DE1904849A1 - Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase aus Escherichia Coli-Zellen - Google Patents

Description

DR. ELISABETH JUNG. DR. VOLKER VOS8IUS. DIPL-ING. GERHARD COLDEWEY

• MONCHENlS ■ I lOEIITRAIIlll ■ TILIFON 1410(7 ■ T(LEOfIAMM-AOREItEi INVENT/MONCHEN

UoZni E 044 (Vo/kä) 702 527 - S

BcRe SQUIBB * SONS, INC., New York, NoY._f V₀St₀A.

31. JAN.196V

¹¹ Verfahren aur Gewinnung ooli-Zellen ^M

L-Asparaginase aue Isoherichia

2. Februar I960, V.St.A., Nr. 702 527

Die Erfindung betrifft eiri verbessertes Verfahren zur Isolierung der L-Aaparaginaee au· leoherichia ooll (E. coli) . Zellen, Das Verfahren 1st dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen der Lyei· unterwirft» den dabei erhaltenen Extrakt mit Ribonuolease_t Desoxyribonuoleaae oder deren Gemisch behandelt und die L-Aeparaginase aue dem Extrakt isoliert.

Zur Gewinnung der Ir-Asparaginase nach dem Verfahren der Erfindung können beliebige Zellen von E. coil verwendet werden. Vorzugsweise werden jedoch trockene Zellen verwendet« die durch LyopfciIieieren oder Behandlung mit Aceton erhalten werften, Die Trocknung alt Aceton let bevorzugt. Vorsugeweise euapendiert aai eine feuchte Zellenpaste von E, <aoli - Zellen» di& durch Zentrifugieren erhalten wird, in destilliertem oder Q.itu-Alztem Wasser

Diese Zellensuspeneion wird vorzugsweise in kaltes Aceton gegeben. Naoh dem Mischen werden die durch das Aceton auegefällten Zellen abfiltriert und getrocknet.

Lysis der Zellen kann nach tibliöhen Verfahren durchgeführt werden, um «inen eellfreien Extrakt su erhalten, der das Enzym enthält» Es sind verschiedene Verfahren zur Zerstörung der Zellen btkftnnt, wie die Behandlung mit Ultraschall oder andere meohanlsohe Verfahren, wie das Vermählen in einer Kolloidmühle. Vorzugsweise werden zur Lysis die Zellen von £· coil mit Lyeoeym in Gegenwart eines Buffers durchgeführt, der den p^-Vtert ■witonen etwa 5 und 9 hält. Die Zelltrümmer werden abzentrifugiert oder abfiltriert. Man kann auch eine wässrige Suspension der E. ooll -Zellen, die mit Natronlauge auf p_H 7,5 bis 6,0 eingestellt ist, mit Lysozym versetzen.

ZeI^freie Extrakte können allerdings in geringerer Reinheit und Ausbeute auch aus den feuchten Zellen von E. coil durch Vermählen, Behandeln mit Ultraschall oder Lysozym erhalten werden.

Bisher «tieee man jedoch bei der.Herstellung dieser zellfreien Extrakte sowie bei der ansohlieseenden Isolierung des Enzyme, die eine Anzahl von nitrations- und Zentrifugationestufen umfasst, auf groeee Schwierigkeiten, da der bei der Lysis der Zellen anfallend· Extrakt eine äusserst hohe Viskosität beeitet,

Di··· Schwierigkeiten bei der Reinigung der Extrakte werden duron das Verfahren der Erfindung überwunden. Durch die verhältniamäsefg einfache M&aenahme der Behandlung des bsi dar Lysis der Zellen anfallenden Extraktes mit geringen Mengen l

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ase, Desoxyribonuelease oder deren Gemischen wird diesee Ziel erreicht· Auf diese Weise wird innerhalb weniger Minuten, selbe1 bei niedrigen Temperaturen, die Viskosität des Extraktes stark herabgesetzt. Dies hat nicht nur den Vorteilt dass sioh der Extrakt dann leicht filtrieren und eentrifugieren kenn, sondern es stellen sich weitere Vorteile bei den nachfolgenden Reinigungsstufen ein» 8,B. bei der Säulenchromatographie, da eint Störung durch Nucleinsäuren unterbleibt» die sich aus der Ribonuclease und bsw. oder Deeoxyribonuclease durch Hydrolyse bilden·

Xm Verfahren der Erfindung wird die Hlbonuclease und Deeoxyribonuclease in Mengen von 10 /*/ml bis 0,1 /7ml und vorsugew«is<In Mengen von 0,25 bis 0,5 { /ml verwendet.

Au· den lellfreien Extrakten, die naoh dsm vorstehend btsohrit-ρ«η·η Verfahren erhalten werden, fällt man unerwünscht· Protein· naoh an sich bekannten Methoden aus und trennt sie ab, i.B« duroh Behandlung mit Manganchlorid und Ammoniumsulfat. und anstehende Zentrifugi«rung· Der- Überstand wird fraktioniert, vorsugsw«l·· mit Aceton, und das Ensym isoliert.

