DE2947646C2

DE2947646C2 - Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2947646C2
Application number: DE2947646A
Authority: DE
Inventors: Takashi Chofu Tokio/Tokyo Hashimoto; Yasuhiko Yokohama Kanagawa Kojima; Seishi Konno; Yoshimoto Tokio/Tokyo Sano; Sadao Tamamura
Original assignee: KITASATO KENKYUSHO TOKIO/TOKYO JP
Current assignee: KITASATO KENKYUSHO TOKIO/TOKYO JP
Priority date: 1978-11-28
Filing date: 1979-11-27
Publication date: 1984-12-20
Also published as: DE2947646A1; GB2036751A; FR2442633A1; GB2036751B; FR2442633B1; US4419349A

Description

Biologische Merkmale
1. Interferon induzierende Aktivität

Proben der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz wurden verwendet, um Interferon in den Zellen und dem Serum von Testtieren zu induzieren. Die Aktivität des entstandenen Interferon wurde durch die im Versuch 1 beschriebene Methode bestimmt. Die Ergebnisse dieser Bestimmung gibt Tabelle 1 wieder, welche zeigt, daß die Interferon induzierende Aktivität positiv ist.

Tabelle 1

Konzentration der Probe (ng/ml) Aktivität (in vitro) Tabelle 2	10 1,0 >IOO >IOÜ	0.1 94	0,01	Dlulcntiiuhmc in (h) nach Verabreichung 0 I 2	240 64	4	b
	<10 90 <10 25		30 14	Π IO
Aktivität (in vivo) Kaninchen 1 Kaninchen 2

Tabelle 2 zeigt die nach der Methode, welche nachstehend im Versuch 1 beschrieben werden soll, bei zwei Kaninchen erhaltenen Ergebnisse, aus denen sich ergibt, daß die Aktivität ihren Maximalwert zwei Stunden nach Verabreichung erreicht. Durch die im Versuch I beschriebene Methode wurde auch bestätigt, daß Interferon im Κύίpci dei TcMiicrcs iiuicii die Wirkung der cnindungsgemiiücn. itiierferon induzierenden Substanz: induziert wurde.

2. Stabilität der Interferon induzierenden Aktivität

Proben von jeweils I mg der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz wurden in Wasser (jeweils 1 ml) gelöst und bei 100⁰C für eine gegebene Zeitspanne oder bei einer gegebenen Temperatur für 1 h erhitzt. Jede Probe wurde dann in gleicher Weise, wie im Versuch I beschrieben (In-vilro-Methodc), behandelt, wobei die in den Tabelle 3 und 4 wiedergegebenen Ergebnisse erreicht wurden, welche /eigen, daß die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz gegenüber Hitzeeinwirkung sehr stabil ist.

TaL -He 3

Heiztemperatur C C)	Aktivila! bei einer Konzernr;ilion der Probe (ug/ml) von	1.0	0.1 0.01	1.0	0.1 0.01
	IO	ll-'-Aktivitäi		>100	96 <10
		> 100	88 <IO	>100	92 <10
Unbchandelt	> 100	> !00	88 < 10	>IOO	98 <10
37	> !00	> 100	80 < 10	>IOO	95 <IO
60	>100	> 100	88 <IO	> 100	70 <IO
80	>100	> 100	85 <IO
100	>100
Erwärmungszeit: 1 h.
Tabelle 4		Aktivität bei einer Konzentration der Probe (μμ/ml) von
flrwarmiings/cit (h)	10
	>I00
Unbehandclt	>100
1	>100
4	>100
8	>100
24

Heiztemperatur: 100°C

3. Akute Giftigkeit

Männliche und weibliche Mäuse (ddy Stamm; 5 Wochen alt; Gewicht 20± 1 g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet Eine physiologische Lösung von Natriumchlorid, welche die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz enthielt, wurde den Mäusen verabreicht (ip. oder oral), um die LD₅₀-Werte von 560 mg/kg (ip.) und über 5 g/kg (oral) zu ermitteln. Es ergab sich kein bemerkenswerter Unterschied zwischen den männlichen und weiblichen Mäusen.

4. Ar.titumor-Aksivität

Mäuse(ddy-Stamm:5 Wochen alt; Gewicht 20 ± 1 g; jede Gruppe bestehend aus Mäusen) wurden alsTestliere verwendet. In der Achselhöhle eines jeden Testlieres wurde eine Probe von S-180 Sarcoma solid tumor (2x2x2 mm) oder Ehrlich ascites tumor (2,5 χ 10* Zellen) geimpft. Nach 24 Stunden wurde die erfindungsgemä-

ßc Interferon induzierende Substanz (0,2 mg) in Wasser gelöst jeder Maus verabreicht. Die Verabreichung erfolgte einmal täglich und wurde 14 Tage lang durchgeführt. Ein bemerkenswerter Antitumor-Effekt wurde beobachtet.

