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Verfahren zur Herstellung von Dextran -Abbau-Produkten für medizinische
Zwecke Es ist bereits lekannt, daß durch eine milde hydrolytisclle Behandlung des
hochmolekularen, neutralen P()ly saccharids Dextran ein Produkt erhalten werden
kann, welches für medizinische Zwecke, z. B. bei Salben, als Plasmaersatzmittel
und in Lösungen verwendet wurde, welche für Funktionspriifungen, z. B. der Nieren,
benutzt werden. Zu diesem Zweck wurde eine milde hydrolytische Behandlung von Dextran
angegeben, welche in einem sauren Medium ausgeführt wurde, so daß eine tilischung
von polymeren Homologen von teilweise depolymerisiertem Dextran erhalten wird, welche
in Wasser löslich ist und bei einer Konzentration voll 4O in Wasser eine relative
\'iskosität zwischen 1,3 und 15 zeigt, obwohl diese Viskosität, wie jetzt nachgewiesen
wurde, in gewissen Fällen vorteilhaft bis auf 1,2 herabgesetzt werden kann.
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Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß T)extran-Abbau-Produkte
mit solchen Eigenschaften durch eine geregelte teilweise Spaltung des Dextrans auf
enzymatischem Wege erhalten werden können, z. B. mit Hilfe von Enzymen oder Mikroorganismen,
welche in einem Dextran enthaltenden Substrat, welches Enzyme erzeugt, kultiviert
wurden. Die Arbeitsbedingungen können in weiten Grenzen verschieden gewählt werden,
und indem man Proben in verschiedenen Zwischenräumen entnimmt und die Viskosität
feststellt, ist es möglich, die erforderlichen Behandlungsperioden zu ermitteln,
welche für die Erreichung des gewünschten Spaltungsgrades verlangt werden.
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In diesem Zusammenhang wird bemerkt, daß der Ausdruck Mikroorganismen
Bakterien, Schimmel, Hefen und andere Pilzarten einschließt. Unter diesen
'.Iikroorganismen
hat sich beispielsweise die Art Cellvibrio (z. B. C. fulva) als geeignet erwiesen.
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Im folgenden sind einige Ausführungsbeispiele für die Herstellung
von teilweise gespaltenem und dennoch hochmolekularem Dextran angegeben, und zwar,
nach der vorliegenden Erfindung mit Hilfe -on Enzymen und Enzyme erzeugenden Mikroorganismen.
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Beispiel I Der Mikroorganismus Cellvibrio fulva wird in einem Substrat
von folgender Zusammensetzung geziichtet: 0,5 g NaN03, 0,25 g K2HPO4, 0,1 g MgSO4,
7 g H20, 20 g Dextran und I 1 Leitungswasser. Die Bakterien werden, nachdem sie
sich genügend entwickelt haben, in der Kulturflüssigkeit in einer geeigneten Stühle
zerrieben. Die Lösung wird in einem Nitrocellulosebeutel einige Tage lang bei einigen
Graden über Null gegen Wasser dialysiert. Nach der Dialyse wird die I,ösung zentrifugiert,
bis sie klar ist, und durch ein Glasfilter, z. B. Jena G 4, filtriert.
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Ein solcher Enzymextrakt wurde dann zur Dextranlösung gegeben. Der
Dextrangehalt der Lösung war 0,7%. Die Versuchstemperatur war 25,o° C, und der Wert
betrug 5,2.
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Die Spaltung des Dextrans wurde unter anderem durch Messungen der
Viskosität und Bestimmungen des Betrages von reduzierendem Zucker verfolgt.
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I)ie folgende Tabelle zeigt, wie die relative Viskosität im Laufe
der Zeit unter den erhaltenen Versuchsbedingungen sinkt.
| Zeit nach Relative Spe- Betrag des frei |
| Beginn des Viskosi- zifische gewordenen reduzie- |
| Versuchs Viskosi- renden Zuckers in Pro- |
| in Minuten tät tät zenten des Dextrans |
| o I,78 0,78 0 |
| 7 1,76 0,76 |
| 20 I,72 0,72 |
| 50 I,6I o,6I |
| 6,6 1,57 0,57 o |
| 100 1,50 0,50 |
| 230 1,33 0,33 |
| 367 1,24 o,24 1 |
| 54° 1,19 0,19 2 |
| 1406 1,09 0,09 3 |
Parallel mit diesem Enzymversuch wurde ein Versuch unter denselben Versuchsbedingungen,
aber mit dem Unterschied ausgeführt, daß das Enzym in der zugesetzten Enzymlösung
durch Wärmebehandlung zerstört worden war. Bei diesem Vergleichsversuch wurde keine
Viskosität erniedrigung erhalten.
