DE1946137C3 - Verfahren zur Gewinnung von Glycerinkinase aus Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Glycerinkinase aus MikroorganismenInfo
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Description
Temperatur von höchstens 103C, vorzugsweise 5'C,
durchgeführt werden. Durch die erfindungsgemäße Kombination von Verfahrensschritten erhält man so
ein überraschend stabiles Präparat, welches auch bei längerem Stehen in der Kälte keinen Aktivitätsverlust
mehr erleidet.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt man bei Verwendung des gleichen Ausgangsmaterials und
der gleichen Menge wie beim Verfahren der erwähnten deutschen Auslegeschrift eine Ausbeutesteigerung
bis zu etwa 300 °/o.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Be i s ρ i e 1 1
1. Aufschluß
6 kg Candida mycoderma werden mit Phosphatpuffer pH 7,0 auf 1001 aufgefüllt und homogen gerührt.
Die erhaltene Zellsuspension wird in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen und mit kaltem, entsalztem
Wasser auf 200 I verdünnt.
2. Protaminsulfatfällung
Die Enzymsuspension mit einem Feststoff gehalt von 20 bis 40 mg/ml wird mit Protaminsulfatlösung, pH 7,0
(c - 10 mg/ml) versetzt, bis keine merkliche Trübung mehr eintritt. Nach kurzem Rühren wird der Niederschlag
durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt.
3. Anionenaustauscherbehandlune
Die erhaltene Enzymlösung wird sofort mit auf pH 7,0 equilibriertem, salzfrei gewaschenem Diäthylaminoäthyl-dextran-Ionenaustauscher
versetzt, bis im Überstand keine Glycerinkinase mehr nachweisbar ist. Der Austauscher wird abgetrennt und das Filtrat
verworfen. Der Filterkuchen wird mit dem dreifachen Volumen 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0
+ 0,1 M Natriumchlorid 20 Minuten gerührt und abgenutscht. Das Filtrat wird verworfen.
Die Glycerokinase wird nunmehr mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 - 0,3 M Natriumchlorid
eluiert.
Die vereinigten Eluate enthalten 72% der ursprünglich vorhandenen Aktivität. Die spezifische Aktivität
beträgt etwa 8 Einheiten.
Zur Konzentrierung wird die Lösung mit Ammoniumsulfat
bis 3,2 M gesättigt und abzentrifugiert, der Überstand wird verworfen.
Beispiel 2
(Vergleichsbeispiel)
(Vergleichsbeispiel)
55
Um zu zeigen, daß es entscheidend auf die erfindungsgemäße Kombination der Verfahrensschritte
ankommt, wurden Vergleichsversuche durchgeführt. Verglichen wurden:
1. das erfindungsgemäße Verfahren,
2. das Verfahren der deutschen Auslegeschrift
1 238 422,
3. das Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1238 422, durch zusätzlichen Protaminsulfatschritt
modifiziert,
4. das Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1 238 422, durch Proiaminsulfatschritt und einen
Schritt mit einem Diäthylaminoäthylßruppen
tragenden Ionenaustauscher auf Dextranbasis modifiziert, und
5. eine der erfindungsgemäßen Methode insoweit ähnliche Arbeitsweise, als der Ionenaustauscher-Schritt
nach der Protaminsulfatstufe weggelassen wurde und als noch die weiteren angegebenen
Maßnahmen angeschlossen wurden.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der Tabelle 1 angegeben.
Bei der Durchführung der Versuche wurde wie im Beispiel 1 bzw. wie in der deutschen Auslegeschuft
1 238 422 beschrieben vorgegangen. Bei Versuch 1 wurde von 68 g Candida mycoderma, bei Versuch 2
von 300 g Candida mycoderma, bei Versuch 3 von 40 g Candida mycoderma und bei Versuch 4 von 107 g
Candida mycoderma ausgegangen. In allen Versuchen wurde von Zellen des gleichen Candida-mycoderma-Stammes
ausgegangen.
Bei dem erfindungsgemäßen Versuch betrug die Ausbeute 97 %. Das erhaltene Produkt war beständig,
und die wäßrigen Lösungen vor Kristallisation waren nach lOtägigem Stehen bei 0 C noch 100% aktiv.