Bei der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz handelt es sich um eine Substanz, welche als Hauptbestandteil Aminosäuren, Zucker und Phosphorsäure enthält und ein Molekulargewicht von etwa 100 000 bis etwa 3 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa 1 000 000) aufweist, wobei angenommen wird, daß es sich um einen Komplex aus Protein und Zucker handelt, welcher Phosphorsäure enthält. Diese Substanz, welche mit 0,08% Trypsin bei 37"C für 2 h inaktiviert wird, entspricht auch der weitgehend anerkannten Definition irgendeiner Interferon induzierenden Substanz, da sie Interferon in tierischen Zellen oder Serum in vivo oder in vitro induziert, wobei außerdem die Aktivität der induzierten Substanz in bezug auf tierische Spezies spezifisch ist, jedoch in bezug auf Virus-Spezies unspezifisch ist. Daraus ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Substanz nicht nur eine neuartige Interferon induzierende Substanz ist, sondern daß es sich auch um eine neue Substanz an sich handelt, da keine Substanz mit den gleichen physikalisch-chemischen und biologischen Merkmalen wie die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz bisher in der einschlägigen Literatur beschrieben worden ist.

Die aus der Tokiwurzel (Angellica acutiloba Kitagawa) isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz hat auch ein hohes Molekulargewicht (mehr als 100 000) und ihre Interferon induzierende Aktivität wird nicht inaktiviert, wenn sie auf l00"C für 1 h erhitzt wird. Ihre chemischen Bestandteile (Hexose: 48%, Uronsäure: 40%, Protein: 5%) und das Infrarot-Absorptionsspektrum unterscheiden sich jedoch von den entsprechenden werten der erfindungsgeniäüen Interferon induzierenden Substanz. Die aus der Maulbccrbaum-Wurzelrinde isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz enthält als hauptbestandteile eine 1 — 3 gebundene Glukose (Hexose: 96%) und hat ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 (hauptsächlich mehr als 60 000). Außerdem j^! findet sich die mitogene Aktivität, welche in den bekannten Interferon induzierenden Substanzen gefunden wird, | welche von bakteriellem Endotoxin und höheren Pflanzen einschließlich der Toki-Pflanzc und Maulbeerbäumen | herstammt, in der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz nicht. 25 |

Verschiedene Pflanzen, welche zum Genus Perilla gehören und als Ausgangsstoff für die Gewinnung verwen- £

del werden können, enthalten beispielsweise Perillaaldehyd, Λ-Finen, I-Limonen, Perillaketon, Naginataketon, J

Shisonin, p-Cumarsäureester, Dihydroperillaalkohol, I-Menthol und dergleichen, wobei es sich in der Gesamtheit (,

aber um niedermolekulare Substanzen mit andersartigen physikalisch-chemischen Merkmalen und ohne Interfe- %

ron induzierende Aktivität handelt. 30 ö

Die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz ist von potentiellem Interesse als Medikament zur /- Verninderung und zur Behandlung verschiedener Krankheiten, welche durch Viren verursacht werden, wie g

beispielsweise tierische tumorartige Viren, da ihre Interferon induzierende Aktivität im Vergleich mit bekann- ■?

ten, aus Pflanzen isolierten Interferon induzierenden Substanzen ausgezeichnet ist und da sie gegen tierische Ά

Tumor-Viren aktiv ist. Außerdem ist ihre Giftigkeit sehr gering, wenn sie oral an Menschen und Tiere verab- 35 j| reicht wird. " Sj

In verfahrensmäßiger Hinsicht wird so vorgegangen, daß die aktive Substanz aus einer Pflanze des Genus |j Peräüa der FarnS'ie Labiatae (in Japan als Genus Shäsö der Famiiäe Shiso bekanni) öder einer Variante derselben ρ

mit Wasser extrahiert wird und der Überstand fraktioniert wird.

Als Pflanzen für die Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz eignen sich besonders Einjahrespflanzcn, welche in verschiedenen Ländern der Welt unabhängig und im Überfluß wachsen und welche verschiedene Varianten wie Mutanten und Hybriden auf natürliche oder künstliche Weise bilden können. Es wurde festgestellt, daß viele Pflanzen, welche zum Genus Perilla der Familie Labiatae gehören und in zahlreichen Ländern wachsen sowie deren Varianten verwendet werden können. Die zum Genus Perilla gehörenden, nachstehend angegebenen Pflanzen sind lediglich als bevorzugte Beispiele anzusehen, wobei die mit einem * versehenen Bezeichnungen der japanischen Nomenklatur entstammen:

Lemon-egoma* (P. citriodora Nakai); Egoma* (P. frutescens Britton); Chirimen-jiso* (P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. crispa Makino): Katamen-jiso* (P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. discolor Makino); Shiso* (P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. purpurea Makino); Aojiso* (P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. viridis Makino); Chirimen-aojiso* (P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. viridiscrispa Makino); Toranoo-jiso* (P. frutescens Britton var. hirtclla Makino vt Nemoto).

