DE1966427C3

DE1966427C3 - Verfahren zur Herstellung von 6-AminopenicUlansäure

Info

Publication number: DE1966427C3
Application number: DE1966427A
Authority: DE
Inventors: Per Staffan Delin; Bertil Ake Dr. Ekstroem; Lars Soelve Dipl.-Ing. Nathorst-Westfelt; Berndt Olaf Harald Sjoeberg; Karl Hugo Thelin
Original assignee: Astra AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 1968-02-15
Filing date: 1969-02-14
Publication date: 1980-03-13
Also published as: CH523320A; SU404195A3; NO131388B; FI47109B; DE1966427B2; FR2001977A1; DE1966428B2; NL6902045A; ES384027A1; CS155970B2; IT1061759B; ES384025A1; AT300198B; ES384026A1; IE32962B1; DE1907365A1; NO131386B; FI47109C; JPS4833386B1; DE1966427A1

Description

Lösungsmittels sowie einer Base oder in Wasser unter Zugabe einer Base rührt und daß man die extrahierte Penicillinacylase in an sich bekannter Weise mit einem mit Bromcyan behandelten Polysaccharid umsetzt

In der selbstreinigenden Zentrifugentrennvorrichtung arbeitet man vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 40⁰C und stößt das Zellmaterial zweckmäßig intermittierend innerhalb von 0,1 bis 0,5 Sekunden durch einen Schlitz einer Breite von 03 bis 0,7 mm durch Aufbringung eines Druckes von 61 bis 75 at aus.

Das ausgestoßene Zellmaterial wird bei 10 bis 50⁰C, vorzugsweise bei 20 bis 40⁰C, während 0,10 bis 5,0 Stunden, zweckmäßigerweise während 0,25 bis 3,0 Stunden, besonders während 0,25 bis 1,0 Stunden, mit einem wirksamen Rührer gerührt, um das Enzym zu lösen, wobei gegebenenfalls in einer Konzentration von 1,0 bis 5,0% ein mit Wasser unmischbares organisches Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, Butylacetat, Isobutylacetat, Amylacetat, Benzol, Toluol oder Chloroform, zugesetzt wird. Um die Extraktion des Enzyms aus dem ausgestoßenen Zellmaterial zu erleichtern, kann zu dem Gemisch eine organische Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniak, oder eine tertiäre organische Base, wie Triäthylamin oder N-Äthylpiperidin, zugesetzt werden, um den pH-Wert zwischen 6,5 und 9,0, beispielsweise zwischen 7,0 und 8,5, einzustellen und zu halten.

Die so erhaltene Enzymlösung wird, gegebenenfalls nach Verdünnung mit Wasser, von zurückgebliebenem Zellmaterial und anderen festen Verunreinigungen nach üblichen Verfahren, wie Filtration und/oder Zentrifugieren, und möglicherweise unter Zusatz von entfärbenden Mitteln, klärenden Mitteln und Filterhilfsmitteln, wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Cellulosepulver, Diatomeenerde oder anderen festen, schwach adsorbierenden Mitteln befreit. Eine weitere Methode ist die, das meiste Zellmaterial durch Zentrifugieren zu entfernen und die darüberstehende Flüssigkeit zu filtrieren.

Eine Reinigung des Enzyms kann man nach dem Rühren des Zellniaterials auch durch Ansäuern der wäßrigen Enzymlösung auf pH 3,0 bis 6,0, beispielsweise auf 4,0 bis 5,0, Entfernung des ausgefällten inaktiven Materials durch Filtration und erneute Einstellung auf den ursprünglichen pH-Wert erreichen.

Die Penicillinacylase, die in den oben beschriebenen zellfreien und gegebenenfalls teilweise gereinigten wäßrigen Lösungen enthalten ist, kann auch dadurch gereinigt werden, daß man die Enzymlösung bei einem pH 4 bis 6, zweckmäßigerweise bei pH 4,5 bis 5,5, mit Tannin bis zu einer Endkonzentration von 300 bis 900 ppm in Gegenwart eines chelatbildenden Mittels, wie Äthylendiamintetraessigsäure, das mit Eisenionen Komplexe bildet, behandelt. Der gebildete Enzym-Tanninkomplex kann in üblicher Weise, wie beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren, isoliert werden. Er kann gewaschen und getrocknet und von Wasser befreit werden, wie beispielsweise durch Trocknen, besonders durch Behandlung mit organischen Lösungsmitteln, die m!< Wasser mischbar sind, wie Aceton.

