DE1517750C

DE1517750C - Verfahren zur Gewinnung von praktisch albummfreiem Lysozym

Info

Publication number: DE1517750C
Authority: DE
Inventors: Yoshitaka Hidaka Yoshio Yoshizawa Masayuki Hashimoto Akira Tokio Matsuoka
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Publication date: 1971-09-16

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung von praktisch albuminfreiem Lysozym aus Eiweiß in kristalliner oder amorpher Form, die sich für medizinischen Gebrauch eignet, so daß sie durch Injektion verabreicht werden kann.

Lysozym (EC 3, 2, 1, 17) ist ein kationisches Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 10,5, das von F 1 e m i η g als bakteriolytisches Enzym des Hiihnereiweißes entdeckt wurde, die ß{\ -> 4)-Bindung von Mucopolysacchariden oder Mucopeptiden hydrolysiert und auch Muramidase genannt wird. Dieses Enzym ist in der Natur weit verbreitet. Es wird nicht nur in Eiweiß, sondern auch in einer großen Anzahl von Geweben und Sekreten verschiedener Tiere, Vertebraten und Invertebraten und in Pflanzen gerunden.

Lysozym hat verschiedene pharmakologische Eigenschaften : Agglutiriierungswirkung, hämostatische Wirkung, Wirkung gegen Infektionen und Viren, Regenerierungs- und Vernarbungsprozesse begünstigende Wirkung, antiphlogistische Wirkung und normalisierende Wirkung auf die Enteralflora. (Die Toxizität dieses Enzyms ist sehr gering und fehlt sogar bei seinen praktischen Anwendungen.)

Diese verschiedenen Wirkungen dieses Enzyms werden in weitem Masse bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen und vielen Zuständen in der Chirurgie verwendet, beispielsweise bei Virusinfektionen und bakteriellen Infektionen, hämorrhagischen Zuständen, Gastro-Intestinal-Erkrankungen usw., und auch bei der prophylaktischen Behandlung von allgemeinen Erkrankungen und Ernährungsstörungen von Neugeborenen und Kindern. Außerdem kann dieses Enzym in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden. '

Es wurden mehrere Laboratoriumsmethoden zur Herstellung von Lysozym beschrieben. Unter diesen kanndie direkte Kristallisationsmethode von G. A 1-d e r t ο η und H. L. F e ν ο 1 d (J. Biol. Chem., Bd. 164, S. 1 [1946]) einer Produktion in technischem Maßstab angepaßt werden. Hierzu gibt man 5°/₀ NaCl zu Eiweiß, stellt den pH-Wert mit NaOH auf 9,5 ein, beimpft mit einer kleinen Menge kristallinem Lysozym und läßt das Gemisch mehrere Tage bei 4°C stehen. Dann sind 60 bis 80°/₀ des in dem Eiweiß enthaltenen Lysozyms kristallisiert. Das so erhaltene rohe Lysozym wird durch ein Umkristallinsationsverfahren in Form einer Ausfällung beim isoelektrischen Punkt oder über seine Salze gereinigt.

Das nach der obigen Methode hergestellte Lysozym oder Lysozymchlorid ist bei einer Grenzwanderungselektrophorese einmustrig, erweist sich jedoch in einer Zonenelektrophorese an einem Polyacrylamidgel nicht als eine einzige Komponente, und es werden mehr als 0,1 °/₀ Albumine (Ovalbumine und Conalbumin) als Verunreinigungen festgestellt. Ein solches unreines Lysozym kann für Medikamente, die zur oralen Verabreichung bestimmt sind, verwendet werden. Eine geringe Menge an Eiueißalbuminen kann jedoch bei parenteniler Verabreichung einen anaphylaktischen Schock hervorrufen. Zur Verwendung für injizierbare Medikamente und pharmazeutische Präparate muß daher eine weitere Reinigung vorgenommen werden, und die Albumine von Verunreinigungen müssen so weit als mcglich entfernt werden.

Durch die direkte Kiistallisationsrriethode werden Lysozym oder seine Salze, wenn die Umkristalüsationsvorgänge mehr als fünfmal in Form einer Ausfällung beim isoelektrischen Punkt oder über seine Salze wiederholt werden, in hoher Reinheit mit einem Gehalt von weniger als 0,01 °/o Albuminen erhalten. Die wiederholten Umkristallisationen führen aber unvermeidbar zu einer erheblichen Abnahme der Ausbeute an Enzym. Diese Arbeitsweise eignet sich daher nicht als technische Reinigungsmethode.

