DE1946137B2 - Verfahren zur Gewinnung von Glycerinkinase aus Mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von Glycerinkinase aus Mikroorganismen

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DE1946137B2 DE1946137A DE1946137A DE1946137B2 DE 1946137 B2 DE1946137 B2 DE 1946137B2 DE 1946137 A DE1946137 A DE 1946137A DE 1946137 A DE1946137 A DE 1946137A DE 1946137 B2 DE1946137 B2 DE 1946137B2
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Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung von Glycerinkinase, welches sich für die Durchführung in technischem Maßstab eignet.
Aus der deutschen Auslegeschrift 1 238 422 ist ein Verfahren zur Herstellung von Glycerinkiiiase bekannt, bei dem Candida mycoderma (Rees) Losser et v Rij aus dem Zentralbüro für Schimmelkulturen in Baarn/Holland lyophilisiert, aus dem Lyophilisat durch Gärung bei 370C ein Extrakt hergestellt, dieser einem Hitzeschritt, einer ersten Ammoniumsulfatfraktkniierung, einer Dialyse mit anschließender Anionenaustauscherchromatographieundanschließend einer zweiten Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen wird. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß hierbei häufig erhebliche Verluste auftreten. Außerdem wurde festgestellt, daß der verwendete Mikroorganismus sich gelegentlich so verändert, daß das Verfahren überhaupt nicht mehr durchführbar war.
Es ist auch schon ein Verfahren bekannt, bei dem aus Escherichia-coli-Stämmen durch Ultraschallaufschluß ein Extrakt hergestellt, dieser einer Streptomycinfällung, anschließend einem Hitzeschritt, einer ersten Ammoniumsulfatfraktionieiung, einer Dialyse, einer zweiten Ammoniumsullatfraktionierung und schließlich einer Chromatography über Diäthylaminoäthyl-Zellulose unterworfen wird (The Journal of 3iol. Chemistry, Vol. 242, Nr. 5, 1967, S. 1030 bis 1035). Dieses Verfahren führt nur zu mäßigen Ausbeuten von etwa 30 °0 und eignet sich nicht für andere Mikroorganismen.
Es bestand daher ein Bedürfnis nach Schaffung eines technisch brauchbaren Verfahrens, welches zuverlässig reproduzierbar bessere Ausbeuten als die bekannten Verfahren liefert.
Ausgangspunkt der Erfindung war die Hypothese, daß die unerklärlichen Verluste beim Verfahren der obenerwähnten deutschen Auslegeschrift auf die Tätigkeil von Proteasen zurückzuführen sind. Es wurde daher ein Verfahren entwickelt, bei dem durch geeignete Wahl der einzelnen Schritte die Möglichkeit zur proteolytischen Zerstörung des gewünschten Enzyms weitgehend ausgeschaltet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Glycerinkinase aus Mikroorganismen besteht daher darin, daß die einen die Aufarbeitung lohnenden Gehalt an Glycerinkinase aufweisenden Mikroorganismus in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen werden, die hierdurch erhaltene Suspension einer Protaminsuliatfällung unterworfen wird, der Niederschlag abgetrennt und das Filtrat in an sich bekannter Weise mit einem Anionenaustauscher auf Zellulose- oder Dextranbasis behandelt wird, wobei diese Verfahrensschritte in der angegebenen Reihenfolge ohne längere Unterbrechung und bei einer Temperatur von höchstens 100C durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt in hervorragender Ausbeute zu einem Präparat, welches beständig ist. Falls eine Weiterreinigung des erfindungsgemäß erhaltenen Glycerinkinase-Piäparates erwünscht ist, kann diese selbstverständlich in an sich bekannter Weise erfolgen.
Als Mikroorganismen werden vorzugsweise Candida-mycoderma-Stämme mit einem die Aufarbeitung lohnenden Gehalt an Glycerinkinase verwendet. Es kann aber auch von anderen Mikroorganismen mit einem die Aufarbeitung lohnenden Gehalt an Glycerinkinase ausgegangen werden.
