CS219880B2 - Method of isolation of the polysaccharide - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu izolace polysacharidů s obsahem dusíku, vykazujících protinádorovou účinost a jiné vynikající farmakodynamické vlastnosti, z hub třídy Basidiomycetes, náležejících k rodu Coriolus.

Z britského patentního spisu č. 1 331 513 je známo, že při čištění extraktu z hub třídy Basidiomycetes je možno izolovat polysacharíd vykazující protinádorovou účinnost. Tento známý způsob však má vážný nedostatek spočívající v nízké účinnosti extrakce aktivní složky, v důsledku čehož je praktická upotřebitelnost této metody k produkci protinádorově účinné látky v průmyslovém měřítku velmi problematická. Při shora popsaném způsobu se k čištění extraktu používá vysolování pomocí síranu amonného, dialýza, srážení pomocí organického rozpouštědla nebo gelová filtrace, tyto čisticí metody jsou však velice málo účinné a nelze tedy výše zmíněný postup považovat za výhodný k odstraňování látek o ' nízké molekulové hmotnosti (látek o molekulové hmotnosti nižší než 5000], obsažených v extraktu. Tyto látky o nízké molekulové hmotnosti nemají při intraperitoneálním ·. podání myším prakticky žádnou inhibiční účinnost proti pevným nádorům Sarcoma-180, mimoto jsou hořké a nepříjemně páchnou, ' takže jejich přítomnost při použití polysacharidů jako léčiv je nežádoucí.

Nyní bylo zjištěno, že polysacharidy s obsahem dusíku, vykazující protinádorovou účinnost a různé jiné farmakodynamické účinky, je možno izolovat ve vysokém výtěžku tak, že se houba rodu Coriolus čeledi Polyporaceae třídy Basidiomycetes extrahuje vodným roztokem zásady o určité koncentraci a získaný extrakt se vyčistí ultrafiltrací nebo/a reversní osmózou.

Předmětem vynálezu je tedy výhodný způsob izolace polysacharidů s obsahem dusíku, vykazujících vynikající protinádorovou účinnost a různé jiné farmakodynamické účinky, z hub náležejících k rodu Coriolus třídy Basidiomycetes.

Výrazem „houba rodu Coriolus“, jež se používá jako výchozí materiál při práci způsobem podle vynálezu, se označují známé druhy hub náležejících k čeledi Polyporaceae a třídě Basidiomycetes. Mezi tyto druhy náležejí například Coriolus versicolor (Fr.) Quél., Coriolus hirsutus (Fr.) Quél., Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus conchifer (Schw.) Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quél., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. a Coriolus biformis (klotz.) Pat. [viz „Coloured Illustrations of Fungi of Japan“, Rokuya Imazeki a Tsuguo Hongo, sv. I (1974) a sv. II (1975)]. Z těchto hub jsou Coriolus versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P č. · 2414), Coriolus consors (Berk.) Imaz. (FERM-P č. 988), Coriolus hirsutus (Fr.) Quél. (FERM-P č. 2711) a Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. (FERM-P č. 2712) uloženy ve sbírce Fermentation Research Institute, Ageincy of Industrial Science and Technology (Chiba-shi,

Japonsko), což je vládní úřad jmenovaný generálním ředitelem japonského patentního úřadu. Výraz „houba rodu Coriolus“ se vztahuje na plodnice nebo/a mycelium houby. Pro účely vynálezu je nejvýhodnější mycelium získané z uměle vypěstované kultury Coriolus versicolor (Fr.) Quél.

Způsob podle vynálezu spočívá v extrahování mycelia · výše uvedené houby vodně alkalickým roztokem o koncentraci 0,01 N až 2 N s tím, že se získaný extrakt zpracuje dále ultracentrifugováním a/nebo reversní osmosou, aby se tím zbavil složek o nízké molekulové hmotnosti, obsažených v extraktu, přičemž se tím míní molekulová hmotnost do 5000.