Als Methode zur Reinigung von Lysozym in Laboratoriumsmaßstab und zur Entfernung der geringen Menge an Proteinverunreinigungen wurde eine chromatographische Methode beschrieben, bei der eine Kationenaustauscherharzsäule (H. H. Ta 11 a η und W. H. S t e i η, J. Biol. Chem., Bd. 200, S. 507, 1953) verwendet wird. Bei. dieser Methode ist jedoch ein Kationenaustauscherharz in einer Menge erforderlich, die mehr als das Hundertfache (Trockengewicht) des zu reinigenden Lysozyms beträgt. Die Apparaturen müssen-daher groß sein, und das Volumen des Abflußes ist außerordentlich hoch, und die Konzentration des Lysozyms in dem Abfluß ist sehr gering. Es kann daher gesagt werden, daß die. obige Methode technisch nicht brauchbar ist.

Wenn ein Kationenaustauscherdextran · oder eine Kationenaustauschercellulose an Stelle des Kationenaustauscherharzes verwendet wird, ist die erforderliche Menge an Kationenaustauscher viel kleiner, doch ist noch etwa die gleiche Menge oder mehr an Austauscher (Trockengewicht) wie zu behandelndes Lysozym erforderlich. Solange es eine Chromatographie ist, muß die Abflußkurve von jedem Ansatz überwacht werden, und eine beträchtliche Erhöhung des Volumens des Abflusses ist unvermeidbar. Diese Methode unterscheidet sich somit nicht merklich von der Chromatographie mit einem Kationenaustauscherharz und erfordert eine sehr komplizierte Stufe für die technische Durchführung. ·

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung von praktisch albuminfreiem Lysozym.

Es wurde nun ein Verfahren zur Entfernung von Protejriverunreinigungen aus Lysozym gefunden, das daraus basiert, daß Proteinverunreinigungen (Albumine), die in aus Eiweiß erhaltenem Lysozym vorhanden sind, alle anionische Proteine sind (die isoelektrischen Punkte von Ovalbumin und Conalbumin betragen 4,6 bzw. 6,0), während Lysozym ein kationisches Protein (mit einem isoelektrischen Punkt von 10,5) ist. Erfindungsgemäß ist es möglich, in wirksamer Weise die in Lysozym enthaltene kleine Menge an Albuminen in sehr einfacher Weise durch Filtrieren einer Lysozymlösung zu entfernen, wobei ein Anionenaustauscherdextran oder eine Anionenaustauschercellulose als Filtermaterial verwendet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, industriell gereinigtes Lysozym herzustellen, bei dem keine Gefahr mehr besteht, das es bei Injektion einen anaphylaktischen Schock hervorruft.

Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens, das von demjenigen der Ionenaustauscherchromatographie völlig verschieden ist, besteht darin, daß nur Proteinverunreinigungen selektiv adsorbiert werden, während Lysozym durch das Filtermaterial durchgeht, ohne adsorbiert zu werden. Das erfindungsgemäße Verfahren sollte daher »Ionenaustauscherfiltrationsverfahren« genannt werden, und es zeichnet sich dadurch aus, daß die erforderliche Menge an Ionenaustauscher viel kleiner als die bei der Ionenaustauscherchromatographie sein kann. Im allgemeinen beträgt die erforderliche

Menge des Ionenaustauschers nicht mehr als ein Fünftel der Menge des zu behandelnden Lysozyms. Da das Volumen des Filtrats überhaupt nicht erhöht ist, ist ein Einengen des Filtrats nach der. Behandlung nicht erforderlich. (Bei der Ionenaustauscherchromatographie ist dagegen auf Grund der starken Vergrößerung des Volumens des Abflusses ein Einengen nach der Behandlung erforderlich.) Außerdem ist bei dem erfind-¹ hgsgemäßen Verfahren eine Überwachung der Abflußkurve, wie sie im Falle der Chromatographie notwendig ist, nicht erforderlich. Der Arbeitsgang ist daher sehr einfach. Dieser Umstand ist für die industrielle Herstellung ein großer Vorteil. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können Albumine in einer so geringen Menge, wie in einer Größenordnung von einem Tausendstel, die in einem' Eiweiß-Lysozympräparat zurückgeblieben sind, leicht entfernt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von praktisch albuminfreiem Lysozym ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von rohem Lysozym oder seinen Salzen mit einem Gehalt an Albuminen und anorganische Salze als Verunreinigungen entsalzt, den pH-Wert der entsalzten Lösung auf 6,0 bis 10,0 und die Ionenstärke der entsalzten Lösung auf 0,01 bis 0,5 durch Zugabe einer Pufferlösung einstellt und diese Lösung zur Adsorption von Albumin über Anionenaustauschercellülosen oder Anionenaustüuscherdextrane filtriert.