Die vorgenannten botanischen Namen sind folgenden druekschriftlichen Veröffentlichungen entnommen: »Genshoku Shokobutsu Dai Zukan«, Vol. I, Hokuryukan,Tokio (1955); »Yakuyo Shokubutsu Dai Jiten«, Hirokawa Shoten, Tokio (1974); »Saishin Wakan Yakuyo Shokubutsu«, Hirokawa Shoten. Tokio (1978).

Bekanntlich besitzen die vorstehend genannten Pflanzen im allgemeinen eine geringe Giftigkeit und beispielsweise Shiso, Aojiso, Chirimen-jiso, Lemon-egoma und dergleichen werden in Japan, China und anderen Ländern gezogen, da ihre Blätter und Samen lange Jahre hindurch beispielsweise als Nahrungsmittel, sinojapanische traditionelle Droge und als Rohstoff für die Herstellung von Parfüm und der gleichen verwendet wurden, bo Infolgedessen steht ohne besondere Schwierigkeiten eine große Menge an Ausgangsmaterial zur Verfugung.

Vorzugsweise werden als Ausgangsmaterial die Blätter und Stengel der Pflanzen verwendet, da die Saat die Substanz nur in geringer Menge enthält und zusätzliche Behandlungsvorgänge erforderlich machen würde, um von der Pflanzenwurzel Erde und dergleichen zu entfernen. Die Blätter enthalten im wesentlichen die gleiche Menge an aktiver Substanz wie die Stengel, und die Mengen an aktiven Fraktionen, welche in verschiedenen Pfianzengeweben enthalten sind, sind im wesentlichen vor und nach der Blütezeit unverändert. Zwecks besserer Konservierung und Extrahierung wird vorzugsweise getrocknetes Material verwendet, wenn es auch möglich ist, frisches Material zu verwenden. Zum Trocknen kann jedes gewünschte Verfahren, wie beispielsweise

Naturtrocknung und Trocknung mit Heißluft, angewendet werden. Erforderlichenfalls ist das Material vor der Verwendung mit Wasser zu waschen.

Die Extraktion mit Wasser kann bei irgendeiner passenden Temperatur, beispielsweise zwischen Raumtemperatur und Siedepunkt der Extraktionsmischung erfolgen. Dh die aktive Substanz besonders in Wasser unter

5 alkalischen Bedingungen (z.B. pH 7—10) löslich ist, ist es vorzuziehen, den pH-Wert des Wassers vor der Verwendung beispielsweise mit einer geeigneten Pufferlösung, Natriumhydroxid. Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydrox!'!, einzustellen. Die Extraktion kann wiihrend einer beliebigen Zeitspanne, gewöhnlich I bis 5 Tage bei Raumtemperatur, erfolgen, wobei diese Zeitspanne abgekürzt werden kann, wenn die Temperatur der Extraktion erhöht wird. So kann beispielsweise die Extraktion wiihrend einer Zeilspanne von 30 min bis 6 h bei

10 45—80°C unter Umrühren erfolgen. In allen Fällen kann mun den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthaltenen aktiven Substanzen extrahieren (in einigen Fällen mehr als 90%). Allerdings sollte die· Anwendung von übermäßig hohen Temperaturen vermieden werden, da hierdurch die Menge nn unerwünschten Verunreinigungen, wie Pigmenten und niedermolekularen Substanzen, die im Extrakt auftreten, erhöht werden kann. Man kann dem extrahierenden Wasser auch einen geeigneten antiseptischen Wirkstoff zusetzen. Die Extraktion kann

is kontinuierlich oder intermittierend erfolgen, und es kann jedes zweckmäßig erscheinende Verhältnis zwischen dem extrahierenden Wasser und dem Rohmaterial angewendet werden.

Aus der extrahierenden Lösung wird in üblicher Weise der Pflanzenrest entfernt, beispielsweise durch Filtrierung. Pressen oder Zentrifueieren. Anschließend werden i.innrwünschtc Verunrcini^ungeri. wie Pigmente und niedermolekulare Substanzen, von dem entstehenden Überstand entfernt, um die Gewinnung der aktiven

20 Fraktion zu ermöglichen. Für diesen Zweck geeignete bevorzugte Verfahren werden nachstehend angegeben.

A) Die überstehende Flüssigkeit wird durch Ultrafiltrierung fraktioniert, beispielsweise mittels einer gccigncten Membrane, um Substanzen zurückzuhalten, welche ein Molekulargewicht von mehr als 100 000 bcsitzen, da die erfindungsgemäße aktive Substanz, welche in den Fraktionen vorhanden ist, ein Molekulargc-

« wicht von etwa 100 000 bis etwa 3 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa I 0IX)OOO) besitzt. Die

Ultrafiltrierung kann unter geeignetem Druck von beispielsweise 0,1 bis 5 kg/cm' mittels einer Membran durchgeführt werden, welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 oder 200 000 zurückhalten kann. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen und zusammengefaßt und dann gefriergetrocknet, wobei man ein braunes Pulver enthält.

