DK145505B - Fremgangsmaade til fremstilling af et nitrogenholdigt polysaccharid - Google Patents

Description

145505

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et nitro-genholdigt polysaccharid med antitumorigen virkning og andre særligt gode farmakodynamiske egenskaber ud fra en svamp tilhørende Corio-lusslægten.

5 Det er velkendt, at polysaccharider med antitumorigen virkning kan fremstilles ved ekstraktion af visse svampe hørende til Basidio-myceterne med et vandigt opløsningsmiddel og rensning af ekstrakten, se GB patentskrift nr. 1.331.513. I nævnte patentskrift nævnes talrige svampearter som kilde til det ønskede stof, bl.a. Coriolus 10 versicolor, og som ekstraktionsmiddel anvendes især varmt vand, selvom det nævnes, at vandige opløsninger, bl.a. af en base, kan anvendes. Til den efterfølgende rensning af ekstrakten nævnes en række rensningsprocedurer som syrebehandling, udsaltning, dialyse, gelfiltrering og ultrafiltrering.

15 Det har nu vist sig, at når der som kilde for nitrogenholdigt polysaccharid specielt anvendes en svamp tilhørende Coriolus-slægten kan et nitrogenholdigt polysaccharid med antitumorigen virkning og 1 forskellige andre farmakodynamiske virkninger opnås i højt udbytte ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, at 20 ovennævnte svamp ved en temperatur pi 50-100°C ekstraheres med en ! vandig alkalisk opløsning med en koncentration beliggende mellem 0,01N og 2N, og at den fremkomne ekstrakt derefter renses ved hjælp af ultrafiltrering og/eller omvendt osmose for at fjerne lavmolekylære stoffer i ekstrakten med en molekylvægt på under 5000.

25 "Svampen tilhørende Coriolus-slægten", der anvendes som ud gangsmateriale ved den foreliggende opfindelse, er en kendt art af svampe tilhørende Polyporaceøe-familien af klassen Basidiomyceter, og sådanne arter omfatter f.eks. Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Coriolus hirsutus (Fr.) Quel., Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus 30 conchifer (Schw.) Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quel., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat., og Coriolus biformis (Klotz.) Pat. (se COLOURED ILLUSTRATIONS OF FUNGI OF JAPAN af Rokuya Imazeki og Tsuguo Hongo, bind I 1974 og bind II 1975). Blandt disse svampe er Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P nr. 2414), Coriolus 35 concors (Berk.) Imaz. (FERM-P nr. 988), Coriolus. hirsutus (Fr.)

Quel. (FERM-P nr. 2711) og Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. (FERM-P nr. 2712 deponeret i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Chiba-shi, Japan) et statsforetagende udpeget af generaldirektøren for de japanske patentmyndigheder. Betegnelsen "svampe tilhørende Coriolus-slægten" betegner i 145505 2 den foreliggende sammenhæng frugtlegemet og/eller myceliet af svampen, og særligt foretrukket til brug i forbindelse med den foreliggende opfindelse er det mycelium, som fås af en kultur af Coriolus versicolor (Fr.) Quel.

5 Koncentrationen af den til ekstraktionen ifølge opfindelsen an vendte alkaliske opløsning afgrænses til området fra 0,01N til 2N som følge af, at såfremt koncentrationen er mindre end 0,01N, er resultatet ikke meget forskelligt fra det, der opnås ved ekstraktion med vand, medens der såfremt koncentrationen overstiger 2N kunne ske en 10 nedbrydning. En foretrukket ekstraktion af Basidiomyceterne kan gennemføres på tilfredsstillende måde ved anvendelse af en alkalisk opløsning med ovennævnte koncentrationsområde ved en temperatur på 50-100°C, fortrinsvis 80-98°C over en periode på 20-600 minutter. Det bør bemærkes, at en ekstraktionstemperatur på under 50°C resulterer 15 i utilstrækkelig ekstraktion af den aktive bestanddel, medes en ekstraktionstemperatur på over 100°C kan medføre aktivitetsreduktion for den fremkomne aktive bestanddel forårsaget af varme. Det foretrukne ekstraktionstidsområde varierer med koncentrationen og temperaturen af den anvendte alkaliske opløsning, men det foretrækkes sædvan-20 ligvis at benytte en tid indenfor ovennævnte område, dvs. 20-600 minutter. Det er muligt at opnå et tilfredsstillende resultat med én ekstraktionsoperation, men om ønsket kan ekstraktionsoperationen gentages adskillige gange.

