingestellt, und die Lösung wurde bei 37° G inkubiert. Der pH-Wert wurde auf 5,0 gehalten, und nach 4 Stunden wurde die Lösung abgekühlt und papierchromatographisch analysiert. 30$ der 6-Aminopenicillansäure waren in Benzylpenicillin überführt.

Beispiel 18

Antigen-bildungsversuche

Methode: Passive Hautanaphylaxie bei Mehrschweinchen, im wesentlichen gemäß de Weck et al., Int. Arch. Allergy, 33 (1968), Seiten 535 - 567. '

Kaninchen-ö-aminopenicillansäureantiserum wurde durch wiederholte subcutane Injektion von roher 6-Aminopenicillansäure und durch zwei Injektionen einer zurückgehaltenen Probe aus einer dialysierten 6-Aminopenioillansäure-Oharge produziert. Bei Versuchen über die passive Zusammenballung der Blutkörperchen zeigte dieses Antiserum einen Titer von 1/4-096. Ein ml c?ieaes

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6-Aminopenicillansäureantiserums wurde intravenös einem weissen Meerschweinchen injiziert. 24 Stunden später wurden 0,1 ml einer 5$igen lösung in Salzlösung von Evans-Blau intravenös verabreicht, und eine Stunde danach wurden 0,1 ml mit 4 mg 6-Aminopenicillansäure, hergestellt nach den Beispielen 14d), 14g) und 14i), intradermal verabreicht. An einer 4. Stelle des Rückens des Tieres wurde eine Probe von 6-Aminopenicillansäure verabreicht, die in herkömmlicher Weise unter Verwendung ganzer Zellen von E. coli hergestellt worden war. Die Proben der 6-Aminopenicillansäure wurden unmittelbar nach dem Auflösen injiziert. Als Kontrolle wurden 0,1 ml normale Salzlösung intradermal injiziert. Bei einem zweiten Meerschweinchen wurde das gleiche Verfahren wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß anstelle des 6-Aminopenicillansäureantiserums ein jhI normale Salzlösung intravenös verabreicht wurde.

Zwei Stunden nach den intradermalen Injsküonen wurde der Umfang des Blauwerdens an den Injektionsstellen bestimmt und als das Produkt zweier senkrechter Durchmesser ausgedrückt.

Ergebnisse

Bei beiden Tieren, dem nieht-sensibilisierten und dem passivsensibilisierten, verursachten alle 6-Aminopenicillansäureproben Ausbreitung des Farbstoffes, die ausgeprägter als an der Stelle der Salzlösungsinjektion, war. Wie jedoch Tabelle III zeigt, verursachte die herkömmliche 6-Aminopenicillansäureprobe eine stärkere Reaktion bei dem sensibilisierten Tier. Die gleiche Reaktion, doch in viel geringerem Ausmaß, erhielt man

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bei 6-Aminopenicillaiisäure nach der Erfindung.

!Tabelle III

Das Produkt zweier aufeinander senkrechter Durchmesser (mm ) blauer Flecken, die durch Injektion von 4- mg der angegebenen Verbindungen intradermal verursacht wurden.

6-Aminopenicillan säure gemäß Bei spiel Nr.	Sensibilisiertes Tier	Ifieht-sensibili- siertes Tier	Unter schied
Hergestellt unter Verwendung E. coli- Zeilen	256	110	146
Hd)	132	120	22
Ug)	195	169	26
U±)	156	169	-13
Salzlösung	12	12	—

Die Ergebnisse zeigen, daß eine Brobe τοπ. 6-Aminopenicillansäure, die nach herkömmlichen Methoden hergestellt wurde, sich von den anderen Proben der 6-Aminopenicillansäure hinsichtlich der Fähigkeit, die passive Hautanaphylaiicie hervorzurufen, unterscheidet. Dies ist ein Ausdruck verminderter Antigenbildung bei 6-Aminopenicillansäure gemäß der vorliegenden Erfindung gegenüber der 6-Aminopenicillansäure, die nach herkömmlichen Methoden unter Verwendung ganzer Zellen von E. coli bereitet wurde.

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer zellfreien Penicillinacylase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Escherichia coli unter Bildung eines Enzyms fermentiert, das intrazelluläre Enzym unter kontrollierten Temperaturen im Bereich von 0 - 50° 0 von der Kulturflüssigkeit des Mikroorganismus durch schnelles Ausstoßen des Zellmaterials durch einen Schlitz oder eine öffnung unter einem aufgebrachten Druck von wenigstens 34 Atmosphären, der jedoch den Druck nicht überschreitet, wo übermäßiges Zerplatzen der Zellen erfolgt, abtrennt, das ausgestoßene Zellmaterial unter Lösen des Enzyms 0,10 - 5»0 Stunden in Wasser von 10 - 50° 0 rührt, anschließend das Enzym aus dem inaktiven Zellmaterial in wäßriger Lösung extrahiert und gegebenenfalls nach einer Reinigung aus der wäßrigen Lösung isoliert.

