DE2713458C2

DE2713458C2 - Verfahren zur Gewinnung von stickstoffhaltigen Polysacchariden

Info

Publication number: DE2713458C2
Application number: DE2713458A
Authority: DE
Inventors: Takayoshi Tokyo Fujii; Fumio Tokyo Hirose; Yoshio Tanashi Tokyo Ohmura; Eiichi Kawaguchi Saitama Takahashi; Saburo Tokyo Ueno; Toshihiko Tochigi Wada; Chikao Kunitachi Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1976-07-07
Filing date: 1977-03-26
Publication date: 1984-03-15
Also published as: DE2713458A1; DK151877A; PL197374A1; FR2361910A1; YU39795B; DE2759978C2; AU497455B2; IT1075700B; BE852987A; PH12242A; JPS5614274B2; ZA773442B; CH628649A5; US4202969A; CA1072034A; AT360145B; NL7703434A; NL169616B; NL169616C; AU2416777A

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Coriolus versicolor (Fr.) Quel verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekcnnzeiciuiei, daß man als wäßrige alkalische Lösung eine Nairiumhydroxidlösung verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion bei 80 bis 98° C durchführt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von stickstoffhaltigen Polysacchariden mit Antilumoraklivjtät und anderen ausgezeichneten pharmakodynamischen Eigenschaften aus einem Pilz der Gattung Coriolus der Familie der Basldlomyceien gemäß Anspruch 1. Die Ansprüche 2 bis 4 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Es ist bekannt, daß ein Polysaccharid mit Antitumorwirkung hergestellt werden kann durch Raffinieren des mit einem wäßrigen Lösungsmittel erhaltenen Extrakts von Basidiomycetcn. Dieses bekannte Verfahren hat jedoch einen schwerwiegenden Nachteil, da die Extraktionseffektivität bezüglich der aktiven Komponenten gering ist und deshalb die praktische Anwendbarkeit dieses Verfahrens zur industriellen Produktion von Antitumorsubslanzen ebenfalls gering ist. Das Raffinieren des Extraktes erfolgt durch Aussalzen mit Ammonlumsulfat, Dialyse, Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel oder Gelfiltration, aber diese Raffinlerungsmittel sind hinsichtlich Ihrer Handhabbarkeit ziemlich ungeeignet und deshalb Ist ein solches Verfahren zur Entfernung der niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht "on weniger als 5000 aus dem Extrakt nicht geeignet. Die niedermolekularen Substanzen besitzen fast keine Hemmwirkung gegen feste Sarcorr.a-180-Tumore in Mäusen bei inlraperitonealcr Verabreichung, schmekken bitter und haben einen unangenehmen Geruch, so daß das Vorhandensein solcher Substanzen bei Verwendung von Polysacchariden als Medikamente unerwünscht lsi,

Es wurde nun gefunden, daß ein stickstoffhaltiges Polysaccharid mit Antltumorwlrkung und verschiedenen anderen pharmakodynamischen Wirkungen in hoher Ausbeute erhalten werden kann, wenn ein zur Klasse Basidiomycetes, Familie Polyporaceae Gattung Coriolus gehörender Pilz In der Im Anspruch I näher bezeichneten Weise mit einer wäßrigen alkalischen Losung, die eine bestimmte Basizltäl aufweist, extrahiert wird und der

erhaltene Extrakt mittels Ultrafiltration und/oder Hyperfiltration raffiniert wird.