30 B) Der Überstand wird gegebenenfalls unter vermindertem Druck konzentriert und mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Methanol, Äthanol. Propanol. n-Butanol oder Aceton, bei einer zweckmäßig erscheinenden Konzentration von beispielsweise 40 bis 70 w/v % behandelt, wobei Präzipitatc entstehen, welche die aktive Substanz enthalten. Diese Precipitate werden dann gefriergetrocknet und man erhält ein braunes Pulver.

35 C) Anstelle des organischen Lösungsmitteis kann man dem Überstand auch ein Ammoniumsalz, wie bcispicls- I

weise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Cctylmethylammoniumbromid oder ein anorganisches I

Metallsalz, wie beispielsweise Zinkchlorid oder Kupferchlorid, bei einer zweckmäßigen Konzentration von I

beispielsweise 20 bis 50 w/v % zusetzen, wobei Präzipitate entstehen, welche dann entsalzt und gefriergetrocknet werden. Man erhält ein braunes Pulver.

Dabei ist die Meng* an Verunreinigungen, welche im Rohpulver enthalten sind, bei Durchführung der Methode A) am geringsten, welche auch einfach durchgeführt werden kann. Außerdem hat sich bestätigt, daß jegliche bemerkenswerte Nebenwirkung vermieden werden kann, selbst wenn eine große Menge des nach der Methode A) erhaltenen Rohpulvers oral an Menschen und Tiere verabreicht wird, so daß dieses Rohpulver für 45 orale Verabreichung ohne weitere Reinigung verwendet werden kann.

Das in der beschriebenen Weise gewonnene Rohpulver kann noch weiter gereinigt werden, und zwar bcip spielsweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung handelsüblicher Wirkstoffe für die Celfiltrierung

i| oder eines loncntauschers. Im erstgenannten Fall kann die Elution mit Wasser durchgeführt werden, wenn es

|ä{ auch möglich ist, eine geeignete Pufferlösung zu verwenden. Im letztgenannten Fall kann die Elution mit einer

j| so geeigneten Pufferlösung durchgeführt werden. Für die lonentauscher-Behandlung werden vorzugsweise han-P?j delsübliche Ionentauscher in der Na*- oder Cl--Form eingesetzt. Für die Reinigung kann man auch eine

>3 geeignete Anionen- oder Kationenaustauschzellulose verwenden. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann

β bestimmte Verunreinigungen enthalten, obwohl seine Interferon induzierende Aktivität für praktische Zwecke

M ausreicht. Die Mengen an Verunreinigungen lassen sich aber durch Kombination der vorgenannten Bchandlun-

g 55 gen weiter herabsetzen.

'ρ Eine nach der erfindungsgemäßen Verwendung hergestellte pharmazeutische Komposition enthält im we-

,S sentlichen als aktive Bestandteil die erfindungsgemäße Substanz zusammen mit einem pharmazeutischen Träger

|| oder Exzipienten. Die Zusammensetzung oder Mischung kann in geeigneter Form für orale, rektale oder

||: parenteral Verabreichung dargeboten werden. So kann beispielsweise die Zusammensetzung oder Mischung

Ii 60 für orale Verabreichung fest oder flüssig sein und die Form von Körnern, Tabletten, überzogenen Tabletten, |ί Kapseln, Sirup, Emulsionen, Suspensionen oder Tropfen haben und Träger oder Exzipienten aufweisen, wie sie

C; allgemein in der pharmazeutischen Technik verwendet werden. So können beispielsweise geeignete Tablellicr-

|i Exzipienten aus Laktose, Kartoffel- und löslichen Stärken und Magnesiumstearat bestehen. Für die parenteral

_fi§ Verabreichung kann der Träger aus einer stenlen, parenteral verträglichen Flüssigkeit, wie beispielsweise

1 b5 sterilem Wasser, oder einem parenteral verträglichen öl. wie beispielsweise Arachis-Ol. in Ampullen bestehen. |ξ Für die Rektal-Verabreichung eignen sich Zäpfchen, wobei der Träger aus einem dafür geeigneten Grundstoff

(|| besteht

§ Zweckmäßigerweise wird die Zusammensetzung oder Mischung in Einsatzmengen formuliert, von denen jede

cine ftststehcnde Dosis des aktiven Bestandteils liefern kann. Tabletten, beschichtete Tabletten, Kapseln, Suppositorien und Ampullen sind Beispiele geeigneter Form von Einsatzmengen.

Die Fig. ! und 2 zeigen das Ultraviolett-Absorptionsspektrum bzw. das durch die KBr-Methode bestimmte Infrarot-Abiorptionsspektrum der erfindungsgemäßen Substanz.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand einiger Ausführungsbcispielc weiter beschrieben.

