DE1467970A1 - Verfahren zur Herstellung antikarzinogener Stoffe - Google Patents

Description

Jap..Io, 20916/63

♦6255/65 \ 6590^/63 \

XeJcen K&iteJta tabusMki Ialaha. lael-iuJiBae-olio, Koaaeo««, B\mkyo-kn_f Tokyo/Japan

Verfahren eur Heretell\mg antikarainogener Stoffe Dt % Srftnduog betrifft «in ¥«rf^^«n eur

' xarsiacgen wirkender Stoffe - ^Ma Beaibueroiu, rd anderSu I^ilana-x». 1·ϊ Gattung der Orsssinan·»· und Rohr-

» JjuiwiaoMdere Wtriift die ErfiMung ein ?erauf Herateilon« eines Polysaccharideβ nit antlkareino-

der Blätter und Stiele

vo?i Baabue oäs^-aadt^tn FÜamsem» die sur §att\ucm der öramingetit).ran, alt Widern Ws&as©^» Eoneentriarmig de» Sxtrak-

J 0 a 6 'J 5 ' Ο 3 S

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tee unter vermindertem Druck und Behandlung

durch Dialyse, Aussalzen, Behandlung mit stark sauren und stark basischen Kunstharz-Ionenaustauschern, Bntfarbungsharz und Bleiacetat. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung einer Polysaecharid-Praktion mit antikarzinogener Wirkung aus Melasse durch

Dialyse, Aussalzen, Behandlung mit

stark sauren und stark basischen Kunstharz-Inonenaustauschern, Entfärbungeharz und Bleiacetat„

In den Extrakten von Bambus, Bambusgras und anderen Pflanzen,die zur Gattung der Graminaceae gehören, und in Melasse wurde erfindungsgemäß eins Substanz mit antikarzino£;ener Aktivität nachgewiepen. Im Vergleich zu den bekannten antikarzinogenen Substanzen zeigt die vorliegende antikarzinogene Substanz eil·= a signifikante antikarsinogene Wirksamkeit, ohne Ν,.οβη-wix klingen aufzuweisen» Aus der Untersuchung d^r vorliegenden Substanz kanr~ geschlossen werden, daß es sich, wie später im einzelnen gezeigt werden soll, um ein Polysac;harid handeln muli. Der Wirkiingsmeohanieraus der Substanz, der an Tufi->r tieren nachgewiesen vmrde, ist wie im folgenden ein&tfhender gezeigt will, höchst beißerkenswert ο

Einer der für das erfindungsgeraäße Verfahren verwende :.c»n Rohstoffe ist Bambua und Baznbusgras, das zur Gattung eier

BAD ORKa'NAL

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Gramincae gehört, ζ. Β·:

Phyllostachys pubeecene HAZEL» Pleioblastue Simonii KAKAI,

Pleioblastue Chino MAKIHO forma Laydekeri HAKIlIO,

Phyi'oetaehys bambueoidee SIEB, et ZUCC·,

Phyllostachys nigra HUHRO, -

Sas a nipponica HAKIHO et SHIBATA, Shibntaea Kumasaoa HAKIHO, Sasa olbo-marginata HAKINO et SHIBATA, Sasa paniculate HAKINO et SHIBATA, Saeaella ramoea HAKINO, Pleioblastus Chino HAKINO, Pleioblastus variegatua HAKINO var.

viridis HAKINO forma glabra HAKINO.

Hauptiachlich werden die Blätter und Stiele, insbesondere von Saea albo-marginata, HAKINO et SHIB , Sasa paniculata, i HAKINO et SHIB oder nahe verwandte Pflanzen, die wild in vielen Gebieten Japane wachsen, ale Rohmaterial verwendet.

Andere, für das erfindungsgemäöe Verfahren als Auegangematerial verwendete Pflanzen, außer Bambus, die zur Gattung der Gramineae gehören, sind:

Oryza sativa L.,

Hordeum vulgäre L. var. Hexastiohon ASCHERS.,

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fritioun aestivun L., ,

Arena fatua L.,

Misoanthus sinensls AlDESSS·, Phragaltes conmunls IRZIIUS, Setarla italioa BEAUV,, PaniouB ailiaoeusi L., Sorghum bioolor MQBIOB,

Zea Mays L.,

Saooharua offiolnaruv L.

Es werden hauptsäöhlioh die Blätter und 8tiele dieser PfIansen verwendet·

Als drittes Rohmaterial für das erfindungegenäSe Verfahret dient die Melasse aus Zuckerrohr (Saooharua offioinaru« L.). Zur Gewinnung der Polyβaoohari(!fraktion mit antikareinogener Aktivität aus Pflanzen, die sur Gattung der Oranineae gehören, werden erhebliche Mengen an Ausgangsmaterial benötigt· Daher ist das Sammeln und der Transport des Rohmaterials «it Schwierigkeiten verbunden. 8onit ist dieses Material sur Herstellung großer Mengen der erfindungsgeaäe herstellbaren Substans weniger geeignet. Dagegen kann bei Verwendung von Melaeeen und Bagassen als Auegangsmaterial die Gewinnung der Substans in vorteilhafter Weise in großen Maßstab erfolgen, da die Melassen, die aus Zuckerrohr hergestellt werden, als Rohstoffquelle reiohlloh vorhanden sind, billig anfallen und

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darUb«rhlxiaue else Extraktion alt helBem Wasser, wie si· bei Verwendung von Pflanzen als Juisgangsmaterial erfolgen mufl, nicht notwendig ist und daher da· Herstellungsverfahren vereinfacht wird,

Is folgenden wird da· >rf 1 nrttmgsgemM Bo Verfahren mit Bambus» Bambuegra· und anderen Fflansen der iattung der Or—inane·e al· lnsgsngs»aterial beschrieben. -

Bei dieser AaefUhrungeform des erf indungegeeäüen Yeriahrene wird da· frieohe Bohmaterlal oder da· angesamelte Ma* terlel, das i» getrockneten loatand aufbewahrt wird, ohne weitere Tovltaliandlung in klein· Btüoke geeohnitten. Sa· g·- sohnitten· oder konservierte Material wird nach Bedarf Terwendet. Zur Srleioaterung der Extraktion ist es rorteilhaft_y da· Rohmaterial vor seiner Terwendung so fein wie möglich su serkleinern.

Dieses serkleinerte Kohmaterlal wird dann mit heilem Wasser extrahiert. Sur extraktion mit heifiem Wasser wird da· Rohmaterial ro——eil mit einer entsprechenden Menge Wasser in einen Keseel au· korrosionsbeständigem 8tahl oder Bisen gegeben und auf 80 si· 100⁰O erwärmt. In um fällen, in denen der pH-Wert Im Laufe dies·· Verfahren· sum sauren Bereich abfälltt iat ·· sum Sweoke einer vorteilhaften Extraktion

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■ -δ-·

wünschenswert, den pH-Wert laufend durch schwache anorganische Basen, wie Natriumcarbonat oder Caloiumhydroxyd, auf 5 bis 9 einzustellen. Die Extraktion wird im allgemeinen ein Bweites Hai wiederholt» wobei das Piltrat, wenn es alkalisch reagiert, mit Säuren neutralisiert wird. Anschließend wird das Piltrat unter yermidertem Druck eingeengt.

Bas Konzentrat wird dann in einen Behälter aus einer semipermeablen Membran, z.B. eine Oellophamiembran gegeben und zur Entfernung der niedermolekularen Bestandteile 24 bis 48 Stunden gegen fließendes Wasser dialysiert und erneut unter vermindertem Druck auf ein geeignetes Volumen eingeengt. Dieses Konzentrat wird mit Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid gesättigt und der nach 24 stiindigem Stehen gebildete Niederschlag abfiltriert· Die Fällung wird einmal mit einer gesättigten Ammoniumeulfatl'dsung gewaschen, in Wasser aufgelöst und diese Lösung dialysiert» um die anorganischen Salze zu entfernen. Die Lösung Bit den nicht-dialyeierbaren Bestandteilen wird mit Essigsäure oder Trichloressigsäure versetzt, wobei in diesem sauren Bereich die Proteine ausgefällt werden. Anschließend wird die saure Lösung über Entfärbungeharze geg*bes» wl· Duolite S-K, wobei dunkelbraune Verunreinigungen, die keine antikar&nogene Aktivitat besitzen, an das Harz gebunden werden und der Durchlauf nahezu vollständig farblos wird. Die Entfärbung kann auch

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«7-

mit Bleiacetat erfolgen, da die Farbstoffbestandteile und andere Verunreinigungen durch die Behandlung mit Bleiacetat auegefällt werden. Bin Überschuß an Bleiionen kann mit Kunetharz-Ionenauetauechern entfernt werden.

Die entfärbte Lösung wird dann in geeigneter Weise bis «u einem Gehalt von 1 bis 5 i> Feststoffen konzentriert und

aur Abtrennung dta erfindu»«eg«a&ß gewünschten Materials wird das Vierfache des Konzentratvolumens eines waesermisehbaren organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Äthanol oder Aceton, zugegeben oder die Lösung wird eingedampft, wobei das erfindungegemäß zu isolierende Material als Festsubstanz erhalten wird, .

Die antikarzinogene Aktivität des erfindungsgemüßh her-. gestellten Produktes wird durch Aussalzen nooh verstärkt· Die Rohextrakte aus Bambus und Bambusgras enthalten ein Ce- λ misch verschiedener Substanzen. Darunter können sioh auch Stoffe befinden, die eine das Krebswaohetum fördernde Wirkung besitzen. Die Reihenfolge der angewendeten Verfahren wie Dialyse, Aussalzen, Behandlung mit Kunstharz-Ionenaustauschern, Entfärbimgsharzen,und Bleiacetat, kann verschieden sein. Hierbei v/ird nahezu stets ein gleichwertiges Produkt erhalten, obwohl einige Unterschiede hinsichtlich der Schwierigkeit dee Verfahrene und der Ausbeute bestehen.

909805/0989 bad orte»**·

Das hergestellte Material ist ein nioht-hygroskopisches» hellgrau bis gelbliohbrann gefärbtes Pulver» das leicht wasserlöslich ist» eich jedoch in den üblichen organischen Lösungsmitteln nicht löst. Die isolierte Substanc beeltst die Eigenschaft eines Polysaccharides. Die Farbreaktion der Substanz alt β.B,(k-Haphtol-HgSO^, Orcin-HCl, Phenol-H₂ ⁸⁰I* Indol-R^SO,, TryptopJian-HgSO^, Anthron-Hg⁸⁰* ist positiv, die Reaktion mit dem Reagens nach Fehling, Benedict oder Teilens *s negativ, und die Subs tans seigt kein reduzierendes Verhalten. Auch sind die Reaktionen mit Bison-Morgan, Hinhydrln und Biuret negativ, was dae Fehlen von Polypeptiden und Proteinen anzeigte Weiterhin seigt die isolierte Substans in eines Bereich über 220 syu Is ÜV-Absorptionsspektrus kein AbsorptionemajcisiBi. Baratts kann gesohloBen werden, daß Huoleinsäuren und Proteine der Substans nicht beigemischt sind. Bas Infrarotspektrus der vorliegenden Sübstans entspricht dem eines Polysaccharides· Die den Hydroxylgruppen susuordnenden Absorptionssaxisa verschwinden naoh der Aoetyliemng der Subetans. Ss wird angenossen, daß die vorliegende Substans ein Polysaocharid des Ö-TypB iet.

Sie SleBentaranalyee der e rf indun^sgesäB hergestellten Subetans ergibt ι C 44,6 Jt, H 5 »94 f>* Bin Aeoheruokstand, Bpurenelesente» Stickstoff, Sohwefel und Phosphor sind nicht

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enthalten· Die Klementaranalyse des acetylierten Derivates ergibt die folgende 8umenfomel (^C3o^Hio°2O^n^i1:>er'^{i C} t ^₉ B 5,59?'. lach der Hydrolyse der Substane alt II Schwefelsäure während 22 Stunden bei 100⁰O wurden 3 Yerechiedene Monosaooharlde nachgewiesen· Diese wurden durch Itepierohronatographie und ffVmCL ftmrtiTCHi β togrppM t> an stark baslsohen Kunethars—Ionen*· austauschen! als Xylose, Arabinoee und Galactose identlfislert«

Die antlkaxslnogene Wirkung des erfindungsgemäe hergestellten Produktes wurde alt de» folgenden Verfahren an einem festen Karsinoa _v de* Bbrlich-Xarsinoa und SarKoe 180 naohgewlesen. 2 bis 6 Millionen Kreoeaellen aus einer Asoiteaflttseigkelt eine Woche nach der Belnpfung werden subkutan in den Rücken einer Maus transplantiert. Bine Tersuohsgruppe besteht jeweils aus 10 Hausen. Bine Gruppe wird als Kontrolle mit einer physiologischen Koohsalslösung behandelt· BIe Verabreichung der Subet&ns erfolgt erstmals 24 Stunden nach der Inplantation und wird 11 MpL jeden «weiten Tag wiederholt· IKLe Wachstumsbedingungen der übertopf te» subkutanen Xarsinoae und Sarkome werden Im Verlauf des- Versuches verfolgt. Bach 25 Tagen wird das durchschnittliche Körpergewicht der Mäuse, die He—quote des Tumorvaohaturne, die Bsgreealonsrate des Tumors und die Mortalität Mit den .entsprechenden Wertem der Kontrollgruppe verglichen. Bis antlkarsinogene Wirkung von ungereinigten Bxtraktsn des Ansgangsaaterlals und die des gemäß Beispiel 1 gereinigten Materials sind In Tabelle I und Tabelle II angegeben·