koncentrace alkalického roztoku, použitého při extrakci Basidiomycet podle tohoto vynálezu, je definována rozmezím 0,01 N až 2 N z toho důvodu, že je-li koncentrace nižší než 0,01 N, · výsledky se příliš neliší od extrakce vodou, zatímco při použití alkalických roztoků o koncentraci nad 2 N může docházet k rozkladům. Výhodná extrakce Basidiomycet se může uspokojivě provádět za použití alkalického roztoku ve výše uvedeném rozmezí koncentrací za teploty 50 až 100 °C, s výhodou 80 až 98 °C po dobu 20 až 800 minut. Je třeba poznamenat, že pokud se extrakce provádí za teploty pod 50 °C, dochází k nedostačující extrakci aktivní složky, zatímco za extrakční teploty nad 100 °C může docházet k nežádoucímu snížení aktivity takto získané aktivní složky v důsledku nadměrného tepla. Výhodné rozmezí extrakční doby kolísá v závislosti na koncentraci a teplotě při použití alkalického roztoku, ale obvykle je výhodné pracovat za teploty ve výše uvedeném výhodném rozmezí po dobu 20 až 600 minut. Je možno dosáhnout uspokojivých výsledků použitím jednoho extrakčního postupu, ale je-li to žádoucí, extrakční postup se může opakovat několikrát.

Z alkalických materiálů se hodí různé látky, jako je hydroxid sodný nebo draselný, amoniak nebo hydroxid vápenatý, které se mohou použít pro přípravu alkalických roztoků podle tohoto vynálezu, a výhodným je použití hydroxidu sodného nebo draselného.

kapalný extrakt se neutralisuje běžnými postupy za použití minerální kyseliny, jako je zředěný roztok chlorovodíkové kyseliny, načež se dále zpracovává ultrafiltrací nebo reversní osmosou, aby se odstranily látky s nízkou molekulovou hmotností z extraktu, to jest látky o molekulové hmotnosti pod 5000. Stalo se běžnou praxí čistit podobné extrakty vysolením síranem amonným, dialysou, srážením organickým rozpouštědlem nebo gelovou filtrací, jak to zde již bylo uvedeno, ale účinnost těchto čisticích způsobů je velmi chabá, takže rozřešení tohoto problému je nutně žádoucí. Studovali jsme význam každého z čisticích postupů ve spojitosti s farmakodynamickými účinky čistě ného produktu a zjistili jsme, že podstata řešení tohoto problému spočívá v odstranění látek s nízkou molekulovou hmotností, obsažených v extraktu. A v souvislosti s dalším studiem účinnějšího postupu s vysokou možností použití při odstraňování takových látek o nízké molekulové hmotnosti jsme nalezli nejúčinnější postup odstraňování látek o nízké molekulové hmotnosti, totiž o molekulové hmotnosti do 5000, uzpůsobením postupů ultrafiltrace a/nebo reversní osmosy.

Zásadním význakem postupu čištění podle tohoto vynálezu je to, že látky se frakcionují v závislosti na molekulové hmotnosti za použití membrány, přičemž se může jednat o určitý druh molekulových sít, a to za tlaku. Při frakcionování membránou jsou hodnoty molekulových hmotností obvykle dány druhem použité membrány, ale protože účinnost írakcionování závisí značně na molekulové váze a konfiguraci molekul v roztoku, nejsou často hodnoty frakcionovaných molekulových vah, jak jsou zaznačeny v katalogu toho či onoho výrobce membrán, jakož i obvykle používané zevní podmínky použitelné pro čištění extraktů podle tohoto vynálezu. Z tohoto hlediska vzato bylo zjištěno, že membrána s označením 5 000 až 15 000 frakcionovaných molekulových hmotností a vyznačující se 98 až 100% inhibováním proti cytochromu c (molekulová hmotnost 13 000) jako standardu se může doporučit k použití při postupu podle tohoto vynálezu. Pokud se týká pracovních podmínek pro postup čištění podle tohoto vynálezu za použití výše uvedené membrány, pak na druhu použité membrány jsou závislé podmínky, jako je látkový průtok, závisející do jisté míry na velikosti a tvaru použitého zařízení, průtok e .traktu a další, ale v případě ultrafiltrace se takový postup obvykle provádí za tlaku 4,9.10¹ až 4,9 . . 105 p_a, _s výhodou 9,81.10⁴ až . 3,92 . 105 Pa, a za teploty obvykle 5 až 70 °C, ' ačkoliv teplota může značně kolísat v závislosti na druhu membrány.

V případě reversní osmosy se tlak použitý při postupu pohybuje obvykle v rozmezí . 1Ó3 až 3/13 . 10⁶ Pa, s výhodou 1,96 . . 105 až 2,45 . 105 Pa a teplota . se pohybuje obvykle v rozmezí 5 až 20 °C.

