CH628245A5

CH628245A5 - Verfahren zur herstellung eines stickstoffhaltigen polysaccharids mit antitumoraktivitaet.

Info

Publication number: CH628245A5
Application number: CH418077A
Authority: CH
Inventors: Saburo Ueno; Chikao Yoshikumi; Fumio Hirose; Yoshio Ohmura; Toshihiko Wada; Takayoshi Fujii; Eiichi Takahashi
Original assignee: Kureha Chemical Ind Co Ltd
Priority date: 1976-07-07
Filing date: 1977-04-04
Publication date: 1982-02-26
Also published as: NL169197B; ZA773441B; IN144759B; NL7703371A; JPS536413A; BE853178A; DE2713536A1; ATA219377A; CA1072033A; PL197371A1; BG33008A3; YU76477A; DK145424B; AU497397B2; PH12619A; HU176828B; FR2361909A1; YU39796B; US4229570A; SU704431A3

Description

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

200 g trockene Myzelien (Feuchtigkeitsgehalt 9,9 %) von Corioius versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P Nr. 2414) aus einer künstlichen Kultur und 3 Liter Wasser wurden in einen mit Rührer ausgerüsteten Fünfliterkolben gegeben, die Mischung im siedenden Wasserbad gerührt und 3 Stunden unter diesen Bedingungen bei einer Innentemperatur von 95 ± 2°C gehalten. Dann wurde die Mischung abgekühlt und durch einen Büchner-Trichter abgesaugt, um das Pilzmaterial von der Behandlungslösung zu trennen. Dann wurden die restlichen Myzelien mit etwa 1 Liter Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Behandlungslösung vereinigt. Das Volumen der vereinigten Lösungen betrug etwa 3,5 Liter, der pH-Wert der Behandlungslösung 5,8. Das restliche Myzel wurde mit 2 Liter Wasser gemischt, dann einer ähnlichen, 2 Stunden dauernden Behandlung unterzogen und mit 1 Liter Wasser zur Gewinnung von 3 Liter Behandlungslösung gewaschen. Der entstandene Pilzrückstand wurde nochmals mit 2 Liter einer 0,1 n Natriumhydroxidlösung vermischt, in ähnlicher Weise 2 Stunden bei 95 ± 2°C behandelt, dann abgekühlt, mit 2 n Salzsäure neutralisiert und zur Trennung von Behandlungslösung und Pilzrückstand unter Sog filtriert. Nach der Trennung wurde der Rückstand mit etwa 500 ml Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Behandlungslösung vermischt, was 2,5 Liter Lösung ergab. Entsprechende Behandlungsgänge wurden unter Verwendung von 2 Liter 0,2 n, 0,3 n und 0,4 n Natriumhydroxidlösung sowie 0,5 Liter Waschwasser wiederholt, was in jedem Verfahrensgang etwa 2,5 Liter Behandlungslösung lieferte.

Diese sechs Behandlungsprodukte mit einem Gesamtvolumen von 16,5 Liter wurden vereinigt, in einem Vakuum-konzentrator (Rotationsverdampfer) bei 60°C auf 700 ml eingeengt und dann in einem Dialyseschlauch aus Cellulose (Visking Tube der Firma Union Carbide Corp.) in fliessen-dem Wasser bei 5°C während 72 Stunden dialysiert. Das erhaltene Dialysat wurde weiter konzentriert und gefriergetrocknet, was 60 g leberbraunes Pulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 7% (Ausbeute 31,1%) ergab. Die Elementaranalyse dieses Pulvers ergab folgende Werte: C 40,3%, H 6,2%, N 2,9%, O 50,6%. Das Molekulargewicht dieses Stoffes, gemessen durch Säulenchromatographie, betrug annähernd 10 000-250 000 und das Gewichtsmittel des Molekulargewichtes, gemessen durch Ultrazentrifugieren unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel, betrug 94 000. Der angegebene Sauerstoffgehalt entspricht dem durch Subtrahieren des gesamten Prozentgehaltes der anderen Elemente von 100 erhaltenen Wert.