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gabel!· I

Wirkung auf das Ehrlich Karsinoa Dosis- durchachnitt-

Probe rung, Hohe Verön- Tueorrag/jcg derung des Mortali- HeBs-

Körpergewich- tat quote, £ Regreetee, g + sion

Rohextrakt

600

Mach Beispiel 1 isoliertes Material 50

+1,8

+3,21

0/10

0/10 97,3 96,5

50

90

Kontrollgruppe phyaiol. Koohsalzleg. +3,17

0/10

Sabelle II

Wirkung auf das Sarkom-1Θ0

Probe

Rohextrakt

durchachnittllohe Vetfitti-Boaie- derung des

;, Körpergewich- Mortalltes» g tat

Tuaor-HeMt-

quote, 1» Regresi» eion

600

+2,5

lach Beispiel 1 ieoliertee Material 90

Kontroll- phyaiol. Koohsalslsg. +2,8

0/10

0/10

0/10

80

80

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Dae nach Beispiel 1 gereinigte Polysaooharid besitzt in .. eiser Doeie . τοη 50 eg/kg eine et ark· antikarzinogene Aktivität gegen das Ehrlioh-Kar&lnom und das Sarkom-180 und führt bei den meisten . Tieren zu einer Regression dee tumore. Die überimpften Zellen wachsen bie sum elften tag nach der Inplantation. Dann wird jedoch das Tumörwaehsttni in der Gruppe, die Bit dem erfindun^BgemÖB hergeetellten Polyeaccharid behandelt wurde, gehemmt, Ungefähr naoh dem 20. Sag let die größte Zahl derrTumoren nicht mehr eicht bar. Auch wenn ein restlicher Ttunor verbleibt, eo handelt ee eich hier nur um kleine Knoten, die aus Bindegewebe bestehen. Diese sichtbare Wirkung kann bei der Xontrollgruppe nicht beobachtet werden. Bis jetst ist Tönkeiner Subetana, die in der Lage ist, Tumoren bu heilen, bekennt geworden, daß sie auch! feete Tumoren zur Regression bringen kann, ohne gleichseitig' das Körpergewicht der Sumortiere bu erniedrigen und Nebenreaktionen auszuüben. Dies iet ein .charakteristisches Merkmal der erfindungsgenHfl hergestellten Bubetans. · ^:

Das erfindungegemäße Verfahren bei Verwendung von Melassen als Rohmaterial wird im folgenden beschrieben. Sie Melassen werden zur Entfernung aller vorhandenen Substanzen mit niedrigem. Molekulargewicht,-wie Rohrsucker, Invertzucker, stickstoffhaltige organische Substanzen, Aacherttckstände und ahn* lichee unter Verwendung einer semipermeablen Membran, wie ' _;. Cellophanpapier, gegen fließendes Wasser dialysiert und die nicht-dialysierbaren Substanzen gesammelt. Anschließend wer-

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den die nioht-dlalysierbaren Substanzen durch Sättigen der Lösung mit anorganischen Salzen, wie Ammoniumsulfat, ausgesalzen. Protein wird durch Ansäuern entfernt· Bann folgt die Behandlung mit Entfärbungsharzen. Sohliefilich wird bei Bedarf eine Behandlung alt Bleiacetat und Kunstharz- Ionenauetauschern zur endgültigen Reinigung durchgeführt, Eateprechend der vorliegenden Notwendigkeit kann die Reihenfolge dieser Behandlungen auch verändert werden.

Sie für das erfindungsgemäße Verfahren ale Rohmaterial verwendeten Melassen fallen in der Rohrzucker verarbeitenden Industrie an. Sie werden erhalten, wenn Rohrzucker durch Konzentrierung von Zuckerrohr extrakt en gewonnen wird oder bei den Reinigungsverfahren von unreinem Rohrzucker.

Zn den Melassen verbleiben noch beträchtliche Mengen an Rohr<~und Invertzucker. Ebenso sind hochmolekulare Polysaccharide vorhanden. Die zu isolierende Substanz «it antikarzinogener Aktivität ist eine bestimmte Komponente dieser hochmolekularen Stoffe und kann alt anorganischen Salzen, wie Ammonlumsulfat ausgefällt werden. Demnach kann die erfindungegemäß zu isolierende Subs tans auch ohne Durahfüh- _; rung der Dialyse durch Salzfällung gewonnen werden« wobei dann die organischen und anorganischen Verunreinigungen durch Behandlung mit Bleiacetat oder Kunstharz—Ionenaustauschern entfernt werden können. Tab jedoch eine wirksame Reinigung '

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erzielen zu können» ist es vorteilhaft* die Melasse vorher su dialysieren und somit alle niedermolekularen Substanzen su entfernen.

Sie Dialyse der Melassen wird unter Verwendung von semlpermeablen Membranen, wie Cellophanpapier, 24 Stunden gegen fließendes Hasser durchgeführt, Die Sauer der Dialyse richtet sieh nach der Art des Rohmaterials, dessen Konzentration, der Größe des Ansatzes und anderen Faktoren. Der grüßte Seil des analysierbaren Materials ist bereits nach 12 bis 24 Stunden ausgetreten. Als semipermeable Membranen können Sohwelnsblasen, Kollodiummembranen und ähnliches verwendet werden. Cellophanpapier» das in einheitlicher Qualität in großen Mengen hergestellt werden kann» ist besonders geeignet.

Haoh der Dialyse wird die Lösung, welche die nicht dialysler- i baren Substansen enthält, unter vermindertem Druck eingeengt. Ist eine geeignete Konzentration erreicht, bo werden bei Raumtemperatur anorganische Salsa bis zur Sättigung zugegeben und die gesättigte Iäsung wird über Backt stehen gelassen« Als anorganisches SaIs kann Kaliumchlorid verwendet werden, jedoch werden mit Amnoniumeulfat gute Ausbeuten erzielt und es ist daher dae geeignetste Salz. Der liedersohlag wird zentrifugiert, mehrmals mit gesättigter SaIs-

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lösüng gewaschen, die Fällung erneut in Wasser aufgelöst, und die Mischung an anorganischen Salsen durch anschließende Dialyse oder durch Behandlung mit Kunstharz-Ionenaustauschern entfernt· Der Rückstand wird bis su einer ge-

eigieten Konzentration eingeengt und mit 2· B. TrichloresBigeäure oder Essigsäure zur Entfernung der Proteine versetzt. Das klare saure Filtrat wird über eine Kolonne mit Bntfärbungshars, wie aktivierter Duolite 8-50 oder Duolite A-7t gegeben und der Durchlauf unter vermindertem Druck auf ein geeignetes Volumen'eingeengt· Dieses Konzentrat wird zur Ausfällung der erfindungegemäfi gewünschten Substanz nit wassermischbaren oranischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Aceton und dergl« vermischt oder es wird zur Srok-

kene eingedampft· ' ^:

Je nach der Hotwendigieii die Reinheit der Substanz weiter su steigern, kann eine Behandlung mit Bleiacetat oder Kunsthars-OConenaustausohern durchgeführt werden« Die dabei anfallender Substanz zeigt weder die Eigenschaft mit Bleiaoetat ausgefällt noch an Ionenaustausoherharz absorbiert zu werden·*

Auch unter Wegfall *s Aussalz-Terfahrens und nach Ausfällung der Proteine direkt aus der nicht-dialyeierten Lösung kann die erfindungegemäfl gewttnsohte Polyeaccharidfraktion erhalten werden· Jedoch ist es im Hinblick auf eine gute Reinigung

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Vorteilhaft, das Aussalzyerfaliren d urchzuführen trots dee dabei eintretenden .geringen Auebeuteverlustes · Eine Bein!» gung kann auch duroh direktes Aussalzen dee Rohmaterials ohne Dialyse erreipht werden» wobei die.auegefällten Stoffe dann einer MaIyse unterworfen werden mit anschließender Auefällung der Proteine und lonenauatauscherharzbehandlung. Bei Verwendung von viskosem Rohmaterial kann der bei der Sttlzbehandlung eintretende Verlust jedooh größer werden. Im gleichen HaB| wie die therapeutisch wirksamen Komponenten durch die Salzbehandlung angereichert werden, nimmt auch die Konzentration an Verunreinigungen, wie Proteine und Farbstoffe, au. Es ist daher notwendig, die Proteine in herkömmlicher Weise SU entfernen. Ist der Gehalt an Proteinrückstand klein, so kann dieser Arbeiteschritt wegfallen. Proteine und auch die Farbstoffe werden bei Behandlung mit Entfärbungsharz an diese« absorbiert und somit entfernt. Auch durch !behandlung mit Bleiacetat können die Farbstoffkomponenten und andere Verunreinigungen erfolgreich entfernt werden.

Das gereinigte Polysaccharid ist ein nicht-hygroskopisches weißes Pulver, das in Wasser löslich, jedoch in den üblichen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist* Die Substanz besitzt neutrale. Eigenschaften und ist hitzestabil, wird jedooh beim Erhitzen unter säuren und alkalischen Bedingungen

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sersetst. Sie Substanz fceeitet die Eigenschaften eines Polysaccharides und enthält keine reduzierenden Zucker_r Monosaccharide,Aminozucker und Aminosäuren. YeraschungerUcketände können nur in Spuren nachgewiesen werden. Der Hachweie von Uronsäure ist ebenfalls negativ· Durch Hydrolyse der Substanz mit IH Schwefelsäure bei 100° C während £2 Stunden wird sie in drei Monosaccharide serlegt, nämlich in Xylose, Arabinose und Galactose«

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Die antikarsinogene Aktivität der naoh dem erfindungegeaäe-ββη Verfahren hergestellten Subetans wird mit der oben beschriebenen Methode geprüft und die dabei erzielten Brgebniaee sind in Tabelle III und IV angegeben.

» ■

Tabelle III Wirkung auf das Ehrlich Karainom

durchschnitt- Durohliohe Ver&n- eohnitta- Tumor-Doaie- derung des Mor- gewicht Heramrung, Körperßewioh- tali- dee Tu- quote, f» Regreee«Ag tee, g tilt jaora, g % eion

Kontroll- phyeiol. . :

gruppe Kooheaia-

löaung +2*82 O/IU 1,38 - O

Veraucha-

gruppe 100 +3,4 0/10 0 100 100

IV

Wirlcung auf daa Sarkom-180

dttxoheohnitt·· Durohllohe Veran« eohnitta- Tumor-Doeie- <t#rung des Mor- gewloht Hemm-·

Körpergewioh- tall- des Tu- quote, i» Hegreatee, g tat aore, g + eion

Kontroll- gvuppe	0	♦2.	42	0/10	1	,83	mm	0
Vemuohe^ gruppe	50	+2,	6	0/10	0	,18	94	80

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Aus den Ergebnissen der Tabellen geht hervor, daß die erfindungsgemäß hergestellte Substanz eine signifikante antikarzinogene Wirkung gegen dae Ehrlich-Kareinom und das Sarkom-180 besitzt und viele Tumoren bei Hausen zur Regression bringen kann. Die bei der Kontrollgruppe und Versuchsgruppe über impf tea Tumoren wachsen stetig bis sum 11. Tag nach der Inplantation. Hach 11 Tagen beginnt das Tumorwaohstum bei den mit der erfindungsgemäß hergestellten Substanz behandelten Vereuchsgruppe abzunehmen und nach dem 20. Tag sind die Tumoren fast nicht mehr sichtbar. Bei Tumorrückständen handelt es sich um kleine Knoten von Bindegewebe. Biese Ergebnisse können bei der Kontrollgruppe nicht erzielt werden. Tiere, die mit der erfindungsgemäö hergestellten Substanz behandelt werden, sind in ihrem Wachstum nicht beeinträchtigt und wöieen keine toxischen Erscheinungen auf. Bis heute sind keine chemischen Substanzen mit vergleichbar starker antikarzinogener Aktivität bekannt, die nioht gleichzeitig Nebenreaktionen zeigen.

Wie oben dargelegt, bezweckt die Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Substanzen mit antikarzinogener Aktivität aus Pflanzen, die zur Gattung der Graminaceae gehören, und Melassen zur Verfügung zu stellen.

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Das Verfahren zur Herstellung dee Rohextrakte β, die Bestimmung der Xoxlzität und der antikarzinogenen Aktivität dieses Rohextraktes, die Reinigung des Rohextraktes, die Eigenschaften des gereinigten Materials, die Hydrolyse des gereinigten Materials sowie die antikarzinogene Aktivität des gereinigten Polysaccharides bei Verwendung von Bambus und Bambusgras als Rohmaterial werden nachstehend beschrieben.

(I) Rohextrakt:

Die gesammelten Blätter werden getrocknet, in feine Stücke geschnitten und mit der siebenfachen Waseermenge, bezogen auf das Rohmaterial, bei 90 bis 100⁰C etwa 5 Stunden unter Rühren extrahiert· In den Fällen, in denen die Extrakte im . Verlauf des Verfahrens eine saure Reaktion annehmen, wird zur Aufrechterhaltung eines neutralen pH-Wertes eine kleine Menge Calolumhydroxyd zugegeben. Nach dem Abkühlen wird der Extrakt filtriert und das Piltrat unter vermindertem Druck konzentriert und getrocknet. Das erhaltene Pulver wird als "Rollextrakt" bezeichnet. Ein Analysenbeispiel dee Rohextraktes zeigt folgende Zusammensetzung:

Oeeamtβticketoff: 1,96 £ Aeoherückstandt 24*6 £ Toxizltät des Rohextraktest Die akute Toxizität wurde unter Verwendung von Mäusen

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(Stamm HDT) mit einem Körpergewicht τοη 18 Ms 20 g untersucht. Bei der intravenösen Injektion von 625 mg/kg eines Rohextraktes, 4er aue Saea albo-marginata (Makino et Shlbata) gewonnen wurde, das im Februar 1962 im Gebiet τοη Mt. Taasawa gesammelt worden war, überlebten die Mäuse, während sie bei Injektion τοη 1250 mg/kg des Rohextraktes sofort nach der Injektion eingingen. Bei der intraperitonealen Injektion τοη 1000 mg/kg überlebten τοη 10 Mäusen 7, während bei der Injektion τοη 2500 mg/kg alle Mäuse Innerhalb τοη 24 Stunden eingingen.