Der als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete zur Gattung Coriolus gehörende Pilz ist eine bekannte Pilzspezies und gehört zu den Polyporaceae der Klasse der Basidiomycetes. Zu diesen Spezien gehören beispielsweise Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Coriolus hirsutus (Fr.) Quel., Coriolus consors (Berk.) lmaz., Coriolus conchifer (Schw.) Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quel., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. und Coriolus biformis (Klotz.) Pat. (siehe »Coloured Illustrations of Fungi of Japan« von Rokuya Imazeki und Tsuguo Hongo, Band 1, 1974, und Band II, 1975). Die Pilze Coriolus versicolor (Fr.) Quel. ATCC 20 545, Coriolus consors (Berk.) lmaz. ATCC 20 565, Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. ATCC 20 561 und Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. ATCC 20 562 sind im Fermentai'i.i Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Chiba-shi, Japan) hinterlegt. Der Ausdruck »zur Gattung Coriolus gehörender Pilz« bezieht sich auf den Früciiikörper und/ouef das Mycci des riucs. Besonders bevorzugt für die erfindungsgemäße Verwendung Ist das Mycel, das von einer künstlichen Kultur des Coriolus versicolor (Fr.) Quel. erhalten wird.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird der Pilz in der ersten Verfahrensslufe mit einer wäßrigen, 0,01 bis 2 η alkalischen Lösung extrahiert und dann wird In der zweiten Verfahrensstufe der erhaltene und neutralisierte Extrakt der Ultrafiltration und/oder der Hyperfiltration unterworfen, um die niedermolekularen Komponenten mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt zu entfernen.

Die Konzentration der alkalischen Lösung bei der erfindungsgemäßen Extraktion der Basidiomycetes liegt im Bereich von 0,01 bis 2 n, weil bei einer geringeren Konzentration als 0,01 η das Ergebnis kaum anders ist als bei einer Extraktion mit Wasser, während bei Konzentrationen von über 2 η eine Zersetzung eintreten könnte. Die Extraktion der Basldlomyceics kann zufrledenstellend durchgeführt werden. Indem man 20 bis 600 Minuten lang bei einer Temperatur von 50 bis 100° C und vorzugsweise 80 bis 98° C mit einer alkalischen Lösung der obigen Konzentration extrahiert. Es sei darauf hingewiesen, daß bei Extraktionstemperaturen von weniger als 50° C die Extraktion der aktiven Komponente unzureichend ist, während Extraktionen bei über 100° C zu einer Verringerung der Aktivität der erhaltenen aktiven Komponente aufgrund der Wärmeeinwirkung führen können. Die bevorzugte Extraktionszeit hang- jeweils von der Konzentration und der Temperatur der verwendeten alkäischen Lösung ab. Gewöhnlich wird es jedoch bevorzugt, bei einer 'm oben angegebenen Bereich liegenden Temperatur zu arbeiten und dementsprechend 20 bis 600 Minuten lang zu extrahieren. Es ist möglich, ein befrledigendes Ergebnis durch eine einzige Extraktion zu erzielen, aber falls gewünscht kann die Extraktion auch mehrere Male wiederholt werden.

Für die alkalische Lösung können verschiedene alkalische Materialien wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammonium- oder Calciumhydroxid verwendet werden. Vorzugswelse werden Natriumhydroxid oder Kallumhydroxld eingesetzt.

Der auf die oben beschriebene Welse erhaltene flüssige Extrakt wird in gewöhnlicher Welse mit einer Mlneralsaure, wie verdünnter Salzsäure, neutralisiert und dann zur Entfernung der niedermolekularen Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als 5000 einer Ultrafiltration unterworfen. Die bisherige Praxis war, den

Extrakt durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Dialyse, Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel oder Gelfiltration zu raffinieren, aber diese Raffinierungsmethoden sind äußerst schlecht durchführbar und so war das Raffinierungsproblem bisher nicht zufriedenstellend gelöst. Die Wirkung aller genannten Raffinierungsmethodcn wurde hinsichtlich der pharmakodynamischen Wirkung des raffinierten Produkts untersucht und es wurde gefunden, daß die Lösung des Raffinierungsproblems darauf hinausläuft, daß die niedermolekularen Substanzen aus dem Extrakt zu entfernen sind. Die Erreichung dieses Zieles sowie die Verwendung eines besser durchführbaren Verfahrens gelang, indem ein sehr wirksames Verfahren zum Entfernen niedermolekularer Substanzen mit Molekulargewichten von weniger als 5000 entwickelt wurde, bei dem die Ultrafiltratlons- und/oder Hyperfiltralionstechnik angewendet wird.