Die in dem Tannin-Niederschlag enthaltene Penicillinacylase kann durch Auflösen des Komplexes bei pH 7 bis 9, beispielsweise 7,5 bis 8,5, in wäßrige Lösung gebracht werden. Wechselweise kann der Komplex auch mit einem Gemisch von Wasser und n-Butanol, bei pH 4 bis 7, beispielsweise 4,5 bis 5,5, behandelt werden. Eine dritte Methode zur Auftrennung des Tanninkomplexes besteht in der Behandlung des in Wasser suspendierten Enzym-Tanninkomplexes aminoäthylcellulose, welcher das Tannin bindet und das Enzym an das Wasser abgibt Die für diese Methode notwendigen Wassermengen sind wesentlich kleiner als jene in den ursprünglichen Enzymlösungen, und auf diese Weise erreicht man eine beachtliche Konzentrierung der enzymatischen Aktivität.

Weiterhin kann die in irgendeiner oben beschriebenen Lösung enthaltene Penicillinacylase mit Hilfe eines Ionenaustauschers konzentriert und weitergereinigt werden. Hierzu wird das Enzym auf einem kationischen Ionenaustauscher mit einer offenen Struktur durch Überleiten der auf pH 3,5 bis 6, beispielsweise 4,0 bis 5,0, eingestellten Lösung des Enzyms durch eine Säule adsorbiert

Wechselweise kann auch der Austauscher zu der gerührten Enzymlösung zugegeben werden. Die Acylase wird danach aus dem Ionenaustauscher durch Eluieren bei pH 6,0 bis 8,0 mit schwachen Pufferlösungen, wie 0,2 M Ammoniumacetat oder Trishydroxyammoniumacetat, freigesetzt

Um reinere Präparate des Enzyms zu erhalten, können anorganische Ionen und niedermolekulare Verunreinigungen aus den Enzymlösungen selbstverständlich durch Dialysieren gegen Wasser entfernt werden. Statt dessen können die Lösungen, wenn nötig nach Konzentrierung durch Verdampfen bei einer Temperatur unterhalb 50⁰C auf eine geeignete Konzentration von 25 bis 100 m Trockengewicht je Millimeter, der Gelfiltration unterzogen werden.

Die so erhaltenen gereinigten Enzympräparate werden mit Bromcyan behandelten Polysacchariden umgesetzt, um ein trägergebundenes Enzym zu ergeben. Das Enzym kann in dieser Form mit einfachen Mitteln, wie beispielsweise durch Filtration, aus der Reaktionslösung gewonnen werden. Die trägergebundenen Enzyme können in Säulen für die kontinuierliche Herstellung der 6-Aminopenicillansäure durch Abspaltung der Seitenkette von Benzylpenicillin benutzt werden.

Es wurde gefunden, daß mit erfindungsgemäß hergestellter trägergebundener Penicillinacylase gewonnene 6-Aminopenicillansäure sehr wenig, wenn überhaupt, proteinhaltige Verunreinigungen mit Allergene erzeugenden Eigenschaften enthält. Dies ist von großer technischer Wichtigkeit, da es so möglich ist, Penicilline mit hypoallergenischen Eigenschaften direkt aus solchermaßen hergestellter 6-Amonpenicillansäure ohne zusätzliche Reinigungsverfahren zu gewinnen. Beispiele von Penicillinen mit hypoallergenischen Eigenschaften, die auf diese Weise hergestellt werden können, sind Λ-Phenoxyäthylpenicillin, a-Phenoxypropylpenicillin, 2,6-Dimethoxyphenylpenicillin, 3-(o-Chlorphenyl)-3-methyl-4-isoxazolylpenicillin, «-Carbonylbenzylpenicillin, a-Azidobenzylpenicillin und «-Aminobenzylpenicillin.

Die trägergebundene Penicillinacylase kann auch zur Entfernung der Seitenkette von Estern des Benzylpenicillin verwendet werden.