Antikareinogene Aktivität:

Sie antikarsinogene Aktivität des Rohextraktes wurde auoh an transplantablen Tumoren der Maus untersucht.

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(a) Aeoitestumori

Binselheiten dleeer Methode werden im Abschnitt TI gegeben. Sie bei Asoltestumoren ersieüen Ergebnisse sind In tab·!· le V angegeben·

Tabelle ▼ Virktme dee Rofcextraktee auf Asolteetumoren

Dosierung* Duroheohnittliohe überlebenaaelt_v Probe A t

	pbyelol, Kochaals- löeimg	12,2
Kontrollwert	600	13,2
Kuna-eaea	400	16,5»
It	200
Il

Khrlloh Karslnoa Serko«-180

15,8 18,6

*iait Ausnahme einer Matte, deren ttberlebeneaeit mehr nie $0 Vage betrug.

Bei der lntraperitonealen Injektion eines Rohextrakte· von einem Ausgangematerial, das aue dem Gebiet von Mt. fansawa stammt, in einer Dosierung von 600 oder 200 mg/kg konnte keine Wirkung auf die Überlebensseit bei Bhrlich-Kareinom und 3arkom-ieo beöbaohtet werden·

(b) Subkutane Tumoren:

Einzelheiten dieser Methode werden unter Abschnitt VI beschrieben*

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fabeile VI

Wirkung dee Rohextraktea auf ein subkutan implantiertes

Sbrlioh Kareinora

duroh-

eohnitt-

liehe

gewloht·, g

Kontroll- phyelol. +1,1 wert Kochsalzlösung

Ht.Zao,1961 400 +2,5

Kontroll- physiol. wert Kochsalz- +2,1 lösung

600 400 200

Kt.Tansawa

+1,8

+2,0 +2,0

Kontroll- physiol, wert Kochsalz- +1,3 lösung

t Kuaa-aaaa Bandalgeb.
Apr.1962 600

Wemaguri-take

Bandalgeb.

Apr.1962 600

Kontroll- phyaiol. wert Kocbsaizlsg.+1,1

+2,0 +1,5

Sasa, TakuahlM,1961

400

+2,3

Kontroll- phyaiol,

wert Koohaalzlag.+6,0

3aaa,Taku-6

200

+6,2 •onnlttl. Tueor- Hör* H gevioht, tali- quote, β tat *

1 *35 0/10 -

0	,94	2/10	39	2	1	1	4
2	,05	0/10	-	0	0	1	9
0	,06	0/10	97	5	3	2	0
1	,20	1/10	42	3	3	0	3
1	,82	0/10	11	1	1	2	6

3,61 1/10

0,62 0/10 83

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2,19	0/10 39 1	4	0	5
1,55	0/10 - 0	1	2	7
0,09	0/10 94 9	0	0	1
4,30	1/10 - 0	0	1	a
2,56	0/10 41 4	1	1	4
	1 « Regression 2 * Abnahme 3 - unverändert 4 - Jiunahme		^0 OB«

Die Ergebnisse der Behandlung des Ehrlich-Karsinoae sind in Tabelle ¥1 angegeben. Dabei war der Rohextrakt am wirksamsten, der aus Bambusgras gewonnen wurde, das aus de« Qebiet τοη Yakushima ßtammt. Bei einer Dosis von 400 «g/kg zeigte sich eine Hemmquote von 94 £. Dabei kam es but vollständigen Sinsohmelsung der Tumoren bei 9 von 10 Mäusen innerhalb von 25 Tagen. Als nächst wirksam erwies sich der Rohextrakt, der aue Bambusgras aus dem Gebiet von Mt· Tanzawa gewonnen wurde. Bei einer Dosierung von 600 mg/kg geigte sich eine Hemmquote von 97 £· Dabei verschwanden bei 8 von 10 Mäusen die Tumoren. Die meisten der verwendeten Präparate seigten eine starke antikarzinogene Wirkung. Dieser Effekt wurde auch bei Verwendung von Rohextrakten aus Sasa albo-aarginata Makino et Shibata (Kuma sasa) aus de« Gebiet von Mt. Zao und Mt. Bandai beobachtet. Die Abhängigkeit der Wirkung auf das Ehrlich-Karzinom vom Zeitpunkt der Ernte iet in Tabelle YII angegeben. Die verwendeten Rohextrakte wurden aus Rohmaterial gewonnen, das an der gleichen Stelle im Mtο Tanzawa-Gebiet im Februar, Juli und Oktober 1962 gesammelt und nach demselben Verfahren aufgearbeitet wurde. Die Ergebnisse mit den im Winter gesammelten Proben sind besser als mit den Sommerproben.

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Tabelle VII

durchschnitt- durch-Hohe Ver- eohnittl. Tumor-Doeie- änderung Tumorge- Mor- Hemmd Kö iht tll t

Pie trirkun;; der Rohextraktt* 41· an· einem Material hergestellt wurden, da· aus den Oebiet von Kuma-sasa und take stammt und am gleiohen Ort au» gleichen Seit w«m|l» wurde miteinander vtrgllohtn. Die Hemmftueteil 83 bsW. 3tf. Das aus Kuma-eaaa staasende Material ist wirksamer als das aus

Datum mg/leg gewiohts.g	+3,6	β	VHXl- tat	-	"■ ι	2	3	4
Kontroll- phrsiol.
werte Kochsalz	+2,9	3,19	2/10	75	O	O	1	9
lösung
Feb.1962 600	+0,8	0,80	0/10	-	5	1	1	3
Kontroll- ph/siol.
werte Kochsalz	+1,8	2,23	0/10	Il	O	1	1	8
lösung	+1,7.			*° ir tMi
Juli 1962 600	1,46	1/10	2	1	2	4
Sept.1962 600	1,02	0/fO		T	1	*

Si· Untersuchungen über dls antifcarünoßene Wirkung von Vl* treman·, Hitooyoln O und Oht^ottjotn k_y die auf #ttt feia^kt al· ßubstanisn mit antikareinftetner Aktivität «u Haben eind, wurde mit denselben Methoden durchgeführt und dl· Brgebnlsee mit denen» die mit den erfindungsgeefiß hergestellt#Ä tlHtxtrakten ereielt wurden, verglichen. Die Srgebniaae bein Ehrlich Karzinom zeigt die Tabelle VIII. 909805/0989

H67970

Tab·!!· VIII

Wirkung verschiedener antikarsinogener Subetanaen auf daa subkutane Ehrlich lareinoa

duroh-

Subatana echnittl. duroh-

Doeie- Yerttndrg. eohnittl· Tumordee KUr- Tuaor- Nor- Henapergew.. gewioht, tali- quote, g g tttt *

Controll- phyeiol. terte Koohaala- +2,2 luaung

fitronine 10 +1,0

Controll- phyeiol· 42,1 Koohaala-

Kito«yoin O 1,8 40,4 Kitoeyoin O 2,3 40,2

lontroll- phyeiol. trerte Xoohsals- 41,3

OhroB)ociy-

41.9

1,46	1/10	-	1	1	1	6
1,78 2,09	1/10 0/10	-22	O O	O O	1 1	8 9
0,90 0,90	0/10 4/10	76 89	O O	1 O	3 3	6 3

1/10 -

1,69 0/10 53

Aue der Tabelle Till geht hervor, daß litvomine keine Virkaaakeit seigt und die Heaaquoten tob Wtonyoin 0 und Ghromo- 76 aas«· 59 t betsagen· 1· kam Jedooh nicht au einer

.· J " ■··■* ■ Ua turnqja. Ba aoheint nioht möglioh, wenn man die

dta Körpergewichte» betrachtet, dia itoeierung ie) ÜPHlllU DtÄer ache Int die eraielte Wirkung bereite ei* tvenawert an eei». BtI de» Terwendung dea erfindungegesttfi

konnte tin Abfall dea KOrpergewiohtee

H67970

der Versuchstiere nicht festgestellt werden. Die makroekopieo!"an. Beobachtungen können im Hinbliok auf die in Tabelle XI aufgeführten Ergebniase wie folgt beschrieben werden* In der Kontrollgruppe trat bei 3 von 10 Tieren Anämie auf. Bei der Verwendung des Hohextraktes in einer Dosierung von 600 mg/kg blieben die Verhältniese bei allen lfäueen normal. Dagegeji wurde in der mit Mitomycin 0 behandelten Gruppe ^ilzatroplii« und Anämie beobachtete

Die Tabelle IX zeigt die Verhältnisse bei der Anwendung des Rehextrakteß vor und nach der Beimpfung mit Ehrlich-Karsinomzelltis, Eb wurden 400 mg/kg eines RohextrakteB, der aua Material des Yakuiihima-take-GebieteB stammt, jeden zweiten Tög verabreioat« Die Versuchsgruppe, die 10 Injektionen vor der Boimpfimg mit Tumoriiellen und 11 mal danach, also 2t Injektionen erliielt, aeigfca keine besseren Ergebniese, als die Gruppe, die nur 11 mal nach der Beimpf ung behandelt wurde. Dagegen zeigt die Gruppe, die 6 mal vor der Beimpfung behandelt wurde, eine schlechtere Hemmquote ira Vergleich zu der Gruppe, die 10 mal vor der B θ impfung behandelt wurde« Die Ilegression der Tumoren ist in allen Fällen nahezu gleich.

BAD 909805/0389

H67970

Tabelle IX

Dosierung 400 m,

des Rohextrakiek

durchBehandlung schnittl.

γ. w nv, Veründrg. durch- $umor~ •a * «*·, clea Kör- schnittl. Mor- Hemm-Beimpfung _pergew., !Humor- töli- quote,

g göw», g tat i»

Veränderungen des !Emaorvolumons

>. ■ 1 .	2	3	4
O	1	2	7
9	O .	O	1
1	1	1	6
7	O	3	O
3	O	4	S
3	O	4	4

Kontrollwerte

χ

Kontrollwerte
Dx 11 χ

χ C) χ

+1,1 1,55

+2,3 0,09 +2,22 1,46

+3,3 0,19 +3,9 0,27 +3,9 0,83.

0/10

Jx

94

1/10	-
0/10	87
1/10	82
1/12	42

Die erwähnten Versuche wurden mit festem Ehrlich KareiaoB

durchgefUhrt, jedooh let die Wirksamkeit gegen 3arkoffi»1&l die glelohe -vie gegen das Eiirlioh Karrinott. Die se der Behandlung dee Sarkoms-IQÖ mit Höhoztrakten ma-saea aus dem Mt.Taneawa-Gebiet Bind in.Tabelle X geben.

Tabelle X

Wirkung auf daa Sarkoffl-180

Substanz

; -..SSSittl.· fturoh- fun**-

Dosie- Verändrg. echnittl. Mor- Hemm-

rung, dos Kör- Turaorgaw.» tali- quote,

Substansi mg/lcg pergew.,g g tat · jt

Kontrollworte phyeiol-Koohoälf3·-*

1/10 0/10 79

1
8

9 O 9 8 O S / O 9 O

3 4

O -3 .>

00 2

CÖPY

U67970

Die Veränderungen Im Wacheturn und die Volumenverringerung des Ehrlich Karzinoms nach Behandlung alt dem Rohextrakt wurde mit den Verhältnissen bei der mit Mitomycin .0 bohandolten Gruppe verglichen und auf die Tumorfläohe bezogen. Sie maximale und minimale Länge des Tumors wurde 9» 14t Πι 2\ und 25 Tage nach der Implantation bestimmt und jeweils miteinander multipliziert. Die durchschnittlichen Tumorflächen in den einzelnen Gruppen sind in Tabelle XI angegeben.

Tabelle XI

ο Veränderung in der Tumorfläche (im )

Sosie- . rung, Substanz mg/kg 9.Tog 14.Tag 17.Tag 21.Tag 25.Tag

Kontrollwerte physiol. Kochsalz lösung	600	88	156	184	267	254
Rohextrakt	400	79	67	44	26	19
Il	1,8	94	133	126	143	152
Mitomycin 0	42	72	85	116	106

Das Wachstum der Tumoren der mit 600 mg RohextraktAß behandalten Gruppe verlauft die ersten 9 Tage mit dem der Kontrollgruppe parallel, nimmt jedoch dann bis zum 21. Tag stetig ab und ist dann gegenüber der Kontrollgruppe deutlich erniedrigt und am 25. Tag zeigen die meisten der Tumoren eine Regression. Dagegen nimmt das Wachstuni der Tumoren der mit Mitomycin C behandelten Gruppe vom ersten Tag an zu, zoirjt jedoch auch an 25.Tag noch keinerlei Regression.

909805/098 9 bad ORlG'NAL

(II) Reinigung;

Wie oben erwähnt, wurde festgestellt, daß Rohextrakte aus Bambus und Baabusgras eine signifikante antikarzinogene Aktivität besitzen. Die Untersuchungen über die Art der wirksamen Komponente führten zu der Annahme, da β es sloh bei der wesentlichen Komponente um eine Polysacoharid-Fraktion handelt und die Rohextrakte dieses Polysaeoharid , das aus drei Monosaoohariden besteht, enthalten«

Zur Überprüfung der antikarainogenen Aktivität wurden subkutane Ehrlioh-Karzlnome verwendet und es wurden die folgenden Verfahren zur Abtrennung und Reinigung der wirksamen Komponente aufgefunden·

a) Fraktionierung mit Äthanol:

10 g Trookenpulver eines Rohextraktes, der aus Kuma-sasa, saaa albo-marginata aus dem Gebiet von Mt. 'üansawa stammt, werden wie in Tabelle VI angegeben mit Wasser auf ein Volumen von 20 ml gelöst. Zu dieser Lösung werden 40 ml Ithanol gegeben und der gebildete niederschlag wird abfiltriert, gesammelt und getrocknet.(Fraktion I)

Das Viltrat wird erneut mit 40 ml Äthanol versetzt und der Iledersohlag gewonnen (Fraktion II). Der Durohlauf wird wiederum mit 80 ml Äthanol versetzt und der niederschlag isoliert (Fraktion ill). Sas Filtrat dieses liedersohlags wird unter vermindertem Druok eingeengt und durch Trooknen ein festes Pulver gewonnen (Fraktion IV). Die Alkoholfraktionierung

909805/0989 . BAD

U67970

- 30 -1st in Tabelle XII wiedergegeben·

fabeile XII

	Xthanol- sugabe, al	Äthanolkonzen	Gewicht der PfiXltmp.	Fraktio nen
	40	tration des Filtrate, Vol.·	-Ψ β	P-I
Roh extrakt	40	66,7	0*5	P-II
10 g in 20 al	80	80,0	1,4	P-III
	Piltrat	89,0	1,4	P-IV
		-	6,0

Die Ergebniese der Prüfung der einzelnen Fraktionen auf ihre antikareinogene Aktivität gegenüber dem Ehrlich Karzinom sind in Tabelle XIII angegeben.