Verschiedene, an diesem Pulver nach Auflösung in Wasser durchgeführte Farbreaktionstests lieferten die gleichen wie in Tabelle I angegebenen Resultate und es wurde bestätigt, dass dieser pulverige Stoffe ein stickstoffhaltiges Polysaccharid ist. Das Inhibitionsverhältnis dieses Stoffes gegen festen Sarcoma- 180-Tumor an Mäusen betrug bei intraperitonealer Verabreichung 90%, bei oraler Verabreichung 70%.

Die Antitumorwirkung dieses Stoffes wurde in üblicher Weise festgestellt, wie im folgenden kurz erläutert: Sarcoma--180 Tumorzellen wurden in die Magenhöhlung von Mäusen transplantiert, nach genügendem Wachstum während 7 Tagen 106 dieser Zellen unter die Haut im Achselbereich anderer Mäuse zur Bildung fester Tumoren transplantiert. Die

Verabreichung der erfindungsgemäss erhaltenen Substanz begann 24 Stunden nach der Transplantation. Bei intraperitonealer Verabreichung wurde die Substanz in einer Dosierung von 10 mg/kg einmal jeden zweiten Tag während insgesamt 20 Tagen bis zu einer Gesamtdosis von 0,2 ml/20 g (Mäusekörpergewicht) verabreicht. Bei oraler Verabrèichung wurde die Substanz in einer Dosierung von 1000 mg/kg einmal pro Tag während 20 Tagen bis zu einer Gesamtdosierung von 0,2 ml/20 g (Mäusekörpergewicht) verabreicht. • Die Tumoren wurden am 25. Tag nach dem Transplantieren ausgeschält und das Tumorwachstumsinhibierungsverhält-nis (%) wurde aus dem mittleren Tumorgewicht von Mäusen, die mit erfindungsgemäss erhaltener Substanz behandelt wurden, und dem mittleren Tumorgewicht der Kontrollmäuse berechnet.

Die Ergebnisse von zum Vergleich mit dem erfindungsgemässen Verfahren durchgeführten Behandlungsläufen unter Verwendung von Wasser allein als Lösungsmittel sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt. In diesen Versuchen wurden alle Behandlungs- und Waschschritte mit Wasser in gleicher Menge anstelle der oben beschriebenen Lösungsmittel durchgeführt. Die Behandlungslösung (gemischt mit Waschwasser) wurde nach jedem Behandlungsgang der Vakuumkonzentration, Dialyse, Abkühlung und Trocknung zur Bestimmung der Ausbeute unterzogen. Die Ergebnisse sind in. Tabelle II zusammengestellt. Aus dieser Tabelle ergibt sich, dass die Behandlungsausbeuten des zweiten und der folgenden Behandlungsgänge scharf abfallen und dass die Zielsubstanz bei wiederholten Behandlungsgängen nicht zu erhalten ist.

TABELLE II

Nr. des Behandlungs-ganges

Behandlungs--

lösung

(Liter)

Waschlösung (Liter)

Ausbeute an trockenem Pulver (Gew.-%)

1

3

1

7,0

2

0,5

2,1

3

2

0,5

0,8

4

2

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0,3

5

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0,5

0,1

6

2

0,5

0,1

Gesamt

13

3,5

10,4

Bemerkung: Myzel-Ausgangsmaterialmenge: 200 g

Behandlungstemperatur: 95 ± 2°C

Beispiel 2

Unter Verwendung der gleichen Anlage wie in Beispiel 1 wurden 200 g trockene Myzelien (Feuchtigkeitsgehalt 8,8%) von Corioius versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P Nr. 2414), der in einem Medium künstlich gezüchtet worden war, in der Folge mit jeweils 2 Liter 0,05 n, 0,1 n, 0,2 n und 0,4 n Natriumhydroxidlösungen behandelt. In jedem Behandlungsgang betrug die Behandlungstemperatur 90-95°C und die Behandlungsdauer 2 Stunden. Nach jedem Behandlungsgang wurde die Mischung abgekühlt, mit 2 n Salzsäurelösung neutralisiert und dann zur Abtrennung von Pilzrückstand und Behandlungslösung unter Sog filtriert. Der Rückstand wurde nach jedem Behandlungsgang mit 500 ml Wasser gewaschen und die Waschlösung mit der entsprechenden Behandlungslösung vermischt.

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Die in jedem Behandlungsgang erhaltene Behandlungslösung wurde in einem Vakuumkonzentrator dialysiert, konzentriert und in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 der Gefriertrocknung unterworfen, um ein leberbraunes Pulver zu liefern.