Beispiele
A. Fermentierung von Escherichia coli

Maiseinweichflüssigkeit (3 kg), Sojabohnenöl (135 ml), Paraffin (12 ml) und Cetanol (3 ml) in Wasser (150 1)

irden auf pH 6,0 mit 45%iger Natronlauge (165 ml) eingestellt und dann bei 124°C 30 Minuten in einem Fermentationsbehälter sterilisiert. Die Lösung wurde gekühlt und mit der oben gewonnenen Kultur geimpft

und anschließend bei 25° C unter Rühren und Belüftung inkubiert 24 Stunden nach der Impfung, nachdem der pH-Wert auf 8,2 angestiegen war, wurden die Bakterienzellen durch Zugabe von 180 1 Butylacetat abgetötet, und das Gemisch wurde anschließend '· gekühlt

B. Reinigung der Penicillinacylase-Lösung

a) Zur Isolierung des Zellmaterials wurde das Gemisch in einer selbstreinigenden Zentrifugentrenn- '■« vonlchtung, wie sie in der Erfindungsdefinition angegeben ist, getrennt Die ausgestoßene Bakterienzellenpaste wurde in 100 bis 120 kg-Anteilen gesammelt Zu jedem Anieil wurden 3,0% Methylisobutylketon zugesetzt, und das Gemisch wurde dann mit Hilfe eines '' Rührers 25 Minuten homogenisiert Die Gesamtausbeute an Zellmaterial betrug 325 kg.

Analyse des Enzyms in den verschiedenen Produktionsstufen ergab die folgenden Werte in Acylaseeinheiten, die entscheidend für die während der betreffenden -"■ Stufe zurückbleibende Enzymmenge sind (eine Acylaseeinheit entspricht der Enzymroenge, die in der Lage ist in 1,5 Stunden bei pH 8,5 und 37° C eine Menge an Benzylpenicillin aufzuspalten, die 1 mg 6-Aminopenicillansäure äquivalent ist):

Fermentationskultur 5 E/ml

darüberstehende Flüssigkeit 0,33 F/ml

flüssiger Auslauf der

Zentrifugentrennvorrichtung 0,28 E/ml

Bakterienzellmaterial 212 E'g

darüberstehende Flüssigkeit in

der Paste vor der Homogenisierung 75 E/g

darüberstehende Flüssigkeit in

der Paste nach der Homogenisierung 123 E/g '■ ■

b) Homogenisierte Bakterienpaste (175 kg. Aktivität 190 E/g) wurde mit 175 kg Wasser verdünnt, und unter Rühren des Gemisches wurde ein Gemisch von Fi'terhilfsmitteln (55,6 kg) zugesetzt. Die Wasserphase ' wurde durch Filtration abgetrennt, und der Filterkuchen wurde mit 50 ml Wasser gewaschen. Die vereinigten Lösungen (290 kg) besaßen eine Aktivität von 48 E/g.

c) Bakterienpaste (1 kg, Aktivität 212 E/g) wurde mit Wasser (2,0 1) verdünnt, mit Hilfe von 0,5 η Natronlauge '" (220 ml) auf pH 8,5 eingestellt und dann 30 Minuten bei 20⁰C gerührt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 0⁰C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen, durch Filtration geklärt und ergab 2,7 kg Lösung mit einer Aktivität von 50 E/g. Erneutes '' zweimaliges Suspendieren des Sedimentes in Wasser (1 1) während 5 Minuten bei pH 8,5 und nachfolgendes Zentrifugieren ergab eine zusätzliche Enzymlösung (2 kg. Aktivität 11 E/g). Dies entspricht einer gesamten Aktivitätsausbeute von 74% wasserlöslicher Acylase.

d) Klare Acylase (1 kg, Aktivität 52 E/g), die gemäß c) erhalten worden war, wurde 8 Stunden gegen strömendes Leitungswasser dialysiert. Die dialysierte Lösung ergab 20,5 g Acylase mit einer Aktivität von 2400 E/g (angegebene als Aktivität der festen Acylase ^hl nach Lyophilisierung).

e) Klare Acylaselön^g (245 kg, Aktivität 48 E/g), die gemäß c) erhalten worden war, wurde gerührt und mit Hilfe von 9 M Essigsäure (2,2 kg) gemäß Anspruch 3 auf pH 4,5 eingestellt. Das Rühren wurde 1 Stunde ^ι·^: fortgesetzt, und danach wurde das Gemisch filtriert und die klare Lösung mit 7 M Ammoniak (4,5 kg) unter Bewegen auf pH 8,0 eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch filtriert und die Lösung mit Hilfe von 9 M Essigsäure (2,0 kg) auf pH 5 eingestellt Die Aktivität der Lösung (220 kg) betrug 47,5 E/g.