Tabelle XIII

durch-

acbnittl. durch»

Doeie- Verändrg. echnittl. Tumorrung, des Kör- Tumor- Hör- Hemm-Fraktionen rag/kg pergew., gewicht, tali- quote, & S tat £ 1

Kontrolliert phyaiol. +0,9 Kooh-

ßohextrakt

P-I

P-II

P-III

P-I?

Kontrollwert

P-I P-I
P-II

600

90 90
390

phyeiol. Kochsalz lösung

200
200
400

+1,4 +1,7 +2,0 +2,1 +1,6

+3,9 +3,0 +1,9

1,91 1/10

1,20

0,68

2,29

2,92

0,63 1,11 0,07

2/10 0/10 0/10 0/10 0/10

i- +3,0 2,83 0/10

0/10 0/10 0/10

100 38 65 -20 -53

8 0 3 0 0

4 1

0 2 1 2 0

1 2

BAD

0 3 3 1

2 4

dee

0 5 3 7 9

U67970

Sa wurde festgestellt, daß die Fraktionen I bis IH wirksam Bind, während die Fraktion IY keine Wirkung zeigt und somit die aktive Komponente bei einer Alkoholkonzentration von ungefähr 90 fi auegefällt wird« Bei Verwendung der alkohollöslichen Fraktion (Fraktion IV) zeigt sich eine Beschleunigung des Tumorwachstums· Der Anteil der Fraktion IV "betrug 60 Gew.-^ des Rohextraktes. Die Fraktionen I bis III werden vereinigt und nachstehend als "Äthanolniederschlag¹¹ bezeichnet.

Weitere Beispiele be.1 Verwendung eines Äthanolniederschlages Bind im folgenden angeführt. Bei Behandlung mit 600 mg/kg eines Rohextraktes, der aus Chimaki-sasa aus dem Gebiet von Bandai stammt, wurden die folgenden Ergebnisse erzielt; durchschnittliches Tumorgewicht: 0,62 g; Hemmquote: 82,8 i>; Regression: 2; Abnahme:.4; Unverändert: 1; Zunahme: 3 (Kontrollwerte: !Durchschnittliches Tumorgewicht: 3,61 g; Regression: 0; Abnahne: 0; Unverändert: 1; Zunahme: 9)· 50 g dieses Rohextraktes werden in 100 öl Wasser gelöst und mit 800 nl Äthanol versetzt. Die Ausbeute an*^lÄthanolnieder8ohlag^lt betrug 23 g. Die antikarzinogene Aktivität dieser Fraktion in verschiedenen Dosierungen ist in Tabelle XIV angegeben.

909805/nQP.Q

3 Λ

U67970

Fraktionen

Kontrollwert physiol*

Koch- +2,32 saläslsg.

^vthano3.nie<--*
ierachlag

2,7

1/10

durch»

Bogie- schnitt!*

rung, Verlindrg·· eohni-Stl· Mor- heinm-. des Kör- 9?«κι<η>· tali- quote, pergew»j g gew -. g tat J»

des-

rorvolui3Q2is

0 0

50	+2	,19	0,76	0/10	72,	0	1	4	1	4
100	+2	«36	1 ,21	1/30	55»	Z	4	0	1	4
200	+1		0,40	0/10	85,	2	7	0	1	2

Ra seigt sich, daß mit einer heiseren Jlooierim«; su.»ch die Jir^ebnisse besser werdsn. tos Govlcht der in Ath&ziol Xöe·* Ii «hen Fraktion csacht atwn clic Kii'Ifte äes Rohcxtraktes ε«β,. Bloß© Pffaktion besitzt ktiint: antikarsinogone AfcUiirität wnd man kann daher sagen, daS die Behandlung mit Alkohol dlo aktive Substanz auf daa Zweifache r

BAD

S 0 9 3 0 5 / 0 ¹J 8 9

H67970

b) Extraktion mit Äther:

Da die aktiv© Komponente mit Alkohol gefällt wird, kann angenommen werden, daß sie in organischen lösungsmitteln nicht löslich ist. Wird jedoch dia Extraktion unter sauren Bedingungen mit Äther durchgeführt, ro gehen aura iOeil Komponenten in Lösung. Ks werden daher die einzelnen Fraktionen bei der Ätherbehandlung isoliert und auf ihre antikarzino- (iti\i Aktivität untersucht»

5 r lies Äthanolniederechlagi.3, der <ua dua Rohextrakt durch Ii'' u.llung mit Alkolu 1 her,j? ;tollt wurde, löat man in Waß3or bis au einem Endvolumen von 10 ml« Durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure wit'd die Lösung auf einon xxH-Wert von 1,0 ein,, jstellt. Daa dab(;i unlöaliihe . ii.jrl.il wird abfiltrioi'l. lint i'iltrab wird miü [>0 ϊαΐ illiiux* \._Aj.:tKi, iud extrahiert. Dio« do iJxfcraktion wird 0 mal in der gleichen weiae vriedorholt (Go.-iamtrft&Z'tiö an Äther 400 ^1). IHii .,ther wird abdestillioi t un»! flor Rückutand &u J.rookrie I. Ha-i -hält 7SiO mg ο ine-3 braunen öls, das als "Ätherextrakt" bü,,eichnet wird. Der Kücfcßtaiid nach der Ätherextraktion wird dann mit Äthylacetat extrahiert. Dabei geht nahezu keine Subatana in das Lösungsmittel über. Die wässrige Lösung wird mit Ätzalkali auf einen JiH-Vert von etwa 7,0 eingestellt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Man erhält 2,3 g eines Rückstandes„

909805/0 989

U67970

Die Ergebnisse der Überprüfung der ant!karzinogenen Aktivität dieser Substansen sind in Tabelle XV angegeWn.

Tabelle

dureh-

achnittl. durch- Tumor·- ,/·.,-:;„.*, ,, Boole- ¥erändrg_o eohnlttX. Mor- Hemm- i' '' rung, des Kör- lumorgew., LaIi- quote, Fraktionen ng/kg porgew, ,g g tat £ 1

Kontrollwert	phyaiol. Kooh- salzlsg.	+2	,62	2	,23	1/10	„	,5	0
Ätherextrakt	250	+2	,26	0	,34	1/10	27	,0	0
Rückstand	400	+1	,55	,45	0/10	06	7

YiV ist ersichtlich, daß die wirkoume Subatan ·, mit Xh¹ r nicht extrahierbar ist.

(c) Fraktionierung mit Kunsthara-Ionenauatau»ohern.

7,5 g des'!Äthanolniederachlagea"werden mit Wanaer auf 150 ml gelöst. Die Lösung wird auf eine Säule mit 50 ecm einea stark sauren Harzionenaustauschers vom Sulfonsüuretyp, Amberlite IR-120 (H-Porm) gegeben und mit 200 ml Wasser gewaschen. Die SUuIe wird dann mit 500 ml 2K Ammoniaklösung elulert. Das amiaonlakalische Eluat wird gesammelt, unter

COPY 909805/0 989

vermindertem Druck eingeengt und getrocknet. Die Ausbeute beträgt 0,5 go Diese Fraktion besteht aus basiechen Substanze·' i'nd AirdnoBävireno Diese Fraktion wird als "basinohe I -aktion¹¹ bezeichnet* Sie gibt eine stark positive Ninhydi-iroreaktion. Der Durchlauf aus dem Ionenaustauscher ?.exgt :^:.ae eauro Reaktion und wird auf eine Kolonne mit 100 cc.-- einer: u'.;ark basischen Haräsionenaustausehers vom t'irt»--'.U!intyp_f Ainberlite IRA-410 (OH-Form) gegeben. Die Folonr-c v/ird jnit ungefähr 1 Liter Wasser gewaschen und das /aafc;n ier au dem Durchlauf gegeben» Wird diese LÖeuag ■_tJt«tei: " ·-rmindertem Druck eingeengt» so erhält μάτι 1 _f7 g •iiiea ' v.-naien Pulvero. Diesen v/ird als "neutrals Fraktion" bcaeic ..iCit» Die Auotnuaeherkolonne v/ird Eilt ungefähr ϊίΟΟ nl 21J Ämrc. iiiuittcarbonatlöeung eluiert^ Nach dem Einengen des "ßluatc v'ird dan erlialtene Konzentrat auf oItiä Säule svJ,t :'O c ei., r tark saurciii. lonenaustauacher -Aiaberlite ϊΗ·-1Ρ.Ο (H-¹ Όι-πι) ...-.:{;eben, viobei man einen sauren Durchlauf erhält« Die-.•c:r Du hlauf* v/ird sur Trockene eingeengt und ergibt 1,6 g cliner» ■ ^.uke!braunen Pulvers. Das Pulver wird als "saure T'rakti«·..--" bezeichnet«, Die Ausbeuten und die reaktiven Eigenschaft« »λ diesii Traktionen Bind in tabelle XTI aufgeführte

COPY

90380 5/0989

δ orgöBiaohe Säur* iti f abdtla XVlI auf «of tüupt

0/10	74	•6	0	3	0	•r
1/Ϊ0	0		ο	1	0	8
0/10			ti	O	10

908805/0989

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4 ι-

ffafctid» Aktivität, während die dteXyaierbarij fmktton, f wivkung&loa ist» Döjfaua icann man ochlieesen, daß dl# Substanz ein betriiohtlioi) hohes Moieku:Urg$*iel*t 1 muß, B|e Sub3tanaB«ttige beträgt nur t/B lyaierbarön Freietio» er.d »ach iM0$fähr 7j5 des ItöhiscilieriatXe«: a*h» g^et Damit Kann f99iige?teXXt werden, dag de« ft« Verfahren eine^:^ute Ktthöde »ur

[er Substanz

i> ;

ei an

c ,_}ϊ*

if-

Ί467&7Ο

1« Dae Holekulargewloht der aktive» fc*fc*tea* liegt liöh ho oh.

aktive Bat*»*»»* iet Ια organiöch<m

nicht löattch* Be handelt *i<& dahetf hei dö* aktiven stan« nicht um Fette, Lipide $der Öle. 3. Be handelt «ioh ^«Äe^ W min Alkaloid aoeh um &&*&*· «öuren. Weiterhin lca»a es keiae fannine&ttJ?« ode» oranleche Säure aein*

4» Be handelt öioh vm «ine n©ut*ale Aue diesem Verhalten lcattn ma» echließön, das β« de» ßtthatane m «in »wrl«ia öd#r ein ^alyaaoobÄ Enteoheidung dieser far«s* vu^«» daher äi«

f«rfal^in Mt $ipiid<w«MätÄii^iire eignet

500. m« de« nicht ä«e dwreh ma^ie «bui de©

Haterial witrd in

gelb et» Boröh Meat« mU i3tiei^ore««igöktare vird dft« darin «nthaltene

bleifct 2 Uage Iä der Suite etöhen imd echlag irird ahaentrifügiert. l>a%9i w«rda»/*i*uren darechlage „erhalten. Atta de» überstand wird durch Zugabe einee achtfachen Yol%sie»B a» Xtäyftnol ein HiederechXa*

909805/0989

ssugt. Dieser Niederschlag enthält kein Protein und gibt eine negative Biuretreaktion. Die Reaktion mit PeGl^ ist negativ, ebenso die Reaktion nach Xdebermaxm-BurckXLzti. Die Reaktion nach Molisii-Udransky ist stark positiv»Der Protsinnioderschlag nach Behandlung mit Sriehloreeeißaäure war 3ο klein,daß die antikarssinogone Aktivität deo Niederschlags nicht geprüft werden konnte.Die Ergebnisse der Prüfung auf antikarzinogene Aktivität dar Nichtprotcin-Fraktion sind in Tabelle XIX angegeben.

HX

durch

JDoaie- des Kör- Twraoy- tali- nuote, /k 6

pergew« „g gew, , g tat Jk 1 2

^ntroll^ert physiol. ■

Koohaalzlsg. +2,27 0,7 1/10 « O 2 2

•11 trat . 75 +2,82 0,085 0/10 88,0 2 5 3

33a aieae Wirkungen nur erreicht wurden mit einer Fraktion, &UB der das Protein entfernt worden war, wurde vermutet, daß .die aktive Substanz ein Potyaaceharid Bein kannte.