Das hervorstechende Merkmal der erfindungsgemäßen Rafftnierungsmitt'- ist, daß die Substanzen nach ihrem Molekulargewicht fraktioniert werden, indem eine Membran, die als eine Art Molekularsieb bezeichnet werden kann, unter Druck verwendet wird. Beim Fraktionieren mittels einer solchen Membran bestimmen sich die Molekulargewichte gewöhnlich nach der Art der verwendeten Membran, da aber die Fraktionierwirkung hauptsächlich vom Molekulargewicht und der Konfiguration der Moleküle in der Lösung abhängt, sind die In den Katalogen kommerzieller Membranhersteller angegebenen Molckulargcwichtsfraktionen und die üblicherweise verwendbaren Arbeitsbedingungen nicht immer für das erfindungsgemäße Raffinieren des erfindungsgemäß erhaltenen Extraktes anweneoar. Sc wurde festgestellt, daß eine Membran für den Molekulargewlchtsfraktlonsbercich von 5000 bis 15 000 und ti .1 einer 98 bis lOOi.igen Undurchlässigkeit für Cytochrom C (Molekulargewicht 13 000) als Standardmaterial zur Verwendung beim crfindungsgcmäßen Verfahren empfehlenswert ist. Die Arbeitsbedingungen bei Verwendung der oben genannten Membran hängen zu einem gewissen Ausmaß von der Größe und Form der verwendeten Vorrichtung, dem Extraktdurchsatz und anderen Faktoren ab, aber im Fall der Ultrafiltration wird gewöhnlich unter einem Druck von 0,5 bis 5 bar, vorzugsweise 1 bis 4 bar und

Tabelle 1 (Farbreaktionentests)

einer Temperatur von gewöhnlich 5 bis 70° C gearbeitet, wenngleich die Temperatur je nach verwendeter Membran schwanken kann. Im Falle der Hyperfiltration wird gewöhnlich bei einem Druck von 20 bis 35 bar, vorzugs-

-. weise 20 bis 25 bar und einer Temperatur von 5 bis 20" C gearbeitet.

Im allgemeinen wird davon ausgegangen, daß die Ultrafiltration geeignet ist zum Fraktionieren von Material mit einem Molekulargewicht von über 10 000, wäh-

i" rend die Hyperfiltration (= Umkehrosmose) zum Fraktionieren von Material mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000 geeignet ist. Ein Fraktionierwert von 5000, der beim erfindungsg^mäßen Verfahren angestrebt wrd, liegt zwischen den für die oben genannten Verfah-

i", ren empfohlenen Bereichen, aber es konnte gezeigt werden, daß beide Verfahren durch geeignete Wahl der Membran zur Abtrennung von Material mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 geeignet sind. So können zum Raffinieren des beim erfindungsgemäßen Ver-

2CI fahren erhaltenen Extrakts die Ultrafiltration und die Hyperfiltration entweder allein oder in Kombination verwendet werden, wobei die jeweilige Auswahl unter Berücksichtigung der Durchführbarkeit und der Effektivität erfolgt.

->■> Der Extrakt, aus dem die niedermolekularen Substanzen mit Molekulargew "-chten von weniger als 5000 nach den obigen Raffinationsverfahren entfernt worden sind, wird, wie üblich, sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet und dann zu kommerziellen Produkten verarbeitet.

in Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Substanz ist leberbraun und hat einen Stickstoffgehalt von 2 bis &% und in vielen Fällen von 3 bis b%. Die Substanz zeigt keinen bestimmten Schmelzpunkt, wird allmählich schwarz und zersetzt sich bei einer Temperatur

»5 von mehr «ils etwa 120° C. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Substanz ist löslich in Wasser, aber nahezu unlöslich in Alkohol, Pyridin, Chloroform, Benzol und Hexan. Sie ist fernpr geschmack- und geruchlos.

■»ο Die Ergebnisse verschiedener mit der nach dem erfindungsgemäüen Verfahren erhaltenen Substanz durchgeführter Farbreaklionen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Farbe Ergebnisse

a-Naphthol-Schwefelsäurereaktion	purpur
(Moliscb-Reaktion)
Indol-Schwefelsäurereaktion	braun
(Disch-Reaktion)
Anthron-Schwefelsäurereaktion	grünlich-blau
Phenol-Schwefelsäurereaktion	braun
Tryptophan-Schwefelsäurereaktion	purpur-braun
Lowry-Folin-Verfahren	blau
Ninhydfin-Reaktion nach Hydrolyse	grünlich-blau
mit Salzsäure

