JPS6013004B2 - インタ−フエロン誘起剤の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はインターフェロン（以下ＩＦという）誘起剤の
製造方法に関する。

さきに本発明者はキク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）ベニ
バナ属（Ｃａｎｈａｍｕｓ）に属しかつインターフェロ
ン誘起活性物質を含有する植物またはその変員の組織か
ら上記活性物質を抽出し、抽出物からこれを回収する工
程によって、優れたＩＦ誘起活性と極めて低い毒性とを
有するＩＦ誘起剤（以下活性物質Ａという）を製造し得
ることを見出したく特許藤昭５４一１３０２４号、同昭
弘−１７０６４１号参照）。さらに活性物質Ａがヒトお
よび動物の腫湯に対して優れた阻止活性を有するばかり
でなく、生理作用を改善する効果を有することを見出し
た（特許願昭和５０王８月６日出機）。活性物質Ａの製
造原料とされる植物は、世界各国に豊富に裁培または自
生し、自然または人工的に突然変異体や雑種のような変
員（ｖａｒｉａｎｔ）を形成する鏡向がある。

各国の多くのベニバナ属植物およびそれらの変員を活性
物質Ａの製造に用いることができる。下記の植物は例示
にすぎない。ベニバナ（Ｃａｎｈａｍｕｓｔｉｎｃのｒ
ｉ瓜Ｌｉｎｎｅ），アレチベニバナ（Ｃａれｈａｍ瓜
ｌａ雌ｔ雌 Ｌｉｎ船），Ｃａｎｈａｍ瓜 ａｒｂｏｒ
ｅＳＣｅ船 Ｌｉｎｎｅ ， ＣａｎｈａｍｕＳ舷ｅｔ
ｊｃ雌Ｎのｍａｎ．またはこれらの変員。

活性物質Ａは水とくにアルカリ性水溶液によく溶けるの
で、原料植物から活性物質Ａを水で抽出する。または親
水性有機溶剤で抽出することもできる。活性物質Ａの分
子量は約１０万以上約３００方以下（主として約５０万
以上約１００方以下）であるから、たとえば、分画分子
量１０万以上の物質を分別できる適当な膜を用いた限外
炉過法で、抽出液の上燈液を処理することによって、活
性物質Ａを抽出液から回収することができる。または抽
出液を所望により濃縮した後、親水性有機溶剤を加える
と、活性成分を含む沈殿物が生じるので、これから活性
物質Ａを回収することができる。あるいは、親水性有機
溶剤の代り１こ、適当なアンモニウム塩または無機金属
塩を用いてもよい。活性物質Ａは水溶性の酸性物質であ
るから、この種の物質の精製に常用される各種の精製法
（たとえばゲル炉過剤やイオン交換剤を用いるカラムク
ロマトグラフィー）によって、回収された粗活性物質Ａ
を精製することができる。上記活性物質Ａは、ベニバナ
属植物またはその変員の組織のうち、花に最も多く含有
されているので、活性物質Ａの製造原料は、実用的には
、花である。さて、その後の研究の結果、これらの植物
またはその変員の種子に、活性物質Ａと同等以上の譲超
活性を有する別の活性物質（以下活性物質Ｂという）が
多量に含有されていること、および活性物質Ａの製造方
法と類似の方法によって活性物質Ｂを簡単に安価に製造
し得ることが分った。活性物質Ｂの理化学的特性はまだ
充分に解明されるに至らないが、活性物質Ａの分子量（
約１０方以上約３００方以下、主として約５０万以上約
１００万以下）とは異なる分子量（約１万以上約２０方
、主として約２万一約８方）を有する点および活性物質
Ｂは種子に、また活性物質Ａは花に主として含有されて
いる点からみて、両者は明らかに異なる物質であると考
えられる。従って本発明の目的は、キク料ベニバナ属に
属する植物またはその変員から単離されたｍ誘起剤の製
造方法を提供することにある。

