DE2659808B2

DE2659808B2 - Proteingebundene Polysaccharide und deren Verwendung zur Bekämpfung von Tumoren

Info

Publication number: DE2659808B2
Application number: DE2659808A
Authority: DE
Inventors: Satoru Fujisawa Kanagawa Enomoto; Tetsuya Tokio Hotta; Minoru Itabashi Ohara; Saburo Tokio Ueno; Chikao Kunitachi Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1976-01-01
Filing date: 1976-12-30
Publication date: 1979-08-02
Also published as: PH14773A; DD129794A5; SE423997B; CA1084488A; BE850018A; DE2659808A1; RO69855A; SE7614725L; PH16682A; DE2659808C3; FR2337144A1; GB1565090A; US4289688A; JPS5283996A; AU2099476A; FR2337144B1; US4271151A; JPS5523271B2

Description

2. Verfahren nach Anspruch i dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) Substanzen mit niederem Molekulargewicht durch UltrafilUation entfernt werden.

3. Verwendung der gemäß Anspruch 1 hergestellten proteingebundenen Polysacchariden bei der intraperitonealen oder oralen Bekämpfung von Tumoren, insbesondere von Sarkom, Ehrlichkarzinom und Ascites hepotoma. ,

Zur Bekämpfung von Tumoren sind z. B. aus der DE-OS 20 43 971 auf Nukleinsäuren aufgebautem und ausgehend von Streptococcus haemolyticus erhaltene Substanzen mit Absorptionsbanden zwischen 1650cm-' und 1070 cm-' bekannt,deren Antitumoraktivität auf einer direkten Zerstörung der Tumorzellen beruht. Diese Substanzen sind jedoch nicht wärmestabil und ihre Wirkung beruht nicht auf einer aktivierenden Wirkung auf die Immunität des Patienten. Ferner sind aus der JP-PS 1647/1963 Verfahren zur Erzeugung einer Antitumorsubstanz durch Aufbrechen der Zellen von Streptococcus haemolyticus, Extrahieren der so zerstörten Zellen, Zugabe eines organischen Lösungsmittels zu dem Extrakt und Aufnahme der Niederschläge als soche bekannt; diese Produkte zeigen ebenfalls keine überlegene Antitumorwirkung.

Aus »Nature« Vol. 233 (Okt. 1971): 486-488 sind Polvsaccharide mit einer Antitumorwirkung bekannt.

nämlich Carboxymethylpachymarane, die von Pachymaran, nämlich einem 0-(l— 3)-linearen Glukan erhalten werden, indem man 0,95 Mol eines Carboxymethylrestes in eine Glukoseeinheit des Polysaccharides Pachymaran einbaut, um ein wasserlösliches Derivat zu erhalten; diese Antitumorsubstanzen sind jedoch nur bei intraperitonealer Verabfolgung wirksam und zeigen keine Antitumorwirkung bei oraler Verabreichung.
Aus der DE-OS 20 50 714 sind ferner Substanzen mit

ίο Antitumorwirkung bekannt, die aus verschiedenen Basidiomycetes Arten gewonnen werden. Diese als PS-K bezeichneten Substanzen haben Polysaccharidstruktur und besitzen zwar bei intraperitonealer Verabreichung eine Antitumorwirkung bzw. Wirksamkeit gegen Karzinome, zeigten sich aber bei oraler Verabreichung als nur sehr gering wirksam. Diese Substanzen sind daher fü;· wissenschaftliche I Intersuchungen von Bedeutung, haben aber kaum praktischen Nutzen.

Es ist auch bekannt, daß die durch Extrahieren von Coriolus Fungi mit einem wäßrigen Lösungsmittel erhaltenen Extrakte, überwiegend aus an Protein gebundenen Polysacchariden bestehen. Da tliese Extrakte aus nativen Basidiomyceten gewonnen werden und komplizierte Verbindungen aus verschiedenen Arten von an Proteine gebundenen Polysacchariden enthaiten, erfolgte jedoch noch keine genaue Aufklärung der Bestandteile dieser Extrakte mit Antitumorwirksamkeit. So offenbart die japanische Patentanmel-

jo dung 17149/1971 ein Verfahren zur Erzeugung eines Antitumor-Polysaccharides durch Extraktion von nativem Coriolus versicolor mit einem wäßrigen Lösungsmittel und Weiterbehandlung des Extraktes durch Dialyse oder Ultrafiltrierung. Da diese Substanz jedoch

j5 inerte Komponenten enthält, ist es erforderlich, erheblich große Mengen von etwa 500 mg/kg intraperiloneal zu verabfolgen, um eine Inhibierungsrate von mehr als 90% gegen Mäuse Sarkoma-180 zu erzielen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue proteingebundene Polysaccharide mit gesteigerter Antitumorwirkung vorzuschlagen, die insbesondere auch oral verabfolgt werden können. Sie beruht auf Untersuchungen von wäßrigen Extrakten aus den verschiedensten Basidiomycetes Arten von Coriolus

4¹) Fungi (Mycel und/oder Fruchtkörper), die nicht nur bei intraperitonealer, sondern auch bei oraler Verabreichung auf ihre Antitumorwirkung untersucht wurden. Zur Lösung der Aufgabe werden daher neue proteingebundene Polysaccharide aus Mycelen und/oder Fruchtet) körpern von Coriolus versicolor (FFR.) Quel. FERM-P Nr. 2412-2426 (Stamm Nr. CM 101 -115) vorgeschlagen, die erhältlich sind durch

(a) Extrahieren der Mycele und/oder Fruchtkörper mit Y) wäßrigen Lösungsmitteln und Einengung des erhaltenen Extraktes,

(b) Aussalzen des Konzentrates durch Zugabe von Ammoniumsulfat, Lösen der Fällung und Entsalzen durch Dialyse,

to (c) Zweistufiges fraktioniertes Fällen der aufgearbeiteten und konzentrierten Lösung mit Ammoniumsulfat, wobei bei der ersten Fraktionierung Ammoniumsulfat bis 25% des Sättigungswertes eingesetzt und der erhaltene Niederschlag verworfen wird und in der zweiten Fraktionierung Ammoniumsulfat bis 40% des Sättigungswertes in der von dem ersten Niederschlag befreiten Lösung eingesetzt und der zweite Niederschlag isoliert wird,

(d) Auflösen des nach (c) erhaltenen zweiten Niederschlages in Wasser und anschließendes Oialysieren der Lösung,

(e) Adsorption des Dialysates an einer Die'hviamiiioethyl-Zellulose-Säule, Waschen der adsorbierten Substanzen in der Säule mit Wasser und Eluieren der in der Adsorptions-Säule verbliebenen Substanzen mit Kochsalzlösung,

(f) nochmaliges Fraktionieren des nach (e) erhaltenen Eluats durch Versetzen mit Ammoniumsulfat bis der Sättigungswert der Reaktionslösung 40% ausmacht und Auflösen der erhaltenen Fällung in Wasser, Entsalzen durch Dialyse und Sprühtrocknen der konzentrierten Lösung.

Vorteilhafterweise werden in Stufe (b) Substanzen mit niederem Molekulargewicht durch Ultrafiltration entfernt.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß die ei findungsgemäße Substanz sehr viel höhere Inhibierungsraten von z. B. 98 bis 100% bei den verschiedensten Tumoren wie Ehrlichkarzinom, Ascites hepotoma und Mäuse Sarkoma-180 durch orale oder intraperitoneale Verabfolgung von äußerst geringen Dosen wie 10 mg/kg zeigen.

Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der neuartigen proteingebundenen Polysaccharide bei der intraperitonealen oder oralen Bekämpfung von Tumoren, insbesondere von Sarkom, Ehrlichkarzinom und Ascites hepotoma.