Beispiel 1

Zunächst wurden getrocknete Blätter von Perilla frutesecns Briiton var. crispa Dec. f. purpurea Makino (in Japan alsShiso bekannt) in einer Menge von i kg mit Wasser gewaschen und in 20 I Wasser bei Raumtemperatur 3 Tage lang stehengelassen, um die Extraktion durchzuführen. Anschließend wurde das Ganze mit 6000 U/min 20 min lang zentrifugiert, um den Rückstand zu entfernen, welcher zweimal mit Wasser gewaschen wurde, wobei jeweils 5 I Wasser verwendet wurden.

Die Waschflüssigkeit wurde mit der überstehenden Flüssigkeit zusammengeschüttet. Der gesamte Feststoffgehalt der kombinierten Lösung betrug 92,892 g (Trockeivbasis). Die kombinierte Lösung wurde bei einem Druck von 3 kg/cm- durch Ultrafiltrieriing mittels eines handelsüblichen Ultrafilter fraktioniert, welcher Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 200 000 zurückhielt, wobei sich ein Rückstand ergab, der dann nach Gefriertrocknung zu 8,813 g eines braunen Pulvers führte. Zu Vergleichszwecken wurde die gleiche Behandlung mit einer Membrane durchgeführt, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als ■ 00 000 zurückzüiiaiicii, wobei sich 9,2iög an braunem Pulver ergaben. In der zweiten Stufe, der Reinigung, wurden 1,5 g des ersten Rohpulvers in 5 ml Wasser gelöst und in eine Säule (4,5 χ 70 cm) übergeleitet, welche mit einem handelsüblichen Wirkstoff für die Gelfiltrierung (Sephadex® G 200) gefüllt war. Die Elution wurde mit 600 ml Wasser durchgeführt und die ausfließende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von jeweils 3 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 27—50 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet, wobei ein weißliches Pulver (117 mg) entstand. In der dritten Stufe (weitere Reinigung) wurde dieses Pulver (100 mg) in einer O₁IM tris-HCl-Pufferlösung (5 ml; pH 7,0; 1-0,01) gelöst und in eine Säule (2.5 χ 70 cm) eingeleitet, welche mit einem handelsüblichen Ionentauscher (DEAF-Sephadex· A-50) gefüllt war. Eine 0.1M tris-HCl-Pufferlösung (300 ml; pH 9,0; enthaltend 0.5M NaCl) wurde für die Elution verwendet. Die ausfließende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von jeweils 3 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 15 bis 25 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet, wobei man ein weißliches amorphes Pulver (58,9 mg) erhielt, welches geringere Mengen an Verunreinigungen aufwies und im wesentlichen die gleiche Interferon induzierende Aktivität besaß wie das zuerst erhaltene weißliche Pulver. Das Endprodukt hatte die oben beschriebenen physikalisch-chemischen Merkmale, sein hoher Reinheitsgrad wurde durch Ultrazentrifugieren und Elektrophorese bestätigt.

Zu Vergleichszwecken wurden die Interferon induzierenden Aktivitäten der in den einzelnen Stufen dieses Beispiels erhaltenen Substanz in gleicher Weise bestimmt, wie im nachstehend erläuterten Versuch 1 (In-vitro-Methode), wobei sich nachstehende Ergebnisse einstellen:

Tabelle 5

40

Probe nach

Aktivität	90	bei einer Konzentration der Probe von	0.1
fog/ml)	>100		<10
10	>100	1.0	<10
>100	<10	94
85	>100
>100
>100

Extraktion 90 <10 <10

Ultrafiltrieriing (Rohpulver) Gelfiltrierung (l.weißl. Pulver) ionentauscher-Behandlung (Endprodukt)

Beispiel 2

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 1 vorgegangen, wobei jedoch Perilla frutescens Britton (in Japan als Egoma bekannt) dadurch extrahiert wurde, daß man die Blätter bei Raumtemperatur 2 h lang in Wasser stehen ließ, dem Wasser 1 N-Natriumhydroxid zusetzte, um den pH-Wert auf 8,5 einzustellen, und dann bei 65°C weitere 2 h lang nochmals extrahierte. Die physikalisch-chemischen Merkmale des Endproduktes (54,5 mg) waren im wesentlichen die gleichen wie bei dem Endprodukt, welches im Beispiel 1 erhalten wurde.

Beispiele 3-8

Die Blätter Stengel und Saatkörner getrocknete Perilla frutescens Britton var. crispa Dec. f. viridis Makino, P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. discolor Makino, P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. crispa Makino, P. frutescens Britton var. crispa Dec. f. viridis-crispa Makino, P. frutescens Britton var. hirteila Makino und Nemoto und P. citriodora Nakai wurden unabhängig voneinander wie im Beispiel 1 vorbehandelt. Die in der zweiten Stufe der Beispiele 1 —8 erhaltenen Produkte wurden unabhängig voneinander in gleicher Weise wie nachstehend im Versuch 1 (In-vitro-Methode) behandelt, um ihre Interferon induzierende Aktivität zu bestimmen. Die bs Ergebnisse zeigt die nachstehende Tabelle 6. Die physikaiisch-chemischcn Merkmale der Endprodukte der Beispiele 3—8 waren im wesentlichen die gleichen wie die des Endprodukts nach dem Beispiel 1.