Bei Versuch 2 betrug die Ausbeute 8,8 %. Die Ausbeute an Enzym war 48 mg mit 95 E/mg aus 300 g
Candida-Zellen. Erfindungsgemäß wurde also eine bedeutend höhere Ausbeute erzielt. Die nach Versuch 2
erhaltenen Lösungen waren aber auch nach lOtägigem Stehen bei 0"C vollständig inaktiv.
Nach Versuch 3 betrug die Ausbeute 5,2%. Berechnet auf 300 g Candida betrug die Ausbeute 23,8mg.
Durch Einfügung eines Protaminsulfatschrittes wurde also die Ausbeute des bekannten Verfahrens nicht
verbessert.
Nach Versuch 4 betrug die Ausbeute 22%. Die Ausbeute, bezogen auf 300 g Candida-Zellen, betrug
100 mg mit 95 Einheiten. Die Ausbeute im Vergleich zu Versuch 2 bzw. 3 wurde wesentlich verbessert.
Versuch 5 wurde nur bis zur Dialyse geführt. Er zeigt, daß bei Weglassen des Anionenaustauscher-Schrittes
im erfindungsgemäßen Verfahren allein bei der Dialyse 34°O der Aktivität verlorengehen.
(Vergleichsbeispiel)
Das Verfahren der Erfindung wurde mit dem aus J. of Biol. Chem. Vol. 242, Nr. 5, S. 1030 bis 1035
bekannten Streptomycin-Sulfatschritt verglichen, indem dieser an Stelle des Protaminsulfatschrittes der
Erfindung durchgeführt wurde.
Hierbei wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, ausgehend von Candida Mycoderma ein Hochdruckaufschluß,
anschließend eine Protaminsulfatfällung, eine Behandlung mit einem Diäthylaminoäthylgruppeii
tragenden Ionenaustauscher auf Dextranbasis und dann ein Hitzeschritt, und zwar 60 Minuten bei 6O0C,
durchgeführt. Unter diesen wesentlich verschärften Bedingungen betrug die Ausbeute nach dem Hitze
schritt noch 36% der ursprünglichen Aktivität. Da die Ausbeute des vorhergehenden Anionenaustauscherschrittes
72% betrug, gingen beim Erhitzungsschritt 50% der Restaktivität verloren.
Das Verfahren wurde in gleicher Weise wiederholt,
jedoch wurde statt des Protaminsulfatschrittes eine
StreptomycinsulfatfäHung eingeschaltet. Beim anschließenden Anionenaustauscherschritt war die vierfache Austauschermenge wie bei der erfindungsgemäßen
Arbeitsweise erforderlich. Das Austauschereluat wies 5
54% der ursprünglichen Aktivität auf. Beim Erhitzungsschritt erfolgte aber ein vollständiger Verlust
der Aktivität.
StreptomycinsulfatfäHung eingeschaltet. Beim anschließenden Anionenaustauscherschritt war die vierfache Austauschermenge wie bei der erfindungsgemäßen
Arbeitsweise erforderlich. Das Austauschereluat wies 5
54% der ursprünglichen Aktivität auf. Beim Erhitzungsschritt erfolgte aber ein vollständiger Verlust
der Aktivität.
Beispiel 4 10
1. Aufschluß
300 g Oospora lactis werden mit Phosphatpuffer
pH 7,0 auf 3 1 aufgefüllt und homogen gerührt. 15
pH 7,0 auf 3 1 aufgefüllt und homogen gerührt. 15
Die erhaltene Zellsuspension wird in der Hochdruckdispersion
aufgeschlossen und mit kaltem, entsalztem
Wasser auf 101 verdünnt.
Wasser auf 101 verdünnt.
2. Protaminsulfatfällung
Die Enzymsuspension mit einem Feststoffgehalt von
bis 40 mg/ml wird mit Protaminsulfatlösung,
pH 7,0 (c = 10 mg/ml) versetzt, bis keine merkliche
Trübung mehr eintritt. Nach kurzem Rühren wird der 25 Niederschlag durch Zentrifugation oder Filtration abgeiicnnt.
bis 40 mg/ml wird mit Protaminsulfatlösung,
pH 7,0 (c = 10 mg/ml) versetzt, bis keine merkliche
Trübung mehr eintritt. Nach kurzem Rühren wird der 25 Niederschlag durch Zentrifugation oder Filtration abgeiicnnt.