BAD

0 8 8 0 5/0989

f) Entfärbung:

Die nicht dialyeierbare fraktion, die aus dem Rohextrakt gewonnen worden war, ist schwärzlich gefärbt. Die oben erwähnte Lösung, aus der das Protein entfernt worden war„ ist ebenfalls gefärbt. Sie konnte nicht entfärbt werden, auch nicht siit Aktivkohle. Jedoch konnten die Fraktionen verhältnismäßig gut entfärbt.werden . mit Hilfe von Ionenaustauschern, welche organisphe Farbstoffe selektiv absorbieren*

1,1 g nicht dialysierbares Material (Trockengewicht) werden in 50 ml Wasser aufgelöst und mit Eisessig bis zu einem pH-Wert von 2,5 versetzt. Die Lösung wird filtriert. Zu einem Teil des Filtrates wird Trichloressigsäure gegeben, aber es erscheint kein Niederschlag, Daher wurde vermutet, daß das Protein mit dem Eisessig entfernt worden war. Die Lösung wird durch eine Säule aus 50 ml Duolite S-30 Ent färbungsharz filtriert. Die Duolite S-30-Säule wird vor Gebrauch mit 1N Essigsäure aktiviert. Der Durchfluß war entfärbt und die Säule wird mit 200 ml 1H Essigsäure ausgewaschen. Nach der Dialyse des Etirchi'lußes und der W&9ch£lü.ß3ig keit mit Hilfe von Cellophanpapier zur Abtrennung der Essigsäure wird die nicht dialysierbare Fraktion im Vakuum konzentriert. Sie v/ird als die "nicht-absorbierte Fraktion" bezeichnet. Die gewaschene Säule wird nochmals mit Wasser

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gewaschen und dann mit O,5N Natronlauge eluiert. Das Eluat wird alt verdünnter HpSO. neutralisiert und gegen fliessendes Wasser dialyisert. Die sich ergebende lösung wird im Vakuum konzentriert und getrocknet, Sie wird als die "absorbierte. Fraktion" bezeichnet. Die nicht absorbierte Fraktion besteht aus 450 mg schwach braunen Pulver und die absorbierte Fraktion aus 550 my schwarzem Pulver. Diese Fraktionen wuxMen auf ihre antikarzinogene Aktivität geprüft. Die Ergebnisse dieser Prüfung sind in Tabelle XX zusammengefaßt.

Tabelle XX

dureh-

eohnittl. durch- Tumor- _{Verändermlffen dea}

Verandrg. eohnittl. Mor- Hemm- £^!£??5i!L

Dosie- des Kör- Sumor- tali- quote,

7erbindung rung, mg Aß pergew. ,g gew«, g tat # 1

itroll- Ct	physiol.Koch salzlösung	+2	,27	0	,17	1/10	_	,5	0	2	2	5
*3ht absor- irte Fr.	a 150	+1	,9	0	,095	0/10	86	,0	5	1	4	0
lorbierte iktion	150	+2	,09	1	,211	1/10	-73		0	0	1	8

BAD
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Es gelang, den größten Teil der gefärbten Substanzen von dem Material, das antikarzinogene Aktivität besitzt, durch Verwendung von Duolite 3-30 Entfärbungsharz in Gegenwart von Essigsäure zu trennen. In dem oben erwähnten Versuch konnte nicht wirksames Material, welches ungefähr die Hälfte ■ der nicht dialysierbaren Fraktion ausmacht, entfernt werden,
g) Aussalzen:

Bs wurcls in (e) gezeigt, daß die Aktivität des nicht dialy» aiorbaren Materials keine Beziehung au der Entfernung dee Proteins hat, jedoch gibt" es viele andere Verfahren» um Protein au entfernen.» Daher ist es hiar riotwesidig, auch di& Aktivität der abgetrennten Proteinfraktion seu mtersuchen» Es wurde ein Verfahren geprüft, in welchem mit Asösonitun-· sulfat ausgeealzen wurde und bei welchem ein garöiesas? niederschlag als in dem Verfahren unter Verwendung von TriohlorössigBäure erhalten wurde. Sa konnte jedoch nicht beobachtet werden, daß das Piltrat, von welchem das Material, das ausgesalzen werden sollte, entfernt war, Aktivität besaßο Dagegen hatte die Fällung starke antikarzinogene Aktivität. Wenn das Protein aus dieser Fällung mit Eisessig oder Trichlor- ©ssigStMure entfernt wurde, hatten die resultierenden Substanzen stocke Aktivität«. Man kam daher zu der Schlußfolgerung, Λ&& die aktive Substanz aue der wä&srigen Lösung durch Sät-

tigung tilt Ammoniumsulfat e.usgefällt werden kaum- imü. daß sie Protein int.

5/0980

U67970

Rohextrakte,.die aus Kuma-sasa (gesammelt im Bandai-Gebiet) bereitet worden waren, wurden der Dialyse unterworfen. Das Troekenpulver der erhaltenen nicht dialysierbaren Substanz wurde alB Ausgangsmaterial benutzt. 10 g des Trokkenpulvers wurden aufgelöst in 200 ml Wasser. Die Lösung wurde mit 165 g Ammoniumsulfat gesättigt. Die gesättigte Lösung wurde über Nacht stehengelassen und die braune Fällung abzentrifugiert. Me Fällung wurde mit gesättigter wässriger Ammoniumsulfatlösung gut gewaschen. Der Niederschlag wurde wieder in Wasser aufgenommen und in einem CeI-lophanpapierbeutel gegen fließendes Wasser dialysiert, um anorganische Salze zu entfernen. Die nicht dialyaierbare Fraktion wurde eingedampft und getrocknet und ergab 2 g schwarzes Pulver, Die Mutterlauge wurde ebenfalls der Dialyse unterworfen und in derselben Weise getrocknet. Die antikarzinogene Aktivität dieser zwei Substanzen wurde geprüf t und die Ergebnisse sind in Tabelle XXI gezeigt. Sie sind bestätigt durch andere Untersuchungen, die in Tabelle XXII zusammengefaßt sind.

BAD

909805/0989

U67970

	Tabelle XXI	durch-	Tumor- γ Mor— Hemm— ,	lurao	derun rvolu	gen ment	des I
		gew., g	vallM quOvg | mm tat %	1	2	3	4
	duroh- achnittl.	3,19 1,06 2,15	2/10 - 0/10 95,0 0/10 32,5 .	0 7 0	0 1 2	1 1 1	7 1 7
bindung rung,mg/kg	pergew.,g
trolle phyaiol. Kochaalaleg. derachlag 100 trat 100	+3,56 +3,14 +3,15

Tabelle XXII

durch-

aohnittl. durch-

VerUndrg. sohnittl. Mor- Hemm-Dosier des Kör- Tunor- tall- quote, runis,iag/1cg pergew.,g gew., g tut %

titrolle physiol.Koch- aalslöaung eder- hlag (B) 200	25	+5,0 +4,9	1,97 0,15
öderschlag (3)	100	+3,9	1,55
3derschlag	+5,5	0,06

1/10 - 2 10 6

0/10 92,3 5 0 4 1

0/10 21,3 0 2 17

0/10 97,0 7 12 0

909805/0" "'

BAD

COPY

h) Behandlung ait Bleiacetat:

8,5 g der aus den Rohextrakt bereiteten nicht dialysierbaren Substanz wurden in 100 ml Wasser aufgelöst. 10$ige Bleiacetatlösung wurde unter ständigem Rühren zu der Lösung gegeben. Der niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Bann wurde der Niederschlag in Wasser suspendiert und mit Schwefelwasserstoff behandelt» Nach Abtrennung des Bleisulfide durch Filtration wurde das Filtrat eingedampft und im Vakuum getrocknet. 1,4 g Trokkenpulver wurden als Bleiacetatfraktion gewonnen. Bas Filtrat, da3 durch die Behandlung des Bleiacetats gewonnen worden war, wurde dann mit Seiger Bleiwasserlösung versetzt und der sich bildende Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag wurde in Wasser suspendiert und mit Schwefelwasserstoff behandelt, um Bleiionen zu entfernen. 0,7 g Trockensubstanz wurden als BleiwaBserfraktion gewonnen. Das Filtrat, das durch die Be-

(Subacetat)
handlung mit Bleiwasser/erhalten wurde, wurde ebenfalls mit

Schwefelwasserstoff behandelt, um Bleiionen zu entfernen. 2,0 g farbloses Trockenpulver wurden als die Fraktion erhalten, die sich durch Bleisalze nicht niederschlagen läßt.

Die Ergebnisse der Prüfung auf antikarzinogene Aktivität dieser drei Fraktionen sind in Tabelle XXIlI aufgezeichnet· Es konnte gezeigt werden, daß das wirksame Material aus wässriger Lösung durch Behandlung mit Bleiacetat und Bleiwasser nicht niedergeschlagen werden kann.

9805/0989

Tabelle XXIII

durch—

achnlttl. durch- Tumor- Veränderungen des

Verändrg. achnlttl. Hör'» Hemm- Tumorvolumens Dosie- dee Kur- Tumor- tall- quote, ■ ■

arbindung rung, mg/kg per gew. _tg gew., g tut i* 12 3 4

lontrolle physiol. Kochsalzlösung

'teiacetatiedersohlag 100

ieiwassernieerschlag 100

iurch Blelaale nicht gefülles Material 1OO

+3	•56	3	,19
+2	,28	4	,36
+3	,11	3	,09

+3,04

1,93

2/10 - 0 0 17

2/10 -45,1 0 0 1 7

0/10 3,1 0 0 3 9

1/10 39,6 2 10 6

(III) Reinigungsgang

Ein Reinigungegang kann durch geeignete Zusammenstellung von Verfahren, welche im Abschnitt (II) geschildert worden sind, aufgebaut werden. Bie jeiat konnten die folgenden Tatsachen aus den bisher geschilderten Ergebnissen abgeleitet werden.

(1) Die aktive Substanz 1st nicht löslich in organischen Lösungsmitteln· wie Alkohol, Äther, usw.

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(2) Die aktive Substanz hat neutrale Eigenschaften.

(3) Die aktive Substanz ist nicht dialysierbar.

(4) Die aktive Substanz ist kein Protein.

(5) Die aktive Substanz wird durch Behandlung mit einem AustauscherJzsrz öntfärbt.

(6) Die aktive Substanz kann auegesalzen werden.

(7) Die aktive Substanz wird nicht durch Behandlung mit Bleiacetat niedergeschlagen.

Aus diesen Tatsachen ergibt sich, daß der wirksamste Konzentratione-ReinigungsprozesB die Dialyse und das Aussalzen ist. Es wurde folgender Reinigungsgang versucht, welcher hauptsächlich eine Dialyse und das Aussalzen umfaßt.

Das getrocknete Rohmaterial wird in Stücke geschnitten und zur Herstellung des Rohextraktes mit heißem Wasser extrahiert. Es ist nicht notwendig, den Rohextrakt zu trocknen, um ihn dem nächsten Reinigungsschritt zu unterwerfen. Das Konzentrat des Rohextraktes wird der Dialyse gegen flies· sendee Wasser unterworfen. Der nicht dialysierbare Teil wird durch Sättigung mit Ammoniumsulfat ausgesalzen» Der Niederschlag wird abzentrifugiert, in Wasser aufgenommen und wiederum dialysiert, um anorganische Ionen zu entfernen. Die nicht dialysierbare Lösung wird mit Eisessig angesäuert. Nach Entfernung des Proteins durch Zentrifugation wird die

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U67970

Lösung durch eine Säule mit einem Entfärbunsharz geschickt, 2SeBo -Duolite S-30. Der Durchfluß wird konzentriert und mit Äthanol versetzt, bis ein niederschlag auftritt<, Die anzureichernde Substanz ist dieser Niederschlag. Wenn sie einen verhältnismäßig großen Anteil an Glührückstand enthält wird sie mit Hilfe von Ionenaustauschern entsalzt. Einzelheiten werden in späteren Beispielen beschrieben. FUr die Entfernung des Proteine kann wie oben erwähnt Eisessig anstelle von Trichloressigsäure verwendet werden« In anderen Versuchen wurde die Wirkung des Proteins, welches durch Ammoniumsulfatfällung, Aufnehmen in Wasser und Versetzen mit !Eriohloressigsäure als Niederschlag gewonnen wurde, hinsichtlich der antikarzinogenen Aktivität mit dem Piltrat, d. h. mit der Hicht-Proteinfraktion, verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle XXIV dargestellt.

H67970

Tabelle XXIV

	durch- schnittl. Verändrg. des Kör pergew. , g	+4,4	dureh- schnittl. Tumor- gew., β	Mor tali tät	Tumor- Hemm- quote,	Veränderungen Tumorvolumens	2	3
Dosie- Verbindung rungtmg/kß	physiol.Koch- Kontrolle salzlösung +5,8	+5,2	1,97	0/10		1	1	O
	Protein 100	+4,9	1,Ot	0/10	48,6	2	2	1
Kicht-Protein 100		0,05	0/10	97,5	O	2	1
CH,COOH-Fil- trat 1OQ	0,20	0/10	.. 90,0	7	O	1
			.7

Aus diesen Ergebnisaen wird wiederum bestätigt, daß die Proteinfraktion keine antikarzinogene Aktivität besitzt,daß abec die Wicht-Proteinfraktion eine starke Aktivität aufweist.

Bin Verfahren ohne Dialyse wird nachstehend als weiterer Reinigungsgang erläutert. Die Lösung des Hohextraktes wird mit Schwefelsäure oder anderen Säuren angesäuert und dadurch werden einige Kationen und Proteine gefällt. Der Niederschlag wird entfernt, das Piltrat sofort mit Ammoniurasulfat gesättigt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in Wasser nufgenommen. Anorganische Salze werden durch stark

erhaltene

saure und basische Ionenaustauscher entfernt» Der/neutrale Durchfluß wird mit Essigsäure versetzt. Dann wird die Lösung zur Entfärbung durch eine Austauachersäule, wie Duolite S-3Q

BAD ORiGiHaL

COf '^{5 n Λ} 3 0 S I 0 9 8 9

gefiihrt. Die entfSrbte Lösung wird im Vakuum eingeengt und Y/ird mit einem Lösungsmittel, wie Äthanol, Methanol oder Aceton versetzt, um ein Troekenpulver zu erzielen. Die Ein« zelheiten Aierden in Beispiel 3, 4 und 5 beschrieben,

natürlich kann das zu isolierende Material durch verschiedene andere Kombinationen von Verfahrensschritten als die oben geschilderten isoliert werden. Es kann nötig sein,dieselben Verfahrensschritte zu wiederholen. Die Ausbeuten an aktivem Material bei den erwähnten Reinigungagängen 3ind in Tabelle XXV zusammengefaßt. Die Ausbeuten hängen ab von der Art der Rohmaterials, dem Zeitpunkt der Ernte und anderen Bedingungen.

	aus g	Tabelle XXV	Ausbeute, g
			0,5 0,28 1,03
Rohoxtrakt Kuma sasa,	Endprodukt, g
600 600 590	3,0 1,7 6,1

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(I?) Eigenschaften:

Dae Endprodukt ißt ein hellbraunes Pulver und enthält noch Verunreinigungen, wie Farbstoffe, Asche und Stickstoff enthaltende Substanzen. Die Eigenschaften des Endproduktes« das so gut wie möglich, gereinigt worden war, werden unter-

BUCht.

