DE1966428B2 - Verfahren zur herstellung von wasserunloeslicher penicillinacylase - Google Patents
Verfahren zur herstellung von wasserunloeslicher penicillinacylaseInfo
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Description
werden, uni eine maximale Freigabe des Enzyms zu Eine Reinigung des Enzyms kann man nach dem
erreichen. Bei solchen Drucken jedoch wurden auch Rühren des Zellmaterials auch durch Ansäuern der
die Zellwände zerstört und große Mengen des Zeil- wäßrigen Enzym-Lösung auf pH 3,0 bis 6,0, beispielsmaterials
in Losung gebracht. In »Nature«, 167 weise auf 4,0 bis 5,0, Entfernung des ausgefällten in-(1951),
Seite 33 ist beschrieben, daß E. coli-Zellen 5 aktiven Materials durch Filtration und erneute Einin
kleinem Maßstab zersprengt werden konnten, wenn stellung auf den ursprünglichen pH-Wert erreichen,
sie aus einer Bombe durch einen Gasdruck von 34 Die PeniciUinacylase, die in den oben beschriebebis
61 at ausgetrieben wurden. nen zollfreien und gegebenenfalls teilweise gereinig-
DSe der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe be- ten wäßrigen Lösungen enthalten ist, kann auch dastand
nun dann, wasserunlösliche PenicilHnacylase io durch gereinigt werden, daß man die Enzymlösung
herzustellen, die beispielsweise in Säulen für die kon- bei einem pH 4 bis 6, zweckmäßigerweise bei pH 4,5
tinuierliche Herstellung von 6-Aminopenicillansäure bis 5,5, mit Tannin bis zu einer Endkonzentration von
verwendet werden kann. 300 bis 900 ppm in Gegenwart eines chelatbildenden
Das ernndungsgemaße Verfahren zur Herstellung Mittels, wie Äthylendiamintetraessigsäure, das mit
von wasserunlöslicher PeniciUinacylase, wobei man 15 Eisenionen Komplexe bildet, behandelt. Der geeinen
Penirilhnacylase bildenden Stamm von E. coli bildete Enzym-Tanninkomplex kann in üblicher
fermentiert, ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Weise, wie beispielsweise durch Filtration oder Zeneiner
selbstreinigenden Zentrifugen-Trennvorrich- trifugieren, isoliert werden. Er kann gewaschen und
tung, die bei einer Temperatur zwischen 0 bis 50° C, getrocknet und von Wasser befreit werden, wie beivorzugsweise
bei 15 bis 40° C, arbeitet, und in der »o spielsweise durch Trocknen, besonders durch Bedas
abgetrennte Zellmaterial intermittierend inner- handlung mit organischen Lösungsmitteln, die mit
halb von 0,05 bis 1,0 Sekunden, vorzugsweise inner- Wasser mischbar sind, wie Aceton,
halb von 0,1 bis 0,5 Sekunden, durch einen ringsum- Die in dem Tannin-Niederschlag enthaltene Peni-
halb von 0,1 bis 0,5 Sekunden, durch einen ringsum- Die in dem Tannin-Niederschlag enthaltene Peni-
laufenden Schlitz mit einer Breite von 0,1 bis 1,5 mm, cillinacylase kann durch Auflösen des Komplexes in
vorzugsweise 0,3 bis 0,7 mm, durch Aufbringungeines »5 Wasser bei pH 7 bis 9, beispielsweise 7,5 bis 8,5, in
Druckes von 34 bis 136 at, vorzugsweise 61 bis 75 wäßrige Lösung gebracht werden. Wechselweise kann
at, ausgestoßen wird, gleichzeitig die Fermentations- der Komplex auch mit einem Gemisch von Wasser
flüssigkeit entfernt und das Zellmaterial ausstößt, daß und n-Butanol, bei pH 4 bis 7, beispielsweise 4,5 bis
man das ausgestoßene Zellmaterial unter Lösen des 5,5, behandelt werden. Eine dritte Methode zur AufEnzyms 0,10 bis 5,0 Stunden in Wasser von 10 bis 30 trennung des Tanninkomplexes besteht in der Be-50°
C oder in Wasser unter Zugabe eines organischen handlung des in Wasser suspendierten Enzym-Tan-Lösungsmittels
oder in Wasser unter Zugabe eines or- ninkumplexes mit einem anionischen Ionenaustauganischen
Lösungsmittels sowie einer Base oder in scher, wie Diäthylaminoäthyl-Cellulose, welcher das
Wasser unter Zugabe einer Base rührt, daß man die Tannin bindet und das Enzym an das Wasser abgibt,
so erhaltene Enzymlösung von zurückgebliebenem 35 Die für diese Methoden notwendigen Wassermengen
Zellmaterial und anderen festen Verunreinigungen sind wesentlich kleiner als jene in den ursprünglichen
nach üblichen Verfahren befreit und daß man das so Enzymlösungen, und auf diese Weise erreicht man
gereinigte Enzym mit einem aktivierten Polymerma- eine beachtliche Konzentrierung der enzymatischen
terial umsetzt. Aktivität.