Die Ergebnisse der Versuche mit den Produkten der verschiedenen Behandlungsgänge sind in Tabelle III zusammengestellt.

TABELLE III

Nr. des Behandlungs-ganges

Natriumhydroxidkonzentration pH bei der Behandlung

Ausbeute an trockenem Pulver (Gew.-%)

1

0,5 n

9,0

10,1

2

0,1 n

11,5

3,5

3

0,2 n

12,5

6,8

4

0,4 n

13,0

6,6

Die Gesamtausbeute betrug 27 % und die Elementaranalyse jedes Produktes lieferte folgende Ergebnisse: C 41,0%, H 6,3%, N 7,3%, O 49,9%.

Die Durchführung der in Beispiel 1 beschriebenen Untersuchungen bestätigte, dass das oben erwähnte Pulver ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10 000-250 000 und einem Molekulargewichtsmittel von 100 000 ist. Das InhibierungsVerhältnis gegen festen Sarcoma-18-Tumor an Mäusen betrug 93% bei intraperitonealer Verabreichung und 73% bei oraler Verabreichung.

Zu Vergleichszwecken in bezug auf die Verfahrensausbeute wurden die gleichen Versuche wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 1 n und 0,4 n Natriumhydroxidlösung durchgeführt und die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt. Wie aus der Tabelle zu erkennen, fiel die Ausbeute bei Wiederholung der Behandlung unter Verwendung der Behandlungslösungen gleicher Konzentration ab und es erwies sich als sehr schwierig, eine hohe Ausbeute zu erzielen, wie sie beim Mehrgangbehandlungsverfahren gemäss der Erfindung erzielt werden kann.

TABELLE IV

Nr. des Behandlungs-ganges

Ausbeute (Gew.-%) an Zielprodukt bei Behandlung mit 1 n NaOH

Ausbeute (Gew.-%) an Zielprodukt bei Behandlung mit 0,4 n NaOH

1

10,5

13,8

2

2,4

2,9

3

1,1

2,0

4

0,5

1,5

Gesamt

14,5

20,2

Beispiel 3

Unter Verwendung der gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten Anlage wurden 200 g trockene Myzelien (Feuchtigkeitsgehalt 9,9 %) von Corioius versicolor (Fr.) Quél.

(FERM-P Nr. 2414) aus einer künstlichen Kultur in einem Medium zuerst mit 3 Liter Wasser bei 95 ± 2°C während 3 Stunden behandelt und dann nach dem Abkühlen zur Abtrennung des restlichen Myzels und der Behandlungslösung unter Sog filtriert. Das als Rückstand verbleibende Myzelmaterial wurde noch mit 1 Liter Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Behandlungslösung zu insgesamt 3,5 Liter Lösung vermischt.

Dann wurde das restliche Myzelmaterial mit 2 Liter 1 n Natriumhydroxidlösung zur Behandlung bei 90-95°C während 30 Minuten versetzt, dann abgekühlt, mit 2 n Salzsäure neutralisiert, unter Sog filtriert und mit 1 Liter Wasser gewaschen, was 3 Liter Behandlungslösung und Pilzrückstand ergab.

Alle erhaltenen Behandlungslösungen wurden vereinigt und wie in Beispiel 1 im Vakuum konzentriert, dialysiert, weiter konzentriert und der Gefriertrocknung unterworfen. Es wurden 33 g leberbraunes Pulver mit 7,0% Feuchtigkeitsgehalt (Ausbeute 21,0%) erhalten. Die Ergebnisse der Elementaranalyse dieses Pulvers ergaben folgende Zusammensetzung: C 41,7%, H 6,4%, N 3,9% und O 48,0%. Die in Beispiel 1 beschriebenen Tests bestätigten, dass es sich bei dieser Substanz um ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10 000-300 000 und einem Molekulargewichtsmittel von 98 000 handelte.

Das Inhibierungsverhältnis dieser Substanz gegen festen Sarcoma-180-Tumor an Mäusen betrug bei intraperitonaeler Verabreichung 94%, bei oraler Verabreichung 68%.

Beispiel 4

Unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Apparatur wurden 200 g trockene Fruchtkörper von in einem Medium künstlich gezüchtetem Corioius versicolor (Fr.)