Tabelle

Nr. Pflanze

Gewebe

Aktivität bei einer Konzentration der Probe von

10

1.0

I. Shiso*) (Perilla frutescens Britton var. crispa Dec. f. purpurea Makino)

2. Egoma*)

(P. frutescens Brit)

3. Aejiso·)

(P. frutescens Brit. var. crispa Dec. f. viridis Makino)

4. Kaiamen-jiso*)

(P. frutescens Brit var. crispa Dec f. discolor Makino)

5. Chinmen-jiso*)

(P. frutescens Brit. var. crispa Dec. f. crispa Makino)

Chirimen-aojiso*)

(P. frutescens Brit. var.crispa Dec. f. viridis-crispa Makino)

7. Toranoo-jiso*)

(P. frutescens Brit. var. hirtella Makino et Nemoto)

Lemon-egoma*) (P. citriodora Nakai)

70

>100 >100

40

>100 >100

60

>IOO >10O

65

>I00 >100

50

>100 >100

70

>IOO >IOO

50

>IO0 >I00

50

>100 >IOO

>100 >100

>100 >100

>100 >100

>100 >100

>IOO >100

>100 >100

Legende:

Nr. - Beispiel A - Saal B - Stengel C - Blätter *) - japanische Nomenklatur

IO

90 92

90 85

95 90

90 84

90 80

85 80

70 70

70 65

Versuch

Bestimmung der IF-Induktion mit IF-induziertcr Substanz und IF-Bcstimmung (Bezugsquelle: Y. Kojima's Bericht in Kitasaio Arch. Mcd,43J5[l970])

a) IF-Induktion (in vitro)

Ein Kaninchen (Gewicht etwa I kg; Neuseeland Weiß: SPF) wurde durch Herzpunktur getötet. Milz. Knochenmark und Lymphknotenzellen wurden entnommen und zu einer Zellsuspension kombiniert, welche die vermischten Zellen (IO⁷ Zellen) enthielt. Die Masse wurde dann in Proben von jeweils I ml aufgeteilt. Vier Proben wurden unabhängig voneinander mit 10, 1.0, 0,1 und 0,1 μg/ml eines Produktes versetzt, welches in gleicher Weise wie im Beispiel I beschrieben hergestellt worden war. Die Proben wurden dann 24 h lang bei 25°C gezüchtet und anschließend zentrifugiert. Die entstehenden überstehenden Flüssigkeiten wurden jeweils als Probe verwendet, um die induzierte Interferon-Aktivität zu bestimmen.

b) IF-Induktion (in vivo)

Eiine wäßrige Lösung (2 ml) eines in gleicher Weise wie im Beispiel I beschriebenen Produktes (500 ng/ml) wurde in die Ohrvene eines Kaninchens (Gewicht etwa I kg; Neuseeland Weiß; SPF) injiziert. 1.2.4 und 6 h n;ich der Injektion wurde dem Testtier eine Blutprobe von jeweils 2 ml entnommen und ilus Serum einer jeden Probe wunde vom Blut isoliert und als Probe zur Bestimmung der Aktivität des induzierten Inicrfcron verwendet.

c) Bestimmung der IF-Aktivität

In beiden Methoden a) und b) wurde Vesicular-stomatilis-Virus als bedrohlicher Virus eingesetzt, um die Aktivität des induzierten Interferon auf nachstehende Weise zu bestimmen. Eine Einschicht-Kultur der belegten Zellen RK-13 von Kaninchen wurde in eine Fiachschale gefüllt; dieser wurde dann eine vorgegebene Menge der 5 Probe der durch die vorgenannten Methoden a) oder b) erhaltenen Lösung zugesetzt Die Kultur wurde bei 37'^JC über Nacht bebrütet Dann wurde die Kultur gewaschen und den verbleibenden Zellen Vesicular-stomatitis-Viren zugesetzt, woraufhin nochmals bei 37°C eine Bebrütung über Nacht durchgeführt wurde. Die Interferon-Aktivität wurde aufgrund des Reduktionsverhällnisses von Platten bestimmt Die Einheit der Interferon-Aktivität wird durch eine reziproke Zahl der höchsten Verdünnung der Probe ausgedrückt, welche zur Reduzie- 10 rung der Zahl von Platten auf 50% erforderlich ist

