DE2334521C3 - Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen von Penicilin-amidase - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen von Penicilin-amidaseInfo
- Publication number
- DE2334521C3 DE2334521C3 DE19732334521 DE2334521A DE2334521C3 DE 2334521 C3 DE2334521 C3 DE 2334521C3 DE 19732334521 DE19732334521 DE 19732334521 DE 2334521 A DE2334521 A DE 2334521A DE 2334521 C3 DE2334521 C3 DE 2334521C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- precipitation
- purified enzyme
- penicillin amidase
- enzyme solutions
- enzymes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Enzyme, und insbesondere solche, die durch Fermentation hergestellt wurden, haben in den letzten Jahren
eine beträchtliche Bedeutung erlangt und werden in vielen chemischen Verfahren als Reaktionskatalysatoren
verwendet. Es ist jedoch sehr schwierig, ein Enzym im industriellen Maßstab zu reinigen. Die Anzahl der
notwendigen Reinigungsstufen ist immer sehr hoch und die einzelnen Stufen sind häufig schwierig durchzuführen
und sehr kostspielig. Dies gilt beispielsweise für die aus der französichen Patentschrift 15 05 666 bekannte
Reinigung von Penicillin-amidase. Diese muß unter Einsatz verschiedener Chemikalien ausgefällt, von der
überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, erneut gelöst, von Feststoffen befreit, mit einem Absorptionsmittel
versetzt und erneut von Feststoffen befreit werden. Ein derartiges Verfahren verlangt also den Einsatz verschiedener
Chemikalien sowie die Durchführung mehrfacher Ausfällungs-, Abtrennungs- und Wiederauflösungsstufen.
Aus Molecular Biology of Human Proteins, Elsevier Publishing Company, 1966, Band I, Seiten 261—262 ist
bekannt, daß kationische Detergentien darunter auch quatirnäre oberflächenaktive Ammoniumsalze bei
neutralem oder leicht alkalischem pH unlösliche Komplexe mit Proteinen bilden und daß die in Lösung
bleibenden Proteine im Gegensatz zu den ausgefällten Proteinen eine Denaturierung nicht erleiden. Aus
Biochemistry, Band 7, 1968, Seiten 2263—2272 ist ein Verfahren zur Fraktionierung von RNS und DNS als
ihre Cetyltrimethylammoniumkomplexe bekannt; die an einen inerten Träger gebundenen Komplexe werden
mit charakteristischen NaCl-Konzentrationen eluiert. Ferner ist aus Biochem. J, 1962, Band 84, Seiten
270—275 bekannt, daß Polyanionen aus ihren wäßrigen Lösungen mit kationischen Detergentien wie Cetylpyridiniumchlorid
ausgefällt werden können, wobei als Polyanionen Heparin, Desoxyribonucleat, Hyaluronat,
Alginat und Dextransulfat genannt sind. Aus diesen Literaturstellen ist das erfindungsgemäße Verfahren
nicht nahegelegt, da es sich bei den bekannten Verfahren um Präparate einfacherer Zusammensetzung
a) mechanisches Brechen oder Lysis von die Enzyme enthaltenden mikrobiellen Zellen,
b) Ausfällen der Proteine, der Nucleoproteine und Nucleinsäuren mit einem quaternären Ammoniumsalz
und
c) Entfernen der gebildeten Ausfällungen durch Zentrifugieren oder Filtration,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Ausfällung in Stufe b) mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei einem
pH-Wert zwischen 4,5 und 7,0 bis zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 0,4% vorgenommen wird bzw. bei
Fällung mit Benzyldimethylalkyl (Cio-Cis)-ammoniumchlorid
bei pH 4,5 und bis zu einer Endkonzentration von 0,2% vorgenommen wird.
Die Verwendung eines in der Erfindungsdefination genannten oberflächenaktiven Mittels zusammen mit
teilweise mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln erwies sich auch als sehr nützlich.