Di· Beispiele erläutern die Erfindung.

BelBPlel 1

15 I alt Aceton getrocknete Zellen von E. ooli B (ATCC 9637) In Vatriumpho*phat-Puff«r suspendiert und mit Lysosy»

behaadelt« Bach 65-al&tttlg«m Sohütteln bei 25⁰C wird kristal-

Dtaoxyribonuel···· der ri·kosen Suspension in 2 Portionen la ·1η·Α OpOOl m©lar«n Phoiphatpuffer vom Pjj-Wert 8,0 «ug·-

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setztf sodaße die Endkonaontration an Desoxyribonuclease in der viskosen, lyeierten Zellßußpension 0,10 bzw. O_f25f/ml beträgt. Gleichseitig wird ein Kontrollversuch durchgeführt, bei dem keine DeBoxyribonuoleaBe verwendet wird. Innerhalb einer Minute nach Zusatz der Desoxyribonuclease hat sich die viskose.Suspension in eine vollständig flüssige Masse verwandelt, während die Suspension ohne Desoxyribonucleasezusatz viskos bleibt. Mach weiterer 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur ist die Iysierte Zellsuspension ohne Desoxyrihonuclease noch ebenso viskos wie zu Beginn. Die Suspensionen werden auf 5 bis 8⁰C abgekühlt, mit einet Manganohloridlösung, versetzt und 20 Minuten in einer Ultrazentrifuge bei 6000 G zentrifugiert. Die ZeIItrummer in der Suspension ohne Deeoxyribonucleasezusatz sind noch nicht eedimentiert. Bas gleiche ist der Fall mit den Zelltrünmern der mit Desoxyribonuclease behandelten Suspension· Allerdings ist der überstand der letztgenannten Suspension wesentlich klarer, und es ist ersichtlich, dass eine wirksamere Trennung erzielt wurde.

Beispiel 2

Da· Verfahren gemäss Beispiel 1 wird wiederholt, jedooh wird nach 30-minütiger Zellysis Desoxyribonuolease in solcher Menge zugegeben, dase die Konzentration 5 bzw· 10/7ml betragt. Das Auenaee der Abtrennung der Zelltrümmer ist nicht unterechtidbar von den von Beispiel 1.

Beispiel 3 Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird nach

20-ttinütigsr Zellysia anetatt 65-minüti^er Zellysis amorphe

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Desoxyribonuclease verwendet. Ea werden die gleichen Ergebniese erhalten wie in Beispiel 1.

Beispiel 4 ?.

Dae Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt,' jedoch wird anstelle von Desoxyribonuolease ein Gemisch gleicher Teile ßibonuoltaet uxid Desoxyribonuoleaee verwendet« E« werden die gleichen Ergebnisse erhalten wie in Beispiel 1.

Beispiel p

50 g mit Aoeton getrocknete Zellen-werden mit 0,05 £ Itfeosym gemäße Beispiel 1 behandelt. Danach wird die Suspension Bit amorpher Desoxyribonuolease in solcher Menge versetst, dass die Konzentration 0,1 /7ml beträgt, das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und auf 1O⁰C abgekühlt. Der Pg-Wert wird hitrauf ait Natronlauge auf 7*6 eingestellt. Danach wird die Suspension Bit Manganchlorldlueung bei einem pjj-Wert »wischen 7*5 und 8,5 Ter-Bftat· Die Suspension wird in der Kälte sentrifugiert. Der überstand wird mit soviel AsutoniuBsulfat versetzt, dass dessen Konaentration 2 molar ist, und die ausgefällten L-aeparaginasefreisn Proteinen werden abgentrifugiert. Dis geklärte 2 »olart AsuoniUBSulfatlttsung wird Bit kaltes Aoeton vsrsstst, und dl· ausgefällte L-Asparaglnast isoliert. Die fällung wird erneut in Wasser suspendiert« Die Ausbeute an Ir-Asparaginase aus. den Bit Aattsii get?ookneten Seilen beträgt 46 #« Di® speilfisohe Aktivität niBBt von 0,58 mmt 2,17 Ιϋ/κβ protein

Claims (2)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase aus Escherichia coil > Zellen» dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen der lysis unterwirft» den dabei erhaltenen Extrakt mit Ribonucleaee, Despxyribonuelease oder ceren Gemisch behandelt und die L-Aeparaginaee aus dem Extrakt isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, daduroh gekenn-Belohnet) dass man einen aus getrockneten Seilen erhaltenen Extrakt verwendet.

3· Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch g « ke naaeiohnet, dass men Esoheriohla coll B Zellen verwendet·