Die erhaltene Substang; ist löslich in Wasser, kaum löslich in organischen Lösungsmitteln, wie Äthanol, Methanol, Aceton, Äther, Petroläther, Chloroform und Benaol. Die Substanz ist nicht dialysierbar, läßt sich durch Aussalzen ausfällen und ist nichtionisch. Sie gibt eine negative Biuretreaktion und eine negative Hinhydrinreaktion. Aminosäuren können nicht nachgewiesen werden, da die papierchromat^ographisehe Untersuchung dee Hydrolysates dee Materials auf Aminosäuren negativ verlief. Daher wurde unterstellt, daß Eiweiß nicht in Endprodukt vorhanden ist. Die FeCl^-Reaktion auf Phenole, wie Tannineäure und ähnliche Verbindungen, ist negativ, auch die liebermann-Burohard·β Reaktion auf Steroide und Saponihglucoside ist negativ. Da ein charakteristisches Absorptionsmaximum bei Wellenlängen größer als 220 in// nicht festgestellt werden könnt·, enthält das Endprodukt keine Flavonglucoside, Proteine oder Nucleotide. Mit dem Endprodukt können die folgenden Reaktionen stark positiv erhalten werden: Molisoh-

BAD

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H67970

üdransky, Anthron-HgSO^, Orcin-HOl, Phenol-R^SO^ und Trypthophan-HgSO^. Das Produkt reagiert negativ mit Fehling's, Benedict's und Sollena«s Reagenz. Die Bison-Morgan Reaktion ist negativ und auch die Oarlsazol-HgSO. Reaktion ist negativ.

Aus diesem Verhalten kann gescbloßen worden, daß die aktive SubBtanz ein Polysaccharid.iat· Biese Vermutung wird bestätigt durch dao Infrarotspsktrum. In Abbildung 1 ist die AbsorptionBkurve des Polysaccharide dargestellt xmxl in Abbildung 2 diejenige üeo Aoetylderivata. Im !'alle tleo Acetyltierivats ist die Absorption, die der OH Gruppe ziikoimvt, fortgefallen.

Acetylierung des Polysaccharide,

1 g dos Polyeacoharidß wird in dem 5~£achen Volumen 80#igera Pyridin gelbst. Dieser iöeung wird unter dauerndem Rühren nach und naoh eine Mischung dee 5-fachen Volumens Pyridin und des 10-fachen Volumens Eaeigeäureanhydrid zugesetzt. Danach wird.die Mischung bei 80°0 auf einen Wasserbad 4 Stunden erwärmt. Anschließend wird die Mischung in zerkleinertes Sie gegeben» mit Chloroform versetzt und ausgeschüttelt. Sie Chloroformphase wird von der Wasserphase abgetrennt, mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrooknet. Nach dem Verdampfen des Chloroforms wird Petroläther zugefügt und der entstandene niederschlag abgetrennt und getrocknet. Es werden 1,25 g eines amorphen weißen PuI-vere erhalten.

U67970

-54-

(?) Hydrolyse des Polysaccharide ·

5 mg der erhaltenen Substanz werden in 0,5 ml IS HgSO-aufgelöst. Biese Lösung wird in einem Bombenrohr 5 Stunden auf 100⁰G erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Lösung mit Bariumcarbonat versetzt und neutralisiert und anschließend abfiltriert. Das Filtrat wird zur weiteren Untersuchung benutzt ,

Hit dem Hydrolysat wird eine papierchromatographische Untersuchung durchgeführt. Es wird das Filterpapier Hr. 51, hergestellt von der Toy ο iioshi Co., benutzt und die Papierohromatographie wird nach der aufsteigenden Methode durchgeführt. Als Lösungsmittel werden die folgenden drei Systeme verwendet.

1. Äthylacetat-Pyridin - Wasser ( 2:1:2)

2. Äthylacetat - Eisessig - Wasser (3:1:3) ι 3. Phenol - Wasser (5:1)

BAD ORIGINAL ^09805/0989

U67970

Verachiedene Spruhreagensien werden für die Entwicklung be« nntst und die Ergebnisse aind In Tabelle XXVI aufgeseiclw net. ' '

'- - ■ . ·.	Tabelle XXTI B^-Wert	Pl.eolt 2	Fleck 3
LöBungsraittel- ßyeteu	Fleck 1	0,33 0,22 0,44	0,235 0,14
1 2 3 -	0,38 0,265 0,H

wurde gefunden, da8 das Hydrolysat 3 Arten von Mono-

aaoohariden enthillt. Verschiedene Sprühreagensien wurden mit

I den LüeungsBittelsyeteA 1 benutst und die Ergebnisse sind in

Tabelle XXVII «ueanraengefaßt. Tabelle

V⁰·⁵³

Hj-0,235

Awomiak-AffflO, n-Phenylendiamin	ι	rötlieh- braun*	rot	braun	•
Anilinnydrogenphthä- lat xot .	graublau	rötlich- braun	gelb-braun
Anieidin-HCl	-	graublau
Reaoroin-HCl		-
Hinhydrin

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-56-

Aue dieser Tabelle geht hervor, daß swei Aldopentosen und eine Aldolioxose in dem Hydrolysat enthalten sind. Ee wurde auf-Grund, der Bj-Vierte vermutet, daß dies Xylose, Arabinose und Galactose sind. Darauf wurde die Papierohromatographie unter Verwendung authentischer Proben durchgeführt und es konnte bewiesen werden, daß diese Substanzen tatsächlich im Hydrolysat enthalten waren·

Weitere Untersuchungen wurden mit Hilfe der Paperchromatographie durchgeführt, tun den Anteil der Monosaccharide in der erhaltenen Substanz festzustellen. Die Papierchromatographie wurde, durchgeführt unter Benutzung eines Löaungsmittelsystems, das aus Äthylacetat, Pyridin und Wasser (2:1:1) bestand und 0,15 H AgFO, enthielt. Es wurde aufsteigend ohromatographiert. Nach dem Lauf wurde das Papier an der Luft getrocknet und 1 Stunde in einem geschloßenen Gefäß aufbewahrt, das Ammoniak enthielt. Darauf wurde es 20 min auf 80⁰O erhitzt* Braune Flecke erschienen. Die optische Sichte der Flecken wurde mit einem Densitometer gesessen und mit einem Standard verglichen, der durch Mischung der authentischen Proben der Monosaccharide Xylose, Arabinose und Galactose in verschiedenem Mengenverhältnis hergestellt worden war« Eb wurde festgestellt, daß die erhaltene Substanz Xylose, Arabinose und Galactose in einem molekularen Verhältnis von 1:1:1 enthält.

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Chromatographie an Ionenaustauschern wurde ebenfalls durchgeführt. Die Monosaccharide.können leicht mit Borsäure ader Borat umgesetzt und in die entsprechenden Boratkomplexe übergeführt werden, welehe eine negative Ladung

besitzen. Die Chromatographie an Ionenaustauschern der

im Hydrolysat

Monosaccharide, die /in der Substanz enthalten waren, wurde unter Benutzung dienes Prinzips ausgeführt.

Als Ionenaustauscher vmrde der Rarzaustauscher Doweac-I in einer Säule benutzt. Diosex* Austauscher wurde mit 1H HCl. gewaschen und 0,1 M Kaliumtetrntyoratlosung (K₀B^O.,) wurde auf die Säule gegeben. Die Säule wurde mit der Boratlösung' gewaschen, bis keine Chlorionen mehr nachweisbar waren. Nach der Überführung des Harzaustausohers in die Boratform wurde die Säule gründlich mit Wasser gewaschen. Die Probe der zu untersuchenden Substanz vmrde folgendermaßen vorbereitet. 25 mg der Substanz wurden in 1 ml 1ΪΙ H₂SO; gelöst und die ' Lösung wurde im kochenden Wasserbad 5 Stunden erhitzt. Dann wurden Säureanteile durch Benutzung von 5 »1 des Ionenaustauschers Dowex 3 entfernt und die Lösung wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 ml 0,01 H Kaliumtetraboratlösung aufgelöst. Die Lösung wurde durch die Säule gesohickt und danach wurde die Säule mit Kaliumtetraboratlösung eluiert. Jede Fraktion des Eluats bestand aus 20 ml. Die Monosaccharide in jeder fraktion wurden nachgewiesen durch die Orcln-HCl- und die Anthron-HgSO.-

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Methode. Die Bestimmung wurde durchgeführt mit Hilfe eines Spektrophotometers mit einem roten Filter. Die Ergebnisse bewiesen die Gegenwart von Xylose, Arabinose und Galactose· Die Ergebniese der Papierchromatographie konnten durch diese Methose bestätigt werden und es wurde auch hier gefunden, daß das Mengenverhältnis von·Xylose : Arabinose : Galactose wie 1:1:1 ist.

(TI) Antikareinogene Aktivität des gereinigten Polysaccharide:

Die antikarzinogene Aktivität des aus dem Rohextrakt gewonnenen gereinigten Polysaccharide (SPS) auf die transplant . tierteri Tumoren bei'Mäusen wurde untersucht durch Vergleich mit der Aktivität von Mitomycin C, einem Handelspräparat.

Die folgenden Tumoren wurden benutzt. Die faste und die Aseites-Form des Ehrlich-Kar^inoms, die feste Form von Sarkom 180, Aacites MH-129-B im C3H-Stamm und die Friend-Yirus-Krankheit, die auf DD/Albino-Mäuse übertragen werden kann. Diese transplantable Mäusekrankheit wurde von 0. Friend ungefähr vor 6 Jahren 'entdeckt und sie ist durch ein Virus verursacht.

Methoden für den Asoites-Tumor.

Frisch aspirierte AsciteBflüssigkeit der Bhrlich-Karzinoma und von MH-129-E# die eine Woche nach der Inoculation gewonnen wurde» wurde in Dosen von 0,2 ml intraperitoneal örup-

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pen yon je 10 Mäusen injiziert. Die Asciteefltissigkelt enthielt ungefähr 6 Millionen Zellen in 0,2 ml. Die Behandlung wurde 24 Stunden nach der inoculation*und 10 Tage vor der Inoculation der AscitesflttsBigkeit begonnen und täglich fortgesetzt. Die durchschnittliche tlberlebensquote jeder Gruppe wurde ale Kriterium zur Beurteilung der Wir* kung der untersuchten Substansen benutzt.

Methoden für die Friend-Virus-Krankneit.

0,2 ml einer Suspension von mit Piend-Vlrue injizierten Milfsen, die 10 i> Kochsalz enthielt, wurde intraperi-toneal Mäusen injiziert und 10 Mäuse als eine Gruppe genommen. Die Behandlung wurde 24 Stunden nach und 1Ö Tage vor der Injektion der Milzhomogenate begonnen und täglich fortgesetat. Die Wirkung der Verbindungen wurde festgestellt durch Vergleich des durchschnittlichen Gewichts der Milz in behandelten und unbehandelten infizierten Mäusen 3 Wochen nach der Injektion des Milzhoxnogenats.

Methoden für eubkutane Tumoren.

0,2 Ml der Aeciteöflüesigkeit von einer Woche alten Ehrlich-KarEinomen und Sarkom 180, welche annähernd 12 Millionen Zellen enthielten» wurden subkutan in der Inguinalregion weiblichen DD-Albino-Mäueen injiziert, die ungefähr

9 0 9 8 0 g ^ Ö 9 8 9

20 g wogen. Die Behandlung begann 1 Tag und 5 lage nach derrintraperitonealen Implantation und wurde jeden 2. Tag durchgeführt.

Sie Tumoren wurden an mehreren Sagen mit einem Zirkel gemessen und das Volumen annähernd berechnet. Am 29· Sag wurden die Mäuse getötet und einer Autopsie untereogen. " Bas Körpergewioht und das Tumorgewioht wurden gesessen'· Die ' - Hewsquote wurde aus den Vergleich dee durchschnittlichen Tumorgewichte der behandelten Gruppe Mt den der . Kontrollgruppe berechnet« Für die Beurteilung dee wachstuns dee Tumors wurde die Tumorgröße der Mäuse in jeder Gruppe am 29* Tag gemessen und mit den Tumorumfang am 11. Tag Terglichen. Die Regression, Abnahme» unveränderte Gröese und Zunahme wurde auf Grund dieser Vergleiche bestimmt. JSs wurden, folgende Ergebnisse erhalten:

Aeoltee-Sttmorea·

Die Werte £Ü* dal» Ehrllch-Ascite e-KarBinom und MH-129-E sind in Tabelle ZXVIII gezeigt. Beide Behandlungsarten, ·-· welche 10 Tage vorher und 24 Stunden nach der Inooulation mit der Asoitesflttssigkeit begonnen wurden» wad ßwar duroh in~ traperitoneale Injektion von SfS in Dosen von 100 mjj/kgi verhinderten das Waohetum der Tumoren nicht und verlängerten auch die LebensBeit der Mäuse nicht mit Ausnahme fön eines Tier in 20 behandelten Mäusen. Die Aeci te »flüssigkeit dieser Maus nahm langeas zu bis sub 20«Tag, danach nahm sie allmählich ab und verschwand schließlich vollständig.