Die Ergebnisse der Tabelle 1 zeigen, daß die erfindungsgemäß erhaltene Substanz ein stickstoffhaltiges Polysaccharld Ist. Das Molekulargewicht dieser Substanz, gemessen durch Ultrazcntrlfugatlon, liegt bei 5000 bis 300 000 und das mittlere Molekulargewicht zwischen 10 000 und 100 000. Auch nach anderen Meßverfahren, Saccharide nachgewiesen
Saccharide nachgewiesen

Saccharide nachgewiesen
Saccharide nachgewiesen
Saccharide nachgewiesen
Peptidbindungen nachgewiesen
α-Aminosäuren nachgewiesen

wie durch Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran, ergaben sich Werte von 10 000 bis 100 000. Deshalb kann mit großer Zuverlässigkeit angenommen werden, daß das mittlere Molekulargewicht der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz Im Bereich von 10 000 bis 100 000 liegt.
Das erfindungsgemäß erhaltene stickstoffhaltige Poly-

saccharid zeigte nicht nur eine hohe Antitumoraktlvltät mit hoher Hemmwirkung gegen festen Sarcoma-180-Krebs In Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung, sondern erwies sich auch bei oraler Verabreichung als wirksam. Dies zeigt die gute Eignung des erfindungsgemäß erhaltenen stickstoffhaltigen Polysaccharide als orales Antltumormittel, an und In der Tat bestätigte sich die genannte Wirkung In einer Vielzahl von Experimenten. Die Nützlichkeit der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz beschränkt sich nicht nur auf die Eignung als orales Antltumormittel sondern zeigt auch eine hohe Immunität-Rekonvaleszenz-Aktivität beim Patienten. Das heißt, sie ist nicht nur wirksam zur Verhinderung von Nebenwirkungen bei der Chemotherapie von Krebs oder einer Steigerung der Empfindlichkeit bei der Radiotherapie, sondern auch zur Verhinderung der Verringerung der Immunität und der physischen Stärke des Patienten nach einer Operation oder einer Bluttransfusion und zur Vorsorge oder zum Schutz gegen Infektionskrankheiten durch Viren öder Bakterien aufgrund der Abnahme der Immunität oder der physischen Stärke. Di- orale Verabreichung der erfindungsgemäß erhaltenen Substanz ergab außerdem eine ausgezeichnete Wirkung hinsichtlich der Verbesserung der Leberfunktlors, der Zunahme des Appetits, der Beseitigung von Darmstörungen und der Förderung der Harnabgabe. Ferner ist die erfindungsgemäß erhaltene Substanz auch wirksam bei der Behandlung von Lepra.

Wie oben beschrieben, Ist es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, ein stickstoffhaltiges Polysaccharid zu erhalten, das nicht nur bei Intraperitonea'ier Verabreichung, sondern auch bei oraler Verabreichung sowohl eine ausgezeichnete Antitumoraktivltät als auch andere pharmakodynamlsche Wirkungen wie die oben genannten zeigt, wobei eine verhältnismäßig einfache Arbeitswelse angewendet wird, und, wie die folgenden Beispiele zeigen, hohe Ausbeuten erreicht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist also geeignet zur Industriellen herstellung eines Antltumormlttels aus Basidiomycetes.