Die Anionenaustaüscher werden vorteilhaft zuvor mit einer Pufferlösung auf den gleichen pH-Wert und die gleiche Ionenstärke wie die Enzymlösung gepuffert. Die geeignete Konzentration der zu filtrierenden Lysozymlösung beträgt 1 bis 10 °/₀. Vorzugsweise stellt man die Ionenstärke der entsalzten Lösung auf 0,01 bis 0,1 ein.

Als Anionenaustauschercellulose wird vorteilhaft Guanidinoäthylcellulose^ Triäthylaminoäthylcellulose, JDiäthylaminoäthylcellulose oder Aminoäthylcellulose und Anionenaustauscherdextran als Diäthylaminoäthyldextran verwendet.

Die pH-Bedingungen, bei welchen diese Anionenaustauschercellülosen und Anionenaustauscherdextrane Lysozym nicht adsorbieren, jedoch selektiv nur Albumine adsorbieren, sind pH-Werte über 6,0, dem isoelektrischen Punkt von Conalbumin. Andererseits wird die Löslichkeit von Lysozym rasch herabgesetzt, wenn der pH-Wert der Lysozymlösung sich 10,5 nähert. In Betracht des Adsorptionsgrades von Albuminen an Anionenaustauscher und der Löslichkeit von Lysozym wird die Filtration vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,5 bis 10,0 vorgenommen.

Außerdem wird der Adsorptionsgrad der Albumine an einem Anionenaustauscher durch die Ionenstärke der Pufferlösung beeinflußt. Unter den gleichen pH-Bedingungen ist der Adsorptionsgrad von Albuminen um so größer, je niedriger die Ionenstärke ist. Wenn die Ionenstärke der Pufferlösung mehr als 0,5 beträgt, so werden Albumine unter jeglichen pH-Bedingungen nicht merklich adsorbiert. Die Filtration wird deshalb bei einer Ionenstärke 0,01 bis 0,5, vorzugsweise von 0,01 bis 0,1, durchgeführt.

Unter den obengenannten Bedingungen wird Lysozym nicht merklich adsorbiert, und die Enzymaktivität wird während des Arbeitsganges nicht herabgesetzt.

Bei der Ionenaustauscherfiltrationsmethode sind daher der pH-Wert und die Ionenstärke der Lysozymlösung wichtige Faktoren. Anorganische Salze enthaltendes rohes Lysozym muß daher entsalzt werden, bevor die Ionenaustauscherfiltration zur Entalbuminierung durchgeführt wird. In einigen Fällen kann der Entsalzungsarbeitsgang nach diesem Filterverfahren erforderlich sein.

Im allgemeinen werden anorganische Salze in einer Enzymlösung durch Dialyse durch eine semipermeable Membran, wie beispielsweise eine Collodiummembran oder durch eine Cellophanmembran, entfernt. Außerdem wird häufig eine Entsalzung mit lonenaustauscherharzen unter Verwendung einer Mischbettvorrichtung angewendet. Es kann auch eine Elektrodialyse angewendet werden.

Die Dialyse mittels einer semipermeablen Membran ist die üblichste und einfachste. Es besteht hier jedoch eine Grenze bezüglich der behandelten Menge. Selbst wenn solche in den letzten Jahren entwickelte nahtlose Cellophanschläuche verwendet werden, ist das Verfahren für eine Produktion in technischem Maßstab nicht geeignet. Als Ersatzmethode kann eine Elektrodialyse genannt werden,, mit der eine Massenbehandlung möglich ist. Ihr größter Mangel· bei der Entsalzung einer Lysozymlösung oder einer Lysozymsalzlösung besteht darin, daß Lysozymmoleküle selbst, _ obgleich Lysozym ein Enzymprotein- ist,' durch die semipermeable Membran durchgeht. Es braucht jedoch nicht gesagt zu werden, daß die Diffusionsgeschwindigkeiten von anorganischen Salzen und Lysozymmolekülen voneinander so verschieden sind, selbst bei der Dialyse, daß der Zweck des Entsalzens erreicht wird.