Die Mikroorganismen können in frischem oder eingefrorenem Zustand verwendet werden. Es ist aber auch möglich, von einem gefriergetrockneten Material auszugehen. Im letzteren Fall wird Puffer zugesetzt, um eine Paste herzustellen, deren Konzentration frisch gewonnener Zellpaste entspricht.
Die Zellsuspension wird in an sich bekannter Weise in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen. Man erhält so eine Enzymsuspension, deren Feststoffgehalt zweckmäßig zwischen ?0 und 40 mg/ml betragen sollte. Gegebenenfalls wird vor oder nach dem Aufschluß eine entsprechende Menge Wasser zugesetzt.
Die erhaltene Enzymsuspension wird mit einer Protaminsulfatlosung versetzt, vorzugsweise bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8. Da die Glycerinkinase hierbei nicht mit ausfällt, ist es möglich, erschöpfend zu fällen, und vorzugsweise wird daher so viel Protaminsulfatlosung zugesetzt, daß bei weiterer Zugabe keine merkliche Trübung mehr eintritt.
Der gebildete Niederschlag wird nach irgendeiner geeigneten Methode, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, entfernt. Der erhaltene Filterkuchen wird zweckmäßig gewaschen und das Waschwasser mit dem Filtrat vereinigt.
Die so erhaltenen vereinigten Filtrate werden mit einem Anionenaustauscher auf Zellulose- oder Dextranbasis behandelt. Vorzugsweise werden Diäthylaminoäthylgruppen enthaltende Ionenaustauscher auf Dextranbasis oder Zellulosebasis verwendet. Die Behandlung kann im Eichverfahren oder auf einer Säule erfolgen. Bevorzugt wird wegen der Einfachheit der Durchführung die Behandlung im Batchverfahren, d. h. die direkte Zugabe des Anionenaustauschers in die Enzymlösung.
Die zu verwendende Austauschermenge läßt sich in jedem Fall durch einen einfachen Vorversuch leicht bestimmen, da die Glycerinkinase an den Austauscher gebunden wird. Es wird daher so viel Anionenaustauscher zugesetzt, bis im Überstand Glycerinkinase nicht mehr nachweisbar ist.
Die Anwendung des Diäthylaminoäthyl-Zelluloseschrittes auf die Glycerinkinase ist an sich bekannt, und die beschriebenen Methoden zur Elution eignen sich auch für das Verfahren der Erfindung.
Wesentlich für das Verfahren der Erfindung ist, daß die Verfahrensschritte in der angegebenen Reihenfolge ohne längere Unterbrechung und zweckmäßig bei einer
Temperatur von höchstens 100C, vorzugsweise 50C1 durchgeführt werden. Durch die erfindungsgemäße Kombination von Verfahrensschritten erhält man so ein überraschend stabiles Präparat, welches auch bei längerem Stehen in der Kälte keinen Aktivitätsverlust mehr erleidet.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt man bei Verwendung des gleichen Ausgangsmaterials und der gleichen Menge wie beim Verfahren der erwähnten deutschen Auslegeschrift eine Ausbeutesteigerung bei zu etwa 300%.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
1. Aufschluß
6 kg Candida mycoderma werden mit Phosphatpuffer pH 7,0 auf 1001 aufgefüllt und homogen gerührt.
Die erhaltene Zellsuspension wird in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen und mit kaltem, entsalztem Wasser auf 200 1 verdünnt.
2. Protaminsulfatfällung
Die Enzymsuspension mit einem Feststoffgehalt von 20 bis 40 mg/ml wird mit ProtaminsulfatlÖsung, pH 7,0 {c = 10 mg/ml) versetzt, bis keine merkliche Trübung mehr eintritt. Nach kurzem Rühren wird der Niederschlag durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt.
3. Anionenaustauscherbehandlung
Die erhaltene Enzymlösung wird sofort mit auf pH 7,0 equilibrierteni, salzfrei gewaschenem Diäthylaminoäthyl-dextran-lonenaustauscher versetzt, bis im Überstand keine Glycerinkinase mehr nachweisbar ist. Der Auslauscher wird abgetrennt und das Filtrat verworfen. Der Filterkuchen wird mit dem dreifachen Volumen 0.05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 -r 0,1 M Natriumchlorid 20 Minuten gerührt und abgenutsclu. Das Filtrai wird verwürfen.