Die erfindungsgemäßen neuen Verbindungen sind Protein-gebundene Polysaccharide mit einem durch Ultrazentrifugation ermittelten Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 300 000 und charakteristischen Farbreaktionen für Saccharide in der «-Naphthol-Schwefelsäure-, Indol-Schwefelsäure-, Antron-Schwefelsäure-, Phenol-Schwefelsäure- und Tryptophan-Schwefelsäure-Reiktion sowie charakteristischen Farbreaktionen für Aminosäure in der Ninhydrin-Reaktion

10

15

20

25

JO

35 nach der Hydrolyse mit Chlorwasserstoffoaure und Peptidbindungen nach der Lowry-Folin-Methode, sowie Absorptionsbereichen der Polysaccharide im NMR-Spektrum bei 05 ± 0,1 ppm, 1,2 ± 0,1 ppm, 2,0 ± C.1 ppm, 4,5 ± 0,1 ppm, 4,7 ± 0,1 ppm und einer breiten Absorption bei 3.0 bis 4,4 ppm, einem Polysaccharid/Protein-Verhältnis von 55/45 bis 95/5, mit der Maßgabe, daß die Protonenstärke des Proteinanteils bei 0,5 bis 2,5 ppm und die des Polysaccharidanteils bei 2,5 bis 6,0 ppm ist der Polysaccharidanteil aus ^-Glucan besteht und keine auf a-Glucan zurückzuführende Absorption bei 4,9 bis 6,0 ppm zeigt und der Proteinanteil aus Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Cystein, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Tryptophan, Phenaialanin, Lysin, Histidin und Arginin aufgebaut ist.

Im folgenden soll die Erfindung näher erläutert werden; in den Zeichnungen zeigen

Fig. 1 das IR-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäßen an Protein gebundenen Polysaccharide;

Fig.2-1, 2-2, 2-3 und 2-4 das NMR-Spektrum der erfindungsgemäßen Verbindungen;

F i g. 3 das NMR-Spektrum von PS-K als Kontrolle.

In den erfindungsgemäßen Verbindungen ist Protein an einen Polysaccharidanteil gebunden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind geruchs- und geschmackslos, wasserlöslich und haben eine hellbraune oder braune Farbe. Sie weisen keinen definierten Schmelzpunkt auf, sondern verfärben sich allmählich schwarz und zersetzen sich bei einer Temperatur von mehr als 120⁰C.

Physikalische und chemische Eigenschaften
(1) Farbreaktionen

Farbreaktionstests wurden an wäßrigen Lösungen der erfindungsgemäßen Verbindungen durchgeführt. Es wurden die in der Tabelle 1 zusammengestellten Ergebnisse erhalten.

Tabelle 1

Farbreaktion

Farbe

Ergebnisse

a-Naphtol-Schwefelsäure-Reaktion (Molish-Reaktion) Indol-Schwefelsäure-Reaktion (Dische-Reaktion)
Anthron-Schwefelääure-Reaktion
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion
Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion
Lowry-Folin- Verfahren

Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit Chlorwasserstoffsäure (6n-HCl, 110'C, 20Std.)

Aus den Farbreaktionstests geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen Saccharide und e>o Protein enthalten.

(2) Löslichkeit

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in Wasser löslich und nahezu unlöslich in Methanol, Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan.

b5

purpurfarben	Saccharide
braun	Saccharide
grünlichblau	Saccharide
braun	Saccharide
pupurbraun	Saccharide
blau	Peptidbindungen,
	Tyrosin, Tryptophan
	Cystein
purpurblau	^-Aminosäuren

(3) Hygroskopizität

Zur Ermittlung der Hygroskopizität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden verschiedene Proben in einen Exsikkator gegeben, der, wie in Tabelle 2 gezeigt, mit gesättigten Salzlösungen jeweils auf einer bestimmten Luftfeuchtigkeit gehalten wurde. Der Feuchtigkeitsgehalt der einzelnen Proben wurde durch Feststellung der Gewichtsveränderung innerhalb einer bestimmten Zeit ermittelt. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

(Feuchtigkeitsaufnahme in Abhängigkeit von der Zeit bei der angegebenen relativen Luftfeuchtigkeit)

Bedingungen	Feuchtigkeitsgehalt, %	3	7	24	48	72	96	144
	Zeil, Std.	12,5	16,0	22,5	25,5	27,0	27,0	27,0
	1	9,5	11,7	15,0	15,5	16,0	16,6	17,0
98% RH 20 C	10,0	9,5	11,7	15,0	15,3	15,5	15,7	16,0
79% RH 25 C	9,0	8,5	9,0	10,0	12,5	12,5	12,5	12,5
52 % RH 20 C	9,0
32% RH 16,4 C	8,0

Verwendete gesättigte Lösung:

bei 32% RH, gesättigte Natriumchlorid-Kaliumnitrat-Lösung

bei 52% RH₁ gesättigte Natriumbichromatlösung
bei 79% RH. gesättigte Ammoniumchloridlösijng
bei 98% RH, gesättigte Bleinitratlösung

Die Tabelle 2 zeigt, daß alle Proben nur eine geringe Veränderung erlitten, und Anzeichen einer Verflüssigung, die durch Feuchtigkeitsabsorption verursacht werden könnten, nicht festgestellt wurden.

(4) pH-Wert

Der pH-Wert der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde dadurch festgestellt, daß man 1 g Proben in 100 ml Wasser löste. Man stellte fest, daß der pH-Wert im Bereich von 6,6 bis 7,2 lag, was bedeutet, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen im wesentlichen neutral sind.

(5) Optische Drehung

Die optische Drehung wurde an einer 0,25%igen wäßrigen Lösung der Proben ermittelt. Der [α] ,'-Wert lag im Bereich von 0 bis 30. Daraus läßt sich schließen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen hauptsächlich aus j9-Gh.can bestehen, dessen optische Drehung in der Nähe ven 0 liegt.

(6) IR-Absorptionsspektrum

Das IR-Absorptionsspektrum wurde in einer Kaliumbromidscheibe festgestellt und ist in F i g. 1 abgebildet. Die breite Absorptionsbande bei 3600 bis 3200 cm-¹ wird den a»-OH zugeschrieben, die in verschiedenem Grad an Wasserstoff gebunden sind. Dies läßt sich zum Beispiel daraus schließen, daß sich die breite Absorptionsbande verringert oder vergrößert, wenn die Hydroxygruppen im Polysaccharidanteil der Probe methoxyliert sind. Die Absorptionen bei 1600 cm-¹ und 1530 cm-' werden der Deformationsvibration von — NH2 bzw. — NHi zugeschrieben, und es ist anerkannt, daß dieses Phänomen vom Proteinanteil in der Probe herrührt Andererseits werden die breiten Absorptionsbanden bei 1200 bis 1000 cm-¹ der antisymmetrischen Dehnungsvibration der C—O—C-Bindung in den Pyranoseringen des Polysaccharidanteils zugeschrieben. Eine charakteristische Absorption, die von der ^-Bindung der Glucose im Polysaccharidanteil herrührt, wird auch bei 890 cm-' beobachtet eine charakteristische Absorption von der «-Bindung bei 840 cm-' wird jedoch kaum festgestellt

Struktureigenschaften
(1) Struktur des Polysaccharidanteils

Zur Ermittlung der strukturellen Eigenschaften des Polysaccharidanteils in den erfindungsgemäßen Verbindungen wurden 10 mg Proben mit 3%iger Chlorwasserstoffsäure in Methanol versetzt, um bei 100⁰C während 16 Stunden eine Methanolyse zu bewirken. Nach der Trimethylsilierung unter Anwendung einer herkömmlichen Methode wurde dann gaschromatographisch analysiert. Die erzielten Ergebnisse zeigen, daß die Glucose mehr als 99% der gesamten Saccharide ausmacht und andere Saccharidkomponenten, wie

j« Mannose, Galactose, Xylose und Fructose, nur sehr spärlich auftreten. Um die Art der Glucose (D oder L) zu ermitteln, wurden Glucosekristalle aus den Hydrolysaten der erfindungsgemäßen Verbindung abgetrennt. Man stellte fest, daß der Schmelzpunkt der abgetrennten Glucose bei 143 bis 145°C lag und beim Vermischen der Glucosekristalle mit Standard-D-Glucose keine Schmelzpunktdepression auftrat. Die den Polysaccharidanteil in den erfindungsgemäßen Verbindungen ausmachende Glucose wurde daher als D-Glucose identifiziert.