Das ausgestoßene Zellmaterial wird bei 10 bis 40 Weiterhin kann die in irgendeiner oben beschriebe-50°
C, vorzugsweise bei 20 bis 40° C, während 0,10 nen Lösung enthaltene Penicillinacylase mit Hilfe eibis
5,0 Stunden, zweckmäßigerweise während 0,25 bis nes Ionenaustauschers konzentriert und weitergerei-3,0
Stunden oder während 0,25 bis 1,0 Stunden, mit nigt werden. Hierzu wird das Enzym auf einem
einem wirksamen Rührer gerührt, um das Enzym zu kationischen Ionenaustauscher mit einer offenen
lösen, wobei gegebenenfalls in einer Konzentration 45 Struktur durch Überleiten der auf pH 3,5 bis 6, beivonl
,0 bis 5,0% ein mit Wasser unmischbares organi- spielsweise 4,0 bis 5,0, eingestellten Lösung des Ensches
Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, Butyl- zyms durch eine Säule adsorbiert,
acetat, Isobutylacetat, Amylacetat, Benzol, Toluol Wechselweise kann auch der Austauscher zu der
acetat, Isobutylacetat, Amylacetat, Benzol, Toluol Wechselweise kann auch der Austauscher zu der
oder Chloroform, zugesetzt wild. Um die Extraktion gerührten Enzymlösung zugegeben werden. Die Acydes
Enzyms aus dem ausgestoßenen Zellinaterial zu 50 läse wird danach aus dem Ionenaustauscher durch
erleichtern, kann zu dem Gemisch eine organische Eluieren bei pH 6,0 bis 8,0 mit schwachen Pufferlö-Base,
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder sungen, wie 0,2 M Ammoniumacetat oder Trishydro-Ammoniak,
oder eine tertiäre organische Base, wie xyammoniumacetat, freigesetzt.