本発明により提供されるＩＦ誘起剤の製造方法は、キク
科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）ベニバナ属（Ｃａｎｈａｍ
雌）またはその変員に属しかつＩＦ誘起活性物質を含有
する植物の組織から、上記活性物質を抽出し、抽出物か
らこれを回収する工程からなり、組織として種子を用い
ることを特徴としている。

本発明により、分子量約１万なし、し約２０万、主とし
て約２方から約８万までの抽出物区分から活性物質を回
収する。

本発明の方法は、活性物質Ａの製造方法と類似であるが
、活性物質Ｂおよび種子特有の理化学的性状に対応する
ために変形されているので、活性物質Ａの製造方法と同
一ではない。

本発明の方法により、活性物質Ａと同等以上のＩＦ誘起
活性を有するび誘起剤を簡単に安価に製造することがで
きる。次に本発明の方法を詳しく説明する。

原料 ベニバナ属植物またはその変員の種子であって、ＩＦ譲
起活性物質を含有するものを原料として用いることがで
きる。

実質的には上記に例示した植物の種子が用いられるが、
とくに有利なのはベニバナの種子である。ベニバナはべ
ニの原料、食料、飼料、薬草等として有用な植物で、古
くから世界各国で広く栽培されている。ベニバナの種子
は各国で食用油原料とされている。これに対して、従来
提案された各種の公知のＩＦ譲起剤の場合、最も重要な
欠点は、高い毒性を有する点である。次に、たとえばベ
ニバナの種子は採油原料として工業的に利用されている
が、処理された種子の油律の用途（飼料等）は、いわば
原始的である。従って本発明の方法に用いられる量の原
料を安価確実に入手することは容易である。原料は新鮮
な種子でもよいが保存および抽出効率上、乾燥した種子
を用いると有利である。

種子は固い外種皮とその内容物からなり、本活性物質は
どちらにも含まれている。抽出前に種子を破砕すると抽
出効率を高めることができる。

従って、採油後の種子の油粕を原料として用いるのは良
い方法である。とくにベニバナの種子は多量の油脂を含
んでいるが、サフラワー油採取の常法（たとえばホット
プレス法、有機溶剤抽出法等）で処理された種子、（た
とえば常法により、スクリュープレスで処理後、ヘキサ
ンで抽出したべニハナ種子の油粕は通常約１％の油脂を
含み、飼料とされている。）を、本発明の方法の良好な
原料として用いることができる。種子から活性物質を抽
出する前に有機溶剤で脱脂した場合と、脱脂しない場合
とを比較すると、本活性物質の収量およびＩＦ誘起活性
は著しい差が認められないことがわかった。抽出 水で抽出することは安価で実用的な方法である。

水を用いる抽出は任意温度（たとえば室温から約１３０
ｑｏまで）で行なうことができる。本発明による物質は
アルカリ性の水溶液（例、風７一１０）によく溶けるの
で、公知の緩衝液や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
、水酸化アンモニウム等を用いて、抽出時に水のｐＨを
調整するとよい。抽出時間は任意であるが、室温では通
常１一５日である。抽出温度が高いと抽出時間は短縮さ
れる（たとえば４０一１２０つ０で３０分から６時間）
。これによって、種子に含まれた活性成分の大部分（場
合により９０％以上）を抽出することができる。所望に
より、抽出時に適当な防腐剤を加えることもできる。抽
出は連続式でもバッチ式でもよい。抽出水と原料との比
は任意である。（例えば原料の５一１の音量）。所望に
より、適当な有機溶剤（例、メタノール、エタノール、
クロロホルム、エーテル、ヘキサンの１種または混合液
）で種子に含まれた脂質のような不純物を除去した後で
水で抽出すると容易に目的産物を抽出することができ、
しかも活性物質は矢なわれない。