Alkaliske materialer af forskellig art, såsom natriumhydroxid, 25 kaliumhydroxid, ammoniumhydroxid eller calciumhydroxid etc. kan benyttes som den alkaliske opløsning ved fremgangsmåden ifølge opfin delsen, og det foretrækkes at benytte natriumhydroxid og kaliumhydroxid.

Den væskeformige ekstrakt, som opnås på ovenstående måde, 30 neutraliseres på sædvanlig vis under anvendelse af en mineralsyre, såsom fortyndet saltsyre, og underkastes derpå ultrafiltrering eller omvendt osmose for at fjerne de lavmolekylære stoffer (med molekylvægt under 5000) i ekstrakten. Det har været sædvanlig praksis at rense ekstrakter af Basidiomyceter ved hjælp af udsaltning under an-35 vendelse af ammoniumsulfat, dialyse, udfældning under anvendelse af et organisk opløsningmiddel eller gel-filtrering, som nævnt ovenfor, men sådanne rensningsmetoder var særdeles vanskeligt gennemførlige, og en løsning på dette problem har derfor været et ønske. Det har vist sig, at de i ekstrakten indeholdte lavmolekylære stoffer er så godt 3 145505 som betydningsløse hvad angår den inhiberende virkning overfor alvorlige Sarcoma-180 tumorer (eng: Sarcoma-180 solid tumours) i mus ved intra-peritoneal indgivelse, og de er endvidere bitre og har en ubehagelig lugt, således at tilstedeværelsen af sådanne stoffer er 5 uønskelig ved brugen af polysacchariderne som lægemidler. Som følge af yderligere studier for at tilvejebringe en mere rationel og gennemførlig fremgangsmåde til fjernelse af sådanne lavmolekylære stoffer er det lykkedes at tilvejebringe en særdeles effektiv fremgangsmåde til fjernelse af de lavmolekylære stoffer med molekylvægt under 5000 10 ved at tilpasse ultrafiltrerings- og/eller omvendt-osmose-teknikken.

Det fremherskende træk ved den rensningsmetode, som benyttes ifølge opfindelsen, er at bestanddelene fraktioneres efter molekylvægt under anvendelse af en membran, som kan kaldes en slags molekyl-si, under tryk. Ved en sådan membranfraktionering bestemmes molekyl-15 vægtværdierne sædvanligvis af de anvendte membrantyper, men da fraktioneringsydelsen i høj grad afhænger af molekylvægten og fortften af molekylerne i opløsningen, er de fraktionerede moiekylvægtværdier, som angives i membranproducentens katalog, og de' generelt anvendelige betingelser for det omgivende miljø, ikke altid anvendelige i 20 forbindelse med rensning af ekstrakten ifølge opfindelsen. I denne forbindelse har det vist sig, at en membran bærende en angivelse af fraktioneringsmolekylvægte pi 5000-15000 og med 98-100% inhibering overfor cytochrom c (molekylvægt 13000) som standardmateriale er anbefalelsesværdig til brug i forbindelse med den foreliggende op-25 findelse. Hvad angår driftsbetingelserne for rensningsmetoden ifølge den foreliggende opfindelse under anvendelse af ovennævnte membran, er disse betingelser faktisk i nogen grad svingende afhængigt af størrelsen og formen af apparatet, gennemledningshastigheden for ekstrakten og andre faktorer, men hvad angår ultrafiltrering gen- 2 30 nemføres denne operation sædvanligvis under tryk på 0,5-5 kg/cm , 2 o fortrinsvis 1-4 kg/cm , og ved en temperatur på normalt 5-70°C, idet dog driftstemperaturen kan variere med membrantypen. For så vidt .

angår omvendt osmose ligger det tryk, der anvendes til denne opera- 2 2 tion, sædvanligvis i området fra 20-35 kg/cm , fortrinsvis 20-25 kg/cm , 35 og temperaturen ligger sædvanligvis i området fra 5 til 20°C.