In vielen Fällen ist es möglich, das Zentrifugieren nach dem Brechen der Zellen zu vermeiden und direkt
eine Behandlung mit einem dieser oberflächenaktiven Mittel vorzunehmen, wodurch das Verfahren beträchtlieh
vereinfacht wird. Es ist jedoch auch möglich, die Zellfragmente nach dem Brechen der Zellen abzuzentrifugieren.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
Ein Stamm von Escherichia Coli wurde nach üblichen Fermentationsverfahren zur Erzeugung von an Penicillin-amidase
reichen Zellen kultiviert.
1 kg Zellpaste, die 2200 Einheiten/g enthielt (1 Einheit Penicillin-amidase ist die Menge an Enzym, die 1 μΜ Penicillin G in 1 Std. bei 37° C hydrolysiert) wurde in 2 I tris-HCl-Puffer (0,01 m) bei pH 8,5 suspendiert. Die homogene Suspension wurde zweimal in einen Homogenisator bei 700 kg/cm2 geleitet.
1 kg Zellpaste, die 2200 Einheiten/g enthielt (1 Einheit Penicillin-amidase ist die Menge an Enzym, die 1 μΜ Penicillin G in 1 Std. bei 37° C hydrolysiert) wurde in 2 I tris-HCl-Puffer (0,01 m) bei pH 8,5 suspendiert. Die homogene Suspension wurde zweimal in einen Homogenisator bei 700 kg/cm2 geleitet.
Das Produkt wurde bei 20 000 UpM 30 Minuten zentrifugiert und das Sediment wurde entnommen.
Das überstehende Produkt, das 420 Einheiten/ml und
27 mg Proteine/ml enthielt, wurde mit Hexadecyl-pyridinium-chlarid bis zu einer Endkonzentration von 0,2%
versetzt. Gleichzeitig wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt, wobei das Medium unter langsamen Rühren
2 Std. bei 37° C gehalten wurde.
Nach Filtration und Zentrifugieren wurde der unlösliche Rückstand entfernt Aus dem klaren überstehenden Produkt wurde das Enzym durch Ammoniumsulfat (70%) mit 59% Ausbeute ausgefällt Das Enzym
zeigte eine spezifische Aktivität von 50,3 Einheiten/mg Protein, was eine 33fache Reinigung bedeutet
B e i s ρ i e I 2
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet jedoch würde
die Behandlung mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei pH 5,0 durchgeführt
Man erhielt eine 2,5fache Reinigung mit einer 63%igen Ausbeute.
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet wobei jedoch die Behandlung mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei
pH 6,0 durchgeführt wurde.
Man erzielte eine zweifache Reinigung mit einer Ausbeute von 67%.
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch wurde die Behandlung mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei
pH 7,0 durchgeführt
Man erzielte eine i2fache Reinigung mit einer Ausbeute von 66%.
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet unter Verwendung von Benzyldimethylalkyl (Cio—C|8)-Amnoniumchlorid als oberflächenaktives Mittel bei den
gleichen pH-Wert-(4,5)- und Konzentrations-(0,2%)-bedingungen.
Man erhielt eine 2,5fache Reinigung mit einer Ausbeute von 68%
4,8 kg E. Coli-Zellen, die Penicillin-amidase enthielten,
wurden unter Rühren in 101 tris-44-Puffer (0,01 m,
pH 8,5) dispergiert
Die Suspension wurde zweimal bei 700 kg/cm2 durch einen Homogenisator geleitet
und 11,7 1 überstehendes Produkt wurden gewonnen, die
11 χ 106 Einheiten Penicillin-amidase und 545 g Proteine
enthielten. Hexadecyl-pyridinium-chlorid wurde bis zur
wurde auf 4,5 gebracht. Das Ganze wurde unter Rühren
3 Std. bei 37° C gehalten und zentrifugiert
Man erhielt 141 einer klären Lösung, die 8,5XlO6
Einheiten und 126 g Proteine enthielt.