Triethylamin oder N-Äthylpiperidin, zugesetzt wer- Um reinere Präparate des Enzyms zu erhalten,
Triethylamin oder N-Äthylpiperidin, zugesetzt wer- Um reinere Präparate des Enzyms zu erhalten,
den, um den pH-Wert zwischen 6,5 und 9,0, beispiels- 55 können anorganische Ionen und niedermolekulare
weise zwischen 7,0 und 8,5, einzustellen und zu halten. Verunreinigungen aus den Enzymlösungen selbstver-
Die so erhaltene Enzymlösung wird, gegebenenfalls ständlich durch Dialysieren gegen Wasser entfernt
nach Verdünnung mit Wasser, von zurückgebliebe- werden. Stattdessen können die Lösungen, wenn nötig
nem Zellmaterial und anderen festen Verunreinigun- nach Konzentrierung durch Verdampfen bei einer
gen nach üblichen Verfahren, wie Filtration und/oder 60 Temperatur unterhalb 50° C auf eine geeignete Kon-Zentrifugieren,
und möglicherweise unter Zusatz von zentration von 25 bis 100 mg Trockengewicht je Millientfärbenden
Mitteln, klärenden Mitteln und Filter- liter, der Gelfiltration unterzogen werden,
hilfsmitteln, wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Cellu- Die so erhaltenen gereinigten Enzympräparate
hilfsmitteln, wie Aktivkohle, Aluminiumoxid, Cellu- Die so erhaltenen gereinigten Enzympräparate
losepulver, Diatomeenerde oder anderen festen, werden mit einem aktivierten Polymermaterial, wie
schwach adsorbierenden Mitteln, befreit. Eiine weitere 65 beispielsweise mit Bromcyan behandelten Polysac-Methode
ist die, das meiste Zellmaterial durch Zentri- chariden, umgesetzt, um ein trägergebundenes Enzym
f ugieren zu entfernen und die darüberstehende Flüs- zu ergeben. Das Enzym kann in dieser Form mit einf asiokeit
zu filtrieren. chen Mitteln, wie beispielsweise durch Filtration, aus
der Reaktionslösung gewonnen werden. Die trägergebundenen Enzyme können auch in Säulen für die
kontinuierliche Herstellung von 6-Aminopenicillansäure benutzt werden.
Es wurde auch gefunden, daß mit erlindungsgemäß hergestellter trägergebundener Pc.iicillinacylase gewonnene
6-Aminopenicillansäure sehr wenig, wenn überhaupt, proteinhaltige Verunreinigungen mit Allergie
erzeugenden Eigenschaften enthält. Dies ist von großer technischer Wichtigkeit, da es so möglich ist,
Penicilline mit hypoallergenischen Eigenschaften direkt aus solchermaßen hergestellter 6-Aminopenicillansäure
ohne zusätzliche Reinigungsverfahren zu gewinnen.
Die trägergebundene Penicillinacylase kann auch X5
zur Entfernung der Seitenkette von Penicillinestern, besonders von Estern von Benzylpenicillin verwendet
werden. Außerdem wurde gefunden, daß die trägergebundenen Enzyme besser als die bisher benutzten
Zellsuspensionen bei der enzymatischen Synthese von ao
Penicillinen aus 6-Aminopenicillansäure und Vorläufern mit Seitenketten sind.
Beispiele
A) Fermentierung von Escherichia coli
A) Fermentierung von Escherichia coli
Maiseinweichflüssigkeit (3 kg), Sojabohnenöl (135 ml), Paraffin (12 ml) und Cetanol (3 ml) in Wasser
(150 1) wurden auf pH 6,0 mit 45%iger Natronlauge (165 ml) eingestellt und dann bei 124° C 30 Minuten
m einem Fermentatiortsbehälter sterilisiert. Die Lösung wurde mit 100 ml einer 20 bis 24 Stunden
fermentierten Kultur von E. coli geimpft und bei 250C unter Belüftung und Rühren 18 Stunden inkubiert.
Maiseinweichflüssigkeit (300 kg), Sojabohnenöl (13,8 kg), Paraffin (1,22 kg), Cetanol (0,3 kg), Phenylessigsäure
(21 kg) und Natriumchlorid (112 kg) in Wasser (14 0001) wurden mit 45 %iger Natronlauge
(40 kg) auf pH 6,6 eingestellt, und die Lösung wurde in einem Fermentationsbehälter bei 124° C 30 Minuten
sterilisiert. Die Lösung wurde gekühlt und mit der oben gewonnenen Kultur geimpft und anschließend
bei 25° C unter Rühren und Belüftung inkubiert. 24 Stunden nach der Impfung, nachdem der pH-Wert auf
8,2 angestiegen war, wurden die Bakterienzellen durch Zugabe von 180 1 Butylacetat abgetötet, und
das Gemisch wurde anschließend gekühlt.