Es ist jedoch unvermeidbar, daß die Ausbeute an Lysozym um so geringer ist, je länger die Dialysezeit ist. Die Entsalzungsmethode mittels Ionenaustauscheiharzen ist zwar eine ausgezeichnete Methode, die für

. Massenbehandlung angewendet werden kann, doch kann sie nicht bei allen Enzymen angewendet werden. Bei einigen Enzymen kann nämlich die Aktivität durch die Ionenaustauscherbehandlung verlorengehen. Die Entsalzung einer Lysozymlösung mit einem Ionenaustauscherharz wurde. von H. H. T a 11 a η und

W. H. S t e i η (J. Biol. Chem., 200, S. 507, 1953) beschrieben. Gemäß dieser Veröffentlichung beträgt die Gewinnungsrate an Lysozym, wenn eine Lysozymlösung mit einer Mischbett-Harzsäule entsalzt wird, nur 75%. Es wird dort der Schluß gezogen, daß es unmöglich ist, eine Lysozymlösung durch eine Ionenaustauscherharzbehandlung· vom Mischbett-Typ ohne Denaturierung des Enzyms zu entsalzen. ■

Es wird daher vorzugsweise eine Ionenaustauscherharzentsalzung vom Doppelbett-Typ ohne Verwen-

50; dung des Mischbett-Typs durchgeführt, wobei eine Entsaltung einer Lysozymlösung ohne Verlust ■ an Aktivität erfolgt. Zu diesem Zweck wird die Lösung zuerst mit einem Kationenaustauscherharz und dann mit einem Anionenaustauscherharz behandelt, so daß die Kationen und die Anionen von niedrigen Molekülen getrennt entfernt werden können.

Gemäß dieser. Verfahrensweise beträgt die Gewinnungsrate des Lysozymproteins mehr als 95 °/₀, und die Lysozymlösung kann.ohne irgendwelche Inaktivierung des Lysozyms entsalzt werden. Außerdem ist im Falle des üblichen Mischbett-Typs der pH-Wert der entsalzten Lysozymlösung auf die Nähe des isoelektrischen Punkts von Lysozym (pH 10,5) beschränkt, während er bei dem erfindungsgemäßen Verfahren je nach Wunsch durch Steuerung der verwendeten Menge des Anionenaustauscherharzes eingestellt werden kann. Im alkalischen Gebiet ist die Lysozymlösung allerdings instabil. Bei Anwendung des Doppelbettes

darf daher die Anionenaustauscherharzbehandlung nicht zuerst durchgeführt werden, weil sonst die Lösung stark alkalisch wird und die Aktivität des Lysozyms verlorengeht.

Demzufolge ist es bevorzugt, daß eine Lösung von Lysozym oder seinen Salzen, die niedrigmolekulare Salze enthält, zuerst mit einem Kationenaustauscherharz in einer berechneten Menge oder in einem Überschuß über die berechnete Menge behandelt wird, so daß anorganische Kationen entfernt werden können, und die durch Entfernung des Kationenaustauscherharzes erhaltene saure Lysozymlösung mit einem Anionenaustauscherharz im Überschuß, in einer berechneten Menge oder in einer kleineren Menge als der berechneten behandelt wird.

Allgemein ist ein Enzymprotein so instabil in einer stark sauren oder stark alkalischen Lösung, daß es irreversibel denaturiert und inaktiviert wird. Es wurde jedoch gefunden, daß die Lysozymaktivität nicht verlorengeht, selbst wenn die Lösung in starker Acidität mit einem pH-Wert von weniger als 1 bei Zimmertemperatur für mehr als 24 Stunden belassen wird. In der lonenaustauscherharz-Entsalzungsmethode vom Doppelbett-Typ, wie sie oben beschrieben ist, wird bei Entfernung der anorganischen Kationen durch die erste Kationenaustauscherharzbehandlung der pH-Wert der Lösung merklich herabgesetzt und die Lösung stark sauer, doch wird Lysozym während der Behandlung nicht inaktiviert. Zur Erzielung einer ausreichenden Wirkung des Kationenaustauscherharzes ist es jedoch zweckmäßig, daß der pH-Wert der Lysozymlösung nach der Kationenaustauscherharzbehandlung über 1,5 gehalten wird. Je höher die Salzkonzentration in der Lösung ist, um so niedriger ist der pH-Wert der mit dem Kationenaustauscherharz behandelten Lösung, doch wird der pH-Wert unter dem Einfluß des gleichzeitig vorliegenden Enzymproteins etwas erhöht. Andererseits wird, da die Viskosität der Lösung proportional zu der Proteinkonzentration ansteigt,, der Harzbehandlungsarbeitsgang schwierig, wenn die Viskosität zu hoch ist. Die Behandlung ist daher am leichtesten, wenn die Lysozymkonzentration etwa 5 bis 10% beträgt. , '