Quél. (FERM-P Nr. 2414) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,7 % zuerst mit 2,4 Liter Wasser bei 95 ± 2°C 3 Stunden behandelt und das Produkt nach dem Abkühlen unter Sog zur Abtrennung des Rückstandes und der Behandlungslösung filtriert, worauf der Rückstand weiter mit 500 ml Wasser gewaschen und das Waschwasser mit der Behandlungslösung zu insgesamt 2,5 Liter Lösung gemischt wurde.

Der Rückstand wurde dann mit 2 Liter 0,4 n Natriumhydroxidlösung vermischt, 1 Stunde bei 90 ± 2°C behandelt, dann abgekühlt, mit 2 n Salzsäure neutralisiert, unter Sog filtriert und mit 500 ml Wasser zur Abtrennung von 2,5 Liter Behandlungslösung vom Rückstand filtriert. Die ähnliche Behandlungsoperation wurde mit 2 Liter 1 n Natriumhydroxidlösung bei 80 ± 2°C 1 Stunde zur Gewinnung von 2,5 Liter Behandlungslösung wiederholt.

Alle Behandlungslösungen wurden vereinigt und der Vakuumkonzentration, Dialyse, erneuten Konzentration und Gefriertrocknung wie in Beispiel 1 unterworfen, was 43,4 g eines leberbraunen Pulvers mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 7,5% ergab (Ausbeute 22%). Die Elementaranalyse dieses Pulvers ergab: C 42,3%, H 6,5%, N 2,2 % und O 49,0%. Die in Beispiel 1 beschriebenen Tests bestätigten, dass diese Substanz ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 10 000-300 000 und einem Molekulargewichtsmittel von 110 000 ist.

Das Inhibierungsverhältnis dieser Substanz gegen festen Sarcoma-180-Tumor an Mäusen betrug bei intraperitonealer Verabreichung 96%, bei oraler Verabreichung 75%.

Zum Zweck des Vergleiches der Behandlungsausbeuten wurde eine ähnliche Behandlung unter Verwendung von Wasser als einzigem Behandlungslösungsmittel durchgeführt. Die Ausbeute an Zielsubstanz betrug in diesem Fall nur 7,6%.

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V

Claims

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1. Verfahren zur Herstellung eines stickstoffhaltigen Polysaccharids mit Antitumoraktivität durch Züchten von Pilzen aus der Klasse der Basidiomyzeten und Behandeln des erhaltenen Pilzmaterials mit wässrigen Lösungsmitteln, dadurch gekennzeichnet, dass man Polyporaceae-Pilze der Gattung Corioius künstlich in einem Medium züchtet und das erhaltene Pilzmaterial zunächst mit Wasser oder einer verdünnten wässrigen alkalischen Lösung und dann schrittweise mit wässrigen alkalischen Lösungen mit graduell zunehmenden Konzentrationen behandelt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fruchtkörper und/oder Myzelien des Pilzes verwendet.

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PATENTANSPRÜCHE

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handlung eine nicht voraussehbare Wirkung auf die Gewinnung überraschend hoher Ausbeuten hat, und zwar im Vergleich zur wiederholten Behandlung unter Verwendung von reinem Wasser oder wässriger alkalischer Lösung mit gleichbleibender Konzentration.

Der Mechanismus, der solche hohen Behandlungseffekte des erfindungsgemässen Verfahrens ermöglicht, ist noch nicht vollständig bekannt, doch wird angenommen, dass ein solches Behandlungsverfahren nicht nur die Gewinnung löslicher Komponenten aus den Basidiomyzeten induziert, sondern auch eine leichte Zersetzung der Basidiomyzeten verursacht, was die Gewinnung löslicher aktiver Komponente verbessert. Es wird mit anderen Worten angenommen, dass das Ausgangsmaterial jedesmal einer Zersetzung unterworfen wird, wenn die Alkalikonzentration der für die Behandlung verwendeten alkalischen wässrigen Lösung erhöht wird, was eine wirksame Gewinnung des aktiven Prinzips ermöglicht.