3. Anionenaustauscherbehandlung
Die erhaltene Enzymlösung wird sofort mit auf pH 7,0 equilibriertem, salzfrei gewaschenem Diäthylaminoäthylgruppen
enthaltenden Dextranbasis-Austauscher versetzt, bis im Überstand keine Glycerinkinase
mehr nachweisbar ist. Der Austauscher wird abgetrennt und das Filtrat verworfen. Der Filterkuchen
wird mit dem dreifachen Volumen 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 + 0,1 M Natriumchlorid 20 Minuten
gerührt und abgenuscht. Das Filtrat wird verworfen.
Die Glycerinkinase wird nunmehr mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 + 0,3 M Natriumchlorid
eluiert.
Die vereinigten Eluate enthalten 77 % der ursprünglich vorhandenen Aktivität.
Zur Konzentrierung wird die Lösung mit Ammoniumsulfat bis 3,2 M gesättigt und abzentrifugiert,
der Überstand wird verworfen.
In der Tabelle 2 sind die in den einzelnen Stufen erzielten Ausbeuten und Aktivitätsmengen angegeben.
Stufe
ml
Aktivität
Ausbeute %
1. Extrakt der Hochdruckdispersion
Protaminsulfatüberstand
lonenaustauscher-Eluate (Ionenaustauscher = ein Diäthylaminoäthylgruppen
tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
2. Gärungs-Extrakt
Hitzeschritt bei 6O0C, Überstand
Ammonsulfat 2,05 M Lösung
Dialysat
lonenaustauscher-Eluat (Ionenaustauscher = ein Diäthylaminoäthylgruppen
tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
3. Protaminsulfatüberstand nach Gärungsaufschluß
Hiueschritt bei 6O0C, überstand
Ammonsulfat-Niederschlag, gelöst
Dialysat
lonenaustauscher-Eluat (Ionenaustauscher = ein Diäthylaminoäthylgruppen
tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
4. Protaminsulfatüberstand nach GärungsaufschluB
lonenaustauscher-Eluat (Ionenaustauscher — ein Diäthylaminoäthylgruppen
tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
Hitzeschritt bei 60 C, Überstand
Ammonsulfat-Niederschlag, gelöst
Dialysat
lonenaustauscher-Eluat (Ionenaustauscher = ein Diäthylaminoäthylgruppen
tragender Ionenaustauscher auf Dextranbasis)
5. Extrakt der Hochdruckdispersion
Protaminsulfatüberstand
Hilzesehritt bei 60 C, Üoerstand
Ammonsulfat-Niederschlag, geiöst
Dialysat
000
000
000
000
280
280
205
164
470
1000
1000
20
22
250
500
500
224
202
20
21
235
420
440
440
20
24,5
1,01
1,01
1,01
9,8
4,7
1,71
1,05
1,01
1,71
1,05
1,01
0,41
5,6
1,7
5,06
5,06
10« 10«
10s
10* 10« 10« 10*
10«
103 103 10a
3,86 · 102
2,9 -10« 1,4 -101
8,2 -103 3,96 · 103
4,14 · 103 3,22 · 103
3,20
3,2 ·
3,02
2,62
2,72.
1,81
103
102 102 102
ΙΟ2 K)2
100 100
97
100 36 22 21
8,8
100 30 9,1 6,9
5,2 100
60 28 29 23
22
100 95 82 85 56
Stufe | ml | Aktivität | Ausbeute |
Extrakt von Hochdruckdispersion
Proitaminsulfat-Überstand [onenaustauscher-Eluate (Ionenaustauscher = ein Diäthyl- aininoäthylgruppen tragender Ionenaustauscher auf Dex- tranbasis) |
5000
8 900 1590 |
2,45 · 104
2,2 -10« 1,89 · 104 |
100
90 77 |
Claims (1)
1 2
men in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen wer-
Patenfc-nspruch: den, die hierdurch erhaltene Suspension einer Prot-
aminsulfatfällung unterworfen wird, der Niederschlag
Verfahren zur Gewinnung von Glycerinkinase abgetrennt und das Filtrat in an sich bekannter Weise
aus Mikroorganismen, dadurch gekenn- 5 mit einem Anionenaustauscher auf Zellulose- oder
zeichnet, daß die einen die Aufarbeitung Dextranbasis behandelt wird, wobei diese Verfahrenslohnenden
Gehalt an Glycerinkinase aufweisenden schritte in der angegebenen Reihenfolge ι■'·..-- längere
Mikroorganismen in der Hochdruckdispersion Unterbrechung und bei einer Temperatur n höchaufgeschlossen
werden, die hierdurch erhaltene stens 100C durchgeführt werden.