Beispiel 1

200 g trockene Mycellen von Coriolus verslcolor (Fr). Quel. ATCC 20 545 (Feuchtigkeitsgehalt: 8,8%; Bruttostlckstoffgehalt: 2,5*) wurden zu 4 Litern 0,1 η NaOH-Lösung gegeben und unter Durchmischen in einem siedenden Wasserbad bei einer Innentemperatur von 90 bis 95° C eine Stunde lang extrahiert. Dann wurde die Mischung auf unter 50* C abgekühlt und schrittweise mit 1 η HCI zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 versetzt. Die Feststoffe wurden abgenutscht und mit 500 ecm Wasser gewaschen. Insgesamt wurden 4,2 Liter flüssiger Extrakt erhalten. Dieser flüssige Extrakt wurde dann der Ultrafiltration unterworfen. Unter Durchmischen und Kühlen und bei einem Druck von 1,5 bar sowie einer Temperatur von 10° C wurden die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als abgetrennt. Anschließend wurde die Lösung konzentriert, so daß 300 cm¹ verarbeitete Lösung erhalten wurden. Diese Lösung wurde gefriergetrocknet und es wurden etwa 26,6 g leberbraunes Pulver (Ausbeute: 13,5%) erhalten. Dieses Pulver hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,5% und die Elementaranalyse ergab folgende Zusammensetzung: C : 40,5%; H : 6,2%; N : 5,8%; O : 47,5:6. (Der Prozentsatz für Sauerstoff wurde erhalten durch Abziehen der Suvnme der Prozentsätze der anderen Elemente von 100.) Die erhaltene Substanz war leicht löslich In Wasser. Sie ZPlgte ein Inhibitionsverhältnis von 90% gegen festen Sarcoma-180-Tumor in Mäusen bei intraperitonealer Verabreichung und 65% bei oraler Verabreichung.

Die Antitumorwirkung des erfindungsgemäß erhaltenen Produktes wurde nach einer herkömmlichen Methode bestimmt, die im folgenden kurz beschrieben wird.

Sarcoma-180-Tumorzellen wurden in die Bauchhöhlen von Mäusen transplantiert. Nachdem die Zellen sieben

to Tage lang ausreichend gewachsen waren, wurden 1O⁶ dieser Zellen weiter unter die Haut der Achselhöhle anderer Mäuse zur Bildung fester Tumore transplantiert. Die Verabreichung des zu testenden Produkts begann 24 Stunden nach der Transplantation. Bei intraperitonealer Verabreichung wurden 20 Tage lang jeden zweiten Tag 10 mg/kg entsprechend einer jeweiligen Gesamtdosis von 0.2 mg in 0,2 ml bei einer 20 g schwären Maus verabreicht. Bei oraler Verabreichung wurde das erhaltene Produkt in Dosen von 1000 mg/kg je Verabreichung 20 Tage lang täglich verabreicht, was einer jeweiligen Gesamtdosis von 20 mg in 0.2 ml bei einer 20 g schweren Maus entsprach. Am 25. Tag nach erfolgter Transplantation wurden die Tumore herausgenommen und ujs Inhibitionsverhältnis bezüglich des Tumorwachstums wurde aus dem mittleren Tumorgewicht bei den behandelten Mäusen und dem mittleren Tumorgewicht bei nicht behandelten Kontrollmäusen berechnet.

Für Vergleichszwecke wurde die Extraktion und die Raffinationsbehandlung unter den gleichen Bedingungen wie beim erfindungsgemäßen Verfahren, aber unter Verwendung von Wasser anstelle von 4 Litern 0,1 η NaOH-Lösung durchgeführt. Die Produktausbeute betrug 7,8% oder etwa 60% der Ausbeute beim erfindungsgemäßen Verfahren.

Beispiel 2

500 g lebende Mycellen von Coriolus vers'color (Fr.) Quel. ATCC 20 545 (Feuchtigkeitsgehalt: 70,8%; Bruttostickstoffgehalt: 2,6% berechnet auf Trockenbasis) wur-.'.3η zu 2 Litern Wasser gegeben und 10 bis 20 Minuten lang mit einem Saftmischer gemahlen. Dann wurde die Mischung allmählich mit 500 ecm In NaOH-Lösung versetzt und in einem heißen Wasserbad zwei Stunden bei 90 bis 95° C extrahiert. Anschließend wurde mit HCl neutralisiert und dann gewaschen. Die Abtrennung der Zellen erfolgte gemäß der Verfahrenswelse von Beispiel 1. Der erhaltene Extrakt wurde der Ultrafiltration unterworfen. Nach Abtrennung der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 wurde die Lösung konzentriert und gefriergetrocknet. Es wurden 24,2 g leberbraunes Pulver (Ausbeute: 15,1%) erhalten. Dl"KS Pulver besaß einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,6% und einen Bruttostlckstoffgehalt von 6% sowie einen unlöslichen Teil von etwa 20%, wenn es in Wasser gelöst wurde. Der restliche Teil war In Wasser gut löslich. (ElementaranalyseC: 41,2%; H: 6,1%; N : 6,0%; 0:46,7%; Sauerstoffgehalt durch Ergänzung auf 100.) Dieses FuI-ver wurde aufgelöst und nach Entfernen des Unlöslichen mittels eines Filterpapiers wurde die Hemmwirkung gegenüber festem Sarcoma-180-Tumor Iv. Mäusen geprüft. Das Produkt zeigte ein Inhibitionsverhältnis von 93% bei Intraperitonealer Verabreichung und 70% bei oraler Verabreichung.