Obvykle se má za to, že ultrafiltrace se hodí pro frakcionování látek o molekulové váze nad 10 000, zatímco reversní osmosa je vhodná pro frakcionování materiálů o molekulové váze nižší než 1000. Frakcionační hodnota 5000, jež je klíčovým bodem tohoto vynálezu, je v rozmezí hodnot, doporučených . pro výše uvedené 2 postupy, ale bylo bezpečně zjištěno, že oba postupy se dají použít pro frakcionování materiálů o molekulové váze do 5000, a to volbou vhodné membrány. Takže při čištění extraktu za použití postupu podle tohoto vynálezu se může použít ultrafiltrace nebo reversní osmosa, a to kterýkoli postup sám jako takový, nebo kombinace obou těchto postupů, a volba záleží výlučně na možnostech zpracování a pracovní účinnosti. Frakce o molekulové váze do 5000, odstraněné z kapalného extraktu, se vyznačují takřka nulovou účinností se zřetelem na inhibiční efekt vůči pevným tumorům Sarcoma-180 u myší při intraperitoneálním podávání, a vyznačují se rovněž velmi hořkou a nepříjemnou chutí, takže se má za to, že přítomnost látek s tak nízkou molekulovou hmotností nemá v žádném případě positivní účinek, ale vyznačuje se přímo škodlivým působením na - farmakodynamický účinek konečného produktu podle tohoto vynálezu, tedy polysacharidu, obsahujícího dusík.

Extrakt, ze kterého byly odstraněny za použití výše zmíněného postupu čištění látky o nízkých molekulových hmotnostech, se suší rozstřikováním nebo - lyofilisováním, a dále se upravuje do formy obchodních přípravků.

Barva. látky, připravené postupem podle tohoto vynálezu, se dá označit jako jádrově hnědá, obsahuje 2 až 8 % dusíku, v četných případech 3 až 6 %. Nemá zřetelný bod - tání, postupně černá a rozkládá . se za teplot nad asi 120 “C. Pokud se týká - rozpustnosti látky podle tohoto vynálezu, pak se rozpouští ve vodě, ale je takřka nerozpustná v alkoholu, pyridinu, chloroformu, benzenu a hexanu. Je bez chuti a bez zápachu.

Výsledky různých barevných testů za použití sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou uvedeny v následující tabulce I.

TABULKA 1 (barevné reakční testy) barva výsledek α-naftol a kyselina sírová (Molischova reakce) indol a kyselina sírová (Discheova reakce) enthron a kyselina sírová fenol a kyselina sírová . tryptofan a kyselina sírová Lowry-Folin ninhydrinová reakce po hydrolýze kyselinou chlorovodíkovou

Z výsledků, uvedených ve výše zmíněné tabulce, je jasné, že sloučeninou podle tohoto vynálezu je polysacharid, obsahující dusík. Molekulová hmotnost sloučeniny podle tohoto vynálezu, měřená ultracentrifugou, je v rozmezí 5 000 až 300 000, a střední molekulová hmotnost kolísá od 10 000 až do 100 000. Při použití dalších postupů, jako je frakcionování za použití ultrafiltrační membrány, se rovněž docilují hodnoty 10 000 až 100 000. Takže lze s velkou spolehlivostí stanovit, že střední molekulová hmotnost podle tohoto vynálezu je v rozmezí 10 000 až 100 000.

Polysacharid, obsahující dusík, jak se získá postupem podle tohoto vynálezu se vyznačuje nejen velkou protinádorovou účinností, a to s vysokým inhibičním poměrem proti pevnému rakovinému bujení Sarcoma-180 u myší při intraperitoneálním podávání, ale ukázalo se, že látka je účinná při orálním podávání. To znamená, že polysacharid, obsahující dusík podle tohoto vynálezu, je velmi účinný jako orální protinádorové činidlo, a skutečně byl tento účinek potvrzen při četných pokusech. Použití látky podle tohoto vynálezu není omezeno na orální protinádorové léky; rovněž se zde ukazuje vysoká regenerační imunitní aktivita u napadeného. To znamená, že látka je nejen účinná při prevenci postranních reakcí při chemoterapii rakoviny nebo zvyšování citlivosti při použití radioterapeutik, ale vyznačuje se účinností při prevenci poklesu imunity a fyzické síly pacienta po operaci nebo krevní transfúzi, a kontrole nebo ochraně před infekčními onemocněními, způsobenými viry nebo bakteriemi v důsledku poklesu imunity nebo fyzické odolnosti. Orální podávání sloučeniny podle tohoto vynálezu rovněž znamená vynikající účinek při zlepšení funkce jater, zvyšování chuti k jídlu, úpravě potíží zažívacího traktu a podporování močení. Látka se rovněž vyznačuje účinností při léčbě leprosy.