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Diese Versuche sind, wie erwähnt, mit einer Nonzentration von 0,70/0
ausgeführt, bezogen auf eine 4°/'Oige Lösung. Der Wert bei einer Versuchszeit von
230 Minuten für die relative Viskosität 1,33 entspricht bei einer 4%igen Lösung
einem relativen Viskositätswert von 4,2, und bei einerVersuchszeit von 1406 Minuten
entspricht dem angegebenen Viskositätswert von 1,09 bei einer 4%igen Lösung ein
Wert von I,5.
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Die relative Viskosität ar = t//710, wobei rl die Viskosität der
Lösung mit z1O die Viskosität des Lösungsmittels, im vorliegenden Fall Wasser, ist.
Die spezifische Viskosität r/,p = 1.
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Wie aus dieser Tabelle zu ersehen, wird die Viskosität deutlich herabgesetzt,
obwohl nur sehr geringe Beträge von reduzierendem Zucker gebildet werden.
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Im Laufe des Versuches wird auch die Niederschlagskonstante erniedrigt.
Der Versuch zeigt, daß während der ersten Spaltung des Dextrans verhältnismäßig
große Bruchstücke des nextranmoleküls gebildet werden. Nach der vorliegenden Erfindung
kann diese Teilspaltung. des Dextrans unterbrochen werden, wenn der gewünschte Viskositätswert
erreicht ist. Dies kann durch Zerstörung des Enzyms, z. B. durch Erhitzen, geschehen.
Auf diese Weise ist es mit Hilfe von Enzymen möglich, das Dextran teilweise auf
eine solcheMolekulargröße zu spalten, welche in die obenerwähnten Grenzen für die
relative Viskosität des schon früher bekannten, teilweise hydrolysierten t)extrans
fällt.
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Beispiel 2 Zu 500 cm3 4%iger hochviskoser Rohdextranlösung werden
200cm3 Enzymlösung zugegeben, welche durch wässerige Extraktion einer Cellvibrio-fulva-Kultur
hergestellt wurde. Der pH-Wert der Mischung ist 5,2.
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Die Temperatur wurde bei 25° C gehalten. (Gleichlaufend mit diesem
Versuch wurde ein Kontrollversuch in derselben Weise ausgeführt, nur mit dem Unterschied,
daß das Enzym weggelassen wurde.) Nach 3 Tagen wurde das Dextran in beiden Versuchen
mit Alkohol ausgefällt. Das Dextran wurde noch einmal in Wasser aufgelöst und durch
Dialyse gegen Wasser in einem Beutel aus Cellulosehydratfolie gereinigt. Die aus
dem teilweise gespaltenen Dextran durch Enzymwirkung bereitete Dextranlösung hatte
einen Gehalt an Trockensubstanz, der bis auf 3,5% anstieg, und ihre relative Viskosität
war 5,2, was in 4%iger Lösung einer relativen Viskosität von 6,I entspricht. (Die
aus dem Dextran aus dem Kontrollversuch bereitete Dextranlösung hatte einen Gehalt
an Trockensubstanz, welcher bis zu 2,80/o stieg, und ihre relative Viskosität war
28,7.) Der Versuch zeigt, daß es auf diesem Wege möglich ist, ein teilweise gespaltenes
Dextran zu erhalten, welches innerhalb der oben angegebenen Grenzen liegt.
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Beispiel 3 Rohdextran wurde der unmittelbaren Einwirkung des Mikroorganismus
Cellvibrio fulva in einer Lösung folgender Zusammensetzung bei 25 bis 30 C ausgesetzt:
Na N 03 0,5 g K2HPO4 . 0,25 g MgSO4 . 0,1 g Rohdextran .. . 20 g Leitungswasser
. . .. 1 1 Das Wachstum des Mikroorganismus wurde u. a. durch die Bildung einer
gelben Farbe im Substrat und die deutliche Herabsetzung der Viskosität der Kulturflüssigkeit
infolge der Spaltung des Dextrans beobachtet. Durch Entnahme von Proben in geeigneten
Zwischenräumen, Fällen des Dextrans mit Alkohol, Reinigen desselben durch Dialyse
und Messen der Viskosität der isolierten Dextranproben ist es so möglich, Produkte
mit einem geeigneten Spaltungsgrad
in derselben Weise wie nach Beispiel
I und 2 herzustellen. Die Spaltung des Dextrans kann z. B. unterbrochen werden,
wenn bei einer Konzentration von 40/0 die relative Viskosität 7 beträgt.
| Dauer der Hy(trolyse Relative Viskosität |
| in Stunden (6%) |
| I Ion |
| 75 |
| () 37 |
| S 27 |
| 19 14 |
| 44 6,7 |
| jo 6.1 |
| h7 4.5 |
| 146 2,3 |
| 356 1,8 |