Versuch 2 Definition von Interferon 15

Die Antivirus-Faktoren a) und b) lieferten die im allgemeinen dem Interferon zugeschriebenen Eigensch^ren, wie Sensibilität auf Inaktivierung durch 0,08% Trypsin (nach 2stündiger Reaktion bei 37° C). Hemmung von Veiicular-stomatitis- und Vaccinia-Viren in RK-!3 Kaninchen-Zellkulturen und Fehlen von Antivirus-Aktivität in L-Zellen gegenüber Vesicular-stomatitis-Viren. 20

Versuch 3

Im Beispiel 1 wurde die Elektrophorese bei 4"C in herkömmlicher Weise durchgeführt, wobei eine im Handel erhältliche Einrichtung, eine Polyacrylamid-Gcl-Platlc (Dicke 3 mm) und ein 0,3M Borsäure-Puffer (pH 8.4) 25 verwendet wurden. Das entstehende Einzelbad zeigte, daß die Testprobe einen hohen Reinheitsgrad besaß.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Aus Pflanzengewebe isolierte Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgenden physikalisch-chemischen Merkmale aufweist:

1) Elementaranalyse: H:8.5-8.7%.C:48.8-49%.N:63-6.5%,P:1.0-l,l%.

2) Molekulargewicht: 100 000 bis 3 000 000.

ίο 3) Infrarot-Absorptionsspektrum (bestimmt durch KBr-Methode) mit sehr starken Banden bei

3100-3700. 2926. 2853, 1660-1630. 1070cm-' und starken Banden bei 1570-1515. 1418-1400, 1270-1230cm-'.

4) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:

Leicht löslich in wäßrigen Lösungen von Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid sowie Ammoniumhydroxid und im wesentlichen unlöslich in Methanol, Propanol. Butanol, Aceton, Chloroform und Diäthyläther.

5) Farbreaktion:

Positiv in Ninhydrinreaktion, Phenol/Schwefelsäure-Reaktion und Dittmer-Reaktion. Negativ in Kolin's Reagens und Elson-Morgan-Reaklion.

6) NatUä: sauer.

7) Chemische Hauptbestandteile:

a) Aminosäuren (relativer Gehalt)

Hydroxyprolin (3.2 ± 03%) Asparaginsäure (93 ± 03%)

Threonin (6.1 ±03) Serin(43±03%)

Glutaminsäure (7.6 ± 03%) Prolin (4.0 ± 03)

Glycin (10.0±03%) Alanin (103 ±03)

Valin (6.6 ± 03%) Isoleucin (5.4 ± 03%)

Leuzin(8.6±03%) Phenylalanin (2,0 ±03%)

L; sin (3.9 ±03%) Arginin (3.4 ±03%)

Tyrosin (Spuren) Histidin (1.3 ±03%)

Ammoniak (13,4 ±0,3%)

b) Zucker (relativer Gehalt)

Arabinose (47,09 ± 03%) Galaktose (25.66 ±03%)

Glukose (20.62 ± 03%) Mannose (4.64 ± 03%)

Xylose (1.99 ±03%)

8) Optisches Drehvermögen:

[rt]D«= -75° bis -82° (-79° im Durchsch.Mtl) (c= 0.47% in 0,1 N NaOH) 9) Wärmestabilität:

Stabil bei 100"C über mindestens 8 Stunden. 10) Antitumoraktivilät: Positiv bei Mäusen gegenüber Sarcoma solid Tumor und Ehrlich ascites Tumor,

und durch wäßriges Extrahieren des Gewebes einer Pflanze der Galturg Perilla und Fraktionieren des Überstandes erhältlich ist.

2. Verfahren zur Herstellung einer Substanz nach Anspruch I. dadurch gckcnnzc chnet, daß man die Pflanze aus der Gruppe

Perilla citriodora Nakai Perilla frutescens Britton

Perilla frutescens Britton var.crispa Dec.f.crispa Makino Perilla frutesccns Britton var. crispa Dec. f. discolor Makino

Perilla frutescens Britton var. crispa Dec. f. purpurea Makino Perilla frutescens Britton var. crispa Dec. f. viridis Makino Perilla frutescens Britton var.crispa Dec. f. viridiscrispa Makino Perilla frutescens Briuon var, hirtclla Makino et NcmoKi

auswählt.

3. Verfahren nach Anspruch 2. dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von 7 bis 10 extrahiert.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, ck'ß man durch Ultrafiltricren des Übcrh5 Standes über einen Ultrafilter fraktionier!, welcher Substanzen mil einem Molekulargewicht über 100 000 zurückhält.

5. Verwendung der Substanz nach Anspruch I als Inlcrfcroninduklor.

Die Erfindung betrifft eine aus Pflanzengewebc isolierte Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanz und eine Verwendung dieser Substanz.