(2) Art der Bindung der den
Polysaccharidanteil ausmachenden Saccharide

Die Stellung der Glycosidbindung wurde in folgender Weise festgestellt Das Bindungsschema von G¹ — (G¹ -► bedeutet die Glucosestruktur),

⁴Gi

und

wurde durch Analyse der durch Perjodatoxydation oder die Smith-Zersetzungsmethode erhaltenen Monosaccharide bestätigt Die Konstitutionsverhältnisse wurden durch Methylierung nach Haworth ermittelt Die durch Hydrolyse der methylierten Verbindungen erhaltenen Saccharide wurden gaschromatographisch als Alditol-Acetat und Methylglucosid identifiziert Weiter wurden die einzelnen Hydrolysate durch Flüssigkeitssäulenchromatographie isoliert und dann kristallisiert oder zur Bestätigung in kristalline Derivate übergeführt Die Molverhältnisse der verschiedenen Bindungen in der erfindungsgemäßen Substanz sind in der Tabelle 3 durch Bezeichnung des Molverhältnisses der G' -»· -Bindung als 1 aufgeführt Die Molverhältnisse in der Tabelle 3 wurden aus den Bereichsverhältnissen auf dem Gaschromatogramm des Alditol-Acetats ermittelt

Tabelle 3

Hydrolysate der
methylierten Zucker

Bindung Molverhältnis

2,3,4,6-Tetra-O-methyl-G

2,3,6-Tri-O-methyl-G
2,3-Di-O-methyl-G

2,6-Di-O-methyl-G

2,4,6-Tri-O-methyl-G
2,4-Di-O-methyl-G

-'Gl-

3-12
0,5-3

0,1-2,5

2 oder weniger 2 oder weniger

Aus der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß der Polysaccharidanteil der erfindungsgemäßen Substanz überwiegend aus ß-1,4-Bindungen aufgebaut ist, daß ahpr auch <?-!,3-Bindungen sowie viele Verzweigungen im Polysaccharidanteil vorliegen. Man kann daraus entnehmen, daß der Polysaccharidanteil in der erfindungsgemäßen Substanz eine Struktur hat, bei der Seitenketten an die Haupiketten der Zellulose gebunden sind und gestreut ß-\,3-Bindungen auftreten.

(3) Charakteristische Eigenschaften
des Proteinanteils

Der Proteinanteil der erfindungsgemäßen Substanz wurde in herkömmlicher Weise hydrolysiert, und die Aminosäuren des Hydrolysats wurden unter Verwendung einer Aminosäuren-Analysiervorrichtung ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4

(Aminosäuren des Proteinanteils)

Art der Aminosäure	Gew.-%
Asparaginsäure	13-19
Threonin	6-10
Serin	6-11
Glutaminsäure	12-18
Prolin	Spur- 8
Glycin	6- 9
Alanin	6-13
Cystein	Spur
Valin	5-11
Methionin	1- 4
Isoleucin	3- 5
Leucin	6- 8
Tyrosin	Spur- 3
Phenylalanin	3- 6
Tryptophan	Spur- 2
Lysin	2- 4
Histidin	Spur- 2
Arginin	2-4
Ammonialc	2- 6

Substanz ist auch, daß Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin und Leucin zusammen mehr als 70% aller im Proteinanteil gefundenen Aminosäuren ausmachen.
5 Obgleich die Aminosäureanalyse auch die Gegenwart von Glucosamin bestätigte, beträgt dessen Menge weniger als 1 Gew.-% der gesamten Proteinmenge.

Hinsichtlich der Bindung der Aminosäuren an den Polysaccharidanteil nimmt man an, daß die Aminosäu-

K) ren fest in Form des Oligopeptids oder Peptids an den Polysaccharidanteil gebunden sind. Diese Annahme ergibt sich aus den Ergebnissen verschiedener, weiter unten aufgeführter Tests.
Zunächst zeigt die Untersuchung mit der Sevag-Methode, die oft zur Entfernung von mit einer Probe vermischtem Protein angewandt wird, daß Proben der erfindungsgemäßen Substanz keine Fällung ergeben. Diese Methode besteht darin, daß man 7s Volumen Chloroform und V25 Volumen n-Butanol zu der wäßrigen Lösung einer Probe gibt, wobei der pH-Wert der Lösung vorteilhaft auf 4 bis 5 eingesteili wird, dann sorgfältig schüttelt und dann genau untersucht, ob sich eine gelähnliche Fällung gebildet hat oder nicht. Wenn der Polysaccharidanteil und das Protein in der Probe nur in Form einer Mischung vorliegen, wird das Protein denaturiert und geliert und bildet zwischen der Wasserschicht und der Chloroformschicht eine Fällung, während eine solche Fällung nicht entsteht, wenn das Polysaccharid und das Protein in gebundener Form ζ 30 vorliegen.

Ein anderer Fällungstest, der ähnlich unter Verwendung von Trifluortrichloräthan durchgeführt wird, führte bei Verwendung von Proben der erfindungsgemäßen Substanz ebenfalls nicht zur Bildung einer Fällung.

Proben der erfindungsgemäßen Substanz zeigten auch keine Veränderung des Proteingehalts an, wenn man Protease, ein proteolytisches Enzym, auf die Proben einwirken ließ.

Aufgrund der Ergebnisse verschiedener Testarten, wie der oben genannten, nimmt man an, daß in der erfindungsgemäßen Substanz das Polysaccharid und das Protein nicht nur als Gemisch, sondern in gegenseitiger chemisch gebundener Form vorliegen.

Was die Bindung des Polysaccharidanteils und des Proteinanteils in der erfindungsgemäßen Substanz anbelangt, so sind folgende Zucker-Protein-Bindungen allgemein bekannt: Bindungen vom N-Acylglycosilamin-Typ, vom O-Glycosid-Typ und vom Glycosidester-Typ. Da aber in der erfindungsgemäßen Substanz die Bindungen mit schwachem Alkali sich nur schwer aufspalten lassen und die Aminosäureanalyse nach der Hydrolyse der erfindungsgemäaßen Substanz die Gegenwart von Glucosamin anzeigte, nimmt man an, daß die Bindungen vom N-Acylglycosilamin-Typ über-

Aus der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß der Protetnanteil der erfindungsgemäßen Substanz IS Aminosäurearten enthält, in denen die sauren Aminosäuren und die neutralen Aminosäuren überwiegen und die basischen Aminosäuren nur in sehr geringer Menge auftreten. Charakteristisch für die erfindungsgemäße wiegen.

(4)NMR-Spektrum

Das NMR-{100-MHz-)Spektrum der erfindungsgemäßen Substanz wurde unter Verwendung von schwerem Wasser als Lösungsmittel und Natrium-22-dimethyl-2-sflanopentan-5-sulfonat {DSS) als innerem Standard gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig.2 wiedergegeben. Wenn man in der F i g. 2 annimt, daß die Absorption bei 03 bis £5 ppm unter dem DSS-Standard den Seitenketten-Protonen des Proteinantefles und die Absorption bei 23 bis 6,0 ppm den Protonen des

Polysaccharidanteiles zuzuschreiben ist, und, wenn man die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanz unter den oben angegebenen Bedingungen als Verhältnis der Protonenstärke zwischen beiden ausdrückt, liegt dieses Verhältnis im Bereich von 95/5 bis 55/45. Bei den obigen NMR-Messungen wurden zur Eliminierung des Einflusses von restlichem leichten Wasser in schwerem Wasser die Werte nach der Korrektur unter Zugrundelegung der Lorenz-Kurve verwendet.