B) Reinigung der Penicillinacylase-Lösung
a) Zur Isolierung des Zellmaterials wurde das Gemisch in einer selbstreinigenden Zentrifugentrennvorrichtung,
wie sie in der Erfindungsdefinition angegeben ist, getrennt. Die ausgestoßene Bakterienzellenpaste wurde in 100 bis 120 kg-Anteilen
gesammelt. Zu jedem Anteil wurden 3,0% Methylisobutylketon zugesetzt, und das Gemisch wurde dann mit Hilfe eines Rührers 25
Minuten homogenisiert. Die Gesamtausbeute an Zellmaterial betrug 325 kg.
Analyse des Enzmys in den verschiedenen Produktionsstufen ergab die folgenden Werte in Acylase-Einheiten, die entscheidend für die während der betreffenden Stufe zurückbleibende Enzymmenge sind (eine Acylase-Einheit entspricht der Enzymmenge, die in der Lage ist, in 1,5 Stunden bei pH 8,5 und 37° C eine Menge an Benzylpenicillin aufzuspalten, die 1 mg 6-Aminopenicillansäure äquivalent ist):
Analyse des Enzmys in den verschiedenen Produktionsstufen ergab die folgenden Werte in Acylase-Einheiten, die entscheidend für die während der betreffenden Stufe zurückbleibende Enzymmenge sind (eine Acylase-Einheit entspricht der Enzymmenge, die in der Lage ist, in 1,5 Stunden bei pH 8,5 und 37° C eine Menge an Benzylpenicillin aufzuspalten, die 1 mg 6-Aminopenicillansäure äquivalent ist):
Fermentationskultur 5 E/ml
darüberstehende Flüssigkeit 0,33 E/ml
flüssiger Auslauf der Zentrifugentrennvorrichtung 0,28 E/ml
Bakterienzellmaterial 212 E/g
darüberstehende Flüssigkeit in der Paste vor der Homogenisierung 75 E/g
darüberstehende Flüssigkeit in der Paste nach der Homogenisierung 123 E/g
b) Homogenisierte Bakterienpaste (175 kg, Aktivität 190 E/g) wurde mit 175 kg Wasser verdünnt,
und unter Rühren des Gemisches wurde ein Gemisch von Filterhilfsmitteln (55,6 kg) zugesetzt.
Die Wasserphase wurde durch Filtration abgetrennt, und der Filterkuchen wurde mit 50 ml
Wasser gewaschen. Die vereinigten Lösungen (290 kg) besaßen eine Aktivität von 48 E/g.
c) Bakterienpaste (1 kg, Aktivität 212 E/g) wurde mit Wasser (2,0 1) verdünnt, mit Hilfe von 0,5
η Natronlauge (220 ml) auf pH 8,5 eingestellt und dann 30 Minuten bei 20° C gerührt. Das
Gemisch wurde 30 Minuten bei 0° C zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen,
durch Filtration geklärt und ergab 2,7 kg Lösung mit einer Aktivität von 50 E/g. Erneutes
zweimaliges Suspendieren des Sedimentes in Wasser (11) während 5 Minuten bei pH
8,5 und nachfolgendes Zentrifugieren ergab eine zusätzliche Enzymlösung (2 kg, Aktivität 11 E/
g). Dies entspricht einer gesamten Aktivitätsausbeute von 74% wasserlöslicher Acylase.
d) Klare Acylase (1 kg, Aktivität 52 E/ml), die gemäß c) erhalten worden war, wurde 8 Stunden
gegen strömendes Leitungswasser dialysiert. Die dialysierte Lösung ergab 20,5 g Acylase mit einer
Aktivität von 2400 E/g (angegebene als Aktivität der festen Acylase nach Lyophilisierung).
e) Klare Acylaselösung (245 kg. Aktivität 48 E/g), die gemäß c) erhalten worden war, wurde gerührt
und mit Hilfe von 9 M Essigsäure (2,2 kg) gemäß Anspruch 3 auf pH 4,5 eingestellt. Das Rühren
wurde 1 Stunde fortgesetzt, und danch wurde das Gemisch filtriert und die klare Lösung mit 7 M
Ammoniak (4,5 kg) unter Bewegen auf pH 8,0 eingestellt. Nach 1 Stunde wurde das Gemisch
filtriert und die Lösung mit Hilfe von 9 M Essigsäure (2,0 kg) auf pH 5 eingestellt.Die Aktivitält
der Lösung (220 kg) betrug 47,5 E/g.