Zur Entsalzung einer Lysozymlösung nach der oben beschriebenen Verfahrensweise können fast alle Sorten von Kationenaustauscherharzen wirksam verwendet werden. Im Falle eines Kationenaustauscherharzes mit einer hochgradig porösen und makroretikularen Struktur tritt jedoch eine Adsorption von Lysozymprotein selbst auf, und die Gewinnungsrate von Lysozym wird erniedrigt. So wurden beispielsweise, was die Entsalzungswirkung eines Kationenaustauscherharzes, zeigt, 2 g von jeder von verschiedenen Arten von Kationenaustauscherharzen (in feuchtem Zustand) zu 10 ml einer wäßrigen 10°/₀igen Lysozymchloridlösung mit einem Gehalt von 2,8 °/₀ NaCl zugegeben und die Lösung bei Zimmertemperatur 1 Stunde behandelt. Die Ergebnisse der Messung der Änderung des pH-Wertes, des Gehaltes an verbliebenem NaCl, der Gewinnungsrate des Lysozyms und der spezifischen Aktivität je Milligramm Lysozymprotein sind in der nachfolgenden Tabelle I gezeigt.

. .· .,Tabelle! ■-. 7. ;.· ■;/'■/.^:. ;-■::·; : :'■■:/■'] . ...'." ..'■'.■:. Entsalzungswirkung von stark sauren Kationenaustauscherharzen und deren Einfluß auf Lyzsoym

Kationenaustauscherfaarze

Gehaltan verbliebenem

.. ■ ■ . NaQ

Gewinnungsrate

von Lysozym

in %

Rate der verbliebenen spezifischen Aktivität

der Lysozyme ■in.*/.

Kontrolle (nicht behandelt) .. _v..... ...........

Ein Styrolharz mit stark saurem SO₃H-Kern und einem

Gehalt von 1 °/₀ Divinylbenzol

Dasselbe mit einem Gehalt von 2°/₀ Divinylbenzol ... Dasselbe mit einem Gehalt von 4°/₀ Divinylbenzol ... Dasselbe mit einem Gehalt von 8 °/₀ Divinylbenzol ... Dasselbe mit einem Gehalt von 10°/„ Divinylbenzol .. Dasselbe mit einem Gehalt von 12°/₀ Divinylbenzol .. Dasselbe mit einem Gehalt von 16°/₀ Divinylbenzol ..

Styrolharz mit stark saurem SO₃H-Kern .

Styrolharz mit stark saurem SO₃H-Kern

4,4

2,8

2,2	0,045
2,2	0,043
2,1	0,031
2,1	0,022
2,1	0,054
2,1	0,045
2,1	0,030
2,2	0,032
2,1	0,040
1,7	0,098

100

100,7
99,6
99,1

102,1

100,0
99,5

100,2
99,8

101,5
70,1

100

106,0 101,5

99,5

99,7 104,1

95,7 102,8 102,0

98,5 ■91,5

Andererseits trat im Falle von Anionenaustauscherharzen keine Adsorption des Enzymproteins auf. Diese Harze können daher in der gleichen Weise wie gewöhnliche Gelharze verwendet werden. 1 ·

Es kann entweder die chargenweise Methode oder die Säulenmethode für die Kationenaustauscherharzbehandlung angewendet werden. Im Falle der Anionenaustauscherharzbehandlung ist jedoch die chargenweise Methode geeignet, wenn der pH-Wert niedriger als der isoelektrische Punkt des Lysozyms sein soll. Wenn ein Anionenaustauscherharz in der berechneten Menge oder in einem Überschuß verwendet wird, kommt der pH-Wert der entsalzten Lysozymlösung in die Nähe des isoelektrischen Punktes des Lysozyms. Wenn jedoch eine geringere Menge als die berechnete verwendet wird, läßt sich der pH-Wert auf irgendeinen Wert unterhalb des isoelektrischen Punktes des Lysozyms einstellen.

