DE2334521C3 - Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen von Penicilin-amidase - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen von Penicilin-amidase

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Description

Enzyme, und insbesondere solche, die durch Fermentation hergestellt wurden, haben in den letzten Jahren eine beträchtliche Bedeutung erlangt und werden in vielen chemischen Verfahren als Reaktionskatalysatoren verwendet. Es ist jedoch sehr schwierig, ein Enzym im industriellen Maßstab zu reinigen. Die Anzahl der notwendigen Reinigungsstufen ist immer sehr hoch und die einzelnen Stufen sind häufig schwierig durchzuführen und sehr kostspielig. Dies gilt beispielsweise für die aus der französichen Patentschrift 15 05 666 bekannte Reinigung von Penicillin-amidase. Diese muß unter Einsatz verschiedener Chemikalien ausgefällt, von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, erneut gelöst, von Feststoffen befreit, mit einem Absorptionsmittel versetzt und erneut von Feststoffen befreit werden. Ein derartiges Verfahren verlangt also den Einsatz verschiedener Chemikalien sowie die Durchführung mehrfacher Ausfällungs-, Abtrennungs- und Wiederauflösungsstufen.
Aus Molecular Biology of Human Proteins, Elsevier Publishing Company, 1966, Band I, Seiten 261—262 ist bekannt, daß kationische Detergentien darunter auch quatirnäre oberflächenaktive Ammoniumsalze bei neutralem oder leicht alkalischem pH unlösliche Komplexe mit Proteinen bilden und daß die in Lösung bleibenden Proteine im Gegensatz zu den ausgefällten Proteinen eine Denaturierung nicht erleiden. Aus Biochemistry, Band 7, 1968, Seiten 2263—2272 ist ein Verfahren zur Fraktionierung von RNS und DNS als ihre Cetyltrimethylammoniumkomplexe bekannt; die an einen inerten Träger gebundenen Komplexe werden mit charakteristischen NaCl-Konzentrationen eluiert. Ferner ist aus Biochem. J, 1962, Band 84, Seiten 270—275 bekannt, daß Polyanionen aus ihren wäßrigen Lösungen mit kationischen Detergentien wie Cetylpyridiniumchlorid ausgefällt werden können, wobei als Polyanionen Heparin, Desoxyribonucleat, Hyaluronat, Alginat und Dextransulfat genannt sind. Aus diesen Literaturstellen ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht nahegelegt, da es sich bei den bekannten Verfahren um Präparate einfacherer Zusammensetzung
a) mechanisches Brechen oder Lysis von die Enzyme enthaltenden mikrobiellen Zellen,
b) Ausfällen der Proteine, der Nucleoproteine und Nucleinsäuren mit einem quaternären Ammoniumsalz und
c) Entfernen der gebildeten Ausfällungen durch Zentrifugieren oder Filtration,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Ausfällung in Stufe b) mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 7,0 bis zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 0,4% vorgenommen wird bzw. bei Fällung mit Benzyldimethylalkyl (Cio-Cis)-ammoniumchlorid bei pH 4,5 und bis zu einer Endkonzentration von 0,2% vorgenommen wird.
Die Verwendung eines in der Erfindungsdefination genannten oberflächenaktiven Mittels zusammen mit teilweise mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln erwies sich auch als sehr nützlich.
In vielen Fällen ist es möglich, das Zentrifugieren nach dem Brechen der Zellen zu vermeiden und direkt eine Behandlung mit einem dieser oberflächenaktiven Mittel vorzunehmen, wodurch das Verfahren beträchtlieh vereinfacht wird. Es ist jedoch auch möglich, die Zellfragmente nach dem Brechen der Zellen abzuzentrifugieren.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
Ein Stamm von Escherichia Coli wurde nach üblichen Fermentationsverfahren zur Erzeugung von an Penicillin-amidase reichen Zellen kultiviert.
1 kg Zellpaste, die 2200 Einheiten/g enthielt (1 Einheit Penicillin-amidase ist die Menge an Enzym, die 1 μΜ Penicillin G in 1 Std. bei 37° C hydrolysiert) wurde in 2 I tris-HCl-Puffer (0,01 m) bei pH 8,5 suspendiert. Die homogene Suspension wurde zweimal in einen Homogenisator bei 700 kg/cm2 geleitet.
Das Produkt wurde bei 20 000 UpM 30 Minuten zentrifugiert und das Sediment wurde entnommen.
Das überstehende Produkt, das 420 Einheiten/ml und
27 mg Proteine/ml enthielt, wurde mit Hexadecyl-pyridinium-chlarid bis zu einer Endkonzentration von 0,2% versetzt. Gleichzeitig wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt, wobei das Medium unter langsamen Rühren 2 Std. bei 37° C gehalten wurde.
Nach Filtration und Zentrifugieren wurde der unlösliche Rückstand entfernt Aus dem klaren überstehenden Produkt wurde das Enzym durch Ammoniumsulfat (70%) mit 59% Ausbeute ausgefällt Das Enzym zeigte eine spezifische Aktivität von 50,3 Einheiten/mg Protein, was eine 33fache Reinigung bedeutet
B e i s ρ i e I 2