Der markante Anstieg der Absorption des Polysaccharidanteils bei 2,5 bis 4,1 ppm wird durch die Methyienprotonen in den Stellungen 2 bis 6 der Pyranoseringe in der Zuckerkette verursacht. Zum Beispiel zeigt Fig.3 das NMR-Spektrum eines Produkts, das aus einem Extrakt von Coriolus versicolor (FR.) Quel. (Polystictus versicolor Fr.) erhalten wurde, wenn man den Extrakt einer Filtration unter Druck, einer Hitzesterilisation und einer Sprühtrocknung unterwarf. Dieses Produkt wird nachfolgend als PS-K bezeichnet. Der größte Unterschied zwischen PS-K und der erfir.dungsgerrsäßen Substanz beim Vergleich der F i g. 2 mit der F i g. 3 besteht darin, daß die erfindungsgemäße Substanz im Bereich von 4,9 bis 6,0 ppm keinerlei auf «-Bindungen zurückgehende Absorption zeigt. Dies bestätigt, daß sich der Polysaccharidanteil der erfindungsgemäßen Substanz allein aus /3-D-Glucan aufbaut.

Es ist bekannt, daß in Fig.2 die Absorption bei 4,5 ppm mit /J-(I-4) und /3-(J-* 6) in den Methinprotonen in der 1-Stellung und die Absorption bei 4,7 ppm mit ]3-( 1 —* 3) und /J-(I-* 2) in den Methinprotonen in 1-Stellung assoziiert ist so daß das Verhältnis /J-(I-4) und /S-(I-6)//?-( 1—3) und /J-(I- 2) ermittelt werden kann. Da aber auch eine Verzweigung vorliegt, muß die oben angeführte Methylierungsmethode zur Aufklärung der Feinstruktur herangezogen werden.

Was den Proteinanteil anbelangt, so ist es schwierig, dessen Struktur allein aufgrund von Messungen des NMR-Spektrums festzustellen. Da die erfindungsgemäße Substanz jedoch Absorptionen in bestimmten gegebenen Bereichen zeigt, wie nachfolgend erläutert ist wird diese Methode dennoch als vorteilhaft für die Identifizierung betrachtet.

Die erfindungsgemäße Substanz zeigt chrakteristische Absorptionen bei 0,9 ± 0,1 ppm, 1,2 ± 0,1 ppm, 2,0 ± 0,1 ppm, 4,5 ± 0,1 ppm und 4,7 ± 0,1 ppm, keine Absorption im Bereich 4,9 bis 6,0 ppm und eine breite Absorption im Bereich 3,0 bis 4,4 ppm.

(5) Molekulargewicht

Das durch Ultrazentrifugation ermittelte Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Substanz liegt im Bereich von 5000 bis 300 000, das durchschnittliche Molekulargewicht im Bereich von 10 000 bis 100 000. Die unter Anwendung anderer Verfahren ermittelten Werte, zum Beispiel durch fraktionierte Ultrafiltration, zeigten ebenfalls auf den Bereich 10 000 bis 100 000. Es ist daher anzunehmen, daß das durchschnittliche Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Substanz im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt fco

Damit ist klargestellt daß die erfindungsgemäße Substanz die, wie das NMR-Spektrum zeigt kein «-Glucan enthält und aus an Proteine gebundenen Polysacchariden (PS-K) gewonnen wird, die von Coriolus Fungi stammen, neu und von PS-K verschieden ist Sie kann leicht aufgrund der spezifischen Absorptionen im NMR-Spektrum identifiziert werden. Diese Methode eignet sich ganz generell für die Charakterisierung komplizierter hochmolekularer Substanzen aus natürlichen Quellen.

Da die erfindungsgemäße Substanz durch Abtrennung von den Mucopolysacchariden (PS-K) erhalten wird, sollte sie hohe Antitumorwirksamkeit besitzen. Sie hat diese auch bei oraler Verabreichung.

Akute Toxizität Akute Toxizität bei Mäusen und Ratten

Als Versuchstiere wurden 4 bis 5 Wochen alte Mäuse vom lCR-ICL-Stamm mit einem Gewicht von 21 bis 24 g sowie 4 bis 5 Wochen alte Ratten vom Donryu-Stamm mit einem Gewicht von 100 bis 150 g verwendet. Die erfindungsgemäße Substanz wurde auf den folgenden vier Wegen verabreicht: intravenös, subkutan, intraperitoneal und oral. Innerhalb des Zeitraums von 7 Tagen nach der Verabreichung der Substanz wurden die allgemeinen Symptome, Tod und Körpergewicht beobachtet. Dann wurden die Tiere getötet und einer Autopsie unterzogen. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengestellt Es starb kein Versuchstier, selbst wenn die erfindungsgemäße Substanz in der maximalen Dosis sowohl an die Ratten als auch an die Mäuse verabreicht wurde. Es war daher praktisch unmöglich, den LDso-Wert zu errechnen.

Tabelle 5
Akute Toxizität bei Mäusen und Ratten

Ver	Verabreichungs	LD₅₀ (mg/kg)	männlich
suchs tier	weg	weiblich	> 1300
Maus	intravenös	> 1300	> 5000
	subkutan	> 5000	> 5000
	intraperitoneal	> 5000	>20000
	oral	>20000	> 600
Ratte	intravenös	> 600	> 5000
	subkutan	> 5000	> 5000
	intraperitoneal	> 5000	>20000
	oral	>20000

Test zur Ermittlung der Antitumorwirksamkeit

(1) Antitumorwirksamkeit in vitro

(I)-I In-vitro-Hemmwirkungauf das Wachstum von ascites hepatoma AH-13 Zellen

Es wurde die 50%ige Hemmkonzentration IC50 ermittelt. Die erfindungsgemäße Substanz wurde in stufenweiser Verdünnung zu einer Suspension von ascites hepatoma AH-i3 Zeilen gegeben und nach 48 Stunden wurden die lebenden Zellen durch Anfärben gezählt um die Wachstumshemmung festzustellen. Die IC50 der erfindungsgemäßen Substanz wurde mit 100 μg/ml festgestellt

(1)-2 In-vitro-Wirksamkeit gegen das Wachstum von Ehrlich ascites Zellen von Mäusen

Es wurde der Einfluß der erfindungsgemäßen Substanz auf die Aufnahme von ³H-Uridin und ³H-Thymidin durch Ehrlich ascites Zellen von Mäusen, die nachfolgend als EC-Zellen bezeichnet sind, untersucht Die EC-Zellen (5 χ 10⁵ZmI) wurden zwei Stunden bei 37°C in Eagle MEM Kulturmedien bebrütet die 500,

12

1000 und 2000μg/ml der erfindungsgemäßen Substanz sowie 0,5 Ci/ml ³H-Uridin oder ³H-Thymidin enthielten. Als Kontrolle wurde anstelle der erfindungsgeniäßen Substanz sterile physiologische Kochsalzlösung zugefügt. Die erfindungsgemäße Substanz vermochte nach 2 Std. die Aufnahme von ³H-Uridin in die RNA von EC-Zellen bei einer Konzentration von 500 μ^/ηιΙ auf etwa 70% der Kontrolle, bei einer Konzentration von 1000 μg/ml auf etwa 65% der Kontrolle und bei einer Konzentration von 2000 μg/ml auf etwa 60% der Kontrolle zu verringern. Die Aufnahme von ³H-Thymidin in die DNA von EC-Zellen wurde nach 2 Stunden bei einer Konzentration von 500 μg/ml auf etwa 65%, bei einer Konzentration von 1000 μg/ml auf etwa 60% und bei einer Konzentration von 2000 μζ/νη] auf etwa 50% reduziert.