外種皮とその内容物とを別々に抽出してもよい。所望に
より、フェノールと水との混合液で種子から活性物質を
抽出することもできる。

この場合フェノールの濃度は、たとえば２０−６０％と
くに４０−５０％、温度と時間は任意でよい（たとえば
５０−８０℃で１ぴ分ないし６０分間）。回収 炉過、圧搾または遠心分離のような常法により、抽出液
から植物の磯笹を除去し、こうして得られた抽出液から
低分子物貿、色素等の不活性成分を除き、活性成分を回
収する。

このため実質的な方法の例は次の通りである。脚 本発
明によるＩＦ誘起活性物質の分子量は約１方以上約２０
方以下（主として約２方ないし８方）であるから、たと
えば分画分子量１万以上２０方以下（例、２万一８方）
の物質を分別できる適当な膜を用いた限外炉過法で上燈
を処理する。限外炉週の圧力はたとえば０．１−５ｋ９
／仇とすることができる。こうして得られた活性部分を
集めて、凍結乾燥すると白色状の粉末が得られる。

フェ／ール／水で抽出した液を限外炉過で分画する場合
には、フェノールや膜を傷つけるおそれのある溶剤を、
透析や減圧のような適当な手法により、限外炉過前に完
全に除去しなければならない。

また水で抽出し限外炉過した後、フェノール／水で再抽
出してもよい。【Ｂ｝ 抽出液を所望により減圧下で濃
縮し、親水性有機溶剤（たとえばメタノール、エタノー
ル、ブロパノール、ブタノール、アセトン等）を抽出液
またはその濃縮液に適当な濃度（たとえば４０一７ルノ
ｖ％）になるように加えると、活性成分を含む沈殿物が
生じるので、所望によりたとえばセルロースチューブで
透析するか、または減圧下に有機溶媒を除去した後に乾
燥すると、白色状の粉末が得られる。

‘ｑ 上記の有機溶剤の代わりに、塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、セチルトリメチルアンモニウムプロ
ミドのようなアンモニウム塩または塩化亜塩、塩化鋼の
ような無機金属塩を適当な濃度（たとえば２０‐５帆／
ｖ％）になるように加えると、活性成分を含む沈殿物が
生じるので、沈殿物をたとえばセチルロースチューブで
透析するか、分画分子量５０００なし、し１万の膜で限
外炉過するかにより脱塩した後乾燥すると、白色状の粉
末が得られる。

以上のようにして抽出液を処理することによって、原料
中の活性成分の大部分（場合により９０％以上）を回収
することができる。

しかし、得られた乾燥粗粉末中の不純物の含有量は凶の
方法が最低である。また弧の方法は操作が簡単で費用が
安く短時間に行なうことができる。しかも■の方法で得
られた粗粉末をそのまま動物に多量に経口投与しても著
しい副作用は認められないことがわかつた。精製 本発明の方法で得られる活性物質は水落性の酸性物質で
あるから、この糧の物質の精製に常用される各種の方法
によって精製することができる。

この粗粉末を、たとえばゲル炉過剤またはイオン交換剤
を用いるカラムクロマトグラフィーのような常法によっ
て精製する。ゲル炉過剤を用いた場合は適当な緩衝液で
溶出してもよいが、通常は水で溶出すればよい。イオン
交換剤を用いた場合は適当な緩衝液で溶出する。実用的
なゲル炉過剤の例は、セフアデックスＧ−５０からＧ−
２００まで、セフアローズ波から脂まで、セフアクリル
Ｓ一２００またはＳ一３００（スエ−デン国、ファーマ
シア・ファイン・ケミカルＡＢ製）、バイオゲルＰ−３
０からＰ−３００まで、バイオゲルＡ（米国、バイオラ
ード・ラボラトリース製）、サガバツク（英国、セラバ
ツク。