Erfindungsgemäß gereinigtes Lysozym und/oder seine Salze verhalten sich homogen in einer Grenzwanderungselektrophorese und einer Zonenelektrophorese an einem Polyacrylamidgel. Der nach einer immunologischen Prüfung ermittelte Gehalt an Ovalbuminen und Conalbumin beträgt etwa 0,005 °/₀. Wird die Ionenaustauscherfiltration erneut durchgeführt, so lassen sich in dem gereinigten Lysozym-

1Oi/ /OU

präparat Albumine nicht nachweisen, selbst nicht durch die immunologische Prüfung. Während dieses Arbeitsganges beträgt die Gewinnung an Lysozym fast 10O⁰I₀.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende Schema erläutert: ·

Eiweiß

Rohes Lysozym (anorganische Salze
und Albumine enthaltendes Rohprodukt)

!I

^ . , f Kationenaustauscherharzbehandlung

Entsalzung { . ■ ■ . . ,, , ,,

° {Amonenaustauscherharzbehandlung

Entalbuminierung

lonenaustauschfiltration, wobei eine Anionenaustauschercellulose oder ein Anionenaustauscherdextran' als Filtermaterial verwendet wird

Praktisch albuminfreies Lysozym

Die Aktivität von Lysozym wurde durch Messung der Lyse einer Suspension von Micrococcus Lysodeikticus ATCC 4698 nach einer turbidimetrischen Methode bestimmt. Diese Meßmethode war eine Modifizierung von G. Litwack (Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., Bd. 89, S. 401, 1955). Eine so hergestellte Suspension von lyophilisiertem Micrococcus Lysodeikticus (in m/15-Phosphatpufferlösung von pH 6,2), daß die Ablesung auf einem photoelektrischen Kolorimeter vei Verwendung eines Rotfilters (Hauptwellenlänge: 640 ΐημ) einen Extinktionswert von 1,0 zeigte, wurde als Substratlösung verwendet. Die Differenz (E₀ — E) zwischen dem Extinktionswert (E) bei Zugabe der gleichen Menge einer Enzymlösung "zu der Substratlösung und Umsetzung der gemischten Lösung bei 35° C während 10 Minuten und dem Extinktionswert (E₀) bei Zugabe der gleichen Menge einer Pufferlösung an. Stelle der Enzymlösung und Behandlung der gemischten Lösung in der gleichen Weise wurde als Menge an lysierten Bakterien festgesetzt. Die Aktivität, die der Differenz (E₀ — £)/l,0 des herabzusetzenden Extinktionswertes je Minute entsprach, wenn in ImI der Reaktionslösung enthaltenes Lysozym unter den obengenannten Bedingungen umgesetzt wurde, wurde als 1 Einheit bestimmt.

Eine Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde zum Nachweis von mehr als 0,1 °/₀ an im rohen Lysozym enthaltenen Albuminen angewendet. Wenn ein konstanter Strom von 9 mA/cm² (70 Volt) unter Verwendung einer Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung (mit einer Ionenstärke von 0,09) 4 Stunden floß, wurde Lysozym um 35 mm nach der Kathode hin bewegt, und Conalbumin und Ovalbumin wurden um 4 bzw. 20 mm nach der Anode hin bewegt. Nach Färbung mit Amidoschwarz 1OB lag die Grenze des Nachweises von Albumin bei etwa 5 γ, und mehr als .0,1 °/₀ Albumine, die als Verunreinigungen in Lysozym vorhanden waren, konnten nachgewiesen werden.

Im Falle von gereinigtem Lysozym, das nicht mehr als 0,1 °/₀ Albumine enthielt, war der Nachweis der Albumine nach einem phys'kalisch-chemischen Verfahren so schwierig, daß die Albumine nach einer immunologischen Prüfung nachgewiesen wurden. Die geringe Menge an Albuminen, die im Lysozym enthalten war, konnte nach einer P.C.A.-Methode unter Verwendung eines passiv mit Kaninchen-anti-Ovalbumin oder mit Kaninchen-anti-Conafbumin sensibilisierten .Meerschweinchens (Z. O vä ry: Progress in Allergy, Bd. 5, S. 459, 1958) oder nach der Methode der Hämagglutinierungs-Inhibjerungsreaktion mit Gerbsäureprotein, verbunden mit Schafserythrocyten (A. B. Stavitsky, J. Immunol., Bd. 72, S. 360, 1954), einem, mit Gerbsäure behandelten Schafserythracytenkoagulat, nachgewiesen werden. Unter Verwendung einer solchen immunologischen Prüfung konnte^das Vorhandensein von mehr als etwa 0,005°/_e Ovalbumin oder Conalbuminim Lysozym nachgewiesen werden. ^:
Die Lysozymproteinkonzentration_ in der Lösung wurde quantitativ durch Messung des UV-Spektrums bestimmt. Der Extinktionskoeffizient (£{*„ 280 ηιμ) bei 280 πιμ betrug 26,35 (A. J. S ο ρ h i a η ο ρ ο u 1 ο s, C. K. Rhodes, D. N. H ο lc ο ms, K. Evan H ο 1 de, J. Biol. Chem., Bd. 237, S. 1107, 1962). Das NaCl wurde .nach einer flammenphotometrischen Methode quantitativ bestimmt. ,