Jak je to výše popsáno, je možno podle tohoto vynálezu připravit polysacharid, obsahující dusík, vyznačující se vynikající protinádorovou účinností, jakož i dalšími farmakodynamickými faktory, jak jsou konečně uvedeny zde výše, a to nejen při intra-

purpurová hnědá	sacharidy sacharidy	ano ano
zelenavě-modrá	sacharidy	ano
hnědá	sacharidy	ano
purpurově-hnědá	sacharidy	ano
modrá	peptidové vazby	ano
zelenavě-modrá	«-aminokyseliny	ano

peritoneálním podávání, ale i při orálním podávání, a to je poměrně jednoduchý způsob; látku je možno přitom získat ve vysokých výtěžcích. Může tady znamenat postup podle tohoto vynálezu možnost průmyslové výroby protinádorového činidla z Basidiomycet.

Postup podle tohoto vynálezu se nyní podrobně popisuje za použití několika způsobů provedení.

Příklad 1

200 g suchých mycelií Coriolus versicolor (Fr.) Quél (FERM-P No. 2414) s obsahem vlhkosti 8,8 % a celkovým obsahem dusíku 2,5 % se vnese do 4 litrů 0,1 N roztoku hydroxidu sodného, načež se extrakce provádí za míchání ve vroucí vodní lázni (tj. za vnitřní teploty 90 až 95 °C) po dobu hodiny; potom se reakční směs ochladí na teplotu pod 50 °C, a postupným ' přidáváním 1 N roztoku chlorovodíkové kyseliny se upraví hodnota pH na 7,0. Pevné podíly se odsají, promyjí se za použití 500 ml vody, a získá se tím 4,2 litrů kapalného extraktu. Ten se ultrafiltruje za použití ultrafiltru (Amicon· lne., ultrafiltrační membrána PM-5) za míchání a chlazení, jakož i za pracovního tlaku 1,49.105 Pa za teploty 10 °C, čímž se odstraní látky o nízké molekulové hmotnosti, tj. s molekulovou hmotností do 5000. Následujícím zahuštěním se získá 300 mililitrů zpracovávaného roztoku. Lyofilisací tohoto roztoku se získá asi 26,6 g játrově hnědého prášku (výtěžek odpovídá 13,,5%). Obsah vlhkosti v prášku činí 7,5 %, při elementární analýze byly nalezeny tyto výsledky: 40,5 % C, 6,2 % H, 5,8 % N, 47,5 % O. (Procento kyslíku bylo vypočteno odečtením do 100.) Látka se snadno rozpouští ve vodě. Vyznačuje se 90% inhibičním poměrem proti pevnému tumoru Sarcoma-180 u myší při intraperitoneálním podávání a 65% inhibičním poměrem při orálním podávání.

Protinádorový účinek produktů podle tohoto vynálezu byl stanoven za použití běžného postupu, který je zde dále krátce popsán.

Buňky nádoru Sarcoma-180 se transplantují do břišní dutiny myši, a po dobu 7 dnů

1 S β S O

13 se ponechají dostatečně rozmnožit. Potom se 10⁵ z těchto buněk dále transplantuje pod axilární kůži jiné myši za vzniku pevného nádoru. Podávání testovaného produktu se zahájí za 24 hodin po transplantování. V případě, intraperitoneálního podávání se produkt aplikuje v dávce 10 mg/kg v každém z dalších 20 následujících dní v celkové dávce 0,2 ml na 20 g váhy těla myši, a v případě orálního podávání se produkt aplikuje v dávce 1000 mg/kg jednou denně po 20 dní v celkové dávce 0,2 ml na 20 g váhy těla myši. 25 dní po transplantací se nádory vyjmou, a inhibiční poměr růstu nádoru se propočte z průměrné váhy nádoru myši, které byl podáván produkt podle tohoto vynálezu a průměrné váhy nádoru kontrolní myši. Pro srovnání se extrakce a čištění provádí za stejných podmínek, ale za použití vody místo 4 litrů 0,1 N roztoku hydroxidu sodného. Výtěžek produktu činil 7,8 %, tj. asi 60 % z množství, jež se získá postupem podle tohoto vynálezu.