Generelt anses ultrafiltrering fer at være egnet til fraktionering af materiale med en molekylvægt pi over 10.000, medens omvendt osmose anses for egnet til fraktionering af materiale med en molekylvægt på mindre end 1000. En fraktioneringsværdi på 5000, som til- 145505 4 stræbes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, ligger midt mellem de områder, som anbefales for ovennævnte to metoder, men det har vist sig, at begge metoder kan anvendes til fraktionering af materiale med en molekylvægt på mindre end 5000 ved passende valg 5 af membranen. Ved rensning af ekstrakten i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan ultrafiltrering og omvendt osmose derfor benyttes enten alene eller i kombination, og valget træffes -ved at tage gennemførlighed og driftseffektivitet i betragtning.

10 Den ekstrakt, hvorfra de lavmolekylære stoffer (med molekylvægt mindre end 5000) er blevet fjernet ved ovennævnte rensningsoperation, underkastes forstøvningstørring eller frysetørring og tilberedes derefter til kommercielle produkter. Det stof, som fremstilles på den ovenfor beskrevne måde ifølge den foreliggende opfindelse, har en 15 lever-brun farve og et nitrogenindhold på fra 2 til 8%, i mange tilfælde fra 3 til 6%. Det har ikke noget tydeligt smeltepunkt og bliver gradvist sortere og nedbrudt ved en temperatur på over ca. 120°C.

Med hensyn til opløseligheden af stoffet er det opløseligt i vand, men næsten uopløseligt i alkohol, pyridin, chloroform, benzen og hexan.

20 Det er også uden smag og lugtfrit.

Forskellige farvereaktionsprøver på stoffet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen gav de i nedenstående tabel 1 viste resultater.

25 Tabel 1

Farvereaktionsprøver Farve Resultat_ a-naphthol/svovlsyre- reaktion (Molisch-prøve) purpur Saccharider bekræftet

Indol/svovlsyrereaktion 3Q (Disch-prøve) brun Saccharider bekræftet

Anthron/svovlsyrereaktion grønblå Saccharider bekræftet

Phenol/svovlsyrereaktion brun Saccharider bekræftet T ryptophan/svovl syrereaktion purpurbrun Saccharider bekræftet 35

Lowry-Folin-prøve blå Peptidbindinger bekræftet N in hydrin-reaktion efter saltsyrehydrolyse grønblå or-aminosyrer bekræftet 5 145505

De i ovenstående tabef anførte resultater indicerer, at stoffet, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er et nitrogenholdigt polysaccharid. Molekylvægten af stoffet målt ved en uitracentrifuge-ringsmetode 11 fra 5000 til 300.000, og vægt-middelmolekylvægten lå 5 fra 10.000 til 100.000. Andre målemetoder, såsom fraktionering under anvendelse af en ultrafiltreringsmembran, gav også værdierne på 10.000 - 100.000. Det kan derfor med stor pålidelighed anslås, at middelmolekylvægten af stoffet ligger mellem 10.000 og 100.000.

Det ifølge den foreliggende opfindelse frembragte nitrogenholdige 10 polysaccharid udviste ikke blot høj antitumorigen aktivitet med højt inhiberingsforhold overfor alvorlig Sarcoma-180 cancer i mus ved intra-peritoneal indgivelse, men viste sig også virksomt ved oral indgivelse. Dette er et tegn på, at det nitrogenholdige polysaccharid har en meget høj tilgængelighed som oralt antitumorigent middel, og 15 denne virkning er også blevet bekræftet ved talrige forsøg. Brugen af stoffet er ikke begrænset til sådanne orale antitumorigene præparater; det udviser også en høj immunitetsbevarende virkning i værten. Dvs. at det ikke blot er virksomt til hindring af bivirkninger ved kemoterapi af cancer eller følsomhedsstigning ved radioterapi, 20 men også til hindring af forringelse af patientens immunitet og fysiske styrke efter en operation eller blodtransfusion og kontrol af beskyttelse overfor infektionssygdomme forårsagt af virus eller bakterier som følge af forringelse i immunitet eller fysisk styrke. Oral indgivelse af stoffet havde også en særdeles god virkning med hensyn til 25 forbedring af leverfunktionen, appetitforøgelse, regulering af tarmforstyrrelser og fremme af urinering. Det er også virkningsfuldt til behandling af spedalskhed.