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung:

Beispiel 1

8 g rohe Kristalle von Lysozym (mit einem Gehalt von etwa 0,2 °/„ Conalbumin, weniger als 0,1 °/o Ovalbumin und 2,7°/₀ NaCl), das nach einem Bentonit-Adsorptionsverfahren nach Alderton und Mitarbeiter (3mal umkristallisiert) hergestellt war, wurden in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde dialysiert und dann durch Zugabe eines Böratpuffers von pH 8 eingestellt (die Endkonzentration des Lysozyms betrug 4% in m/100-Boratpuffer).

Diese Lösung wurde durch eine Filtriersäule filtriert, , die mit 2 g (Trockengewicht) Guanidinoäthylcellulose gefüllt war, die zuvor mit m/100-Boratpuffer voii pH 8,0 behandelt worden war.

Das Filtrat wurde gegen 10~³ n-HCI dialysiert und lyophilisiert, wobei 6,2 g gereinigtes Lysozymchlorid erhalten wurden. Die Lysozymaktivität betrug 57 Einheiten/mg. Das Produkt erwies sich als eine einzige Komponente bei einer Polyacrylamidgelelektrophorese. Der Gehalt an Albuminen betrug nach einer immunologischen Prüf ung etwa 0,005 °/₀.

^: Beispiel 2

20 g eines rohen Lysozymchloridpulvers (mit einem Gehalt von etwa 0,5 °/₀ Conalbumin, etwa 0,2 E Ovalbumin und etwa 4 ⁰J₀ NaCI), das nach dem direkten Kristallisationsverfahren von Alderton und Mitarbeiter (lmal umkristallisiert) hergestellt worden war, wurden in Wasser so gelöst, daß eine 10°/₀ige Lösung erhalten wurde. Die Lösung wurde durch eine Säule geleitet, die mit etwa 50 g Styrolharz mit stark saurem SO₃H-Kern und 8 °/₀ Divinylbenzol (als nasses Harz) gefüllt war. das zuvor als Η-Typ hergestellt war, und

. 109 638/122

die Säule wurde mit Wasser gewaschen, bis kein Lysozymprotein mehr nachweisbar war. Der Abfluß und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt. Zuvor als OH-Typ hergestelltes Styrolharz mit stark basischer N(CH₃)₃-Gruppe wurde allmählich zu einer vereinigten Lösung unter Rühren so zugegeben, daß der pH-Wert 7,5 betrug. Der Gehalt an NaCl in dieser Lösung betrug 0,02 °/₀, bezogen auf das in der Lösung gelöste vorhandene Lysozym. Die Gewinnungsrate an Lysozym betrug 96 °/o-

Die so erhaltene entsalzte Lösung (mit einem Gehalt von 19,2 g Lysozym) wurde durch Zugabe eines Phosphatpuffers von pH 7,5 so eingestellt, daß die Endkonzentration an Lysozym etwa 5% in m/100-Phosphatpuffer betrug. ■' Eine kleine Menge an unlöslichen Bestandteilen wurde entfernt.

Die klare Lösung wurde durch eine Filtriersäule filtriert, die mit 2 g (Trockengewicht) Diäthylaminoäthyldextran (chemisch vernetztes Dextran) gefüllt war, das zuvor mit einem m/100-Phosphatpuffer von pH 7,5 gepuffert worden war. Die Gewinnungsrate an Lysozym bei diesem Filtrierarbeitsgang betrug 98°/o.

Zu der Hälfte des Volumens des Filtrats wurden etwa 5 g nasses Styrolharz mit stark saurem SO₃H-Kerri zugegeben, das zuvor als Η-Typ zubereitet war, und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur etwa 1 Stunde gerührt. Das Harz wurde durch Filtrieren entfernt und 3mal mit einer minimalen Menge Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und durch allmähliche Zugabe von Styrolharz mit stark basischer N(AIkyl)₂-Alkohol-Gruppe, das zuvor als OH-Typ zubereitet war, neutralisiert. Das Harz wurde abfiltriert und 3mal mit einer minimalen Menge Wasser gewaschen. Dann wurden die Waschflüssigkeiten mit dem Filtrat vereinigt. Nach Lyophilisieren des Gemisches wurde ein gereinigtes Lysozympulver erhalten. Die Gewinnungsrate an Lysozym betrug 98,4 °/₀. Das Produkt erwies sich als eine einzige Komponente bei einer Polyacrylamidgelelektrophorese. Nach der immunologischen Prüfung wurden etwa 0,005 % Albumine in dem Präparat festgestellt. Der Gehalt an anorganischen Salzen betrug 0,03%.