Beispiel 3

2 kg trockene Zellen von Coriolus verslcolor (Fr.) Quel. ATCC 20 545 (Feuchtigkeitsgehalt: 8,0%, Bruttostlckstoffgehalt: 2,5%) wurden zu 20 Litern 0,4 η NaOH-

Lösung gegeben und In einem mit einem Helz-/Kühl-Mantcl und einem Rührer ausgestatteten Extraktionskessel unter Durchmischen einer zweistündigen Extraktion unterworfen, wobei die Temperatur des Heiz-/Kühi-Mantels so eingestellt wurde, daß die Innentemperatur 90 bis 95° C betrug. Die extrahierte Aufschlämmung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 durch portionsweise Zugabe von 2 η HCI unter Rühren wurden die festen Rückstande durch Zentrifugieren vom flüssigen Extrakt abgetrennt. Die festen Rückstände wurden mit 20 Litern 0,4 η NaOH-Lösung vermischt und zwei Stunden einer nochmaligen Extraktlonsbchandlung bei 90 bis 95° C unterworfen. Anschließend wurde wiederum gekühlt, neutralisiert und die Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, um einen flüssigen Extrakt und feste Rückstände zu erhallen. Die letzteren wurden wiederum eine Stunde lang einer ExirakiiuMsbciiuiiuiuiig, wie uucm ucSCnficucn, mit 0,4 η NaOH-Lösung unterworfen, um einen Extrakt zu erhalten.

Diese dreimal wiederholte Extraktion ergab Insgesamt etwa 58 Liter flüssigen Extrakt. Dieser flüssige Extrakt wurde mittels eines Vakuumkonzenlralors auf etwa 10 Liter konzentriert und dann der Ultrafiltration unterworfen. Die Ultrafiltration erfolgte bei 10" C und unter einem Druck von 2,11 bar, um die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 zu entfernen. Anschließend wurde nochmals konzentriert, so daß etwa 5 Liter verarbeitete Lösung erhalten wurden. Außerdem wurden etwa 70 Liter verarbeiteter Lösung, die die niedermolekularen Substanzen enthielten und bei der Ultrafiltration angefallen waren, einer Hyperfiltration unterworfen, um die niedermolekularen Substanzen zu entfernen. Dann wurde wiederum konzentriert, so daß etwa 5 Liter verarbeitete Lösung erhalten wurdsri. Die Arbeitsbedingungen bsi dieser 5eK3nd!un° waren wie folgt: mittlerer Druck: 25 bis 30 bar; Behandlungstemperatur: etwa 10" C. Dann wurden die bei der Ultrafiltration und der Hyperfiltration erhaltenen Lösungen vereinigt und 10 Liter der vereinigten Lösung wurden durch Sprühtrocknen pulverisiert, wobei etwa 395 g leberbraunes Pulver (Ausbeute: 19,9%) erhalten wurden. Dieses Pulver besaß einen Feuchtigkeitsgehalt von 7% und seine Elementaranalyse ergab folgende Ergebnisse: C : 40,8%; H : 6,0%; N : 4,0%; O : 49,2%. Das Inhlbltlonsverhältnls dieses Produktes gegenüber festem Sarcoma-180-Tufnor in Mäusen betrug 92% bei Intraperitonealer Verabreichung und 70% bei oraler Verabreichung. Es war gut löslich in Wasser.