Den foreliggende opfindelse vil nu blive beskrevet detaljeret ved hjælp af nogle udførelseseksempler.

30

Eksempel 1 200 g tørt mycelium af Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P nr. 2414) (fugtighedsindhold: 8,8%, bruttonitrogenindhold: 2,5%) tilsattes til 4 liter 0,1N NaOH-opløsning og ekstraheredes under 35 omrøring i et kogende vandbad ved en indre temperatur på 90-95°C i 1 time, og blandingen afkøledes derefter tit en temperatur på under 50°C og tilsattes gradvist 1N HCI-opløsning til indstilling af pH til 7,0. Derefter fjernedes de faste stoffer ved vacuumfiltrering, og disse faste stoffer vaskedes med 500 ml vand, hvorved der fremkom 6 145505 totalt 4,2 liter væskeformig ekstrakt. Denne væskeformige ekstrakt underkastedes derefter ultrafiltrering under anvendelse af en ultrafiltreringsmembran, "type PM-5", fremstillet af polysulfonat af Amicon Far East Ltd, Japan, under omrøring og afkøling og under et drifts-5 tryk på 1,5 kg/cm^ ved 10°C til fjernelse af lavmolekylære stoffer med en molekylvægt på under 5000 efterfulgt af koncentrering til 3 tilvejebringelse af 300 cm behandlet opløsning. Denne opløsning underkastedes yderligere frysetørring, hvorved der fremkom ca. 26,6 g leverbrunt pulver (udbytte: 13,5%). Dette pulver havde et fugtig-10 hedsindhold pi 7,5%, og en elementaranalyse gav følgende sammensætning: C: 40,5%, H: 6,2%, N: 5,8%, O: 47,5%. (Det procentiske oxygenindhold er den værdi, som fis ved at subtrahere summen af det procentiske indhold af andre grundstoffer fra 100). Det var letopløseligt i vand. Det udviste et inhiberingsforhold så højt som 90% 15 overfor alvorlig Sarcoma-180 tumor i mus ved intra-peritoneal indgivelse og et inhiberingsforhold pi 65% ved oral indgivelse.

Den anti-tumorigene virkning af produktet bestemtes ved en sædvanlig fremgangsmåde, som beskrives i korthed nedenfor.

Sarcoma-180 tumorceller transplanteredes ind i bughulen hos 20 mus, og efter at cellerne havde fået mulighed for at vokse tilstræk-keligt over en periode på 7 dage, transplanteredes 10 celler videre ind under huden af axillae hos andre mus med henblik på udvikling af kraftige tumorer. Indgivelse af det produkt, som skulle undersøges, påbegyndtes fra den 24. time efter transplantation. Med hensyn til 25 intra-peritoneal indgivelse blev produktet indgivet i en dosis på 10 mg/kg pr. indgivelse én gang hver anden dag i 20 dage til en totalmængde på 0,2 ml pr. 20 g muselegemsvægt og med hensyn til oral indgivefse blev produktet indgivet i en dosis på 1000 mg/kg pr. indgivelse én gang om dagen i 20 dage til en total mængde på 0,2 ml 30 pr. 20 g muselegemsvægt. Tumorerne udskrælledes på den 25. dag efter transplantationen, og tumorvækstinhiberingsforholdet beregnedes ud fra middelvægten af tumorer i de mus, som havde fået indgivet produktet, og middelvægten af tumorerne i kontrolmusene. For at sammenligne gennemførtes ekstraktions- og rensningsbehandlingen 35 under samme betingelser, men med anvendelse af vand i stedet for 4 liter 0,1N NaOH-opløsning. Produktudbyttet var 7,8% eller ca. 60% af det som opnåedes med fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

7 145505

Eksempel 2 500 g levende mycelium af Coriolus versicolor (Fr.) Quel.