f) Gemäß c) erhaltene Acylaselösung (500 g, Aktivität 52 E/g) wurde gemäß Anspruch 3 auf pH
4 eingestellt und 15 Minuten bei 0° C gerührt, um Proteinverunreinigungen auszufällen. Nach
dem Zentrifugieren und Einstellen auf pH 7,5 wurde die erhaltene klare Lösung (500 g, Aktivität
40 E/g) gegen Leitungswasser über Nacht dialysiert. Das gefriergetrocknete Produkt ergab
4 g mit einerAktivität von 4900 E/g.
C) Reinigung der Acylase mit Tannin
Gemäß Be) gewonnene Acylaselösung (185 kg, Aktivität 47,5 E/g) wurde gerührt und gemäß Anspruch
4 mit Äthylendiamintetraessigsäure (50 g) und anschließend mit einer Tanninlösung (166 g) und Natriumsulfit
(55 g) in Wasser (5,5 1) behandelt. Nach einstündigem Rühren wurde Kieselgur-Filterhilfsmiittel
(1,5 kg) und Natriumsulfit (700 g) zugesetzt und
die Suspension filtriert, wobei man 3950 g feuchten festen Tanninacylaseniederschlag mit einer Aktivität
von 1930 E/g erhielt.
a) Wie oben hergestellter feuchter Tanninacylaseniederschlag (3750 g, Aktivität 1930 E/g) wurde
in 0,1 molarem Ammoniumacetat mit pH 5,0 (5,0 1) und Butanol (2,5 1) suspendiert. Natriumsulfit
(50 g) wurde zugesetzt, und der pH-Wert wurde mit Hilfe von Essigsäure auf 5,0 eingestellt.
Das Rühren wurde 20 Minuten fortgesetzt und das Gemisch filtriert. Die Wasserphase
(6650 ml, Aktivität 800 E/ml) wurde abgetrennt.
b) Der wie oben hergestellte Tanninacylaseniederschlag wurde filtriert und gemäß Anspruch 4 unter
Rühren in 0,1 M Ammoniumacetatpuffer mit pH 8,0 (100 ml) suspendiert. Das Rühren wurde
1 Stunde fortgesetzt, und der pH-Wert wurde auf 8,0 eingestellt. Das Gemisch wurde filtriert
und ergab 100 ml Acylai,c!ösung mit 220 E/ml.
c) In Pufferlösung mit pH 8 (100 ml) suspendierter wie oben hergestellter feuchter Tanninacylaseniederschlag
wurde gemäß Anspruch 4 mit 2-Diäthylaminoäthylcellulose (2 g, Kapazität 1,0
M Äquivalent/g) behandelt. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und filtriert und ergab eine
Acylasclösung (90 ml) mit 494 E/ml.
D) Reinigung der Acyiase mit Ionenaustauschern
a) Die gemäß Bb) erhaltene Acylaselösung (5000 ml, Aktivität 48 E/ml) wurde mit Hilfe von 9
M Essigsäure auf pH 4,6 eingestellt. Nach Stehen über Nacht in der Kälte wurde das Gemisch filtriert
und die klare Lösung gemäß Anspruch 5 durch eine Ionenaustauschersäule geschickt
(durch Vernetzung von Dextran erhaltenes Polysaccharid mit Sulfoäthylgruppen, Säulendurchmesser
8 cm, Säulenlänge 15 cm in 0,1 M Ammoniumacetat, pH 4,6). Die Säule wurde mit
dem Ammoniumacetatpuffer von pH 4,6 (650 ml) gewaschen. Die Acyiase wurde mit 0,2 M
Ammoniumacetatpuffer von pH 8,0 eluiert. Die erhaltenen 640 ml besaßen eine Aktivität von
326 E/ml.
b) Eine gemäß Ca) erhaltene gereinigte Acylasclösung (5550 ml, Aktivität 800 E/ml) wurde auf
pH 4,6 eingestellt und in gleicher Weise wie unter a) behandelt. Man erhielt 2350 ml mit einer Aktivität
von 1610 E/ml.