Příklad 2

500 g živých mycelií Coriolus versicolor (Fr.j Quél. (FERM-P No. 2414 j s obsahem vlhkosti 70,8 % a celkovým obsahem dusíku 2,6 %, přepočteno na sušinu, se vnese do 2 litrů vody a vše se míchá v obvyklém mixeru šťáv 10 až 20 minut. Potom se ke směsi přidává postupně 500 ml 1 N roztoku hydroxidu sodného, a extrakce se provede v horké vodní lázni teploty 90 až 95 °C po 2 hodiny; následuje neutralizování kyselinou chlorovodíkovou, promytí a oddělení pevných podílů za použití postupu z příkladu 1, a extrakt takto získaný se zpracuje ultrafiltrací za použití ultrafiltru s ultrafiltrační membránou G-05T, Bio-Engineering Co, čímž se odstraní sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti s molekulovou hmotností do 5000 s následujícím zahuštěním. Dalším lyofilisovámm se isoluje 24,2 g játrově hnědého prášku (výtěžek odpovídá 15,1 %) s obsahem vlhkosti 7,6 % a s celkovým obsahem dusíku 6,0 °/o. Rozpouští-li se tato látka ve vodě, pak obsahuje nerozpustný podíl v množství asi 20 %. Zbývající část se ve vodě rozpouští ' dobře. Elementární analýza: 41,2 % C, 6,1 % C, 6,0 % N, 46,7 % O (obsah kyslíku byl vypočten odečtením do 100). Získaný prášek se rozpustí ve vodě a po odstranění nerozpustných podílů na filtračním papíru (č. 5c) se testuje inhibiční účinnost na pevný nádor Sarcoma-180 u myší. Byl zjištěn 93% inhibiční poměr v případě intraperitoneálního a 70% inhibiční poměr v případě orálního podávání.

Příklad 3 kg suchých buněk Coriolus versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P No. 2414) s obsahem vlhkosti 8,0 % a s celkovým obsahem dusíku 2,5 % se vnese do 20 litrů 0,4 N roztoku hydroxidu sodného, a extrakce se provádí po 2 hodiny za míchání v extrakčním zařízení, vybaveném vyhřívacím a chladicím pláštěm, jakož i míchadlem, přičemž se teplota ve vyhřívacím plášti upraví tak, že vnitřní teplota reakční směsi se pohybuje v rozmezí 90 až 95 °C. Extrahovaná suspense se ochladí na teplotu místnosti a po úpravě pH na 7,0, přidáním 2 N roztoku chlorovodíkové kyseliny po částech a za míchání, se oddělí pevný zbytek od kapalného extraktu odstředěním. Pevný odstředěný zbytek se smíchá s 20 litry 0,4 N roztoku hydroxidu sodného a provede se podobná extrakce 2 hodiny za teploty 90 až 95 °C, načež se reakční směs ochladí, neutralisuje a pevný podíl se odstředí (odstraní se tím extrahované buňky). Získá se tím kapalný extrakt a zbytek, který se znovu zpracuje podobnou extrakcí za použití 0,4 N roztoku hydroxidu sodného, a to po dobu jedné hodiny. Isoluje se tím další extrakt.

Popsanou třikrát opakovanou extrakcí se získá asi 58 litrů kapalného extraktu celkem, ten se zahustí na objem asi 10 litrů destilací ve vakuu, a potom se ultrafiltrací (za použití membrány NFA-180, Abcor lne.) za teploty 10 °C a tlaku 2,07.10⁵ Pa odstraní látky o nízké molekulové váze, tj. s molekulovou hmotností pod 5000. Dalším zahuštěním se získá přibližně 5 litrů zpracovávaného roztoku. Asi 70 litrů zpracovávaného roztoku, obsahujícího frakci látek o nízkých molekulových hmotnostech, a získaného po ultrafiltrací se zpracuje reversní osmosou [za použití membrány AS-205 Abcor Inc), čímž se odstraní látky o nízkých molekulových hmotnostech, a zahuštěním se připraví asi 5 litrů zpracovávaného roztoku. Pracovní podmínky při tomto zpracování jsou: průměrný tlak 2,45.10⁶ až 2,94.10⁸ Pa, teplota asi 10 °C. Potom se roztoky z ultrafiltrace a ze zpracování reversní osmosou spojí, a 10 litrů takto spojeného roztoku se suší rozstříkáním. Získá se tím 395 g játrově hnědého prášku (výtěžek 19,9 %), obsah vlhkosti činí 7,0 %, elementární analýza: 40,8 % C, 6,0 % H, 4,0 % N, 49,2 % O. Inhibiční poměr tohoto produktu na pevné nádory Sarcoma-180 myší byl 92 proč, v případě intraperitoneálního a 70 % v případě orálního podávání. Látka se dobře rozpouští ve vodě.