Q Gemäß c) erhaltene Acylaselösung (500 g, Aktivität 52 E/g) wurde gemäß Anspruch 3 auf pH 4 eingestellt und 15 Minuten bei 0°C gerührt, um Protein verunreinigungen auszufällen. Nach dem Zentrifugieren und Einstellen auf pH 7,5 wurde die erhaltene klare Lösung (500 g. Aktivität 40 E/g) gegen Leitungswasser über Nacht dialysiert Das gefriergetrocknete Produkt ergab 4 g mit einer Aktivität von 4900 E/g.

C Reinigung der Acylase mit Tannin

Gemäß Be) gewonnene Acylaselösung (185 kg, Aktivität 473 E/g) wurde gerührt und mit Äthylendiamintetraessigsäure (50 g) und anschließend mit einer Tanninlösung (166 g) und Natriumsulfit (55 g) in Wasser (5,5 1) behandelt Nach einstündigem Rühren wurde Kieselgur-Filterhilfsmittel (1,5 kg) und Natriumsulfit (700 g) zugesetzt und die Suspension filtriert, wobei man 3950 g feuchten festen TanninacyJaseniederschlag mit einer Aktivität von 1930 E/g erhielt.

a) Wie oben hergestellter feuchter Tanninacylaseniederschlag (3750 g, Aktivität 1930 E/g) wurde in 0,1 molarem Ammoniumacetat mit pH 5,0 (5,0 I) und Butanol (2,5 1) suspendiert Natriumsulfit (50 g) wurde zugesetzt, und der pH-Wert wurde mit Hilfe von Essigsäure auf 5,0 eingestellt. Das Rühren wurde 20 Minuten fortgesetzt und das Gemisch filtriert. Die Wasserphase (6650 ml. Aktivität 800 E/ml) wurde abgetrennt.

b) Der wie oben hergestellte Tanninacylaseniederschlag wurde filtriert und unter Rühren in 0,1 M Ammoniumacetatpuffer mit pH 8,0 (100 ml) suspendiert. Das Rühren wurde 1 Stunde fortgesetzt, und der pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt. Das Gemisch wurde filtriert und ergab 100 ml Acylaselösung mit 220 E/ml.

c) In Pufferlösung mit pH 8 (100 ml) suspendierter wie oben hergestellter feuchter Tanninacylaseniederschlag wurde mit 2-Diäthylaminoäthylcellulose (2 g, Kapazität 1,0 M Äquivalent/g) behandelt. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und filtriert und ergab eine Acylaselösung (90 ml) mit 494 E/ml.

D. Reinigung der Acylase mit Ionenaustauschern

a) Die gemäß Bb) erhaltene Acylaselösung (5000 ml, Aktivität 48 E/ml) wurde mit Hilfe von 9 M Essigsäure auf pH 4,6 eingestellt. Nach Stehen über Nacht in der Kälte wurde das Gemisch filtriert und die klare Lösung durch einen lonenaustauschersäule geschickt (durch Vernetzung von Dextran erhaltenes Polysaccharid mit Sulfoäthylgruppen, Säulendurchmesser 8 cm, Säulenlänge 15 cm in 0,1 M Ammoniumacetat, pH 4,6). Die Säule wurde mit dem Ammoniumacetatpi:ffer von pH 4,6 (650 ml) gewaschen. Die Acylase wurde mit 0,2 M Ammoniumacetatpuffer von pH 8,0 eluiert Die erhaltenen 640 ml besaßen eine Aktivität von 326 E/ml.

b) Eine gemäß Ca) erhaltene gereinigte Acylaselösung (5550 ml, Aktivität 800 E/ml) wurde auf pH 4,6 eingestellt und in gleicher Weise wie unter a) behandelt. Man erhielt 2350 ml mit einer Aktivität von 1610 E/ml.

c) Die unter b) gereinigte Acylaselösung (230 ml. Aktivität 1610 E/ml) wurde durch Eindampfen im Vakuum auf ein Volumen von 24 ml konzentriert. 15 ml des Konzentrates mit einer Aktivität von 15 000 E/ml wurden durch eine lonenaustauschersäule (Durchmesser 2,5 cm, Länge 100 cm) geschickt. Die Acylase wurde mit entionisiertem Wasser eluiert. Man erhielt die

Acylase in 108 ml, Aktivität 1710 E/ml. Gefriertrocknung dieser Lösung ergab 1,8 g mit einer Aktivität von 92 500 E/g.

d) Eine gemäß Bb) erhaltene Lösung (100 ml) wurde durch Dialyse gegen destilliertes Wasser während 1 Stunde teilweise entsalzt und sodann mit Carboxymethylcellulose in der H+ -Form (kleine Ionenkapazität, 1 mÄqu/g, etwa 40 mg/ml) behandelt. Der pH-Wert wurde auf 4,0 bis 4,5 eingestellt. Der Ionenaustauscher wurde abgetrennt und die absorbierte Acylase durch Erhöhung des pH-Wertes auf etwa 6 und Erhöhung der lonenstärke durch Zugabe von Phosphatpuffer eluiert.