ラボラトリース製）等である。イオン交換剤の実用的な
例は、ＤＥＡＥセフアデツクスＡ一２５およびＡ一５０
（ＣＩ‐型）、ＱＡＥセフアデツクスＡ−２５およびＡ
−５０（ＣＩ‐型）、ＣＭセフアデツクスＣ−２５およ
びＣ−５０（Ｎａ＋型）、ＳＰセフアデツクスＣ−２５
およびＣ−５０（Ｎａ１型）、ＤＥＡＥセフアセル（Ｃ
Ｉ‐型）、ＤＥＡＥセファロースＣＬ一服（ＣＩ‐型）
、ＣＭセファロースＣＬ−紐（Ｎａ十）（スヱーガン国
、ファーマシア・ファイン・ケミカルＡＢ製）等である
。適当なアニオンまたはカチオンィオン交換セルロース
を用いて粗粉末を精製することもできる。こうして得ら
れるものは、多少の不純物を含んでいるが、ＩＦ誘起剤
として用いることができる。所望により、上記の精製工
程を組合わせることによって、不純物をさらに除去する
こともできる。ｍ誘起活性 後記実施例記載の方法で得られた最終産物の試料を用い
て試験動物の細胞および血清中にＩＦを議起し、その活
性を後記試験例記載の方法で測定した結果は第１表およ
び第２表の通りで、ＩＦ議超活性が認められた。

第１表 ＩＦ活性（インピトロ法） ５羽のウサギを用いて、後記試験例記載の方法で実施例
１の最終産物から得た結果は第２表の通りで、５羽とも
に投与後２時間で最大の活性に達した。

実施例２以下で得られた最終産物の活性値もおよそ同様
であった。第２表 （ＩＦ活性、イン・ピボ法、平均値） 次に、下記の実施例において用いたベニバナ等の種子は
日本産であるが、比較のために、下記の外国産ベニバナ
の種子を各実施例記載の方法でそれぞれ処理して得た最
終産物を、後記試験例記載のィンビトｏ法およびィンビ
ボ法で処理して、び議起試験を行なった結果、日本産ベ
ニバナの結果と有意義な差は認められなかった。

‘１１アメリカ合衆国アリゾナ州Ｔｕｃｓｏｎ産■ 同
アリゾナ大学産“Ｏｉｌａ”｛３｝ 同カルフオルニア
大学（合衆国農務省種苗園産）“ＰａｎｉａＩ Ｈｕｌ
ｌ”，“１４一５”，“Ｒｅｄ肥ｄ 日山１一２”およ
び“０１ｅｉｃＬｅｅが’（４｝ フランス国パリ、市
販品 ■ インドカルカッタ市販品 後記試験例【ａ’，‘ｂ｝記載のィンピトロ法およびィ
ンビポ法で産生されたＩＦ試料は、同動物種のウサギＲ
Ｋ−１群細胞上で水庖性口内炎ウイルスの増殖を抑制す
る他、ワクシニアウィルス（Ｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒ瓜
）の増殖も抑制するが、動物種の異なるマウスのＬ細胞
では水癖性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の増殖を抑制しな
い。

また、０．雌トリプシンを３７０で２時間作用させると
そのＩＦ活性は失活する。従って、本発明の方法によっ
て生産された活性物質は、広く認められたＩＦ誘起剤の
定義に該当する物質であることが明らかである。前述の
通り、本活性物質は実質的に精製された状態において無
定形白色粉末で、水溶性の酸性物質である。その理化学
的特性はまだ充分に解明されてはいないが、分子量の異
なる点ならびに上記の通り、ＩＦ誘起活性が活性物質Ａ
と同等以上である点からみて、活性物質Ｂは新規のＩＦ
誘起剤であると信じられる。活性物質Ｂは、ヒトおよび
動物の各種ウイルス感染症の予防および治療剤として有
用であることが期待される。実施例 １ 乾燥したベニバナ（Ｃａれｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｍ；
ｕＳＬｉｎ肥）の種子（１００夕）を細砕した後、水（
１０００叫）中に常温で３日間放置することにより抽出
し、これを遠心処理（ｌｏｏ０ぴ．ｐ．ｍ．、２０分間
）して、抽出液と残笹に分け、残澄を水（各５００の‘
）で２回洗浄し、洗液を抽出液に合わせた。