(2) Antitumorwirksamkeit in vitro und in vivo

(Unterdrückungswirkung der

erfindungsgemäßen Substanz auf das Wachstum von

Ehrlich ascites Zellen)

Es wurde die Unterdrückungswirkung der erfindungsgemäßen Substanz auf das Wachstum von Ehrlich ascites Zellen von Mäusen, die nachfolgend als EC-Zellen bezeichnet sind, untersucht. Die EC-Zellen (5 χ 10⁶ Zellen/ml) wurden drei Stunden bei 37°C in Hanks-Lösung bebrütet, die 5000 μg/ml der erfindungsgemäßen Substanz enthielt. Nach der Bebrütung impfte man die EC-Zellen in einer Menge von 10⁶ Zellen je Maus in die peritonealen Höhen von weiblichen JCR-JCL-Mäusen (10 Mäuse je Gruppe) und stellte fest, wieviel Mäuse innerhalb eines Zeitraums von 20 Tagen starben.

ίο Innerhalb dieser 20 Tage starb kein einziges der mit den EC-Zellen, die mit der erfindungsgemäßen Substanz behandelt worden waren, beimpften Tiere. Einige Mäuse zeigten keine Unterleibsödeme. Auf der anderen Seite starben alle Mäuse der Kontrollgruppe, die mit den EC-Kontrollzellen beimpft worden waren, innerhalb der 20 Tage an Tumor.

(3) Test zur
Ermittlung der Antitumorwirkung in vivo

Die Ergebnisse der Tests zur Ermittlung der Antitumorwirkung in vivo bei Mäusen und Ratten sind in der Tabelle 6 zusammengestellt. Die erfindungsgemäße Substanz zeigte in jedem Fall hohe Antitumorwirkung.

Tabelle 6

Antitumorwirkung in vivo bei Mäusen und Ratten, die mit Tumorzellen beimpft wurden

Tumor	Maus oder Ratte, Stamm	Beimpfung und Verab- reichungs- form	Anzahl der ein geimpften Zellen je Tier	Zeit bis zum Beginn der Verabrei chung nach der Beimpfung	Dosis, mg/kg, Tag x Anzahl der Verab reichungen	Zeit bis zur Auswertung der Wirkung (Tage nach d. Beimpfung)	Tumor-Hemm wirkung, %
Sarkom-180	ICR-JCL	s.c.-i.p.	10⁶	24 Std.	500X10	32	97-100
(fest)		s.c.-i.p.	10⁶	24 Std.	250 X 10	32	97-100
		s.c.-p.o.	10⁶	24 Std.	1000X10	32	85- 90
		s.c.-p.o.	10⁶	24 Std.	500X10	32	83- 89
		S.C.—i.p.	10"	24 Std.	10X11	32	97-100
Ehrlich Karzinom (fest)	ICR-JCL	s.c.-i.p.	10"	24 Std.	50X10	35	100
Ascites hepatomas AH-13	Donryu	i.p.-i.p.	10*	7 Tage	250 x 10	60	mehr als 70 % der Tiere wur den geheilt und

überlebten

Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz

Für die Erzeugung der ernndungsgemäSen Substanz können nicht nur die angegebenen Stämme von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (Polystictus versicolor Fr.) — Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology Deposit FERM-P Nr. 2412—2426 (Stamm Nr. CM 101 — 115) —, sondern auch andere Stämme von Coriolus versicolor (Fr.) QueL sowie Stämme verwendet werden, die zu anderen Arten gehören, zum Beispiel Coriolus consors (Berk.) Imaz. [Irpex consors Berlc], Coriolus pubescens (Fr.) Quel. [Polyporus pubescens Schum. ex Fr-; Tyromyces pubenscens (Fr.) Imaz.], Coriolus biformis (Klotz.) PaL [Polystictus biformis (KL) Fr.], Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. FPolystictus hirsutus Fr.], Coriolus conchifer (Schw.) Pat. [Polysticius cuiichifcr (Schw.) Sacc: Poronidulus conchifer iSchw.) Murr.], Coriolus pargamenus (Fr.) FaL [Pölysticius pargamenus Fr.]. Für die technische Herstellung ist es jedoch am vorteilhaftesten, den oben angegebenen CM-101-Stamm zu verwenden, da er die höchste Ausbeute an erfindungsgemäßer Substanz liefert.

ω Diese ist in den Extrakten der Fruchtkörper und Mycelien von Coriolus enthalten.

Die Fungi werden vorkultiviert und die Mycelmatte, die sich auf der Oberfläche des Kulturmediums gebildet hat, wird mit physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert, um den Impfstoff für die eigentlichen Kulturen zu liefern. Diese werden zur Bildung des Mycels, das mit einem wäßrigen Lösungsmittel, zum Beispiel heißem Wasser oder verdünnter alkalischer Lösung extrahiert

wird, als stationäre oder submerse Kulturen gezüchtet. Der erhaltene Extrakt wird nach der Entfernung des Rückstandes eingeengt und darauf mit Ammoniumsulfat ausgesalzen oder einer Ultrafiltration unterworfen, um die Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Der so gereinigte Extrakt wird bis auf 5 bis 10 Gew.-% eingeengt Die konzentrierte Lösung wird mit weiterem Ammoniumsulfat in einer Menge, die 25% des Sättigungswertes entspricht, versetzt, um eine fraktionierte Fällung zu erreichen, worauf die gebildete Fällung entfernt wird Die entstehende Lösung wird nochmals mit Ammoniumsulfat in einer Menge versetzt, die 40% des Sättigungswertes entspricht Die ausgeschiedene Fällung wird gesammelt mit Wasser gelöst und durch Dialyse entsalzt Die erhaltene Lösung wird über eine Diäthylaminoäthyl-Zellulose Säule geführt und die von der Säule adsorbierte Substanz mit Wasser gewaschen und darauf mit 1 n-Kochsalzlösung eluiert. Das erhaltene Eluat wird nochmals mit Ammoniumsulfat in einer Menge, die 40% des Sättigungswertes entspricht, versetzt, um eine Fällung zu bilden, die erneut in Wasser gelöst und dann durch Dialyse entsalzt wird. Das entstandene gereinigte Produkt wird getrocknet, um die erfindungsgemäße Substanz zu erhalten.

Wie schon angegeben, zeigt das erfindungsgemäße Protein gebundene Polysaccharid bei oraler Verabreichung ausgezeichnete Antitumorwirkung. Die erfindungsgemäße Substanz verstärkt auch die Immunreaktion des Wirts und verhindert oder verringert weitgehend eine Abnahme der Immunität oder körperlichen Widerstandskraft von Patienten, die verschiedenen Behandlungen ausgesetzt waren, zum Beispiel einer chemotherapeutischen oder radiotherapeutischen Behandlung, einem chirurgischen Eingriff oder einer Bluttransfusion, und zwar unabhängig davon, ob sie von einem Karzinom befallen sind oder nicht. Die erfindungsgemäße Substanz schützt Patienten auch wirksam vor infektiösen Erkrankungen, wie Hepatitis oder Pneumonie, die durch Viren oder Bakterien verursacht werden können, wenn die Betroffenen nicht mehr ausreichend immun oder in schlechter körperlicher Verfassung sind.

Die erfind'jngsgemäße Substanz führt bei oraler Verabreichung an den Patienten nicht nur zu einer Verbesserung des allgemeinen körperlichen Zustands, sondern bewirkt auch in erstaunlicher Weise eine Förderung der Darmtätigkeit und erhöht den Appetit. Außerdem erweist sie sich als außerordentlich hilfreich bei der Unterstützung eines regelmäßigen Stuhlgangs, wenn ein Patient sehr lange bettlägerig ist.

Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.