E. Reinigung der Acylase durch Gelfiltration

Gemäß Ca) erhaltene Acylaselösung (150 g, Aktivität 166 E/g) wurde durch Eindampfen im Vakuum auf ein Volumen von 9 mm konzentriert, einer Gelfiltration auf Dextran-Ionenaustauscher in einer Säule von 3 χ 80 cm zugeführt und mit entionisiertem Wasser eluiert. Die Aktivität (21 200 E) wurde in 80 ml erhalten, die 15,2% des zugeführten Materials enthielten, wie auf der Grundlage der Adsorption bei 280 πιμ bestimmt wurde.

F. Bindung der Acylase an Polymermaterialien

a) Eine Agaroselösung (4%ig, 2,5 ml) wurde filtriert, und der isolierte feuchte Feststoff wurde 1 Minute bei pH 11,5 bis 12,0 in einer eiskalten wäßrigen Bromcyanlösung (5%ig, 2 ml) gerührt. Das feste Gel wurde durch Filtration gewonnen und auf dem Filter gut mit Eiswasser und eiskalter l.Omolarer Boraxlösung gewaschen. Das Gel wurde dann in 0,1 M Borax (4 ml) suspendiert und mit E. coli-Acylase (Aktivität 159 000 E/g, 0,106 g), erhalten gemäß Dd), 24 Stunden bei 4° C gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das gewonnene feste Material sorgfältig auf dem Filter mit Wasser gewaschen und ergab 1,2 g festes Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 679 E/g.

b) Dreidimensional vernetztes Dextran (0,100 g) wurde 8 Minuten bei pH 11,5 bis 12 mit einer eiskalten wäßrigen Lösung von Bromcyan (5%ig, 2 ml) gerührt und filtriert. Das gewonnene Gel wurde gut mit Eiswasser und eiskalter 0,1 M Boraxlösung (4 ml) gewaschen. Gemäß Dc) erhaltene E. coli-Acylase (Aktivität 159 000 E/g, 0,106 g) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 4° C gerührt. Dann wurde das Gemisch auf pH 7,5 eingestellt und filtriert. Das feste Material wurde auf dem Filter mit Wasser gut gewaschen und ergab 0,3 g Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 212 E/g.

c) Das Experiment b) wurde mit dreidimensional vcriiciziern Dextran mit Diaihylaminoathylgrapytn (0,1

g) an Stelle des obigen vernetzten Dextrans wiederholt. Die Ausbeute betrug 1,25 g feuchtes Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 435 E/g.

d) Das Experiment b) wurde mit Cellulosepulver an Stelle des obigen vernetzten Dextrans wiederholt. Die Ausbeute betrug 0,35 g Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 261 E/g.

e) Dreidimensional vernetztes Dextran (0,5 g) wurde zu 20 ml Wasser gegeben und bei Raumtemperatur 3 Tage stehengelassen. Danach wurde das Gemisch gekühlt, und eine kalte Lösung von Bromcyan (1 g) in Äther (15 ml) wurde unter Rühren zugesetzt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 11,5 bis 12 gehalten. Nach Aufhören der Reaktion wurde das Gemisch filtriert und das feuchte Polymer mit Eiswasser und schließlich mit einer eiskalten 0,1 M Boraxlösung gewaschen. Das noch feuchte Polymermaterial wurde zu einer Lösung von Penicillinacylare (10 ml, Aktivität 4000 E/ml) zugesetzt, danach wurden 380 mg festes Borax zugegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 4 bis 5°C gerührt. Danach wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Die Ausbeute betrug 4,9 g feuchtes Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 3750 E/g.

G. Herstellung der 6-Aminopenicillansäure

Eine gemäß Fa) erhaltene an Polymermaterial gebundene Penicillinacylase (31 g, Aktivität 679 E/g) wurde in Wasser (600 ml) suspendiert, danach wurde Borsäure (2,2 g) und schließlich Benzylpenicillinkaliumsalz (21 g) in Wasser (100 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 35°C gerührt und der pH-Wert durch Zugabe von 0,5 η Natronlauge konstant auf 7,0 gehalten. Nach 3 Stunden wurde das Reaktionsgemisch, das 11,7 g 6-Aminopenicillansäure (96%) enthielt, filtriert, und die Lösung wurde mit einem halben Volumenteil Methylisobutylketon bei pH 3 unter Zugabe von 5 η Salzsäure extrahiert, um unumgesetztes Benzylpenicillin und während der Reaktion abgespaltene Phenylessigsäure zu entfernen. Die Wasserlösung wurde abgetrennt, durch Zugabe von Natriumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 120 ml konzentriert.

Die Lösung wurde auf 5° C gekühlt und unter Rühren durch Zugabe von 5 η Salzsäure auf pH 4,3 angesäuert, um kristalline 6-Aminopenicillansäure auszufällen. Nach 1 Stunde wurden die Kristalle abfiltriert, mit kaltem Wasser und anschließend mit trockenem Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 10,6 g 6-Aminopenicillansäure mit 99%iger Reinheit (Gesamtäüsbcüic 86%) erhalten wurden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch Züchtung eines Penicillinamidase bildenden Stammes von Escherichia coli, Extraktion der dabei gebildeten Penicillinacylase aus dem Zellmaterial und anschließende Behandlung von Benzylpenicillin mit der zellfreien Penicillinacylase, dadurch gekennzeichnet, daßmanvonder Extraktion in einer selbstreinigenden Zentrifugentrennvorrichtung, die bei einer Temperatur zwischen 0 bis 50⁰C arbeitet und in der das abgetrennte Zellmaterial intermittierend innerhalb von 0,05 bis 1,0 Sekunden durch einen ringsumlaufenden Schlitz mit einer Breite von 0,1 bis 1,5 mm durch Aufbringung eines Druckes von 34 bis 136 at ausgestoßen wird, gleichzeitig die Fermentationsflüssigkeit entfernt und das Zellmaterial ausstößt, daß man das ausgestoßene Zellmaterial unter Lösen des Enzyms 0,10 bis 5,0 Stunden in Wasser von 10 bis 50°C oder in Wasser unter Zugabe eines organischen Lösungsmittels oder in Wasser unter Zugabe eines organischen Lösungsmittels sowie einer Base oder in Wasser unter Zugabe einer Base rührt und daß man die extrahierte Penicillinacylase in an sich bekannter Weise mit einem mit Bromcyan behandelten Polysaccharid umsetzt.

Es ist bekannt, daß bestimmte Bakterien und Pilze Enzyme produzieren, die die Amidbildung in der 6-Stellung von Penicillinen hydrolysieren und allgemein als Penicillinacylasen oder -amidasen bezeichnet werden (siehe Bacteriological Reviews, 30,1966, S. 761). Bei der großtechnischen Produktion von 6-Aminopenicillansäure werden derzeit gewöhnlich Zellsiispensionen von Escherichia coli, die eine Acylase oder Amidase enthalten, verwendet. Da das Enzym aber weitgehend intracellulär vorliegt, muß das Penicillin notwendigerweise zuerst in die Zellkörper eindringen, um mit dem Enzym zu reagieren, v/as zu einer langsameren Reaktion führt. Der Zellstamm kann auch andere Enzyme enthalten, die das Penicillin oder die gebildete 6-Aminopenicillansäure durch Aufspaltung der /?-Lactambindung inaktivieren oder die die Zellkultur mit den Oganismen, die solche Enzyme bilden, verunreinigen. Außerdem ist das Verfahren mit verfahrenstechnischen Nachteilen und Ausbeuteverlusten durch Adsorption an Zellmaterial verbunden, und unter Verwendung ganzer Zellen erhaltene 6-Aminopenicillansäure kann proteinhaltige Verunreinigungen enthalten, die in der Lage sind, gefährliche Allergien bei Menschen und Tieren hervorzurufen.