こうして得られた抽出液をＭＣ一４Ａ型限外炉過器（バ
イオエンジニアリングＫ．Ｋ．、東京）で、ＸＭ−１０
山兆辰外炉過膜（分画分子量１０方、米国アミコン社製
）を用いて限外炉過（圧力３ｋ９／地）した後、その透
過液をＰＭ■戸過騰（分画分失子量１方、米国アミコン
社製）を用いて、限外炉過した。残留物を集めて凍結乾
燥し、白色粉末（２１２のｏ）を得た。この粉末を水（
５の‘）に溶解し、その水溶液をセフアデツクスＧ−１
００（ファーマシア・フアイン・ケミカルＡＢ、スヱー
デン国）を充填したカラム（４．５×７０伽）に添加し
、水（１２００の‘）で熔出し、綾出液を各５私の区分
に分け「６Ｇ蚤から１５伍蚤までの区分を合わせて脱塩
後凍結乾燥し、白色状粉末（５５．２雌）を得た。さら
に精製するために、この粉末を０．０１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．０、１＝０．０１）（５の‘）に溶解
し、ＤＥＡＥセフアデツクスＡ−５０（フアーマシア・
ファイン・ケミカルＡＢ、スエーデン国）を充填したカ
ラム（２．５×７０仇）に添加し、０．２Ｍトリスー塩
酸緩衝液（冊８．６：０．８Ｍ食塩を含む、５００肌）
で溶出し、溶出液を各５の‘の区分に分け、２疎蚤から
４項客までの区分を合わせた。この溶液をＦＭ−１０限
外炉過膜（分画分子量１方、米国アミコン社製）を用い
た限外炉週により脱塩後、凍結乾燥し、不定形な白色状
粉末（斑．ｌｍｏ）を得た。これを第１の白色状粉末と
比べると、ＩＦ謎超活性が高まった。実施例 ２ 乾燥したベニバナの種子（１００夕）を細砕し、水（１
０００似）を加え、１０ぴ０で６０分間抽出した後、抽
出液を実施例１記載の方法に準じて処理し、白色粉末（
４１．２雌）を得た。

実施例 ３ 乾燥したベニバナの種子（１００夕）を細砕し、水（１
０００Ｍ）を加え、１２０ｏｏで６０分間オ−トクレー
ブ（１気圧）で抽出した他、実施例１記載の方法に準じ
て処理し、白色粉末（４３．４のｏ）を得た。

実施例 ４乾燥したベニバナの種子（１００夕）を細砕
し、アセトン（５００の‘）で４℃で一夜放置した後、
抽出液を炉紙で炉過して、務澄を得た。

この礎澄にアセトン（５００の‘）を加えて６０分間振
とう抽出し、抽出液を炉紙で炉過して浅漬を得た。同様
のアセトン振とう抽出を５回くり返して得た残澄を減圧
下に乾燥してアセトンを除き、水（ｌ０００叫）を加え
、実施例１記載の方法に準じて処理し、白色粉末（４４
．６雌）を得た。実施例 ５ アセトンの代わりにクロロホルムノメタノール混合液（
５００の‘；１：ｌｖ／ｖ）を用いた他、実施例４と同
様の方法によって処理し、白色粉末（３０のｐ）を得た
。

実施例 ６ ベニバナの種子（１００夕）を圧搾器で絞りその残澄に
水（１０００の【）を加え、１０ぴ０で６０分間加熱抽
出し、実施例１記載の方法に準じて処理し、白色粉末（
３７．６のｏ）を得た。

実施例 ７ アレチベニバナの種子（１００夕）を細砕し、水（５０
０凧‘）を加え、筋℃に加熱後、６８ｑｏの９０％フェ
ノール溶液（５００の【）を加え、かくはんしながら２
び分間抽出した。