Die Ausbeute be'rug 77% bei einer 33fachen
Reinigung.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen von Penicillin-amidase aus ELcoli durcha) mechanisches Brechen oder Lysis von die Enzyme enthaltenden mikrowellen Zellen,b) Ausfällen der Proteine, der Nucleoproteine und Nucleinsäuren mit einem quaternären Ammoniumsalz undc) Entfernen der gebildeten Ausfällungen durch Zentrifugieren oder Filtration,dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung in Stufe b) mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 7,0 bis zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 0,4% vorgenommen wird bzw. bei Fällung mit Benzyldimethylalkyl (Cio—Ci8)-ammoniumchlorid bei pH 4,5 und bis zu einer Endkonzentration von 0,2% vorgenommen wird.handelt, während bei dem erfindungsgemäßen Verfahren rohe und komplexe Ausgangsmaterialien vorliegen. Aus Journal of Biological Chemistry, Band 244, Nr. 5, 10. März 1969, Seite 1120 ist ferner die Reinigung der Acetohydroxysäure Isomeroreduktase durch Aufbrechen der Zellen und Fällung mit Cetyltrimethylammoniumbromid bekannt Das erfindungsgemäße Verfahren ist hierdurch nicht nahegelegt, da es sich hierbei um ganz spezielle, völlig andere Enzyme handeltίο Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher ein einfach durchzuführendes Verfahren zur Reinigung von Enzymen, durch Vereinfachung der Zentrifugations- und Filtrationsvorgänge, bei dem hohe spezifische Aktivitäten (spezifische Aktivität = Aktivität/mg Protein) erhalten werden.Es wurde nun gefunden, daß durch die Verwendung von bestimmten oberflächenaktiven quaternären Ammoniumsalzen bei einer gegebenen Konzentration und einem speziellen pH-Wert eine leicht filtrierbare und bei einer geringen Gravitation zentrifugierbare Ausfällung an Proteinen, Nucleoproteinen und Nucleinsäuren erhalten werden kann.Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Gewinnung gereinigter Enzymlösungen von Penicillinamidase aus Escherichia coli durch
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT2673372 | 1972-07-07 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2334521A1 DE2334521A1 (de) | 1974-01-24 |
DE2334521B2 DE2334521B2 (de) | 1976-12-23 |
DE2334521C3 true DE2334521C3 (de) | 1981-11-19 |
Family
ID=11220129
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19732334521 Expired DE2334521C3 (de) | 1972-07-07 | 1973-07-06 | Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen von Penicilin-amidase |
DE19732366417 Expired DE2366417C (de) | 1972-07-07 | 1973-07-06 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19732366417 Expired DE2366417C (de) | 1972-07-07 | 1973-07-06 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
BE (1) | BE801351A (de) |
DE (2) | DE2334521C3 (de) |
DK (1) | DK133952B (de) |
FR (1) | FR2192114B1 (de) |
GB (1) | GB1411503A (de) |
IE (1) | IE38174B1 (de) |
LU (1) | LU67902A1 (de) |
NL (1) | NL7309439A (de) |
NO (1) | NO138451C (de) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4055469A (en) * | 1976-12-10 | 1977-10-25 | Eastman Kodak Company | Purification of microbial enzyme extracts using synthetic polyelectrolytes |
JPS56109586A (en) * | 1980-02-05 | 1981-08-31 | Cpc International Inc | Production of fixed glucoseisomerase |
US5622822A (en) * | 1994-09-13 | 1997-04-22 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR1482569A (fr) * | 1966-06-07 | 1967-05-26 | Mobil Oil Corp | Procédé d'oxydation enzymatique de dérivés hydrocarbonés |
FR1505666A (fr) * | 1966-12-01 | 1967-12-15 | Bristol Myers Co | Procédé de production de l'acide 6-aminopénicillanique par la dégradation enzymatique d'une pénicilline |
-
1973
- 1973-06-18 IE IE100473A patent/IE38174B1/xx unknown
- 1973-06-19 GB GB2913173A patent/GB1411503A/en not_active Expired
- 1973-06-21 FR FR7322608A patent/FR2192114B1/fr not_active Expired
- 1973-06-22 BE BE1005183A patent/BE801351A/xx not_active IP Right Cessation
- 1973-06-29 LU LU67902D patent/LU67902A1/xx unknown
- 1973-07-03 NO NO272773A patent/NO138451C/no unknown
- 1973-07-05 DK DK374273A patent/DK133952B/da not_active IP Right Cessation