e) Die unter b) gereinigte Acylaselösung (230 ml, Aktivität 1610 E/ml) wurde durch Eindampfen
im Vakuum auf ein Volumen von 24 ml konzentriert. 15 ml des Konzentrates mit einer Aktivität
von 15000 B/ml wurden gemäß Anspruchs
durch eine Ionenaustauschersäule (Durchmesser 2,5 cm, Länge 100 cm) geschickt. Die Acyiase
wurde mit entionisiertem Wasser eluiert Man erhielt die Acyiase in 108 ml, Aktivität 1710 E/
ml. Gefriertrocknung dieser Lösung ergab 1 ,H g mit einer Aktivität von 92 500 E/g.
d) Eine gemilß Bb) erhaltene Lösung (100 ml)
wurde Dialyse gegen destilliertes Wasser während 1 Stunde teilweise entsalzt und sodann mit
Carboxymethylcellulose in der H ^-Forrn (kleine Ionenkapazität, 1 mÄqu/g, etwa 40 mg/m!) gemaß
Anspruch 5 behandelt. Der pH-Wert wurde auf 4,0 bis 4,5 eingestellt. Der Ionenaustauscher
wurde abgetrennt und die adsorbierte Acyiase durch Erhöhung des pH-Wertes auf etwa 6 und
Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von Phosphatpuffer eluiert.
E) Reinigung der Acyiase durch Gelfiltration
Gemäß Ca) erhaltene Acylaselösung (150 g, Aktivität 166 E/g) wurde durch Eindampfen im Vakuum
'5 auf ein Volumen von 9 mm konzentriert, einer Gelfiltration
auf Dextrau-Ionenaustauscher in einer Säule von 3 X 80 cm zugeführt und mit entionisiertem Wasser
eluiert. Die Aktivität (21200 E) wurde in 80 ml erhalten, die 15,2% des zugeführten Materials enthielten,
wie auf der Grundlage der Adsorption bei 28(1 ΐημ bestimmt wurde.
F) Bindung der Acyiase an Polymermaterialien
a) Eine Agaroselösung (4%ig, 2,5 ml) wurde filtriert,
und der isolierte feuchte Feststoff wurde 1 Minute bei pH 11,5 bis 12,0 in einer eiskalter
wäßrigen Bromcyanlösung (5%ig, 2 ml) gerührt, Das feste Gel wurde durch Filtration gewonnen
und auf dem Filter gut mit Eiswasser und eiskalter !,Omolarer Boraxlösung gewaschen Das Gel
wurde dann in 0,1 M Borax (4 ml) suspendier! und mit E. coli-Acyiase (Aktivität 159000 E/g:
0,106 g), erhalten gemäß Dd), 24 Stunden bei + 40C gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und
das gewonnene feste Material sorgfältig auf dem Filter mit Wasser gewaschen und ergab 1,2 g festes
Polymer mit einer spezifischen Aktivität vor 679 E/g.
b) 25 dreidimensional vernetztes Dextran (0,K)Og]
wurde 8 Minuten bei pH 11,5 bis 12 mit einei
eiskalten wäßrigen Lösung von Bromcyai (5%ig, 2 ml) gerührt und filtriert. Das gewonnene
Gel wurde gut mit Eiswasser und ciskaltei 0,1 M Boraxlösung (4 ml) gewaschen. GcmäL
Dc) erhaltene E. coli-Acyiase (Aktivität 159(HM
E/g, 0,106 g) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei +4° C gerührt. Danr
wurde das Gemisch auf pH 7,5 eingestellt unc filtriert. Das feste Material wurde auf dem Filtei
mit Wasser gut gewaschen und ergab 0,3 g Polymer mit einer spezifischen Aktivität von 212 E/g
c) Das Experiment b) wurde mit dreidimenslona vernetztem Dextran mit Diäthylamlnoäthyl
gruppen (0,1 g) anstelle des obigen vernetztet
Dextrans wiederholt. Die Ausbeute betrug 1,25 {
feuchtes Polymer mit einer spezifischen Aktivltä von 435 B/g.