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XXYIII

Wirkung von SPS auf das Ehrlich Aaoiteo Karainom im Stamm DD und auf daa MH-129-E Ascites-Hepatom im Stamm CjH

O CO OO O

O CO OO (O

Verbindung

Ehrlich A·eitee Karatno»

MH-129-B

Doaierung,mg/kg

Beginn der Behandlung

durch- Ge-. Zahl aurch-

sc&nittl. ,eehl< 4er aohnittl.

Ge- Zahl der Überle- ' Mäu- Überle-

schlecht Mäuse benszeit, se benszeit,

Kontrolle physiol.Koch-

aalalöeung 1 .Tag

SFS

Q.

100

100

10 lage vorher

1 .Tag

10

10 10

13,4

12,2 >12,8

5
5

32,5 25,4

tt:f

16,8 19,4

?riend-Virus-Krankheit.

Die intraperitoneale Injektion von SPS mit einer Dosierung von IQQ mg/kg hatte keinen hemmenden Effekt auf diese Virusleukämie, Y/enn die Behandlung 10 Tage vor und 24 Stunden nach der Injektion >ier Milzhoraogenate vorgenommen wurde. Mitomycin C hatte eine zerstörende Wirkung auf diese Krankheit, wie am Milzgewicht festgestellt werden konnte.

I . . ^; ■. ■

tabelle XXIX
Wirkung von SPS und Mitomycin C auf die Friend-Virus-Ka?ankhett

dosierung, DiirchmgAs * schnittl. Durchwahl der Verändrg, schnittl. Hör-Behänddes Kör- Milzge- tali-Verbindung lungen pergew.,g wicht, g tut Hernrnquote, % ,

Kontrolle	physiol.Koch	+2,7	3,0	0/10	-23
	salzlösung	+0,9	3,7	4/10	0
SPS	50 χ 18*	+2,9	3,0	5/10	80
	50 χ 13**	+0,7	0,6	1/10
Mitomycin C	1,8 χ 13**

* Behandlung wurde 10 Tage vor der Implantation begonnen ** Behandlung wurde 1 Tag nach der Implantation begonnen.

Subkutane Tumoren. .

Die Tumoren, die am besten auf SPS ansprachen, waren das subkutane Ehrlich Karzinom und das Sarkom-180. Wie aus Tabelle XXX ersichtlich ist, konnte eine volletündige Rückbildung beobachtet werden und zwar bei den Tieren, bei denen die Behandlung mit 200 mg SPS/kg am ersten Tag

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uo:«?dcn via:·, in 9f>;S der KiIIo und bei de«· T bsi denen Λ±ν ΒοηθτκΠ.υή'? am 5. £ag begonnen worden war, in 60?9..d^ff Fälle. Bei Behandlung mit Dosen sawiechen 25 mid 100.mg sr3/kß boi. oinera ?ag und. 5 Vage alten 'Jumc-ι·βη xnrcilo c^enfaXlrs ein lieamendor Bffokt licobaohtet. Bei 1 Und 5 Tago alte« Tuiaoren vmrde bei Behandlung mit Mitomycin 0 keine vollständige Rückbildung beobachtet,

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*♦♦*♦«*

XXXI

SSEf U8& Mtoasyc&fc C mit 4a» subkutan

*» S

1	Z	0'	4
0	0	t	3
&		2	0
6		0
	2	2
0	2	•5

100 χ 15 3*1,β ac 1

1/5

€/10

28

λΛ ^w . _s --Ϊ

Der be^eutönöate Aspekt cUeaer tfat^uofcUHgea let «ie fca~ . ho I-rozefltzafcl der BückMlduttg de» subkutan«» 6äj?1co«-1B0 und des HhrliclWiarainoms bei «Rue»», -^eXcfce dftroh intra~ peritcnealo InJQktiofc van SPS Imtemdslt vrurätn tmd dio «erringe Töxiisität. Bis Subiitan» hatte keine Wtxktiftg «uf i

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Säääffii

mit signifikanten Wirkungen auf das subkutane Sarkom 37, Sarkom 180 und Krebs 2, die aber keine Wirkung bei den Ascitesformen dieser Tumoren habe i. Die onkolytischen Eigenschaften dieser Hefepolysaccharide uind sehr ähnlich denjenigen der erfindungsgemäß hergestellten Polysaccharide. Sie beeinflußen die Resorption von soliden Tumoren, sie verursachen Nekrose der Tumoren ohne H'imorrhagie und siesind wirkungslos gegenüber Aaoites-Tuinoeen. Diller et al. schlossen aus ihren Untersuchungen übe:·: ten WirkungEinechanismue dieser Substanzen, daß die Resorption des Tumors und die Nekrose durch eine Verraittlungsreaktion erfolgen Jcönnte, bei der dio phagocytären Elemente der Leber und _ Milz angeregt werden. Bei den Untersuchungen zeigte das erfindungsgemäß hergestellte SPS keinen Ei ifluß auf das Angehen oder das Wachstum der subkutanen Tumoren innerhalb der ersten 9 Tage nach der Transplantation. Die Substanz scheint nicht direkt auf die Tumor ze Ilen zu wircen, η durch eine noch unbekannte Substanz, welche sekundär im Tierkörper gebildet wird.

So scheint der Wirkungsmec'ianlsmus von SPS nicht derselbe zu sein, wie derjenige, der bei der direkten Tumorzeretörung durch bakterielle Polysaccharide vorliegt und welcher schon früher von vielen Forschern berichtet worden ist. Er scheint auch verschieden zu sein von der Wirkung der Polysaccharide ■

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welche von B.elkin et al. aun höliqren Pflanzen iooliert worden sind, und v/eleho das Wnoiisitum des Ancitea Sarkoms 37 hemmen können.

Die Beispiele erläutern das orfinrtungegemaLio Verfahren.

Beispiel 1

10 kg getrocknete Blätter von Sasa albo-marginata Makino et Shibata werden geschnitten und in etwa 70 Liter. Wasser suspendiert. Die Mischung wird auf 80 Mo 10O⁰O erhitzt*» und 5 Stunden box dieser Temperatur unter Rühren gehalten, iiach dem Stohenlaöseu. der Lösung V^ei ^irjiuüitoüi^oratur v/ird aio filtriert. Dor P.ückatand wird mit etv*, 60 Litei.· vrasser vorßetat und wieder extrahiert. Per duükelbrauns Extrakt wird unter veryaindertem Druck'konzentriert. Der pH-Wert deo Ex~ traktes ist nahezu neutral. Durch PiltEation können Verunreinigungen de» konzentrierten Extraktes entfernt v/erden. Das Piltrat wird dann gegen fließende« V/aerser 24 bio 48 Stunden mit Hilfe von üellophanpapier al« Boraipermoahle ViQm- hvan dialyaierto Das Innendialyeat wird wiederum filtriort und das Siltrat im Vakuum auf ungefähr 2 Liter eingeengt. Dann v/ird pulverisiertes Amnoniumsulfat unter Rülircn bis zu Sättigung zugefügt. Die Lösung wird über Nacht im Kühlraum stehengelassen, danach filtriert. Der dunkelbraune Niederschlag wird mehrmals mit gesättigter Ammoniuinsulfatlösung

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gewaschen. Darm, v/ird der niederschlag in etv/a 2 Mter V/aaaer aufgenommen und von Verunreinigungen abfiltriert. Das F;iltrr.t v/.ird gagen ionenfreies Wasser 24 Stunden unter Bonut- ?iv.uz von Cellophanpapier als aera:·, permeable Membran α Ι ει Iyoisrt. Das ojfhaitono rnnondialy;-,£>.t wird auf ungefähr 1 Liter im Vakuum koaaontrioi't. Dann v/Aru die Losung mit etwa 60 ml E:u.;c;jaig vei'eetist. Man orbiilt eine 1ΪΪ EßBigaruirelößiuigc Jfieä er schlage, vrie Protein Uiid. älinlic'-io ^ubataaiKoii, v/erdeii abfiltriert. Tw- I^piltrat v/ird durch eine Aufstaue eher oäule filttriort, vralclie otv/a 200 ml IHiolit« Ü-30 fiiitfarbungaharii enthält, das rait 1Π Eßsigääuro vorroliancialt worden w.ar.. Dor Durchfluß i«t nuv· :ioch schwach gelb gefärbt .Der Durchfluß wird in Vakuum auf ungefähr 100 iul konsi^ntriart. JUesö Lösung wird mit Ί-00 Eil Ji'i.hfüxol v'ersetat und die entstehende Fällung wird iibaenvi-ifugiert und getrockiret. Man erhält 3_r4'g PoIy-

oviä. Dae JSndpi'odulct .Ist ein schwach ^elb'es fein«ο Sr₅ duo in V/aaser l?5i)l:lch, ;iijdoch öchv;er lönlich in öen gdwöl'Jiliciujn ov&sniBChen I-ortuiüöifi.ittGln ist. Ea ist nicht hyjTrowkopisch. Die Verbremungtjanal.yne des Produktes ergibt folgende Werte:

Vi 1,12$; Asche: 3,64 '^.

Beispiel 2

Trockene Blätter von Sasa-Gras (Sasa albo-marginata), welches in Okunikko im Dezember 1962 geerntet worden war, werden

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ßerstampft und 390 k# davon werden, in 3000 Liter Wasser bei 60 bis 80⁰C unter heftigem Rühren ungefähr 8 Stunden incubiert. Naoh Filtration der extrahierten Lösung wird der Extrakt auf etwa 160 Liter unter vermindertem Druck konzentriert und dann unter Zueata von 12 kg Filtrierhilfe filtriert. Das Piltrat wird gegen fließendes Vfasser dialyeiert und das Innendialysat auf etwa 40 Liter konzentriert. Das Konzentrat wird mit Ammoniumsulfat gesättigt und über Nacht ötehen gelaasen. Die entstandene Fällung wird abzentrifugiert und 2 mal mit gesättigter Aramoniumsulfatlösung gewaschen. Dann wird der lfiederischlag in 40 Liter V/aeser aufgenommen und gegen fließendes Waoßor dialysiert. Dae Innendialysat wird auf 42 Liter konzentriert und dann mit 3 Liter Eisessig versetzt. Die Löuung wird über Ha.cht stehen gelassen. Dann wird zentrifugiert und der Überstand durch eine Duolite ΰ-30 Harzauetauseher säule filtriert «Der Durchflui} wird filtriert, auf etwa 5 Litor konzentriert und dann mit 4 Volumen Äthanol versetzt. Die Lösung wird Über Hacht stehengelassen. Aue dieser Lösung werden 70 g graubraunes amorphes Pulver gewonnen. Das rohe Pulver v/ird wiederum in 2 Liter destilliertem Waeser aufgenommen und von unlöslichen Stoffen abfiltriert. Dan Filtrat wird durch eine Amberlite IR-120 Austauschersäule (H-Form, 700 ml) und aasohließend durch eine Amberlite IRA-410 Austaußchersäule (OH-Form, 1000 ml) filtriert. Der Durchfluß wird im Vakuum konzentriert und mit 4.Volumen

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Äthanol verdatet. Die Lösung wird über Nacht stehengelassen. Der entstehende Niederschlag, wird abzentrifugiert und mit Äthanol und Äther gewasohen. Bs werden 14 g graues Pulver erhalten! welches eine ausgesprochen positive Orcin, Molish. und Anthron-Reaktion gibt, aber negativ auf PeIiling's, Tollona'SjElson-Morgan's und Hinhydrln Reagenz reagiert· Das Pulver ist leicht löslich in Wasser und unlöslich in den gewöhnlichen organischen Lösungsmitteln. Die Verbindung ergab die folgende Elementaranalyse:

0 44,6 #; H >,94 i>\ N 0,75 #; Asche 2,1#.

Beispiel 3

Frische Blätter von saöa-psyniculata werden in feine Stücke geschnitten. 30 kg.der geschnittenen Blätter werden in 200 Liter Wasser suspendiert und unter Rühren gekocht. Im Verlauf des Auelaugens wird die Lösung sauer· Darum wird CaI-ciunihydroxyd zugefügt,- um die FlUseigkeit neutral zu halten. Nach ungefähr 5 Stunden wird dieser Prozess unterbrochen und der Extrakt filtriert. Der Rückstand wird wiederum mit 100 Liter Wasser extrahiert. 400 g Calciumhydroxyd werden insgesamt für .den JBxtraktioneprozesB benötigt. Die Extrakte werden vereinigt und im Vfücuum auf ungefähr 20 Liter eingeengt· Dies stellt den Bphextrakt dar. Dann wird der Extrakt mit verdünnter Schwefelsäure auf pH 3,5 eingestellt. !CaI-

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ciumsalze und Protein werden niedergeschlagen und durch Filtration abgetrennt. Das Piltrat wird mit verdünnter natriumcarbonat lösung unter Rühren . ...,·.. . . ;.

neutraliBiert. Danach wird pulverisiertes Aiamonium-Bulfat bis zur Sättigung unter Rühren zugesetzt* Nach dem Stehenlassen der Lösung über Hacht wird sie gefiltert. Der dunkelbraune Niederschlag wird wieder in etwa 7 Liter Wasser aufgenommen« Die Lösung wird nochmals gefiltert, um Verunreinigungen au entfernen, und da» Piltrat wird dann mit Ammoniumsulfat gesättigt· Das Aussalzen wird mehrmals wiederholt. Das sich ergebende Material v/ird mit gesättigter Ammoniumsulfatesung gewaschen und in etwa 3 Liter destilliertem Wastser aufgenommen.. Dann wird die Lösung durch stark saure und s tark basische ionentvustauschersäulen filtriert, um anorganische Ionen vollständig zu entfernen. Dem Durchfluß wird Eisessig zugefügt bis au einer Konzentration von ungefähr 1 normal. Der geringe Proteinniederschlag wird sorgfältig abfiltriert. Dann wird das Filtrat durch eine

Duolite S-30 Austausehereaule filtriert J)er Durchfluß wird im Vakuum auf 200 ml eingeengt. Zu dieser Lösung werden 800 ml Aceton gegeben. Hach dem Abfiltrieren des Niederschlages wird die erhaltene Fällung mit wasserhaltigem 80#igem Aceton gewaschen und anschließend mit wasserfreiem Aceton behandelt und getrocknet. Man erhält 5,5 g dunkles Pulver.