Wenn die Behandlung dagegen von Anfang an unter Verwendung einer hochkonzentrierten wässrigen alkalischen Lösung ohne eine vorgängige Behandlung mit Wasser durchgeführt wird, ist die Produktausbeute im ersten Gang zwar relativ hoch, fällt aber im zweiten Behandlungsgang und in allen folgenden Behandlungsgängen scharf ab. Dies beruht wahrscheinlich auf folgenden Gründen: Die Fraktion (Zielkomponente), die normalerweise mit heissem Wasser oder einer verdünnten alkalischen wässrigen Lösung gewonnen werden sollte, unterliegt unter kräftigeren Bedingungen einer übermässigen Zersetzung, wodurch das Zielprodukt, nämlich hochmolekulares Polysaccharid, zu niedermolekularen Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als 5000 abgebaut wird. Das in der oben beschriebenen Weise nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Produkt kann in üblicher Weise unter Verwendung einer Mineralsäure, wie verdünnter Chlorwasserstoffsäure, neutralisiert und dann einer Reinigungsbehandlung unterzogen werden. Hierzu kann die bei jedem Behandlungsgang erhaltene Lösung der Reinigung unterzogen werden oder man kann die in den jeweiligen Gängen erhaltenen Lösungen miteinander vereinigen und dann gemeinsam reinigen.

Es können verschiedene Reinigungsmethoden angewendet werden, wie Ultrafiltration, Umkehrosmose, Gelfiltration, Aussalzen und Fällen unter Verwendung von organischem Lösungsmittel, und diese Methoden können einzeln oder gemeinsam angewendet werden. Durch eine solche Reinigung lässt sich ein bevorzugtes stickstoffhaltiges Polysaccharid mit Antitumoraktivität erhalten.

Die Elementaranalyse der erhaltenen stickstoffhaltigen Polysaccharide zeigt, dass diese in erster Linie aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff aufgebaut sind. Der Stickstoffgehalt des Produktes ändert sich in Abhängigkeit vom Stickstoffgehalt des Ausgangsmaterials, doch wurde festgestellt, dass gewöhnlich Produkte mit einem Stickstoffgehalt von über 2 Gew.-%, meist solche mit einem Stickstoffgehalt von 3-5 Gew.-%, erhalten werden können.

Verschiedene Farbreaktionstests mit dieser Substanz lieferten die in der folgenden Tabelle I zusammengestellten Ergebnisse.

TABELLE I

Farbreaktion

Farbe

Resultate a-Naphthol-Schwefel-

säure-Reaktion

(Molish-Reaktion)

purpur

Saccharide bestätigt

Indol-Schwefelsäure-

Reaktion

(Disch-Reaktion)

braun

Saccharide bestätigt

Anthron-Schwefel-säure-Reaktion gründlichblau

Saccharide bestätigt

Phenol-Schwefel-säure-Reaktion braun

Saccharide bestätigt

T ryptophan-Schwefel-säure-Reaktion purpurbraun

Saccharide bestätigt

Lowry-Folin-V erfahren blau

Peptidbindungen bestätigt

N inhy drin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure purpurblau a-Aminosäuren bestätigt