Die ülyccrokinase wird nunmehr mit 0,05 M kuliumphosphatpuffer pH 7,0 — 0.3 M Natriumchlorid eluiert.
Die vereinigten Eluate enthalten 72% der ursprünglich vorhandenen Aktivität. Die spezifische Aktivität beträgt etwa 8 Einheiten.
Zur Konzentrierung wird die Lösung mit Ammoniumsulfat bis 3.2 M gesättigt und abzentrifugiert, der i berstand wird verworfen.
Beispiel 2
(Vergleichsbeispiel)
Um zu zeigen, daß es entscheidend auf die erfindungsgemäße Kombination der Verfahrensschritte ankommt, wurden Vergleichsversuche durchgeführt. Verglichen wurden:
1. das erfindungsgemäße Verfahren,
2. das Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1 238 422,
3. das Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1 238 422, durch zusätzlichen Protaminsulfatschritt modifiziert,
4. das Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1 238 422, durch Protaminsulfatschritt und einen Schritt mit einem Diät'uylaminoäthylgruppen tragenden Ionenaustauscher auf Dextranbasis modifiziert, und
5. eine der erfindungsgemäßen Methode insoweit ähnliche Arbeitsweise, als der Ionenaustauscher-Schritt nach der Protaminsulfatstufe weggelassen wurde und als noch die weiteren angegebenen
ίο Maßnahmen angeschlossen wurden.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Tabelle 1 angegeben.
Bei der Durchführung der Versuche wurde wie im Beispiel 1 bzw. wie in der deutschen Auslegeschrift 1 238 422 beschrieben vorgegangen. Bei Versuch 1 wurde von 68 g Candida mycoderma, bei Versuch 2 von 300 g Candida mycoderma, bei Versuch 3 von 40 g Candida mycoderma und bei Versuch 4 von 107 g
so Candida mycoderma ausgegangen. In allen Versuchen wurde von Zellen des gleichen Candida-mycoderma-Stammes ausgegangen.
Bei dem erfindungsgemäßen Versuch betrug die Ausbeute 97 %. Das erhaltene Produkt war beständig, und die wäßrigen Lösungen vor Kristallisation waren nach lOtägigem Stehen bei 00C noch 100% aktiv.
Re: Versuch 2 betrug die Ausbeute 8,8 %. Die Ausbeute an Enzym war 48 mg mit 95 E/mg aus 300 g Candida-Zellen. Erfindungsgemäß wurde also eine bedeutend höhere Ausbeute erzielt. Die nach Versuch 2 erhaltenen Lösungen waren aber auch nach lOtägigem Stehen bei O0C vollständig inaktiv.
Nach Versuch 3 betrug die Ausbeute 5,2 %. Berechnet auf 300 g Candida betrug die Ausbeute 23,8 me. Durch Einfügung eines Protaminsulfatschrittes wurde also die Ausbeute des bekannten Verfahrens nicht verbessert.
Nach Versuch 4 betrug die Ausbeute 22%. Die Ausbeute, bezogen auf 300 g Candida-Zellen, betrug 100 mg mit 95 Einheiten. Die Ausbeute im Vergleich zu Versuch 2 bzw. 3 wurde wesentlich verbessert.
Versuc'i 5 wurde nur bis zur Dialyse gefuhrt. Er zeigt, da-i bei Weglassen des Anionenaustauscher-Schrittes im erfindungsgemäßen Verfahren allein bei der Dialyse 34% der Aktivität verlorengehen.
Beispiel 3
(Vergleichsbeispiel)
Das Verfahren der Erfindung wurde mit dem aus J. of Biol. Chem. Vol. 242, Nr. 5, S. 1030 bis 1035 bekannten Streptomycin-Sulfatschritt verglichen, indem dieser an Stelle des Protaminsulfatschrittes der Erfindung durchgeführt wurde.