Suspension einer Protaminsulfatfällung unterwor- to Das erfindungsgemäße Verfahren führt in hervorfen wird, der Niederschlag abgetrennt und das ragender Ausbeute zu einem Präparat, welches be-Filtrat in an sich bekannter Weise mit einem ständig ist. Falls eine Weiterreinigung des erfindungs-Anionenaustauscher auf Zellulose- oder Dextran- gemäß erhaltenen Glycerinkinase-Präparates erwünscht basis behandelt wird, wobei diese Verfahrens- ist, kann diese selbstverständlich in an sich bekannter schritte in der angegebenen Reihenfolge ohne 15 Weise erfolgen.
Suspension einer Protaminsulfatfällung unterwor- to Das erfindungsgemäße Verfahren führt in hervorfen wird, der Niederschlag abgetrennt und das ragender Ausbeute zu einem Präparat, welches be-Filtrat in an sich bekannter Weise mit einem ständig ist. Falls eine Weiterreinigung des erfindungs-Anionenaustauscher auf Zellulose- oder Dextran- gemäß erhaltenen Glycerinkinase-Präparates erwünscht basis behandelt wird, wobei diese Verfahrens- ist, kann diese selbstverständlich in an sich bekannter schritte in der angegebenen Reihenfolge ohne 15 Weise erfolgen.
längere Unterbrechung und bei einer Temperatur Als Mikroorganismen werden vorzugsweise Can-
von höchstens 100C durchgeführt werden. dida-mycoderma-Stämme mit einem die Aufarbeitung
lohnenden Gehalt an Glycerinkinase verwendet. Es kann aber auch von anderen Mikroorganismen mit
20 einem die Aufarbeitung lohnenden Gehalt an Glycerinkinase
ausgegangen werden.
Die Mikroorganismen können in frischem oder ein-
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Ge- gefrorenem Zustand verwendet werden. Es ist aber
winnung von Glycerinkinase, welches sich für die auch möglich, von einem gefriergetrockneten Material
Durchführung in technischem Maßstab eignet. 25 auszugchen. Im letzteren Fall wird Puffer zugesetzt,
Aus der deutschen Auslegeschrift 1 238 422 ist ein um eine Paste herzustellen, deren Konzentration
Verfahren zur Herstellung von Glycerinkinase be- frisch gewonnener Zellpaste entspricht,
kannt, bei dem Candida mycodernia {Rees) Lodder Die Zellsuspension wird in an sich bekannter Weise
kannt, bei dem Candida mycodernia {Rees) Lodder Die Zellsuspension wird in an sich bekannter Weise
et v. Rij aus dem Zentralbüro für Schimmelkulturen in der Hochdruckdispersion aufgeschlossen. Man erin
Baarn/Holland lyophilisiert, aus dem Lyophilisat 30 hält so eine Enz>msuspension, deren Feststoff gehalt
durch Gärung bei 37°C ein Extrakt hergestellt, dieser zweckmäßig zwischen 20 und 40 mg/ml betragen sollte,
einem Hitzeschritt, einer ersten Ammoniumsulfat- Gegebenenfa'ls wird vor oder nach dem Aufschluß
fraktionierung, einer Dialyse mit anschließender eine entsprechende Menge Wasser zugesetzt.