Die Ergebnisse dieser Farbreaktionstests bestätigen, dass das Endprodukt des erfindungsgemässen Verfahrens (Zielprodukt) ein stickstoffhaltiges Polysaccharid ist, das hauptsächlich peptidgebundenen Stickstoff enthält. Durch Säulenchromatographie wurde festgestellt, dass das Molekulargewicht der Zielsubstanz im Bereich von etwa 5000-300 000 liegt und dass das Gewichtsmittel des Molekulargewichtes, gemessen in der Ultrazentrifuge, im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt. Die niedermolekularen Fraktionen (mit Molekulargewichten von weniger als 5000), die bei der oben erwähnten Reinigungsbehandlung anfallen, erweisen sich in bezug auf Inhibitionseffekte gegen feste Sarcoma-180-Tu-moren von Mäusen nach intraperitonealer Verabreichung als praktisch unwirksam, sind bitter, haben einen unangenehmen Geruch und führen zu Nebenwirkungen. Man nimmt daher an, dass diese niedermolekularen Substanzen zum phar-makodynamischen Effekt der vorliegenden stickstoffhaltigen Polysaccharide, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten werden, nicht beitragen, sondern lediglich nachteilige Wirkungen auf die Zielsubstanz haben.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene stickstoffhaltige Polysaccharid zeigt Antitumoraktivität an Mäusen nicht nur bei intraperitonealer, sondern auch bei oraler Verabreichung. Dieses stickstoffhaltige Polysaccharid kann mit anderen Worten ein ausgezeichnetes Antitumormit-tel für orale Verabreichung bieten. Dieser Effekt wurde in verschiedenen Untersuchungen, wie im folgenden erläutert, bestätigt. Das stickstoffhaltige Polysaccharid ist aber nicht nur als orales Antitumormittel verwendbar, sondern erweist sich auch als wirksam für die Wiedergewinnung der Immunität des Patienten. Insbesondere ist dieser Stoff nicht nur zur Vermeidung von Nebenwirkungen bei der Chemotherapie von Krebs bzw. der Bekämpfung einer erhöhten Empfindlichkeit als Folge von Radiotherapiemethoden geeignet, sondern kann auch die Verminderung der Immunität oder Widerstandskraft von Patienten nach Operationen oder Bluttransfusionen zu vermeiden helfen und infektiöse Krankheiten, die durch Viren oder Bakterien als Folge verminderter Immunität oder Schwächung der Widerstandskraft verursacht sind, bekämpfen oder vorbeugen. Das erfindungsge-mäss erhaltene stickstoffhaltige Polysaccharid bietet bei ora-

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3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Pilz Corioius versicolor (Fr.) Quél, gezüchtet wird.

4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung bei Temperaturen von

50-I00°C durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der wässrigen alkalischen Lösung sukzessive innerhalb des Bereiches von unter 2 n erhöht wird.

6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung drei- bis achtmal wiederholt wird.

7. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die gesamte Behandlungszeit 1-20 Stunden beträgt.

8. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrigen alkalischen Lösungen Natrium-hydroxidlösungen sind.

9. Nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 hergestelltes stickstoffhaltiges Polysaccharid mit Antitumoraktivität.

Es ist bekannt, dass ein Polysaccharid mit Antitumoraktivität dadurch erhalten werden kann, dass das Produkt der Behandlung von Basidiomyzeten mit wässrigem Lösungsmittel einer Reinigung unterzogen wird. Dieses Verfahren hat jedoch einen schwerwiegenden Nachteil, indem die Behandlungseffizienz in bezug auf die aktive Komponente gering ist, was zu erheblichem Verlust an wertvoller Antitumor-substanz führt. Dementsprechend hat dieses Verfahren wenig praktischen Wert, insbesondere vom Gesichtspunkt der technischen Herstellung von Antitumorsubstanz aus Pilzen.

Das Verfahren gemäss der Erfindung ist gekennzeichnet durch die im Patentanspruch 1 genannten Merkmale und ermöglicht eine vorteilhafte Gewinnung von Antitumorsubstanz. die verschiedene pharmakodynamische Effekte bietet. Die erhaltene Antitumorsubstanz wird im folgenden auch als stickstoffhaltiges Polysaccharid bezeichnet.

Pilze der Gattung Corioius, die künstlich in einem Medium gezüchtet und dann der weiteren Behandlung unterzogen werden, sind eine bekannte Gattung der Familie Poly-poraceae aus der Klasse der Basidiomyzeten und umfassen beispielsweise die folgenden: Corioius versicolor (Fr.) Quél., Corioius hirsutus (Fr.) Quél., Corioius consors (Berk.) Imaz., Corioius conchifer (Schw.) Pat., Corioius pubescens (Fr.) Quéi., Corioius pargamenus (Fr.) Pat. und Corioius biformis (Klotz.) Pat. (siehe «Colored Illustrations of Fungi of Japan» von Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo, Band I, 1974, und Band II, 1975). Corioius versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P Nr. 2414), Corioius consors (Berk.) Imaz. (FERM-P Nr. 988), Corioius hirsutus (Fr.) Quél. (FERM-P Nr. 2711) und Corioius pargamenus (Fr.) Pat. (FERM-P Nr. 2712) sind im Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology (Chiba-shi, Japan), einer vom General- ' direktor des japanischen Patentamtes bezeichneten Regie-5 rungsstelle hinterlegt.