10

B e i s ρ i e 1 3

Wurde das durch die Ionenaustauscherfiltration unter Verwendung von Diäthylaminoäthyldextran (vgl. Beispiel 2) als Filtermaterial im Beispiel 2 entalbuminierte Filtrat nochmals einer Ionenaustauscherfiltration unter den gleichen Bedingungen ohne Entsalzung und Lyophilisation unterzogen, so war es unmöglich, Albumine nachzuweisen, selbst nicht durch

ίο die immunologische Prüfung. Während der 2mal wiederholten Ionenaustauscherfiltrationen konnten 96% Lysozym wiedergewonnen werden.

Das Filtrat wurde dann gegen 10~³n-HCl dialysiert und unter Verwendung eines feinporigen Filters filtriert und lyophilisiert. Es wurde so ein salzfreies . Lysozymchloridpulver, in dem auch immunologisch kein Albumin nachzuweisen war, erhalten und das sich für Injektionszwecke eignet. Die Gewinnungsrate des Lysozyms betrug 75 %.

Rohes kristallines Albumine enthaltendes Lysozymchlorid und gemäß Beispiel 3-erhaltenes praktisch albuminfreies Lysozymchlofid wurden nach der folgenden Prüfmethode bezüglich Anaphylaxie geprüft. - ' Methode: Männliche gesunde Meerschweinchen mit einem Gewicht von je 250 bis 350 g wurden verwendet. Jedem von zehn Meerschweinchen wurden 10 mg Lysozym je Kilogramm Körpergewicht 5mal jeden zweiten Tag intramuskulär injiziert. An dem 21. bis 28. Tag nach der letzten Injektion wurden jedem Meerschweinchen auf intramuskulärem Weg Erkennungsinjektionen von 10 mg Lysozym je Kilogramm verabfolgt. Als Kontrolle wurden Meerschweinchen verwendet, die in der gleichen Weise mit Kochsalzlösung behandelt wurden. Nach der Erkennungsinjektion wurde die Reaktion der Tiere 15 Minuten lang beobachtet. Diejenigen, die einen starken Schock (anaphylaktischen Schock), wie beispielsweise eine Ataxie und eine Konvulsion u. dgl., zeigten oder starben, waren positiv. Falls alle negativ waren, wurden die zum Test verwendeten Proben als nicht anaphylaktisch bewertet. Ergebnisse: Die bei den Prüfungen erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

	Tabellen	Geprüftes Lysozymchlorid	■	Negativ	Positiv
Beispiel	Albumine enthaltendes rohes kristallines Lysozym chlorid*) praktische albuminfreies Lysozymchlorid von Bei spiel 3	Anzahl der geprüften Tiere	0 10	9 0
1 2	9 10

*) Nach der direkten Kristallisationsmethode von A1 d e r t ο η und Mitarbeitern (lmal umkristallisiert) erhaltene Lysozymchloridkristalle wurden dialysiert, entsalzt und dann lyophylisiert. Das Produkt enthielt 0,2% Ovalbumin und 0,5 °/o Conalbumin.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von praktisch albuminfreiem Lysozym, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von rohem Lysozym oder seinen Salzen mit einem Gehalt an Albuminen und anorganischen Salzen als Verunreinigungen entsalzt, den pH-Wert der entsalzten Lösung auf 6,0 bis 10,0 und die Ionenstärke der entsalzten Lösung auf 0,01 bis 0,5 durch Zugabe von Pufferlösung einstellt und diese Lösung zur Adsorption von Albumin über Anionenaustauschercellulosen oder Anionenaustauscherdextrane filtriert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ionenstärke der entsalzten Lösung auf 0,01 bis 0,1 einstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Entsalzung der wäßrigen

1 0 1/ /OU

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Lösung von rohem Lysozym oder seinen Salzen zeichnet, daß man als Anionenapstauschercellulose

unter Anwendung eines Doppelbettes aus Kat- ' Guanidinoäthylcellulose, Triäthylaminoäthylcellu-

ionenaustauscher- und Anionenaustauscherharz lose, Diäthylaminoäthylceilulose oder Aminoäthyl-

durchführt. cellulose und als Anionenaustauscherdextran Di-

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 5 , äthylaminoäthyldextran verwendet.