(FERM-P nr. 2414) (fugtighedsindhold: 70,8 %, bruttonitrogemndhold: 2,6% beregnet på tørbasis) tilsattes sammen med 2 liter vand og 5 findeltes i et saftblandeapparat i 10-20 minutter, og blandingen til- 3 sattes derefter gradvist 500 cm 1N NaOH-opløsning og ekstraheredes i et varmt vandbad ved 90-95°C i 2 timer efterfulgt af neutralisering med HCI, vask og separering af celler ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1, og den fremkomne ekstrakt underkastedes ultrafiltrering 10 under anvendelse af en ultrafiltreringsmembran, "type G-05T", fremstillet af en polyelektrolyt af Bio-Engineering Co., Japan, til fjernelse af lavmolekylære stoffer med en molekylvægt på under 5000 efterfulgt af koncentrering og frysetørring til tilvejebringelse af 24,2 g leverbrunt pulver (udbytte: 15,1%). Dette pulver havde et fugtigheds-15 indhold pi 7,6%, et bruttenitrogenindhold på 6,0% og havde en uopløselig del på ca. 24% ved opløsning i vand. Den resterende del var letopløselig i vand. (Elementaranalyse gav C: 41,2%, H: 6,1%, N: 6,0%, O: 46,7% (hvor det procentiske oxygenindhold er den værdi, der fås ved at subtrahere summen af værdierne for C, H og N fra 20 100)). Dette pulver opløstes, og efter fjernelse af de uopløselige stoffer ved hjælp af et filterpapir (nr. 5c) undersøgtes dets inhi-berende virkning overfor alvorlig Sarcoma-180 tumor hos mus. Det udviste et inhiberingsforhold på så meget som 93% for såvidt angår intra-peritoneal indgivelse og et inhiberingsforhold på 70% for såvidt 25 angår oral indgivelse.

Eksempel 3 2 kg tørceller af Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P nr.

2414) (fugtighedsindhold: 8,0%, bruttonitrogemndhold: 2,5%) tilsattes 30 til 20 liter 0,4N NaOH-opløsning og underkastedes 2-timers ekstraktion under omrøring i en ekstraktionsbeholder forsynet med varme-kølekappe og omrører, medens kappetemperaturen indstilledes således, at den indre temperatur holdt sig på 90-95°C. Den ekstraherede opslemning nedkøledes til stuetemperatur, og efter indstilling af pH til 35 7,0 ved tilsætning af 2N HCI portionsvis under omrøring fraskiltes remanensen (tørstof) fra det væskeformige ekstrakt ved hjælp af en centrifugalseparator. Remanensen (tørstof) blandedes med 20 liter 0,4N NaOH-opløsning og underkastedes en tilsvarende ekstraktionsbehandling ved 90-95°C i 2 timer, efterfulgt af afkøling, neu- 145505 δ tralisation og centrifugal separering (separering af celler), hvorved væskeformig ekstrakt og remanens fremkom. Sidstnævnte underkastedes endnu engang en tilsvarende ekstraktionsbehandling med 0,4N NaOH-opløsning i én time, hvorved der fremkom en ekstrakt. Denne 5 tre-trins ekstraktionsoperation gav totalt ca. 58 liter væskeformig ekstrakt. Denne væskeformige ekstrakt koncentreredes til ca. 10 liter ved hjælp af en vacuum koncentrater og underkastedes derefter ultra-o 2 filtrering ved 10r C og et tryk på 2,1 kg/crn under anvendelse af en ultrafiltreringsmembran, "type HFA-180", fremstillet af Ulvac Corpo-10 ration, Japan, til fjernelse af lavmolekylære stoffer (med en molekylvægt på under 5000) efterfulgt af yderligere koncentrering for at tilvejebringe ca. 5 liter behandlet opløsning. Ca. 70 liter behandlet opløsning indeholdende den fra ultrafilteret fjernede lavmolekylære fraktion underkastedes omvendt osrtiose under anvendelse af en mem-15 bran til omvendt osmose, “type AS-205", fremstillet af Abcor Inc., til fjernelse af de lavmolekylære stoffer og koncentreredes derefter, hvorved der fremkom ca. 5 liter behandlet opløsning. De til denne behandling anvendte driftsbetingelser var følgende: Middeltryk 25-30 kg/cm^, behandlingstemperatur: ca. 10°C. Derefter blev de fra ultra-20 filtreringsbehandlingen og omvendt osmose-behandlingen fremkomne opløsninger bragt sammen, og 10 liter af denne kombinerede opløsning pulveriseredes under anvendelse af et forstøvningstørreapparat, hvorved der fremkom ca. 395 g leverbrunt pulver (udbytte: 19,9%).