Bei Interferon, welches nachstehend auch als IF oder virjshemmender Faktor bezeichnet wird, handelt es sich um eine Substanz, welche auf tierische Zellen einwirken kann, um das Wachstum eines Virus zu hemmen, und eine von der Zelle durch die Virusinfektion freigesetzte Proteinart ist. Die virozide Aktivität von IF ist bezüglich einer Tierspezies spezifisch, bezüglich einer Virusspezies jedoch unspezifisch und kann unter für ihre Induzierung unterschiedlichen Bedingungen sehwanken. Es ist auch bekannt, daß das Wachstum bestimmter tierischer luniorartiger Viren durch IF unter bestimmten Bedingungen stark gehemmt werden kann. Interferon induzierende Substanzen sind daher von Interesse für Vorbeugungsmaßnahmen und die Behandlung verschiedener menschlicher und tierischer Erkrankungen durch Virusinfektion.

Es ist bekannt, eine Interferon induzierende Substanz der eingangs genannten Art (JP-OS 32 107/78), von welcher angenommen wird, daß es sich um eine Art von heieropolymerem Saccharic! handelt, die als Hauptbestandteile Hexose (48%), Protein (5%) und Uronsäure (40%) enthält und ein Molekulargewicht von mehr als 100 000 besitzt, aus der Wurzel von Angellica acutiloba Kitagawa (in Japan als Toki bekannt) mit heißem Wasser zu extrahieren und das Extrakt einer Dialyse zu unterwerfen. Dem entstandenen Rückstand wird Aceton zugesetzt, wobei ein Präzipitat erhalten wird, welches dann gefriergetrocknet wird. Das Extrakt kann auch unter vermindertem Druck konzentriert oder durch Ultrafiltration mit einer semipermeablem Membran und anschließende Dialyse isoliert werden.

Eine andere bekannte, Interferon induzierende Substanz (JP-OS 99 313/78) soll ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 (in der Hauptsache mehr als 100 000) aufweisen und a'i Hauptbestandteil eine 1 —3 gebundene Glukose (Hexose: mehr als 90%) enthalten. Diese Interferon induzierende Substanz wird dadu'.-ri hergestellt, daß die Wurzelrinde eines Maulbeerbaumes, wie beispielsweise Morus alba Linne (in Japan ak Maguwa bekannt) oder Morus bombyeis Koizdumi (in japan als Yamaguwa bekannt), mit heißem Wasser extrahiert wird, der extrahierten Lösung ein organisches Lösungsmittel zugesetzt wird, um ein Präzipitat zu erhalten, und diesetn Präzipitat eine geringe Wassermenge zugesetzt wird, die Lösung der Dialyse zur Herstellung eines Rückstandes unterworfen wird und dieser Rückstand dann gefriergetrocknet wird Auch in diesem Fall kann die Lösung nach der Extraktion und/oder vor der Dialyse durch Konzentration unter vermindertem Druck oder durch Verwendung einer semipermeablen Membran in annehmbaren Mengen gewonnen werden. Diese beiden Interferon induzierenden Substanzen haben eine geringe Giftigkeit und können leicht hergestellt werden. Her billige und reichlich vorhandene Vorrat der Pflanzengewebe, aus denen die Interferon induzierenden Substanzen erhalten werden, könnte jedoch zufolge der fortgesetzten Verwendung dieser Pflanzcngewebe über viele Jahre hinweg als Quelle einer traditionellen sinojapanischen Droge zur Neige gehen.

Es ist zwar auch schon bekannt, wäßrige Extrakte von Pflanzen der Gattung Perilla unmittelbar als traditionelle sinojapanische Droge zu verwenden. Daß diese Extrakte eine Interferon induzierende Substanz enthalten, ist bisher aber nicht festgestellt worden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Interferon induzierende Substanz aus dem Gewebe anderer Pflanzen zu gewinnen.

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß eine Substanz, welche aus dem Gewebe verschiedener Pflanzen isoliert wurde, welche zum Genus Perilla der Familie Labiuiac (in Japan als Genus Shiso der Famiiic Shiso bekannt) und ihren Varianten gehören, bei geringer Giftigkeil ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität zeigt. Außerdem kann die aktive Substanz aus Pflanzengewcbc leicht und preiswert isoliert werden.

Die erfindungsgemäßc Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, welche in der Form von amorphem weißlichem Pulver stabil ist, ergibt sich aus dem Kennzeichen des Patentanspruchs 1.

Das Molekulargewicht wurde durch Ultrazcntrifugieren, Ultrafiltricren und Geliütrieren mit handelsüblichen Geräten und Produkten bestimmt. Der Schmelzpunkt ist unbestimmt; bei etwa 220⁰C tritt Verkohlung ein. Die Aminosäuren wurden durch Hydrolyse mit 6N IICI bei 110⁰C in einer Zeitspanne von 48 h in vacuo und durch nachfolgende Analyse bestimmt. Die Zucker wurden durch Hydrolyse mit 0,1 N Schwefelsäure bei 8O⁰C während einer Zeitspanne von 20 min bzw. mit 1N Schwefelsäure bei 100"C in einer Zeitspanne von 2 h und anschließende Analyse bestimmt.