2. Verfahren nach Anspruoh 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Druck von 34 - 136 Atmosphären anwendet.

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ORIGINAL INSPECTED

3. Verfahren aaeh Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zellmaterial innerhalb von 0,05 - 1,0 Sekunden ausstößt.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß man das Zellmaterial durch einen ringsum laufenden Schlitz oder eine Öffnung mit einer Breite von 0,1 - 1,5 mm ausstößt.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kulturflüssigkeit und das Zellmaterial voneinander trennt, indem man den Mikroorganismus durch ausreichende Sättigung des Kulturmediums, mit einem organischen Lösungsmittel abtötet, welches niedrige Löslichkeit in Wasser besitzt und aus Butylacetat, Isobutylacetat oder Amylacetat besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1 - 5> dadurch gekennzeichnet, daß. man das Enzym in Lösung bringt, indem man das ausgestoßene Zellmaterial im Wasser mit Methylisobutylketon, Butylacetat, Isobutylacetat, Amylacetat, Benzol, Toluol oder Chloroform rührt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Methylisobutylketon, Butylacetat, Isobutylacetat, Amylacetat, Benzol, Toluol oder Chloroform in einer Kon- z> -it-ration von 1» ^vf^f> ve:r".·/:-,: Ie* _;

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8. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man beim Extrahieren des Enzyms Natriumhydroxids, Kaliumhydroxid oder Ammoniak zusetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß man beim Extrahieren des Enzyms Triäthylamin oder N-Äthy!piperidin zusetzt.

fc 10. Verfahren nach Anspruch 1 -9 , dadurch gekennzeichnet, daß man das extrahierte Enzym in der Weise reinigt, daß man die wässrige Lösung von Enzym und inaktivem Zellmaterial auf pH 3,0 - 6,0 ansäuert und das ausgefällte inaktive Zellniaterial durch Filtration entfernt und anschließend den pH-Wert wieder auf seine ursprüngliche Höhe einstellt.

11. Verfahren nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß man das extrahierte Enzym aus der zellfreien wässrigen Lösung bei pH 4 - 6 mit Tannin in Gegenwart eines chelatbildenden, mit Eisenionen Komplexe bildenden Mittels ausfällt und den gebildeten Enzym-Tanninkomplex durch Filtration oder Zentrifugieren.isoliert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die in dem Tannin-Niederschlag enthaltene Penicillinacylase durch Auflösen des isolierten Komplexes in Wasser bei pH 7 - 9 in die wässrige Lösung freisetzt»

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die in dem Tannin-Niederschlag enthaltene Penicillinaeylase durch Auflösen des isolierten Komplexes in einem Gemisch von Wasser und n-Butanol beJy$H 4 - 7 in die wässrige Lösung freisetzt.

14· Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die in dem T_annin-Niederschlag enthaltene Penicillinacylase durch Behandlung des in Wasser suspendierten isolierten Komplexes mit DEAE-Cellulose, die das Tannin bindet, freisetzt.

15· Verfahren nach Anspruch 1 - 14_f dadurch gekennzeichnet, daß man das extrahierte Enzym konzentriert und reinigt, indem man eine auf pH 3_f5 - 6 eingestellt Lösung des Enzyms durch eine Säule eines kationischen Ionenaustauschers mit einer offenen Struktur schickt oder den Ionenaustauscher zu der gerührten Enzymlösung zusetzt, und danach die Acylase aus dem Ionenaustauscher durch Eluieren bei pH 6,0 - 8,0 mit schwachen Pufferlösungen, die aus 0,2 m-Ammoniumacetat oder Trishydroxymethylammoniumacetat bestehen, freisetzt.

16. Verfahren nach Anspruch 1 - 15_f dadurch gekennzeichent, daß man anorganische Ionen und niedermolekulare Verunreinigungen aus der Enzymlösung durch Dialysieren gegen Wasser entfernt.

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17. Verfahren nach Anspruch 1 -15, dadurch gekennzeichnet, daß man anorganische Ionen und niedermolekulare Verunreinigungen aus der Enzymlösung durch Eindampfen der lösung bei einer Temperatur unterhalb 50° C bis zu einer Konzentration von 25 - 100 mg Trockengewicht je rnä. und anschließende Gelfiltration entfernt.

18. Verfahren nach Anspruch 1 - 17, dadurch gekennzeichnet, daß man das gereinigte Enzym durch Umsetzung mit einem

W aktivierten Plymermaterial chemisch modifiziert.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als aktiviertes Polymermaterial ein mit Bromzyan be-· handeltes Polysaccharid verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß man das gereinigte Enzym durch Gefriertrocknung der Enzymlösung bei einer Temperatur zwischen -10 und +50°

isoliert.

21. Verfahren nach Anspruch 1 - 19, dadurch gekennzeichnet, daß man das gereinigte Enzym durch Plotationstrocknung der Enzymlösung in einem Luftstrom bei 10 - 55° C isoliert.

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