Beispiele 1 bis 4

200-ml-Erlenmeyer-Kolben, die 30 ml eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung enthielten:

5% Glucose,
0,2% Peplon,
0,3% Hefeextrakt,
0,1% KH₂PO₄und
0,1% MgSO₄ · 7H₂O

wurden jeweils mit Stämmen von CM-101 (Fermentation Research Institute of Agency of Industrial Science and Technology Deposit FERM-P. Nr. 2412), CM-102 (FERM-P. Nr. 2413) und CM-103 (FERM-P. Nr. 2414), dieCoriolus versicolor(Fr.-)Quel. (Polystictus versicolor Fr.) angehören, beimpft. Innerhalb von 10 Tagen wurden

b0 bei 25 bis 27° C stationäre Kulturen gebildet Die auf der Oberfläche des Kulturmediums entstandene Mycelmatte wurde zur Herstellung von Impfstoff mit physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert Der Impfstoff wurde dann in 1,0-Liter-KuIturflaschen übertragen, die 2GO ml des gleichen Kulturmediums enthielten und bei 25 bis 27° C 25 Tage bebrütet Die Mycelausbeute betrug 4 bis 43 g je Kolben für CMlOl,2,0 bis 2,5 g für CM-102 und 2,7 bis 3,2 g für CM-103.

Dann wurden 3 Liter destilliertes Wasser zu jeweils 100 g der erhaltenen Mycele gegeben, und die Mycele wurden jeweils unter Rühren 3 Stunden bei 98° C extrahiert Nach beendeter Extraktion wurden die einzelnen Lösungen in Extrakt und Extraktionsrückstand getrennt, worauf der Extraktionsrückstand nochmals der gleichen Extraktionsbehandlung wie zuvor unterworfen wurde, wofür man die in der Tabelle 7 aufgeführten wäßrigen Lösungsmittel verwendete. Dann wurden die einzelnen Extrakte gesammelt und eingeengt Die eingeengte Extraktlösung wurde zur Bildung einer Fällung mit Ammoniumsulfat gesättigt Die erhaltene Fällung wurde nochmals in Wasser gelöst und durch Dialyse unter Verwendung einer Zellulosemembran en„alzt. Die so erhaltene Lösung wurde bis auf 5 Gew.-% eingeengt dann mit Ammoniumsulfat in einer Menge versetzt, die 25% des Sättigimgswertes entsprach. Nach der Entfernung der durch diese Behandlung verursachten Fällung wurde die Lösung nochmals mit Ammoniumsulfat in einer Menge versetzt, die 40% des Sättigungswertes entsprach. Die erhaltene Fällung wurde in Wasser gelöst und auf die gleiche Weise wie oben entsalzt. Dann wurde sie über eine Diäthylaminoäthyl-Zellulose Säule geführt. Die von der Säule adsorbierte Substanz wurde mit Wasser gewaschen und darauf mit 1 Mol Kochsalzlösung eluiert. Das Eluat wurde wiederum mit Ammoniumsulfat in einer Menge versetzt, die 40% des Sättigungswertes entsprach. Die gebildete Fällung wurde gesammelt und erneut in Wasser gelöst Dann wurde die erhaltene Lösung durch Dialyse entsalzt, eingeengt und sprühgetrocknet, worauf man die erfindungsgemäße Substanz erhielt. Die Eigenschaften dieser Substanz und die in Tierversuchen erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 7 zusammengestellt Die »Alkaliextraktionsmethode«, die Alkali als Lösungsmittel verwendet und in Tabelle 7 aufgeführt ist, entsprach dem oben angegebenen Verfahren mit der Abweichung, daß '/io n-Ätznatronlösung anstelle von Wasser bei der erneuten Extraktion des Rückstandes verwendet und der pH-Wert nach Beendigung der Extraktion mit '/to n-Chlorwasserstoffsäure auf den neutralen Wert eingestellt wurde.

Die in der Tabelle 7 angegebenen Werte des IR-Absorptionsspektrums, das unter Verwendung einer Kaliumbromidscheibe aufgenommen wurde, sind grafisch in der Fi g. 1 dargestellt, das heißt, es wurde eine Absorption von v-OH bei 2600 bis 3200 cm-', Deformationsvibrationen von — NH₂ und -NH bei 1600 cm-' bzw. 1530cm-', eine breite Absorption bei 1200 bis 10O0cm-', eine asymmetrische Dehnungsvibration der C—O—C-Bindung in den Pyranoseringen des Polysaccharidteils und eine spezifische Absorption bei 890 cm-' aufgrund der ^-Bindung der Glucose aber kaum eine Absorption (α-Bindung) bei 840 cm-' beobachtet.

Da hinsichtlich des IR-Absorptionsspektrums kein wesentlicher Unterschied zwischen den verschiedenen Proben bestand, sind die Ergebnisse des Beispiels 1 allein als repräsentativ gezeigt.

Das NMR-Spektrum wurde unter Verwendung von DSS als innerem Standard und schwerem Wasser als Lösungsmittel aufgenommen. In der Tabelle 7 sind die Werte nach Korrektur unter Zugrundelegung der Lorenz-Kurve zur Eliminierung des Einflusses von restlichem leichten Wasser in schwerem Wasser aufgeführt.

Das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Substanz wurde durch Ultrazentrifugation ermittelL Es lag bei allen Proben im Bereich von 5000 bis 300 000. Für die Messungen wurden das Sedimentationsgleichgewicht und das synthetische Grenzmuster unter Verwendung eines optischen Interferenzsystems angewandt. Die Versuchsbedingungen waren wie folgt: Konzentration der Probe 0,3%; Lösungsmittel Vio m-KCl; Temperatur 25°C; Länge der Lösungskolonne 1,7 mm; Geschwindigkeit 22 000 U/Min.; Meßzeit 5 Stunden.

Die Aminosäureanalyse wurde nach einer herkömmlichen Methode durch Zugabe von 4 ml 6 n-Chlorwasserstoffsäure zu 10 mg jeder Probe, Gefriertrocknung mit Trockeneis-Aceton, Verschließen in einem Rohr unter vermindertem Druck, 24stündige Hydrolyse bei 110° C, Trocknen und darauf Lösen in 30 bis 40 ml einer Zitronensäure-Pufferlösung vom pH 2,20 durchgeführt.

Zur Ermittlung der spezifischen Drehung wurde zuerst die optische Drehung mit der Natrium-D-Linie (589 ιτιμ) unter Verwendung einer 0,25%igen wäßrigen Lösung jeder Probe und 5-cm-Zellen gemessen und die spezifische Drehung [α] ; aus der gemessenen optischen Drehung α errechnet.

Die Zusammensetzung der Monosaccharide der erfindungsgemäßen Substanz wurde in folgender Weise untersucht. 3 mg jeder Probe wurden in eine 5-mm-Glasampulle gegeben, die man mit 10 ml 3%igem Chlorwasserstoff in Methanol versetzte, um innerhalb von 16 Stunden bei 100⁰C eine Mcthanolyse zu bewirken. Das gebildete Produkt wurde mit Silbercarbonat neutralisiert und bei Raumtemperatur filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft und zur Trockene gebracht. Anschließend wurde in 0,5 ml trockenem Pyridin gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 0,2 ml Hexamethyldisilazan und 0,3 ml Trimethylchlorsilan versetzt. Die gebildete Mischung ließ man zur Trimethylsilierung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Nach Beendigung dieser Umsetzung wurde das Gemisch in Chloroform gelöst, und nach der Entfernung des überschüssigen Reaktionsmittels durch Waschen

Tabelle 7

mit Wasser wurde die erhaltene Lösung zur Trockene eingedampft. Die so behandelte Substanz (Trimethylsilat) wurde in Tetrachlorkohlenstoff gelöst und gaschromatographisch untersucht

Die Art der Bindung der Saccharide wurde nach der Methode von Haworth ermittelt Danach wurden 2 g jeder Probe in 10 ml 1 n-NaOH-Lösung gelöst und, während man das Gemisch unter einem Stickstoffstrom auf 40 bis 50° C hielt und heftig rührte, wurden innerhalb