K 1,3 $>\ Asche 3,5 ^. ■

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1»2 kg gcechnittene Roispflnnsen (Ory'sa Sativa L.) v/erden in ungefähr 20 Liter V/ajjcor suspendiert und etwa 5 Stunden unter Rühren auf 90 bis 93⁰O erhitzt. Nach dem Stehenlaesen äer Mischung bei Zimmertemperatur wird filtriert. Das -Pil— trat wird im Vakuum auf ungefähr 1,2 Liter eingeengt. Dann werden 60 ml Eisessig 2ugefügt, um die Lösung sauer zu machen. Die entstandene Fällung v/ird durch 3ontrifugation abgetrennt. Der Überstand v/ird auf 600 inl eingeengt und unter Rühren mit pulverisiertem AirjnoniiuiifcUlfat bis iiur iUittigiuig versetzt. Die gesättigte Lösung v/ird über Hach.t in einsra Kühiraiun v.teilengelassen und dann .gefiltert. Dia dUii3;«ll>rauhe. Füllung wild aentrifugiert \ma z\/e±nel .mit geaättigtsr Ammoi'.iiiBis'iili'ai^:3.öi3ung gewa^thon« D;mn v/ird die i'allimg in iingofähr L)OO /tjI Wasser aui'geuoairien tmei gegen ίΊ±βί3ϋ:κίβε V/aesor in Oellophanpapier 3 it'age dialysiert. Das Imieiidialys&t. wird im Vakuum auf 680 ml eingeengt. Nach Zugabe von ungefähr 42 ml Eieeseig wird die Lösung durch eine Duolite S-30 Auetauschersäule filtriert, welche mit 1N Essigsäure vorbehandelt worden war. Das Volumen des Austausehers im V/assdr beträgt ungefähr 100 ml«, Der Durohfluß ,ist noch^ schwach gelb gefärbt iuid -'■;--.wird 3 l'age dialysiert und dann im Vakuum auf urjgöfähr 40 wl eingeengt. Die Irisung wird mit 160 ml Äthanol vei-f:et«t und ciio s ich bildende Fällung wiflpd>~abzeittrifugier.t und getrocknete Man erhält 0,27 g Poly.'^accharid. Das Pr.o-

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dukt let einfeineβ grauet Pulver, welches in Wasser lös» lieh, aber in den gewöhnlichen oraniechen Lösungsmitteln kaum löslich ist. Sb ist nich hygroskopisch.

N 0,9 %; Ab ehe 2,0 #. Beispiel ft

10 kg getrocknete Blätter und Stengel von Maie (Zea Mays L«) werden zerstampf und mit ungefähr 70 Liter Wasser vereetzt. Die Suspension wird etwa 5 Stunden unter Rühren auf 80 bis 100°ö erhitzt. Nach Pilt:?ierung der extrahierten Lösung werden die rückständigen MaLablätter und Stengel mit 70 Liter Wasser versetzt und v/iedarum eihitat, dann filtriert. Die extrahierten Löoungen we ?den vereinigt und unter vermindertem Druck auf ungefähr 1 ) Liter eingeengt. Dann werden 600 ml Eisessig zugefügt. Die gebildete Fällung wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Lösung wird dann auf ungefähr 4 Liter konzentriert und miter Rühren wird festes Ammoniumsulfat bis zur Sättigung zugefügt. Diese gesättigte Lösung wird über Nacht im Kühlraum stehengelassen und dann filtriert. Der braune Niederschlag wird abzentrifugiert und zweimal mit gesättigter Ammoniumsulfatlöeung gewaschen. Dann wird der- Niederschlag in ungefähr 4 Liter Wasser aufgenommen und gegen fließendes Wasser mit Hilfe einer Oellophanpapier- Membran 2 lage dialysiert. Das Innendialysat wird unter ver minderten Druck auf 3 Liter eingeengt. Nach Zugabe von 200 ml

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üi-'iß \ΐ±\·α. die. Lösung durch eine !Ouolite S-30 Austau~ scher säule; filtriert, wololi© mit 1U Essigsäure vorbehandelt worden war. Der Durchfluß ist nur noch hellgelb ge färbt und wirrt 2 Tage dialysiert » dann im Vakuuia auf ungefähr 500 ral cixigengt. ITach Zugabe von 1,5 Liter ^: Äthanol wird di«.> Wnllmig abaentrifugiert und getrocknet. . Man erhält 1,8 g hellgslbös Polysaecharid. H 1,25 $■% Asche 0,8 JA.

3»5 ^g V/eizenstro3i werden mit 45 Liter Wasser vermischt und 6 Stunden unter Rühren auf 90 bis 95°C erhitzt. Der Extrakt wird abfiltriert und im Vakuum auf 2,3 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird 45 Stunden mit Hilfe von Cellophanpapier dialysiert und dann auf 750 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wird mit Ammoniumsulfat^ gesättigt. Die Lösung· wird _: über Nacht stehengelassen und die dunkelbraune fällung wird durch Zentrifugation gewonnen. Die Fällung wird wieder in 500 ml Waeeer aufgenommen und "Verunreinigungen werden durch Filtration entfernt« Das Pilfrat wird wieder mit Ajpnoniumsulfat gesättigt. Der erhaltene Niederschlag wird gut ge-f waschen mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung und in 750 »X destilliertem Wasser aufgenommen. Die Lösung wird durch eine Säule eines stark sauren Kunsthare-Ionenaustauschers und darauf durch eine Säule eines stark basischen Kirnethara-Ionen-

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auBtauschers geleitet,tun alle anorganischen Salze vollständig zu entfernen. Der Durchfluß wird mit 40 al Bisessig versetzt Mb eine Konzentration von ungefähr 1 normal erreicht ist. Die niedergeschlagenen Proteine werden sorg-

fältig abfiltriert. Danach wird das Piltrat durch eine Säule Duolite 3-30 Bntfärbungehara geeohickt und der Durchfluß im Vakuum bis auf 100 ml konzentriert. Nach Filtration des

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Konsentrates werden 400 ml Aueton zugefügt. Der niederschlag wird iiitriert, mit 80$igem wässrigen Aceton und anschile-

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Bend mit wasserfreiem Aceton gut gewaschen und getrocknet.

Es werden 2,4 g graues Pulver erhalten.

H 1,1 #;' Asche 1,8 $. ^:

Beispiel 7

1,2 kg handelsübliche Rohrzuckermelaese werden gegen fliessendee WasBer ungefähr 48 Stunden mit Hilfe von Cellophanpapier dialysiert. Be werden etwa 5 Mter Innendialysat erhalten· Die Lösung wird unter vermindertem Druck ' auf ungefähr 600 ml konzentriert· Verunreinigungen werden duroh Zentrifugieren entfernt und es wird ein klarer, brauner Überstand erhalten, der mit ungefähr 500 g Ammoniumsulfat bis zur Sättigung versetzt wird. Die Lösung wird über Nacht stehengelassen. Die abgesetzten festen* Bestandteile werden durch filtration oder Zentrifugation gewonnen; Die Fällung wird zweimal mit gesättigter Ammoniumeulf at lösung

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gewaschen und dann wieder in etwa 1 Liter Wasser aufgenommen. Unlösliches Material wird durch Filtration entfernt. Das sich ergebende klare Filtrat wird gegen fließendes Wasser mit Hilfe von Cellophanpapier dialysiert, tun Salze au entfernen. Das Innendialyeat wird auf 800 ml konzentriert und mit 50 Eil Eisessig vorsetzt, lter erhaltene Niederschlag wird durch Filtration entfernt. Dann wird das Piltrat durch eine etwa 200 ml Duolite S-30 Harzaustauseher enthaltende Säule filtriert, die mit 1N Essigsäure vorbehandelt war, . Der entfärbte Durchfluß wird im Vakuum auf etwa 30 ml eingeengt und mit 120 ml Methanol vermischt· Der gebildete niederschlag wird durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 550 mg graues Pulver»

Dae graue.Pulver hatte keine reduzierenden Eigenschaften wie ein Zucker, da ein iest mit Fehling's Reagenz negativ verlief« Das Produkt enthält Spuren von Stickstoff und Asche. N 0,6 £; Asche 1, 3 $.

Beispiel 8

6 kg Melasse werden gegen fließendes Wasser mit Hilfe von Cellophanpapier dialysiert. Das Innendialysat wird im Vakuum eingeengt, bis man ungefähr 1 Liter dunkelbraune Lösung er- hält. Sine kleine Menge von Verunreinigungen wird filtriert und dann wird die Lösung mit 1,5 kg AmmOhiumsulfat gesättigt.

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T,ach dem Stehenlassen der Lösung über Macht wird der Niederschlag durch Zentrifugetion gesammelt. Der Niederschlag wird zvreimal mit gesättigter Aramoniurasulfatlösung gewaschen. Der erhaltene dunkelbraune Niederechlag wird in ungefähr 200 ml Wasser aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wird in einen Cellophanpapierbeutel eingefüllt und gegen fließendes Wasser 72 Stunden dialysiert. Ite werden etwa 3 Liter nicht dialyeier-"bare Lösung erhalten« Dies« Lösung wird einmal filtriert. Das * klare liltrat wird dann mit 200 ml Eisessig versetzt und die Mischung wird wiederum filtriert. Es hatte sich eine β ehr geringe Menge festes Protein gebildet. Dann wird das Filtrat durch eine Säule von 800 ml Entfärbungsharz Duolite A-7»welonea mit 1N Essigsäure vorbehandelt worden war, geschickt. Der Durchfluß wird bei niedriger Temperatur auf ungefähr 500 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird mit 12 g neutralern Bleiacötat versetzt; wobei sich ein brauner Niederschlag bildet. Diesel? Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wird mit 10biger Natriumcarbonatlösung etwa auf pH 8,0 eingestellt. Das Bleicarbonat wird ausgefällt und abfiltriert. Die Lösung wird, durch Säulen von 25 ml Kimstharalonenaustauscher AmberIite IR-120 und dann durch 50 ml Amberlite IRA-4IO Kunstharzaustauscher geschickt· Der pH-Wer^ des

Durchfluß _ _ . _ _Λ

leioht gelb-braunen beträgt ungefähr 7.5er Durchfluß

wird im Vakuum auf 100 ml konzentriert, dann mit 400 ml Äthanol unter Rühren versetzt. Die Fällung wird abgefiltert und ge-

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trocknet. Ausbeute 0,9 g grauee Pulver.

Dei· tfaehv/eis von Bleiionen in dam Produkt ist negativ. Das 'Produkt enthält Spuren von Stickstoff und A&ohe. Ein Monooaccharid kann nicht nachgewiesen werden. N 0,5 $Ί Asche 0,1 ^.

■·--··■■■ ■

Beispiel 9

10 kg Bagaoaen aus Zuckerrohr (Saccharum officinalum Le) werden mit 80 Liter kochendem Wasßer 6 Stunden unter Rühren extrahiert« Die extrahierte Lösung wird abfiltriert und im Vakuum auf ungefähr 5 Liter konzentriert. Das Koneentrat wird 2 Sage mit Hilfe von Cellöphanpapier dialysiert und die nicht dialysierbare Lösung v/ird auf 1,3 Liter konzentriert· Dao Konzentrat wird mit Aiamoniumoulfat gesättigt. Nach dem Stehenlassen über Nacht wird die Lösung aentrifugiert»; Der erhaltene dunkelbraune Niederschlag wird in 1 Liter Wasser aufgenommen und . unlösliches Material wird durch Filtration entfernt. Das klare Piltrat wird wieder mit Anmoniitm? eulfat gesättigtο Diese Aussalzüng wird noch mehrmals Wiederholt· Die erhaltene Fällung wird mit gesättigter Ammoniumeulfatlüeung gut gewaschen und wieder in 1 Liter Wasser aufgenommen. Die Lösung wird durch eine Säule eines sauren und eines basischen Kunetharzionenaustausohere geschickt, ;Qa an-

organische Salee zu entfernen..Der Durchfluß wird mit 65 al

iJieeseig

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veiBetzt und yon ausgefällten Stoffen alafiltriort, 3)as trat wird durch eine Säule eines Duolite S-30 Ehtfärbungßharsses und anschließend durch eine öäule einoö Dowex-3 Ionenaustauschers geschickt, durch welchen die Essigsäure gebunden wurde. Der pH-Wert dea Durchflüssen iat ungefähr>neutral.Der Durch« y/ird im Vakuum auf 300 ml konsentriert und mit 1,2 Liter Kethanol versetzt* Der Hiederschlag wird filtriert und mit 80 $igem Methanol und dann mit alaBOlutem Methanol gewaschen ' und getrocknet. Kan erhält 0,43 ggraueo Pulver. H 0,35 ^cfa Asche 0,

Pat entansgrüche

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Claims (3)

■ i - Patentansprüche?

1. Verfahren zur Herstellung eines antikarzinogenen Poly-; saccharide aus Pflanzen der Gattung Gramineae, d a d u r c h g e k e η η ζ e 1 ebnet, daß man fein zerkleinerte Blätter und Stengel der Pflanzen mit Wasser extrahiert, den Ei-. trakt einengt und dfte erhaltene-Konzentrat in- beliebiger Beihenfolge durch-Bialyee, Aussalzen, Behandlung mit stark sau-

■ i

ren Kunstharz-Ionenaustauschern, ßtarfc basiochen Ionenaustauschern, Bntfärbungsharz'und Bleiaoetat reinigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1,-dadurch gekenn zel c hn e t, daß als Pflanzen der Gattung Gramineae Bambusrohr, und Bambus^ras verwendet wird. ..

3. Verfahren nach Anspruch 1'_y dadurch gekennzeichnet, daß als Auögangßmaterial Melassen imd gassen aus Zuckerrohr verv/endet wird.

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