Hierbei wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, ausgehend von Candida Mycoderma ein Hochdruckaufschluß, anschließend eine Protaminsulfatfällung, eine Behandlung mit einem Diäthylaminoäthylgruppen tragenden Ionenaustauscher auf Dextranbasis und dann ein Hitzeschritt, und zwar 60 Minuten bei 6O0C, durchgeführt. Unter diesen wesentlich verschärften Bedingungen betrug die Ausbeute nach dem Hitze schritt noch 36% der ursprünglichen Aktivität. Da die Ausbeute des vorhergehenden Anionenaustauscherschrittes 72% betrug, gingen beim Erhitzungsschritt 50% der Restaktivität verloren.
Das Verfahren wurde in gleicher Weise wiederholt,
jedoch wurde statt des Protaminsulfatschrittes eine
Streptomycinsulfatfäliung eingeschaltet. Beim anschließenden Anionenaustauscherschritt war die vierfache Austauschennenge wie bei der erfirdungsgemäßen
Arbeitsweise erforderlich. Das Austauschereluat wies
54% der ursprünglichen Aktivität auf. Beim Erhitzungsschritt erfolgte aber ein vollständiger Verlust
der Aktivität.
Beispiel 4
1. Aufschluß
300 g Oospora lactis werden mit Phosphatpuffer
pH 7,0 auf 5 1 aufgefüllt und homogen gerührt.
Die erhaltene Zellsuspension wird in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen und mit kaltem, entsalztem
Wasser auf 10 1 verdünnt.
2. Protaminsulfatfällung
Die Enzymsuspension mit einem Feststoffgehalt von
bis 40 mg/ml wird mit Protaminsulfatlösung,
pH 7,0 (c = 10 mg/ml) versetzt, bis keine merkliche
Triibung mehr eintritt. Nach kurzem Rühren wird der 25 Niederschlag durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt.
3. Aaionenaustauscherbehandlung
Die erhaltene Enzymlösung wird sofort mit auf pH 7,0 equilibriertem, salzfrei gewaschenem Diäthylaminoäthylgruppen enthaltenden Dextranbasis-Austauscher versetzt, bis im Überstand keine Glycerinkinase mehr nachweisbar ist. Der Austauscher wird abgetrennt und das Filtrat verworfen. Der Filterkuchen wird mit dem dreifachen Volumen 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 + 0,1 M Natriumchlorid 20 Minuten gerührt und abgenuscht. Das Filtrat wird verworfen.
Die Glycerinkinase wird nunmehr mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 + 0,3 M Natriumchlorid eluiert.
Die vereinigten Eluate enthalten 77 % der ursprünglich vorhandenen Aktivität.
Zur Konzentrierung wird die Lösung mit Ammoniumsulfat bis 3,2 M gesättigt und abzentrifugiert, der Überstand wird verworfen.
In der Tabelle 2 sind die in den einzelnen Stufen erzielten Ausbeuten und Aktivitätsmengen angegeben.
Tabelle 1
Stufe
ml
Aktivität
Ausbeute
o/ /o
1. Extrakt der Hochdruckdispersion
Protaminsulfatüberstand
Ionenaustauscher-Eluate (Ionenaustauscher = ein Diäthylaminoäthylgruppen tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
2. Gärungs-Extrakt
Hitzeschritt bei 6O0C, Überstand
Ammonsulfat 2,05 M Lösung
Dialysat
Ionenaustauscher-Eluat (Ionenaustauscher = ein Diäthylaminoäthylgruppen tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
3. Protaminsulfatüberstand nach Gärungsaufschluß
Hitzeschritt bei 6O0C, Überstand
Anmonsulfat-Niederschlag, gelöst
Dialysat
Ionenaustauscher-Eluat (Ionenaustauscher = ein Diäthylaminoäthylgruppen tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis) ,
4. Protaminsulfatüberstand nach Gärungsaufschluß
Ionenaustauscher-Eluat (Ionenaustauscher = ein Diäthylaminoäthylgruppen tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
Hitzeschritt bei 6O0C, Überstand
Ammonsulfat-Niederschlag, gelöst
Dialysat