d) Das Experiment b) wurde mit Cellulosepulvei
anstelle des obigen vernetzten Dextrans wieder
β» holt. Die Ausbeute betrug 0,35 g Polymer mi
einer spezifischen Aktivität von 261 E/g.
709 529/485
"5
936
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslicher Penicillinacylase, wobei man einen Penicillinacylase
bildenden Stamm von Escherichia coli fermentiert, dadurch gekennzeichnet, daß
man in einer selbstreinigenden Zentrifugen-Trennvorrichtung, die bei einer Temperatur zwischen
0 bis 50° C, vorzugsweise bei 15 bis 40° C, arbeitet, und in der das abgetrennte Zellmaterial
intermittierend innerhalb von 0,05 bis 1,0 Sekunden, vorzugsweise innerhalb von 0,1 bis 0,5 Sekunden,
durch einen ringsumlaufenden Schlitz mit einer Breite von 0,1 bis 1,5 mm, vorzugsweise 0,3 X5
bis 0,7 mm, durch Aufbringung eines Druckes von 34 bis 136 Atmosphären, vorzugsweise 61 bis 75
Atmosphären, ausgestoßen wird, gleichzeitig die Fermentationsflüssigkeit entfernt und das Zellmaterial
ausstößt, daß man das ausgestoßene Zeil- ao
material unter Lösen des Enzyms 0,10 bis 5,0 Stunden in Wasser von 10 bis 50° C oder in Wasser
unter Zugabe eines organischen Lösungsmittels oder in Wasser unter Zugabe eines organischen
Lösungsmittels sowie einer Base oder in a5
Wasser unter Zugabe einer Base rührt, daß man die so erhaltene Enzymlösung von zurückgebliebenem
Zellmaterial und anderen festen Verunreinigungen nach üblichen Verfahren befreit und daß
man das so gereinigte Enzym mit einem aktivierten Polymermaterial umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als akiiviertes Polymermaterial
ein mit Bromzyan behandeltes Polysaccharid verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicillinacylase in
der Weise reinigt, daß man die wäßrige Penicillinacylaselösung nach dem Rühren des Zellmaterials
in Wasser auf pH 3,0 bis 6,0 ansäuert, sodann das Zellmaterial abfiltriert und schließlich den pH-Wert
des Filtrates wieder auf seinen ursprünglichen Wert einstellt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicillinacylase in
der Weise reinigt, daß man die extrahierte Penicillinacylase bei pH 4 bis 6 mit Tannin in Gegenwart
eines chelptbildenden, mit Eisenionen Komplexe bildenden Mittels ausfällt, den Enzym-Tanninkomplex durch Filtration oder Zentrifugieren iso-
liert und sodann unter Freisetzung der Penicillinacylase in Wasser bei pH 7 bis 9 oder in einem
Gemisch von Wasser und n-Butanol bei pH 4 bis 7 auflöst oder die Penicillinacylase durch Behandlung
des in Wasser suspendierten Enzym-Tanninkomplexes mit Diäthylaminoäthylcellulose, die
das Tannin bindet, freisetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicillinacylase in
der Weise reinigt, daß man eine auf pH 3,5 bis 6 eingestellte Lösung des Enzyms durch eine Säule
eines kationischen Ionentaustauschers mit einer offenen Struktur schickt oder den Ionenaustauscher
zu der gerührten Enzymlösung zusetzt und danach die Penicillinacylase aus dem Ionenaustauscher
bei pH 6,0 bis 8,0 mit schwachen Pufferlösungen eluiert.