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet jedoch würde die Behandlung mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei pH 5,0 durchgeführt
Man erhielt eine 2,5fache Reinigung mit einer 63%igen Ausbeute.
Beispiel 3
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet wobei jedoch die Behandlung mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei pH 6,0 durchgeführt wurde.
Man erzielte eine zweifache Reinigung mit einer Ausbeute von 67%.
Beispiel 4
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch wurde die Behandlung mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei pH 7,0 durchgeführt
Man erzielte eine i2fache Reinigung mit einer Ausbeute von 66%.
Beispiel 5
Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet unter Verwendung von Benzyldimethylalkyl (Cio—C|8)-Amnoniumchlorid als oberflächenaktives Mittel bei den gleichen pH-Wert-(4,5)- und Konzentrations-(0,2%)-bedingungen.
Man erhielt eine 2,5fache Reinigung mit einer Ausbeute von 68%
Beispiel 6
4,8 kg E. Coli-Zellen, die Penicillin-amidase enthielten, wurden unter Rühren in 101 tris-44-Puffer (0,01 m, pH 8,5) dispergiert
Die Suspension wurde zweimal bei 700 kg/cm2 durch einen Homogenisator geleitet
Es wurde 30 Minuten bei 20 000 UpM zentrifugiert
und 11,7 1 überstehendes Produkt wurden gewonnen, die 11 χ 106 Einheiten Penicillin-amidase und 545 g Proteine enthielten. Hexadecyl-pyridinium-chlorid wurde bis zur
Endkonzentration von 0,4% zugeführt und der pH-Wert
wurde auf 4,5 gebracht. Das Ganze wurde unter Rühren 3 Std. bei 37° C gehalten und zentrifugiert
Man erhielt 141 einer klären Lösung, die 8,5XlO6 Einheiten und 126 g Proteine enthielt.
Die Ausbeute be'rug 77% bei einer 33fachen Reinigung.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen von Penicillin-amidase aus ELcoli durch
    a) mechanisches Brechen oder Lysis von die Enzyme enthaltenden mikrowellen Zellen,
    b) Ausfällen der Proteine, der Nucleoproteine und Nucleinsäuren mit einem quaternären Ammoniumsalz und
    c) Entfernen der gebildeten Ausfällungen durch Zentrifugieren oder Filtration,
    dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung in Stufe b) mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 7,0 bis zu einer Endkonzentration von 0,2 bis 0,4% vorgenommen wird bzw. bei Fällung mit Benzyldimethylalkyl (Cio—Ci8)-ammoniumchlorid bei pH 4,5 und bis zu einer Endkonzentration von 0,2% vorgenommen wird.
    handelt, während bei dem erfindungsgemäßen Verfahren rohe und komplexe Ausgangsmaterialien vorliegen. Aus Journal of Biological Chemistry, Band 244, Nr. 5, 10. März 1969, Seite 1120 ist ferner die Reinigung der Acetohydroxysäure Isomeroreduktase durch Aufbrechen der Zellen und Fällung mit Cetyltrimethylammoniumbromid bekannt Das erfindungsgemäße Verfahren ist hierdurch nicht nahegelegt, da es sich hierbei um ganz spezielle, völlig andere Enzyme handelt
    ίο Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher ein einfach durchzuführendes Verfahren zur Reinigung von Enzymen, durch Vereinfachung der Zentrifugations- und Filtrationsvorgänge, bei dem hohe spezifische Aktivitäten (spezifische Aktivität = Aktivität/mg Protein) erhalten werden.
    Es wurde nun gefunden, daß durch die Verwendung von bestimmten oberflächenaktiven quaternären Ammoniumsalzen bei einer gegebenen Konzentration und einem speziellen pH-Wert eine leicht filtrierbare und bei einer geringen Gravitation zentrifugierbare Ausfällung an Proteinen, Nucleoproteinen und Nucleinsäuren erhalten werden kann.
    Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Gewinnung gereinigter Enzymlösungen von Penicillinamidase aus Escherichia coli durch
DE19732334521 1972-07-07 1973-07-06 Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen von Penicilin-amidase Expired DE2334521C3 (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4055469A (en) * 1976-12-10 1977-10-25 Eastman Kodak Company Purification of microbial enzyme extracts using synthetic polyelectrolytes
JPS56109586A (en) * 1980-02-05 1981-08-31 Cpc International Inc Production of fixed glucoseisomerase
US5622822A (en) * 1994-09-13 1997-04-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using polyethyleneimine and an anionic phosphate ester surfactant and amplification of same

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1482569A (fr) * 1966-06-07 1967-05-26 Mobil Oil Corp Procédé d'oxydation enzymatique de dérivés hydrocarbonés
FR1505666A (fr) * 1966-12-01 1967-12-15 Bristol Myers Co Procédé de production de l'acide 6-aminopénicillanique par la dégradation enzymatique d'une pénicilline

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DK133952C (de) 1977-01-24
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IE38174L (en) 1974-01-07

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