Ionenaustauscher-Eluat (Ionenaustauscher = ein Diäthylaminoäthylgruppen tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
5. Extrakt der Hochdruckdispersion
Protaminsulfatüberstand
Hitzeschritt bei 6O0C, Überstand
Ammonsulfat-Niederschlag, gelöst
Dialysat
210 000
220 000		 1,01 · 106
1,01 · 10»
24 000 9,8 -106
3 280
3 280
205
164		 4,7 -104
1,71 · 10«
1,05 · 10*
1,01 · 10*
470 0,41 · 10«
1000
1000
20
22		 5,6 -103
1,7 -103
5,06 · 10a
3,86 · 102
250 2,9 -102
2 500 1,4 -10*
224
202
20
21		 8,2 -103
3,96 · 103
4,14 · 103
3,22 · 103
235 3,20 · 103
420
440
440
20
24,5		 3,2 -102
3,02 · 102
2,62 ■ 102
2,72 · 102
1,81 · 10°-
100 100
97
100 36 22
21
8,8
100 30 9,1 6,9
5,2 100
60 28 29 23
22
100 95 82 85 56
I 946
Tabelle
Stufe
Aktivität
Ausbeut«
Extrakt von Hochdruckdispersion
Frotaminsulfat-Überstand
Ioccaaustausclier-Eluate (Ionenaustauscher = ein Diäthyiaminoäthylgruppen tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
5000
8 900
1590
2,45 · 10* 2,2 -10*
1,89 · 10*
100 90
77

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Gewinnung von Glycerinkinase aus Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß die einen die Aufarbeitung lohnenden Gehalt an Glycerinkinase aufweisenden Mikroorganismen in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen werden, die hierdurch erhaltene Suspension einer Protaminsulfatfällung unterworfen sind, der Niederschlag abgetrennt und das Filtrat in an sich bekannter Weise mit einem Anionenaustauscher auf Zellulose- oder Dextranbasis behandelt wird, wobei diese Verfahrensschritte in der angegebenen Reihenfolge ohne längere Unterbrechung und bei einer Temperatur von höchstens 10° C durchgeführt werden.
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AT533270A AT294734B (de) 1969-09-11 1970-06-12 Verfahren zur Herstellung von Glycerinkinase
ZA705188*A ZA705188B (en) 1969-09-11 1970-07-27 Process for obtaining glycerokinase
IL35073A IL35073A (en) 1969-09-11 1970-08-06 Process for obtaining glycerokinase from microorganisms
DK408370AA DK126336B (da) 1969-09-11 1970-08-07 Fremgangsmåde til udvinding af glycerinkinase.
NLAANVRAGE7012013,A NL170753C (nl) 1969-09-11 1970-08-14 Werkwijze voor het winnen van glycerolkinase uit micro-organismen.
CH1339570A CH556877A (de) 1969-09-11 1970-09-08 Verfahren zur gewinnung von glycerinkinase.
GB43151/70A GB1260059A (en) 1969-09-11 1970-09-09 Process for obtaining glycerokinase
US70927A US3677901A (en) 1969-09-11 1970-09-09 Process for the production of glycerokinase
HUBO1247A HU167714B (de) 1969-09-11 1970-09-09
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5852632B2 (ja) * 1979-06-06 1983-11-24 東洋醸造株式会社 新規なグリセロ−ルキナ−ゼおよびその製造法
US4935346A (en) 1986-08-13 1990-06-19 Lifescan, Inc. Minimum procedure system for the determination of analytes
US6458326B1 (en) 1999-11-24 2002-10-01 Home Diagnostics, Inc. Protective test strip platform
US6525330B2 (en) 2001-02-28 2003-02-25 Home Diagnostics, Inc. Method of strip insertion detection
US6541266B2 (en) 2001-02-28 2003-04-01 Home Diagnostics, Inc. Method for determining concentration of an analyte in a test strip
US6562625B2 (en) 2001-02-28 2003-05-13 Home Diagnostics, Inc. Distinguishing test types through spectral analysis

Also Published As

Publication number Publication date
CH556877A (de) 1974-12-13
IL35073A (en) 1974-01-14
GB1260059A (en) 1972-01-12
NL7012013A (de) 1971-03-15
IL35073A0 (en) 1970-10-30
SE355582B (de) 1973-04-30
JPS491869B1 (de) 1974-01-17
AT294734B (de) 1971-12-10
DK126336B (da) 1973-07-02
NL170753B (nl) 1982-07-16
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