Alle diese Nachteile werden vermieden, wenn man ein zelifreies oder gereinigtes Enzympräparat verwendet. In der Literatur finden sich verschiedene Methoden, die gereinigte Enzympräparate aus Escherichia coli-Stämmen herzustellen versuchten. Gemäß »Hindustan Antibiotics Bull.«, 4 (1961), Seiten 48 und 152 wurden in einem Phosphatpuffer suspendierte Zellen mit Ultraschallwellen behandelt, wobei eine 25fache Reinigung durch fraktionierte Ausfällung und mit einer Chromatographiersäule erreicht wurde. Gemäß »Nature«, 201 (1964), S. 824, wird ein Enzympräparat geringer Reinheit durch Gefriertrocknung und Dialyse der filtrierten Kulturbrühe erhalten. Gemäß »Acta Microb. Acad. Scient Hung.«, 12 (1962), S. 395 erhielt man eine 40iache Reinigung eines E coli-Enzyms durch Ammoniumsulfatausfällung und nachfolgende Calciumphosphatgeladsorption und Diäthylaminoäthylcellulose-Chromatographie eines Phosphatpufferextraktes von E coli-Zellen, die mit Ultraschallwellen behandelt waren.

Nach der JP-PS 26 050/64 erhält man eine mäßige Ausbeute an gereinigtem Enzympräparat von E coli

i» durch Extrahieren der Zellen mit Boratpuffer über längere Zeitdauer oder über kürzere Zeit in Kombination mit Ultraschallwellenbehandlung. Aus dem Extrakt konnte das Enzym in fester Form nach Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse und Gefriertrocknung erhal-

■ ■ ten werden.

Nach der US-PS 32 97 546 bekommt man eine Lösung eines Enzyms aus E coli durch Behandlung der Zellkultur mit einer Verbindung wie Ca(NC>3)2 und quaternären Ammoniumverbindungen, Abfiltrieren der

' > Zellen und Suspendieren derselben in Wasser während einiger Stunden sowie anschließende Entfernung der Zellen durch Filtration mit nachfolgender Behandlung des Filtrates mit Aktivkohle.

Es ist außerdem bekannt, daß in Bakterienzellen enthaltene Enzyme beim Extrudieren von Zellsuspensionen unter hohem Druck durch ein enges Mundstück freigegeben werden. Gemäß »Appl. Microbiol.«, 11 (1964), S. 467, wo Untersuchungen mit anderen Enzymtypen als Penicillanamida;,en beschrieben sind,

■! muß Hochdruck über 1000 at angewendet werden, um eine maximale Freigabe des Enzyms zu erreichen. Bei solchen Drücken jedoch wurden auch die Zellwände zerstört und große Mengen des Zellmaterials in Lösung gebracht. In »Nature«, 167 (1951), S. 33, ist beschrieben, daß E coli-Zellen in kleinem Maßstab zersprengt werden konnten, wenn sie aus einer Bombe durch einen Gasdruck von 34 bis 61 at ausgetrieben wurden.

Aus der DE-AS 1111 778 ist es weiterhin bekannt, aus Escherichia coli gewonnene zellfreie Penicillinacylase

'· mit Benzylpenicillin unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure umzusetzen. Diese aber besitzt ebenso wie aus ihr bereitete Penicilline unerwünscht hohe Antikörperwerte.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe be-

:' stand somit darin, 6-Aminopenicillansäure mit möglichst geringen Mengen Allergene erzeugender Verunreinigungen und möglichst niedrigen Antikörperwerten zu bekommen, um aus ihr so ohne zusätzliche Reinigung hyperallergenische Penicilline erzeugen zu können.

•υ Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch Züchtung eines Penicillinamidase bildenden Stammes von Escherichia coli, Extraktion der dabei gebildeten Penicillinacylase aus dem Zellmaterial und anschließende Behandlung

>·. von Benzylpenicillin mit der zellfreien Penicillinacylase ist dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Extraktion in einer selbstreinigenden Zentrifugentrennvorrichtung, die bei einer Temperatur zwischen 0 bis 50⁰C arbeitet und in der das abgetrennte Zellmaterial intermittierend

.•ι innerhalb von 0,05 bis 1,0 Sekunden durch einen ringsumlaufenden Schlitz mit einer Breite von 0,1 bis 1,5 mm durch Aufbringung eines Druckes von 34 bis 136 at ausgestoßen wird, gleichzeitig die Fermentationsflüssigkeit entfernt und das Zellmaterial ausstößt, daß man das

. ausgestoßene Zellmaterial unter Lösen des Enzyms 0,10 bis 5,0 Stunden in Wasser von 10 bis 50°C oder in Wasser unter Zugabe eines organischen Lösungsmittels oder in Wasser unter Zugabe eines organischen