これを室温まで冷却後、遠心処理し（７００仇．ｐ．ｍ
．；２０分間）水層（上層）フェノール層（中間層、下
層）残澄に分離した。水層部分を回収した。残りのフェ
ノール層と残１１との混合部分にさらに水４００の１を
加え；６８℃で２０分間再抽出した。このときの水層部
分を回収し、さきの水層部分に合し、セルロースチュー
ブに入れ、４℃で３日間イオン交換水で透析した。その
後に実施例１記載の方法に準じて処理し；白色粉末（２
５０のｐ）を得た。試験例 １ ＩＦ誘起法およびＩＦ活性測定法（参考文献：Ｙ．Ｋｏ
ｊｉｍａ，Ｋｉねｓａｔｏ Ａｒｃｈ．，Ｅ×ｐ．，Ｍ
ｅｄ，．４３：３５１９７０）‘ａーイン・ピトロ法に
よるｍの譲起方法ウサギ（体重約ｌｋ９、ニュージーラ
ンドホワイト種、ＳＰＦ）を全採血して殺し、際豚、骨
髄およびリンパ節細胞を採取し、子牛血清１０％を含む
イーグルＭＥＭ培地（日水製薬製）を用いて混合細胞１
０７／の‘を含む細胞浮遊液をつくり、各浮遊液区分（
１の‘）に、本発明の製造例１記載の法で得られたｍ譲
超剤１０，１，０．１，０．０１ムタ／の‘をそれぞれ
加え、２５午○で２独時間培養後、各培養液を遠心処理
してその上澄液をとり、び活性測定用に供した。

‘ｂ｝ィン・ピポ法によるびの譲超方法 製造例１記載の法で得られた『誘起剤の水溶液（５００
ムタ／の【）２Ｍをウサギ（体重約ｌｋ９、ニュ−ジラ
ンドホワイト種、ＳＰＦ）の耳静脈に注射し、１，２，
４，６時間後に採血（２の上）し、その血清をび活性測
定用に供した。

｛Ｃ血清性の測定 上記【幻，‘ｂ’法ともに、産生されたｍ活性の測定は
、ウサギ賢株化細胞（ＲＫ−１３）を用いた５０％ブラ
ック半減法で行なわれる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ キク料（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）ベニバナ属（Ｃａ
   ｒｔｈａｍｕｓ）に属しかつインターフエロン誘起活性
   物質を含有する植物またはその変員の組織から上記活性
   物質を抽出し、抽出物からこれを回収する工程からなる
   インターフエロン誘起剤の製法において、組織として種
   子を用いることを特徴とする方法。 ２ 水で抽出する特許請求範囲１による方法。 ３ 水とフエノールとの混合液で抽出する特許請求範囲
   １による方法。 ４ 抽出液に親水性有機溶剤を加えることにより活性物
   質を回収する特許請求の範囲１から３までのどれかによ
   る方法。 ５ 抽出液にアンモニウム塩または無機金属塩を加える
   ことにより活性物質を回収する特許請求範囲１から３ま
   でのどれかによる方法。 ６ キク料（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）ベニバナ属（Ｃａ
   ｒｔｈａｍｕｓ）に属しかつインターフエロン誘起活性
   物質を含有する植物またはその変員の組織から上記活性
   物質を抽出し、抽出物からこれを回収する工程からなる
   インターフエロン誘起剤の製法において、種子に含有さ
   れた上記活性物質を水で抽出し、抽出液から限外濾過に
   よって活性物質を回収することを特徴とするインターフ
   エロン誘起剤の製法。 ７ フエノールを含む水で抽出し、抽出液からフエノー
   ル分を除去した後限外濾過する特許請求範囲第６項によ
   る方法。 ８ 限外濾過により、分子量約１万ないし約２０万、主
   として約２万ないし約８万の抽出物を分別する特許請求
   範囲第６または７項による方法。 ９ プレスされた種子を用いる特許請求範囲１から８ま
   でのどれかによる方法。 １０ 脱脂された種子を用いる特許請求範囲１から９ま
   でのどれかによる方法。 １１ 有機溶剤で脱脂された種子を用いる特許請求範囲
   １０による方法。 １２ プレス後に有機溶剤で脱脂された種子を用いる特
   許請求範囲１０による方法。