ίο mehrerer Stunden 20 ml Dimethylschwefelsäure und 40 ml 30%ige Natriumhydroxidlösung tropfenweise zugefügt. Nachdem das Gemisch über Nacht gestanden hatte, wurde es der gleichen Behandlung mit der gleichen Menge Methylierungsmittel unterworfen. Die Reaktionslösung wurde nach der Neutralisation in fließendes Wasser dialysiert Das Dialysat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und dreimal der Methylierung unterworfen, worauf man nach weiterer Neutralisation und Dialyse das Gemisch unter verringertem Druck zur Trockene eindampfte Die zurückgebliebene Substanz wurde in 20 ml einer Mischung aus Chloroform und Methanol im Verhältnis 10:1 gelöst, worauf man eine Mischung aus Petroläther und Äther im Verhältnis 1 :1 zugab, um die methylierte Substanz auszufällen. Anschließend wurden etwa 20 mg dieser methylierten Substanz mit 1 n-Schwefelsäure 16 Stunden bei 100° C hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde nach einem herkömmlichen Verfahren in das Alditol-Acetat übergeführt und das Molverhältnis aus dem Spitzenbereich des Gaschromatogramms ermittelt. Um zwischen 2.3,6-Tri-O-Me-G und 2,3,4-Tri-O-Me-G zu unterscheiden, wurden 20 mg der methylierten Substanz 16 Stunden bei 100° C in einem verschlossenen Rohr einer Methanolyse unterworfen, wofür man 3% Chlorwasser-

J5 stoff in Methanol verwendete. Die Gegenwart von 2,3,4-Tri-O-Me-G wurde durch die gaschromatographische Analyse des Methanolyse-Produkts nicht bestätigt. Jedes der obigen abgebauten Produkte wurde unter Verwendung eines Standards gaschromatographisch identifiziert. Ferner wurde jedes der oben genannten abgebauten Produkte unter Anwendung einer Flüssigkeitssäulenchromatographie und Kristallisation oder Überführung in ein kristallines Derivat isoliert.
Die Eigenschaften, strukturellen Charakteristika und die Antitumorwirkung der so erhaltenen an Protein gebundenen Polysaccharidsubstanzen sind in zusammengefaßter Form in der Tabelle 7 wiedergegeben.

	Beispiel Nr.	2	3	4
	1	Nr. 2412	Nr. 2413	Nr. 2414
Hinterlegungsnummer FERM-P	Nr. 2412	CM-101	CM-102	CM-103
Stamm Nr.	CM-101	Alkali	heißes Wasser	Alkali
Extraktionsmethode	heißes Wasser	0,9	0,3	0,4
Ausbeute in g je 100 g trockener Fungi	0,7	0,5-28	1,0-19	0,8-29
Molekulargewicht x 10⁴	0,8-25	9,0	4,7	8,9
Durchschnittliches Molekulargewicht X ΊΟ⁴	6,8
Farbreaktion (Saccharid)		purpur	purpur	purpur
cr-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion	purpur	farben	farben	farben
	farben

Indol-Schwefelsäure-Reaktion

braun

	Fortsetzung	26 59 808	2	18	4
17			grünlich-		grünlich
		blau		blau
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion	Beispiel Nr.	braun	3	braun
	1	purpur	grünlich	purpur
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion	grünlich	farbenbraun	blau	farbenbraun
Trypiophan-Schwefelsäure-Reaktion	blau		braun
	braun	blau	purpur	blau
Farbreaktion (Protein)	purpur	purpur	farbenbraun	purpur
Lowry-Folin-Methode	farbenbraun	farbenblau		farbenblau I I
Ninhydrin-Reaktion nach der Hydrolyse mit		+ 2	blau	vorhanden
Chlorwasserstofifsäure (6n-HCl, 20 Stunden)	blau		purpur	vorhanden
Spezifische Drehung, [a]j}	purpur	vorhanden	farbenblau	vorhanden
IR-Absorptionsspektren	farbenblau	vorhanden	+ 1	vorhanden
3600-3200 cm"¹	ei'	vorhanden		vorhanden
1600 cm"¹		vorhanden	vorhanden	fehlt
1530 cm"¹	vorhanden	vorhanden	vorhanden	Fig. 2-4
1200-1000 cm"¹	vorhanden	fehlt	vorhanden
890 cm"'	vorhanden	Fig. 2-2	vorhanden	vorhanden
840 cm"¹	vorhanden		vorhanden	vorhanden
NMR-Spektren (Zeichnung)	vorhanden	vorhanden	fehlt	vorhanden
Absorptionsbereich (ppm)	rehlt	vorhanden	Fig. 2-3	vorhanden
0,9 ± 0,1	Fig. 2-1	vorhanden		vorhanden
1,2 ±0,1		vorhanden	vorhanden	fehlt
2,0 ±0,1	vorhanden	vorhanden	vorhanden	fehlt
4,5 ± 0,1	vorhanden	fehlt	vorhanden	vorhanden
4,7 ± 0,1	vorhanden	fehlt	vorhanden
5,0 ±0,1	vorhanden	vorhanden	vorhanden	85,5
5,4 ±0,4	vorhanden		fehlt	14,5
3,0 ± 4,4	fehlt	79,8	fehlt
Absorptionsintensität Verhältnis	fehlt	20,2	vorhanden	7,0
Polysaccharid	vorhanden			0,7
Protein		3,5	86,2	1,3
Glycosid-Analyse (Art der Bindung)	{!6,1	0,1	13,8	0,2
-¹G⁴-	13,9	0,9		0,4
-¹G³-		0,3	8,0	1
-ψ	5,3	Spur	2,0	Glucose über 99 I
-¹GI-	0,7	1	2,0	14,6
	0,8	Glucose	1,0	9,2
¹G-	2,0	über 99	0,2	7,2
Monosaccharidkomponente	(!,3		I	13,1
Anteil, %	1	14,8	Glucose	1,8
Aminosäureanalyse	Glucose	8,1	über 99	7,1
Asparaginsäure	über 99	6,4
Threonin		14,0	13,5
Serin	18,4	3,8	7,3
Glutaminsäure	7,1	7,4	7,0
Prolin	6,4		14,0
Glycin	12,3	1,5
1,7	7,8
7,6

19

Fortsetzung

20

Beispiel Nr. 1

Aminosäureanalyse

Alanin 7,8

Cystein +

Valin
Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan I ysin
Histidin Arginin (Ammoniak)

Gesamtmenge an Asparaginsäure, Serin, 75,1

Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin und Leucin

Akute Toxizitä't, Maus, LD₅n, mg/kg intravenös männlich

weiblich subkutan männlich weiblich

intraperitoneal männlich weiblich

oral

männlich weiblich

Akute Toxizität, Ratte, LD₅₀, mg/kg intravenös männlich weiblich

subkutan männlich weiblich

intraperitoneal männlich weiblich

oral

männlich weiblich

Antitumorwirkung Hemmwirkung in vitro auf das Wachstum

von ascites hepatoma AH-13 Zellen IC₅₀, |xg/ml 9,5

8,5

74,7

73,7

8,9

7,5	7,4	7,6	7,6
1,4	1,5	1,7	1,7
4,6	4,3	4,7	4,7
8,0	7,1	8,0	7,9
2,2	1,8	1,8	2,0
5,0	4,3	5,2	5,0
	+	0,9	+
2,8	2,4	2,8	2,4
1,5	1,4	1,7	1,5
3,4	2,9	2,8	2,8
2,3	2,9	3,2	2,5

75,6

über	1300	über	1300	über	1300	über	1300
über	1300	über	1300	über	1 300	über	1300
über	5000	über	5000	über	5000	über	c ηπΛ J UUU
über	5 000	über	5000	über	5000	über	5000
über	5000	über	5000	über	5000	über	5000
über	5000	über	5000	über	5000	über	5000
über	20 000	über	20000	über	20 000	über	20000
über	20000	über	20000	über	20 000	über	20000
über	600	über	600	über	600	über	600
über	600	über	600	über	600	über	600
über	5000	über	5000	über	5000	über	5000
über	5000	über	5 000	über	5000	über	5000
über	5000	über	5000	über	5000	über	5000
über	5000	über	5 000	über	5000	über	5000
über	20000	über	20000	über	20000	über	20000
über	20 000	über	20000	über	20 000	über	20000