Es ist bekannt, daß bestimmte Bakterien und Pilze Enzyme produzieren, die die Amidbindung in der 6-Stellung
von Penicillinen hydrolysieren und allgemein als Penicillinacylasen oder -amidasen bezeichnet werden
(siehe Bacteriological Reviews, 30, 1966, Seite 761). Bei der großtechnischen Produktion von 6-Aminopenicillansäure
werden derzeit gewöhnlich Zellsuspensionen von Escherichia coli, die eine Acylase
oder Amidase enthalten, verwendet. Da das Enzym aber weitgehend intracellulär vorliegt, muß das
Penicillin notwendigerweise zuerst in die Zellkörper eindringen, um mit dem Enzym zu reagieren, was zn
einer langsameren Reaktion führt. Der Zellstamm kann auch andere Enzyme enthalten, die das Penicillin
oder die gebildete 6-Aminopenicillansäure durch Aufspaltung der /3-Lactambindung inaktivieren oder
die die Zellkultur mit den Organismen, die solche Enzyme bilden, verunreinigen. Außerdem ist das Verfahren
mit verfahrenstechnischen Nachteilen und Ausbeuteverlusten durch Adsorption an Zellmaterial
verbunden, und unter Verwendung ganzer Zellen erhaltene 6-Aminopenicillansäure kann proteinhaltige
Verunreinigungen enthalten, die in der Lage sind, gefährliche Allergien bei Menschen und Tieren hervorzurufen.
Alle diese Nachteile werden vermieden, wenn man ein zellfreies oder gereinigtes Enzympräparat verwendet.
In der Literatur finden sich verschiedene Methoden, die gereinigte Enzympräparate aus Escherichia
coli-Stämmen herzustellen versuchten. Gemäß »Hindustan Antibiotics Bull.«, 4 (1961), Seiten 48,
152 wurden in einem Phosphatpuffer suspendierte Zellen mit Ultraschallwellen behandelt, wobei eine
25fache Reinigung durch fraktionierte Ausfällung und mit einer Chromatographiersäule erreicht wurde. Gemäß
»Nature«, 201 (1964), Seite 824 wird ein Enzympräparat geringer Reinheit durch Gefriertrocknung
und Dialyse der filtrierten K alturbrühe erhalten.
Gemäß »Acta Microb. Acad. Scient. Hung.«, 12 (1966), Seite 395 erhielt man eine 40fache Reinigung
eines E. coli-Enzyms durch Ammoniumsulfatausfällung und nachfolgende Calciumphosphatgeladsorption
und Diäthylaminoäthyl-Cellulose-Chromatographie eines Phosphatpufferextraktes von E. coli-Zellen,
die mit Ultraschallwellen behandelt waren.
Nach der JA-PS 26050/64 erhält man eine mäßige
Ausbeute an gereinigtem Enzympräparat von E. coli durch Extrahieren der Zellen mit Boratpuffer über
längere Zeitdauer oder über kürzere Zeit in Kombination mit Ultraschallwellenbehandlung. Aus dem
Extrakt konnte das Enzym in fester Form nach Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse und Gefriertrocknung
erhalten werden.
Nach der US-PS 3 297 546 bekommt man eine Lösung eines Enzyms aus E. coli durch Behandlung der
Zellkultur mit einer Verbindung wie Ca(NO3)2 und
quaternären Ammoniumverbindungen, Abfiltrieren der Zellen und Suspendieren derselben in Wasser
während einiger Stunden sowie anschließende Entfernung der Zellen durch Filtration mit nachfolgender
Behandlung des Filtrates mit Aktivkohle.
Es ist außerdem bekannt, daß in Bakterienzellen enthaltene Enzyme beim Extrudieren von Zellsuspensionen
unter hohem Druck durch ein enges Mundstück freigegeben werden. Gemäß »Appl. Microbiol.«,
11 (1964), Seite 467, wo Untersuchungen mit anderen Enzymtypen als Penicillinamidasen beschrieben
sind, muß Hochdruck über 1000 at angewendet
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