Příklad 4

Do 4 litrů 0,1 N vodného roztoku hydroxidu sodného se vnese vždy 200 g vysušeného mycelia některé z hub rodu Coriolus, uvedených v následující ' tabulce 2, a toto mycelium se 1 hodinu extrahuje za míchání při teplotě 90 až 95 °C. Po ochlazení na teplotu pod 50 °C se výsledná směs neutralizuje 1 N vodnou kyselinou chlorovodíkovou na pH 7,0 a pevný materiál se odfiltruje. Po promytí této pevné látky 500 ml vody se filtrát spojí s promývací kapalinou (celkový objem 4200 ml) a podrobí se ultrafiltraci na přístroji Desk-top Ultrafilter (výrobce: Amicon lne., USA) opatřeném ultrafiltrační membránou PM-5 (výrobce: Amicon lne., USA). Ultrafiltrace se provádí za míchání a chlazení, při pracovním tlaku 1,47.10⁵ Pa a při teplotě 10 °C, a slouží к odstranění látek s molekulovou hmotností pod 5000.

Výsledná kapalina se zahustí na objem 300 ml a lyofilizuje se, čímž se získá jasně hnědý práškový produkt.

Vlastnosti práškových produktů získaných z mycelií jednotlivých druhů hub rodu Coriolus se zjišťují jako v příkladu 1 a jsou uvedeny v následující tabulce 2.

	TABULKA 2 i.' '
Vlastnosti produktů získaných	z různých druhů Coriolus	průměrná moleku-
	výtěžek	elementární analýza (°/o)	lová I. P.*
druh	(%)	C Η N	hmotnost (%)

C. hirsutus (Fr.)

Quél. (FERM-P	10,Q	40,1	6,2	5,3	100 000	90
2	č. 2711) C. consors (Berk) Imaz. (FERM-P	12,5	39,8	6,0	4,5	100 000	70
3	č. 988) C. conshifer (Schw.) Pt.	10,8	39,7	6,1	5,1	100 000	74
4	C. pubescens (Fr.) Quél.	11,8	38,0	5,9	3,8	100 000	80
5	C. pargamenus (Fr.) Pat.	9,6	38,5	5,8	4,2	100 000	86
6	C. biformis (Klotz.) Pat.	10,0	42,0	6,4	6,0	100 000	79
7	C. versicolor	13,6	40,6	6,2	5,8	100 000	91
Legenda:	(Fr.) Quél. (FERM-P č. 2412) *) I. P. = Inhibice růstu nádoru	Sarcoma	180.

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims (4)

1. Způsob izolace polysacharidů o molekulové hmotnosti 5 000 až 300 000, obsahujících 2 až 8 °/o hmotnostních dusíku a vykazujících protinádorovou účinnost, extrakci houby z třídy Basidiomycetes zásaditým vodným roztokem, vyznačující se tím, že se houba rodu Coriolus čeledi Polyparaceae extrahuje vodným roztokem hydroxidu sodného o normalitě v rozmezí 0,01 až 2,0 N, v množství odpovídajícím pětinásobku až dvěstěnásobku hmotnosti houby, při teplotě 50 až 100 °C, takto získaný vodný extrakt se neutralizuje a zbaví se látek o molekulové hmotnosti pod 5000 ultrafiltrací za tlaku od 4,9 . 10⁴ do 4,9 . 10⁵ Pa nebo/a reversní osmosou za tlaku 2,45 . 10⁶ až 3,43 . 10⁶ Pa.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se jako houba používají přírodní nebo uměle vypěstované buňky nebo/a mycelium.

3. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se jako houba používá Coriolus versicolor (Fr.) Quél.

4. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se extrakce provádí při teplotě 80 až 98 °C.