Anionenaustauscherchromatographie und anschließend Die erhaltene bnzymsuspension wird mit einer
Anionenaustauscherchromatographie und anschließend Die erhaltene bnzymsuspension wird mit einer
einer zweiten Ammoniumsulfatfraktionierung unter- 35 Protaminsulfatlösung versetzt, vorzugsweise bei einem
worfen wird. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß pH-Wert zwischen 6 und 8. Da die Glycerinkinase
hierbei häufig erhebliche Verluste auftreten. Außerdem hierbei nicht mit ausfällt, ist es möglich, erschöpfend
wurde festgestellt, daß der verwendete Mikroorganis- zufallen, und vorzugsweise wird daher ^ ο viel Protaminmus
sich gelegentlich so verändert, daß das Verfahren sulfatlösung zugesetzt, daß bei weiterer Zugabe keine
überhaupt nicht mehr durchführbar war. 40 merkliche Trübung mehr eintritt.
Es ist auch schon ein Verfahren bekannt, bei dem Der gebildete Niederschlag wird nach irgendeiner
*us Escherichia-coii-Stämmen durch Ultraschallauf- geeigneten Methode, beispielsweise durch Filtrieren
ichluß ein Extrakt hergestellt, dieser einer Strepto- oder Zentrifugieren, entfernt. Der erhaltene Filtermycinfällung.
anschließend einem Hitzeschritt, kuchen wird zweckmäßig gewaschen und das Wascheiner
ersten Ammoniumsulfatfraktionierung, einer 45 wasser mit dem Filtrat vereinigt.
Dialyse, einer zweiten Ammoniumsulfatfraktionierung Die so erhaltenen vereinigten Filtrate werden mit
Dialyse, einer zweiten Ammoniumsulfatfraktionierung Die so erhaltenen vereinigten Filtrate werden mit
und schließlich einer Chromatographie über Diäthyl- einem Anionenaustauscher auf Zellulose- oder Dex-
»minoäthyl-Zelluiose unterworfen wird (The Journal tranbasis behandelt. Vorzugsweise werden Diäthylof
Biol. Chemistry, Vol. 242, Nr. 5, 1967, S. 1030 bis aminoäthylgruppen enthaltende Ionenaustauscher auf
1035). Dieses Verfahren führt nur zu mäßigen Aus- 50 Dextranbasis oder Zellulosebasis verwendet. Die Bebeuten
von etwa 30°0 und eignet sich nicht für andere handlung kann im Bauverfahren oder auf einer Säule
Mikroorganismen. erfolgen. Bevorzugt wird wegen der Einfachheit der
Es bestand daher ein Bedürfnis nach Schaffung Durchführung die Behandlung im Batchverfahren,
eines technisch brauchbaren Verfahrens, welches zu- d. h. die direkte Zugabe des Anionenaustauschers in
verlässig reproduzierbar bessere Ausbeuten als die 55 die Enzymlösung.
bekannten Verfahren liefert. Die zu verwendende Austauschermenge läßt sich in
Ausgangspunkt der Erfindung war die Hypothese, jedem Fall durch einen einfachen Vorversuch leicht
daß die unerklärlichen Verluste beim Verfahren der bestimmen, da die Glycerinkinase an den Auslauscher
obenerwähnten deutschen Auslegeschrift auf die Tätig- gebunden wird. Es wird daher so viel Anionenauskeit
von Proteasen zurückzuführen sind. Es wurde 60 tauscher zugesetzt, bis im Oberstand Glycerinkinase
daher ein Verfahren entwickelt, bei dem durch ge- nicht mehr nachweisbar ist.
eignete Wahl der einzelnen Schritte die Möglichkeit Die Anwendung des Diäthylaminoäthyl-Zellulose-
zur proteolytischen Zerstörung des gewünschten En- schriltes auf die Glycerinkinase ist an sich bekannt
zyms weitgehend ausgeschaltet wird. und die beschriebenen Methoden zur Elution eignen
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung 65 sich auch für das Verfahren der Erfindung,
von Glycerinkinase aus Mikroorganismen besteht Wesentlich für das Verfahren der Erfindung ist daß
von Glycerinkinase aus Mikroorganismen besteht Wesentlich für das Verfahren der Erfindung ist daß
daher dann, daß die einen die Aufarbeitung lohnenden die Verfahrensschritte in der angegebenen Reihenfolge
Gehalt an Glycerinkinase aufweisenden Mikroorganis- ohne längere Unterbrechung und zweckmäßig bei einer
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