Dette pulver havde et fugtighedsindhold på 7,0%, og dets elementar-25 analyse gav følgende resultater: C: 40,8%, H: 6,0%, N: 4,0%, O: 49,2%. Inhiberingsforholdet for dette produkt overfor alvorlig Sar-coma-180 tumor hos mus var 92% for såvidt angår intra-peritoneal indgivelse og 70% for såvidt angår oral indgivelse. Det var let opløseligt i vand.

30

Eksempel 4

Til 4 liter af en vandig 0,1N natriumhydroxidopløsning tilsattes 200 g tørret mycelium af hver af de i tabel 2 anførte arter fra Coriolus-slægten, og myceliet ekstraheredes under omrøring ved en 35 temperatur på 90-95°C i 1 time. Efter afkøling til en temperatur under 50°C, neutraliseredes blandingen til en pH-værdi pi 7,0 ved tilsætning af en vandig 1N HCI-opløsning og filtreredes til fjernelse af det faste stof. Det fraseparerede faste stof vaskedes med 500 ml vand.

Den samlede opløsning af filtratet og vaskeopløsningen, der udgjorde 9 145505 4.200 ml, underkastedes ultrafiltrering under anvendelse af en ultrafiltreringsmembran, "type DM-5", fremstillet af Amicon Inc., USA, under omrøring og afkøling og ved et driftstryk på 1,5 kg/cm ved 10°C til fjernelse af lavmolekylære stoffer med en molekylvægt p§ 5 under 5000. Den fremkomne væske kondenseredes til 300 ml. Ved frysetørring af væsken opnåedes et leverbrunt pulver. Egenskaberne af det pulverformede produkt fra hvert mycelie af svampene tilhørende Coriolus-slægten bestemtes som i eksempel 1 og angives i tabel 2.

Tabel 2 10 Ud- Grundstof- Gnstl. Inhiberings- * bytte sammensætning molekyl- forhold (%)

Nr. Art (%) C Η N vægt i.p. p.o.

1. C.hirsutus(Fr. )Quél. 10,0 40,1 6,2 5,3 100.000 90 69 15 (FERM-P Nr. 2711) 2. C.consors(Berk)lmaz. 12,5 39,8 6,0 4,5 100.000 70 66 (FERM-P Nr. 988) 3. C.conchifeKSchw. )Pat. 10,8 39,7 6,1 5,1 100.000 74 67 4. C.pubescens(Fr.)Quél. 11,8 38,0 5,9 3,8 100.000 80 68 20 5. C.pargamenus(Fr.)Pat. 9,6 38,5 5,8 4,2 100.000 86 67 6. C.biformis(Klotz.)Pat. 10,0 42,0 6,4 6,0 100.000 79 66 7. C.versicolor(Fr. )Quél. 13,5 40,5 6,2 5,8 100.000 90 69 (FERM-P Nr.2415)

Note: Inhiberingsforholdet overfor transplanterede Sarcoma-180 i 25 mus.

Det fremgår af tabel 2, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen ikke blot er effektiv overfor Coriolus versicolor (Fr.)Quél., men også overfor andre svampearter af Coriolus-slægten, såsom Coriolus hirsutus 30 (Fr.)Quél., Coriolus consors (Berk)lmaz., Coriolus conchifer (Schw.)

Pat., Coriolus pubescens (Fr.)Quél., Coriolus pargamenus (Fr.)Pat. og Coriolus biformis (Klotz. )Pat., til frembringelse af et nitrogen-holdigt polysaccharid med antitumorigen aktivitet.

Det nummer, der står efter betegnelsen FERM-P Nr., f.eks.

35 FERM-P Nr. 2414 i eksempel 1, er deponeringsnummeret for den pågældende svampeart hos Fermentation Research Institute, der er et japansk statsforetagende.