97

100

98

Fortsetzung

	Beispiel Nr.	71	2	70	3	72	4	73
	1	64		65		65		63
Hemmwirkung in vitro auf das Wachstum		59		60		60		59
von Ehrlich ascites Zellen (EC-Zellen)
von Mäusen
nach 120 Minuten Aufnahme von ³H-Uridin
in die RNA von EC-Zellen (die Kontrolle		63		65		64		65
ist mit 100 angegeben)		60	61	59	60
500 \|xg/ml	50	51	52	51
1000 \|J-g/ml
2000 μg/ml
nach 120 Minuten Aufnahme von	alle	alle	alle	alle
³H-Thymindin in die DNA von EC-Zellen	überlebten	überlebten	überlebten	überlebten
(die Kontrolle ist mit 100 angegeben)
500 μg/ml
1000 μg/ml
2000 μg/ml	98	99	100	99
Unterdrückung des Wachstums von	100	100	98	98
Ehrlich ascites Zellen	100	100	100	100
300 μg/ml	85	84	85	86
	90	87	89	90
Antitumorwirksamkeit in vivo
(Wachstumshemmung)	100	100	100	100
Maus Sarkom-180
i.p. 10 mg/kg
250 mg/kg
500 mg/kg
p.o. 500 mg/kg
1000 mg/kg
Maus Ehrlich
i.p. 50 mg/kg

Ratte AH-I." (Überlebende/Zahl der
verwendeten Ratten, nach 60 Tagen)

i.p. 250 mg/kg

7/10 8/10

8/10

Vergleichsversuche

Zum Vergleich des Inhibierungsvermögens der erfindungsgemäßen Substanzen gegenüber denen der DE-OS 20 50 714 bei experimentell auf Tiere transplantierten Tumoren wurden folgende Versuche durchgeführt:

1. Eine Maus der Gattung ICR-JCL mit einem Gewicht von 20 g wurde intraperitoneal mit Sarkoma-180-Tumorzellen beimpft Als nach einer Woche ein hinreichender Anstieg von ascitischer Flüssigkeit in der Maus beobachtet wurde, wurden IO⁶ Zellen des Sarkom-Tumors der Maus subkutan den Axillarbereich anderer Mäuse subkutan

transplantiert, und zwar jeweils in aus je 10 Mäusen bestehende Gruppen von Mäusen. Der Mäusegruppe 1 wurde nur eine Salzlösung verabfolgt, da diese als Kontrollgnippe diente. Den anderen Mäuse-

60

65 gruppen wurden die zu untersuchenden Polysacchariden, die ebenfalls in einer Salzlösung gelöst waren, in verschiedenen Konzentrationen oder in verschiedenen Voiumenmengen verabfolgt. Die erste Verabfolgung der Polysaccharide wurde eine Woche nach der Transplantation intraperitoneal durchgeführt und danach jeden zweiten Tag insgesamt 9mal wiederholt Die von den transplantierten Tumorzellen in der Maus gebildeten Tumore wurden tagtäglich beobachtet; 5 Tage nach der letzten Verabfolgung des Polysaccharids, also nach der 10. Verabfolgung, wurde die durchschnittliche Körpergewichtszunahme der Maus bei jeder Gruppe bestimmt; anschließend wurden die Mäuse abgetötet und bei einer Autopsie auf Nebenwirkungen untersucht; femer wurde das Gewicht des exzisierten Tumors jeweils bestimmt Die Körpergewichte der jeweiligen Mäuse zeigten keine wesentlichen Unterschiede.

Das prozentuale Inhibierungsverhältnis berechnet sich nach der folgenden Formel:

IV in % =

100,

in der C das Durchschnittsgewicht des Tumors in Gramm bedeutet, der bei jeder einzelnen Mausjder Kontrollgruppe exzisiert worden ist, während Tdas Durchschnittsgewicht derTumore bedeutet, die bei den einzelnen Mäusen der mit der jeweiligen Polysaccharid-Verbindung behandelten Mäusegruppe exzisiert worden sind.
Hierbei wurden folgende Werte erhalten

Vers.- Gesamtdosis

mg/kg

Snhibierungsvcrhäitnis in%

Vergleich Gemäß
gemäß Erfindung DE-OS
2050714

10

15

20

100 = 10X10
1000 = 10X100
3000 = 10X300

68,8
72,4
80,0

99,0
100,0
100,0

25

Diese Tabelle zeigt, daß das erfindungsgemäße Produkt bereits bei sehr kleinen Dosen ein höheres Inhibiemngsverhältnis von 99 gegenüber einem

Wert von 68,8 zeigt. Dieses bedeutet, daß das erfindungsgemäße Produkt 1,44mal aktiver als das Vergleichsprodukt ist, das gemäß Beispiel 13 in der DE-OS 20 50 714 beschrieben worden ist.
2. Bei einem weiteren Vergleichsversuch wurden die zu untersuchenden Produkte 24 Stunden nach der Transplantation täglich im Verlaufe von 20 Tagen verabfolgt, und zwar einmal mit einer Dosis von 500 mg/kg Körpergewicht und zum anderen mit 1000 mg/kg Körpergewicht. Am 25. Tage nach der Transplantation wurde wiederum das Inhibierungsverhältnis berechnet, wobei folgende Werte erhalten wurden:

Inhibierungsverhältnis bei einer Dosis von

500 llXX)

mg/kg/Tag mg/kg/Tag

Mit dem erfindungsgemäßen Produkt
(Tabelle 7 Nr. 1)

Mit dem Vergleichsprodukt gemäß
DE-OS 2050714

90

75,8

Diese Werte zeigen deutlich, daß das erfindungsgemäße Produkt l,2fach wirksamer als das Vergleichsprodukt ist.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

J. Proteingebundene Polysaccharide aus Mycelen und/oder Fruchtkörpem von Coriolus versicolor (FR.) QueL FERM-P Nr. 2412-2426 (Stamm Nr. CM — 115) erhältlich durch

(a) Extrahieren der Mycele und/oder Fruchtkörper mit wäßrigen Lösungsmitteln und Einengung des erhaltenen Extraktes,

(b) Aussalzen des Konzentrates durch Zugabe von Ammoniumsulfat, Lösen der Fällung und Entsalzen durch Dialyse,

(c) Zweistufiges fraktioniertes Fällen der aufgearbeiteten und entsalzten Lösung mit Ammoniumsulfat, wobei bei der ersten Fraktionierung Ammoniumsulfat bis 25% des Sättigungswertes eingesetzt und der erhaltene Niederschlag verworfen wird und in der zweiten Fraktionierung Ammoniumsulfat bis 40% des Sättigungswertes in der von dem ersten Niederschlag befreiten Lösung eingesetzt und der zweite Niederschlag isoliert wird,

(d) Auflösen des nach (c) erhaltenen zweiten Niederschlages in Wasser und anschließendes Dialysieren der Lösung,

(e) Adsorption des Dialysates an einer Diethylaminoethyl-Zellulose-Säule, Waschen der adsorbierten Substanzen in der Säule mit Wasser und Eluieren der in der Adsorptions-Säule verbliebenen Substanzen mit Kochsalzlösung,

(f) nochmaliges Fraktionieren des nach (e) erhalte-: nen Eluats durch Versetzen mit Ammoniumsul-· fat bis der Sättigungswert der Reaktionslösung 40% ausmacht und Auflösen der erhaltenen Fällung in Wasser, Entsalzen durch Dialyse und Sprühtrocknen der konzentrierten Lösung.