Beispiel 4 (nachgereicht)

200 g trockenes Mycel von Coriolus verslcolor (Fr.) Qu6l. ATCC 20 545 (Feuchtigkeitsgehalt: 8,8%, Brutto-

Tabelle

stickstoffgehalt: 2,5'Ί.) wurden zu 4 I 0,1 η NaOH-Lösung gegeben und unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95° C 1 Stunde extrahiert. Nach dem Kühlen der Mischung auf eine Temperatur unter 50° C wurde die Mischung mit wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf pH 7,0 eingestellt. Der feste Rückstand wurde abgesaugt und mit 500 ml Wasser gewaschen. Durch Vereinigung der Extraktionslösung und des Waschwassers erhielt man 4,21, die zur Entfernung der Substanzen mit einem

m Molekulargewicht von unter 5000 einer Umkehrosmose unterworfen wurden. Die Umkehrosmose wurde unter Kühlen und Rühren bei 30° C und einem Druck von 27 bar In einer Vorrichtung der Abcor Inc. mit einer AS-205 Membran durchgeführt. Der bei der Umkehrosmose

ι> erhaltene Rückstand wurde zu etwa 25,2 g leberbraunem Pulver (Ausbeute 12,8%) gefriergetrocknet. Dieses Produkt enthielt 7,4% Feuchtigkeit.

Eicmcniaranaiyse: C 40,7%; ii 6,3%; N 5,5%; O 47,5%. Das Produkt löste sich leicht In Wasser. Bei Intraperlto-

:o nealer Verabreichung hemmte es das Wachstum von festen Sarcoma-180-Tumorzellen, die In Mäuse Implantiert worden waren, zu 90% und bei oraler Verabreichung zu 65%.

Vergleichsversuch (nachgereicht)

Das für die Extraktion verwendete Mycel war vom Stamm AT.vC 20 545 von Coriolus verslcolor (Fr.) Quel. Die in jeder Testreihe erhaltenen Produkte zeigten nach der Reinigung die gleichen physikalisch-chemischen

JO Eigenschaften und die gleiche Antitumorwlrkung gegen den festen Tumor Sarcoma-180 und gegen den festen Ehrlich Tumor ICR-JCL.

In beiden Testreihen wurden fünf Versuche durchgeführt. In den zwei ersten Versuchen, Nr. 1 und 2, wurde eine Extraktion durchgeführt, wobei Im Versuch 1 Wasser und !m Versuch 2 eine 0,1 η Natriumhydroxid lösung verwendet wurde. In den Versuchen 3,4 und 5 wurde die gleiche Mycelprobe zweimal extrahiert, wobei man im Versuch 3 Wasser, Im Versuch 4 wäßrige 0,4 η und im Versuch 5 wäßrige 1 η Natriumhydroxidlösung verwendete. In den Versuchen, bei denen für die Extraktion wäßrige Natriumhydroxidlösung eingesetzt worden war, wurden die Extrakte mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, worauf In gleicher Welse gerel-

■»5 nlgt wurde. Die Extraktionstemperatur betrug 95° C und die Extraktionszelt jeweils 3 Stunden.

Die erhaltenen Ergebnisse sind In der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Sie zeigen, daß bei Verwendung einer alkalischen wäßrigen Lösung die Ausbeute an

so stickstoffhaltigem Polysaccharld wesentlich größer ist als bei Verwendung von Wasser und demonstrieren itimii die Überlegenheit des beanspruchten Verfahrens ..^"-:nüber dem der GB-PS 13 31 513.

	Versuch 1	Versuch2	Versuch 3	Versuch 4	*Ver jui 5**
Normalität der Natriumhydroxid- Lösung	0 (Wasser)	0,1	0 (Wasser)	0,4	1,0
Anzahl der Extraktionen	1	1	2	2	2
Ausbeute an Polysaccharide, bezogen auf das Mycelgewicht	1,5	2,4	2,0	44	4,7

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung von stickstoffhaltigen Polysacchariden aus Pilzen der Familie Polyporaceae der Gattung Coriolus, dadurch gekennzeichnet, daß man die Pilze

a) mit einer wäßrigen, 0,Oi η bis 2 η alkalischen Lösung bei 50 bis 100° C extrahiert,

b) den erhaltenen Extrakt neutralisiert und

c) zur Entfernung der Substanzen mit einem Molekulargewicht von unter 5000 bei einem Druck von 0,5 bis 5 bar einer Ultrafiltration durch eine Membran als Molekularsieb und/oder bei einem Druck von 20 bis 35 bar einer Hyperfiltration unterwirft.