Als künstlich in einem Medium gezüchtete Pilze der Gattung Corioius können die Fruchtkörper und/oder Myzelien der oben genannten Pilzarten verwendet werden. Die Myzelien aus künstlichen Kulturen von Corioius versicolor (Fr.) io Quél, werden besonders bevorzugt.

Zur Gewinnung des. gewünschten stickstoffhaltigen Polysaccharids aus den künstlich gezüchteten Basidiomyzeten wird das Pilzmaterial mehreren Behandfungsgängen (Mehrstuf enbehandlung) unterworfen, d. h. das Ausgangsmaterial 15 wird zunächst unter Verwendung von Wasser oder einem wässrigen Lösungsmittel behandelt, das eine geringe Menge an Alkali enthält (eine verdünnte alkalische Lösung), und dann in mehreren Stufen unter Verwendung wässriger Lösungen mit graduell zunehmenden Alkalikonzentrationen wei-2o ter behandelt. Im Laufe dieses Verfahrens kann die Behandlung unter Verwendung einer Behandlungslösung gleicher Konzentration wiederholt werden. Als wässriges Lösungsmittel, das eine geringe Menge Alkali enthält, wird eine wässrige Lösung verstanden, in welcher der pH-Wert der wässrigen 25 Phase nach Mischung mit dem Pilz um etwa 7 liegt oder geringer ist. Diese spezifische Definition beruht auf der Tatsache, dass bei Verwendung von reinem Wasser oder einer • Natriumhydroxidlösung mit einer Konzentration; von etwa 0,01 n zur Vermischung mit dem Pilz der pH-Wert einer 30 solchen Lösung wegen der dem Pilz eigenen Pufferwirkung im Bereich von etwa 4-7 bleibt.

In bezug auf die wässrigen alkalischen Lösungen, die beim erfindungsgemässen Verfahren in graduell steigenden Konzentrationen verwendet werden, wird die Konzentration 35 dieser Lösungen vorzugsweise so eingestellt, dass die Maxi- . malkonzentration im Bereich von 2n oder niedriger liegt. Dies ist durch die Tatsache bedingt, dass eine Zersetzung der aktiven Komponente eintreten könnte, wenn die Behandlung bei einer Konzentration erfolgt, die höher als der oben erwähn-40 te Wert liegt. Das für die Behandlung der Basidiomyzeten nach dem erfindungsgemässen Verfahren verwendete wässrige Lösungsmittel wird vorzugsweise in jedem Behandlungsgang in Mengen entsprechend dem Fünf- bis Zweihundertfachen des Gewichtes des Ausgangsmaterials (bezogen auf 45 Trockengewicht) verwendet, und meist wird diese Behandlung bei 50-1 Ö0°C während 20 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt. Behandlungstemperaturen von Unter 50°C können zu einer schlechten BehandlungsWirkung bzw. Effizienz führen, während Behandlungstemperaturen von über 100°C zu einer 50 Verschlechterung des Endproduktes führen könnten. Die Zahl der BehandlüngSgänge beträgt gewöhnlich zwei bis zehn, vorzugsweise drei bis etwa acht. Zur Vermeidung einer Zersetzung der aktiven Komponente wird bevorzugt, dass die gesamte Erhitzungsdauer unter den oben angegebenen 55 Temperaturen weniger als 20 Stunden beträgt, und zwar unabhängig von der Zahl der Behandlungsgänge. Es empfiehlt sich auch, däss die gesamte Erwarmungsdaüer nicht weniger als 1 Stunde beträgt, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Das für das erfindungsgemässe Verfahren verwen-60 dete Alkali kann Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Cal-ciumhydroxid öder Ammoniak sein, wobei die Verwendung von Natriumhydroxid allgemein zweckmässig ist

Die oben erwähnte mehrstufige Behandlung unter Verwendung der wässrigen alkalischen Lösungen mit zunehmend 65 höheren Konzentrationen bietet eine bessere Ausbeute an Endprodukt, als mit konventionellen Methoden erzielbar ist, und ist daher für die technische Produktion von grosser Bedeutung, Dies bedeutet, dass eine solche mehrstufige Be

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1er Verabreichung auch eine hervorragende Wirkung in bezug auf Verbesserung der Leberfunktion, der Appetitzunahme, der Behebung von Darmstörungen und die Förderung des Harnabganges. Die Zielsubstanz erweist sich auch als wirksam zur Behandlung der Lepra.