- 1973-07-05 NL NL7309439A patent/NL7309439A/xx not_active Application Discontinuation
- 1973-07-06 DE DE19732334521 patent/DE2334521C3/de not_active Expired
- 1973-07-06 DE DE19732366417 patent/DE2366417C/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK133952B (da) | 1976-08-16 |
IE38174B1 (en) | 1978-01-18 |
BE801351A (fr) | 1973-10-15 |
NL7309439A (de) | 1974-01-09 |
NO138451B (no) | 1978-05-29 |
FR2192114A1 (de) | 1974-02-08 |
IE38174L (en) | 1974-01-07 |
GB1411503A (en) | 1975-10-29 |
DK133952C (de) | 1977-01-24 |
DE2366417C (de) | 1982-07-08 |
DE2334521A1 (de) | 1974-01-24 |
NO138451C (no) | 1978-09-06 |
FR2192114B1 (de) | 1979-01-12 |
LU67902A1 (de) | 1973-08-31 |
DE2334521B2 (de) | 1976-12-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE4134854C2 (de) | ||
DE2224131B2 (de) | Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Cholesterinoxydase, welches Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon und H tief 2 O tief 2 oxydiert | |
DE3124228C2 (de) | Verfahren zur Isolierung von Superoxid-dismutase aus roten Blutzellen | |
DE2519382A1 (de) | Verfahren zur gewinnung einer gereinigten alpha-galactosidase aus einer alpha-galactosidase enthaltenden fluessigkeit | |
DE2334521C3 (de) | Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen von Penicilin-amidase | |
DE3689375T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von substantiell reinen nicht für Transpiration geeigneten Polydesoxyribonukleotiden mit biologischen Aktivitäten und respektives Produkt. | |
DE2551966A1 (de) | Verfahren zum reinigen von urokinase | |
EP0065286B1 (de) | Verfahren zum Reinigen bzw. Anreichern von biologisch aktiven Proteinen und hierzu geeignetes Mittel | |
DE2217911A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Desoxyribonucleinsäuren mit erhöhtem Molekulargewicht | |
DE2337312C3 (de) | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Dehydrogenasen | |
DE1966428C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslicher Penicillinacylase | |
DE2828235B1 (de) | Verfahren und Adsorptionsmittel zur Isolierung und Reindarstellung von Enzymen aus einer Roh-Enzym-Loesung | |
DE1916723C3 (de) | Verfahren zur Reinigung von L-Asparaginase | |
DE2143062C2 (de) | Wasserunlösliches Enzympräparat für die Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin oder einem Salz dieses Penicillins und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE10309281A1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines beta-1,3-Glukans mit verbesserten Eigenschaften | |
DE515931C (de) | Verfahren zur Gewinnung wertvoller Enzyme | |
DE2167035C3 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Creatin-amidinohydrolase | |
DE1767153C3 (de) | Das als Chondroitinase-AC bezeichnete Enzym aus den Zellen von Flavobacterium heparinum ATCC 13125 und Verfahren zur Herstellung eines Enzymproduktes mit diesem Enzym | |
DE1959603A1 (de) | Kristalline Kombination aus L-Asparaginase und einem Metall- oder Metalloidion und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE68914989T2 (de) | Verfahren zur Behandlung und Entfärbung von Proteinlösungen, die Häm- und Chlorophyll-Pigmente enthalten, und entsprechende Produkte. | |
DE1904849A1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase aus Escherichia Coli-Zellen | |
DE2822842A1 (de) | T-faktor, von proteolytischen enzymen im wesentlichen freies coa-spc und deren herstellung | |
DE2224131C (de) | Verfahren zur Gewinnung des Enzyms Cholesterinoxydase, welches Cholesterin mit O tief 2 zu Cholestenon und H tief 2 O tief 2 oxydiert | |
DE2167034A1 (de) | Creatinin-amidohydrolase | |
DE19547748A1 (de) | Verfahren zur Behandlung einer Fermentationsbrühe, die Polysaccharid enthält |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8369 | Partition in: |
Ref document number: 2366417 Country of ref document: DE Format of ref document f/p: P |
|
AH | Division in |
Ref country code: DE Ref document number: 2366417 Format of ref document f/p: P |
|
Q171 | Divided out to: |
Ref country code: DE Ref document number: 2366417 |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |