DE2655844B2

DE2655844B2 - Verfahren zur Herstellung antitumorwirksamer Substanzen

Info

Publication number: DE2655844B2
Application number: DE2655844A
Authority: DE
Inventors: Kiro Ibaragi Asano; Satoru Fujisawa Kanagawa Enomoto; Tsuyoshi Saito; Hiromitsu Tanaka
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1975-12-18
Filing date: 1976-12-09
Publication date: 1979-06-07
Also published as: NL171224C; AU2035476A; BR7608526A; JPS5290614A; GB1521168A; FR2335235B1; RO69485A2; DK570176A; YU303776A; AT347031B; IN142077B; JPS5628152B2; ES454304A1; BE849476A; DD129330A5; SU786855A3; IT1123693B; CH622948A5; CA1055487A; NL7614016A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum vorteilhaften Herstellen von antitumorwirksamen Substanzen, die aus stickstoffhaltigen Polysacchariden zusammengesetzt sind, dreh Extraktion des zur Gattung Coriolus genus gehörenden Pilzes der Klasse Basidiomycetes mit einem wäßrigen Lösungsmittel und Reinigen des erhaltenen Extraktes nach den Maßnahmen, die im Patentanspruch im einzelnen angegeben sind.

Es ist bekannt, daß antitumorwirksame Substanzen, die aus Polysacchariden zusammengesetzt sind, aus Basidiomycetes-Pilzen hergestellt werden können. So werden beispielsweise in der GB-PS 13 31 513 verschiedene Extraktionsverfahren zur Herstellung antitumorwirksamer Polysaccharid-Substanzen aus den Polyporaceae angegeben, und zwar in Beispiel 2, S. 6; Beispiel 4, S. 10; Beispiel 5, S. 12; Beispiel 6, S. 14; Beispiel 8, S. 22; Beispiel 9, S. 27; Beispiel 10, S. 32; Beispie! 11, S. 37; Beispiel 12, S. 42; Beispiel 13, S. 47; Beispiel 14, S. 52; Beispiel 15, S. 57; Beispiel 16, S. 62 und Beispiel 19, S. 77.

Es ist insbesondere auch bekannt, daß die aus Polysacchariden zusammengesetzten antitumorwirksamen Substanzen durch Reinigen des von der Extraktion eines Basisdiomycetes-Pilzes erhaltenen Extraktes mit einem wäßrigen Lösungsmittel unter normalem Druck hergestellt werden können. Dieses bekannte Verfahren besitzt jedoch den schwerwiegenden Nachteil, daß das bei ihm verwendete Extraktionsverfahren unlolerierbar schlecht bezüglich des Extraktionswirkungsgrades für die aktiven Komponenten ist. Solch ein geringer Extraktionswirkungsgrad führt zu einem beträchtlichen Verlust der aktiven Komponenten, die in großer Menge in dem Extraktionsrest übriggelassen werden. Dies ist nicht nur vom Standpunkt der Wirtschaftlichkeit und Produktivität für die antitumorwirksamen Substanzen, sondern auch vom industriellen Standpunkt unerwünscht, da solch ein Verlust zur Verschwendung und zur Beseitigung als Abfall von wertvollen Materialien führt und außerdem das Problem der Beseitigung von Abfallmaterialien mit sich bringt.

Im Laufe der Untersuchungen zur Beseitigung der oben beschriebenen Probleme bei der Herstellung von antitumorwirksamen Substanzen aus der Extraktion des Pilzes der Klasse Basidiomycetes mit einem wäßrigen Lösungsmittel haben die Anmelder gefunden, daß eine Substanz, die als stickstoffhaltigem Polysaccharid zusammengesetzt ist und eine hervorragende antitumorwirksame Aktivität besitzt, mit einer hohen Ausbeute erhalten werden kann, wenn der zu der Coriolus genus gehörende Basidiomycetes-Pilz mit einem wäßrigen Lösungsmittel unter Druck und bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 120 bis 200° C extrahiert wird.

Der Ausdruck »zur Gattung Coriolus genus gehörender Basidiomycetes-Pilz oder Basidiomycetes fungus (oder einfach Basidiomycetes)« wird hier zur Bezugnahme auf den Pilz der Klasse Basidiomycetes verwendet,

ίο der zu der Coriolus genus der Polyporaceae-Familie in der botanischen Klassifikation gehört, und derartige Basidiomycetes sind bekannt und umfassen z. B. folgende Pilze: Coriolus versicolor (Fr.) Quel, Coriolus hirsutus (Fr.) Quel, Coriolus consors (Besh.) Imaz,

is Coriolus conchifer (Schw.) Pat, Coriolus pubescens (Fr.) QueL Coriolus pargamenus (Fr.) Pat und Coriolus biformis (Kitz.) Pat (Vgl. COLOURED ILL ¹JSTRA-TIONS OF FUNGI OF JAPAN von Rokuya I m a ζ e k i und Tsuguo H ο η g ο, Bd. 1,1974 und Bd. II, 1975).

Der hier verwendete Ausdruck »zu der Coriolus

genus gehörender Basidiornyceies« soll auch so interpretiert werden, daß er die Myzelien oder

Pilzgeflechte und Fruchtkörper der Pilzklasse bedeutet Daher ist es die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren

zur Herstellung von Substanzen mit hervorragenden antitumorwirksamen Aktivitäten bzw. Wirksamkeit in einer hohen Ausbeute mittels Extraktion von den Myzelien und/oder Fruchtkörpern der zu der Coriolus genus gehörenden Basidiomycetes zu schaffen.

jo Das Merkmal dieser Erfindung beruht darin, daß die zur Coriolus genus gehörenden Basidiomycetes mit einem wäßrigen Lösungsmittel unter einem Druck von 1,8 bis 20 kg/cm² und bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 120 bis 200⁰C extrahiert werden, um ein antitumorwirksames, stickstoffhaltiges Produkt zu erzeugen, das so lange gereinigt wird, bis alle niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt sind. Es wurde allgemein angenommen, daß die aktiven und wirksamen Bestandteile des Pilzes zersetzt werden, wenn die Basidiomycetes unter hoher Temperatur wie beispielsweise 120 bis 200°C extrahiert werden, so daß es, obgleich es möglich sein könnte, die insgesamte Extraktionsrate zu vergrößern, jedoch kaum möglich wäre, die Ausbeute der erwünschten antitumorwirksamen Substanzen zu verbessern. So wird beispielsweise in der US-PS 38 83 505 in Spalte 1, Zeilen 17 bis 28, angegeben, daß einige Polysaccharide das Wachstum von Sarcoma-180 bei Mäusen hemmen können, daß

-,<> diese Polysaccharide jedoch so schlecht oder gar nicht in Wasser löslich sind, daß es Schwierigkeiten bereitet, sie zu injizieren. Außerdem würden sie auch aus natürlichen Quellen nur in geringen Ausbeuten und darüberhinaus durch Verfahren gewonnen, die so rauh sind, daß sich ihre Struktur ändert, beispielsweise durch alkalische oder saure Extraktionsmedien, die bei hohen Temperaturen angewendet werden. Weiterhin wird ab Spalte 1, Zeile 64, bis Spalte 2, Zeile 10, angegeben, daß zur Vermeidung von Nachteilen nur Temperaturen bis

w) zu 40 bis 70⁰C verwendet werden sollten. Das bedeutet, daß die Meinung vorherrschte, daß hohe Temperatren für das Extraktionsverfahren nicht günstig seien.

Durch die vorliegende Erfindung wurde jedoch gefunden, daß die gewünschte antitumorwirksame

b5 Substanz ganz im Gegensatz zu dieser allgemeinen Annahme in einer hohen Ausbeute erhalten werden kann, wenn die Extraktion bei der oben angegebenen Temperatur unter Druck durchgeführt wird.

Zur Durchführung der Extraktion unter Druck gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Ausgangsmaterial, die Myzelien und/oder Fruchtkörper der zu der Coriolus genus gehörenden Basidiomycetes, in ein Druckgefäß wie z. B. einen Autoklav für Chargenbetrieb oder einen rohrförmigen Extraktor vom Durchflußtyp zusammen mit einem wäßrigen Lösungsmittel eingebracht, und das Material wird darin bei einer Temperatur von 120 bis 200⁰C extrahiert Der bei dieser Behandlung anzuwendende Druck ist von einer Größe, ι ο die dem gesamten Dampfdruck des in dem Gefäß enthaltenen wäßrigen Lösungsmittels äquivalent ist Er ist nicht höher als 20 kg/cm², vorzugseise geringer als 16 kg/cm², aber auch nicht niedriger als 1,8 kg/cm². Die Extraktionszeit kann in Abhängigkeit von der verwendeten Temperatur geeignet eingestellt werden, liegt jedoch im allgemeinen vozugsweise innerhalb des Bereiches Von 5 bis 360 Minuten. Das bedeutet, daß eine geeignete Extraktionszeit innerhalb des oben angegebenen Bereiches ge ma b der angewandten Temperatur, die innerhalb des Bereiches von Ϊ20 bis 2ÖÖ⁼C Hegt, ausgewählt wird. Wenn die Extraktionstemperatur niedriger als 120⁰C ist, kann keine zufriedenstellende Extraktion erfolgen, wenn dagegen die Temperatur 200⁰C überschreitet, kann Zersetzung der aktiven Grundbestandteile auftreten und das Verfahren praktisch unanwendbar machen. Es sollte ebenfall bemerkt werden, daß eine Extraktionszeit, die kurzer als 5 Minuten ist, zu einer geringen Extraktionswirkung führt, während die Extraktionszeit von mehr als 360 Minuten jo Zersetzung der aktive·· Bestandteile verursachen kann.

Bei der praktischen Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung kann der Extraktionslbetrieb wiederholt unter den oben angegebener Bedingungen durchgeführt werden, oder das Ausgangsmaterial v, (Basidiomycetes) kann bei einer Temperatur umterhalb 100⁰C vor der eigentlichen Extrakton in ein wäßriges Lösungsmittel eingetaucht werden oder andererseits kann der erhaltene Extrakt mit einem wäßrigen Lösungsmittel bei einer Temperatur von weniger als 100°C nach der Extraktion ausgewaschen werden.

Das in der Erfindung verwendete wäßrige Lösungsmittel kann von der Art sein, die üblicherweise in den bekannten Verfahren verwendet wird, wie beispielsweise reines Wasser, wäßrige Säure oder alkalische Lösung, v, wäßrige Harnstofflösung und Aminosäure-Lösung. Ein derartiges wäßriges Lösungsmittel wird üblicherweise in dem Verhältnis von fünfmal bis einhundertmal, vorzgsweisc zehnmal bis fünfzigmal (bezogen auf das Gewicht) bezüglich des Ausgangsmaterials verwendet, ya Das am meisten zu bevorzugende wäßrige Lösungsmittel für die Verwendung in dieser Erfindung ist Wasser oder eine verdünnte alkalische Lösung von weniger als I N.

Der so erhaltene Extrakt wird dann durch Ultnifiltrie- v, rung (Ultrafiltration), Aussalzen, Dialyse, umgekehrte Osmose oder andere Mittel raffiniert und gereinigt, die entweder allein oder in Kombination angewendet werden können, um die niedermolekularen Substanzen (solche mit Molekulargewicht von weniger als 5()00) aus bo dem Extrakt zu entfernen. Diese Raffinierungsltiehandlung liefert ein stickstoffhaliges Polysaccharid, das eine hervorragende antitumorerzeugende Wirksamkeit besitzt.

Die aus den stickstoffhaltigen Polysacchariden zusammengesetzten Substanzen, die nach dem Verfahren der Erfindung erhalten werden, zeigen eine hervorragende antitumorerzeugende Aktivität mit insbesondere hoher Inhibitionswirkung gegen festen Sarcoma-180-Krebs (Sarcoma-180 solid cancer), und das nicht nur bei intraperitonealer Verabreichung sondern auch bei oraler Verabreichung an Mäusen. Das bedeutet, daß die stickstoffhaltigen Polysaccharide dieser Erfindung ein hervorragendes Antikrebsmittel liefern können, und eine solche Wirkung ist in vielen Experimenten bestätigt worden. Die Verwendung Her gemäß der Erfindung erhaltenen Substanzen ist nicht auf die oralen Verabreichungen zur Erzeugung der antitumorerzeugenden Wirksamkeit beschränkt; sie stimulieren auch Immunitätsreaktionen. Genauer gesagt es wurde festgestellt, daß diese Substanzen nicht nur zur Verhinderung von Nebenwirkungen bei den chemiscnen therapeutischen Behandlungen von Patienten, die Tumor hatten und erhöhte Anfälligkeit bei Bestrahlungsbehandlungen zeigten, wirksam waren sondern auch zum Hemmen einer Abnahme der Immunität oder der physischen Kräfte des Patienten, die von einer Operation oder Bluttransfusion herrührte, wirksam waren oder Widerstandskraft gegen Virus- oder Bakterieninfektion verliehen, wenn die Immunität cder die physischen Kräfte des Patienten gering waren. Es wurde ebenfalls festgestellt, daß orale Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanzen eine hervorragende Wirkung zur Verbesserung der Leberfunktion ausübten, Appetit anregten, intest'inale Störungen heilten und Urinieren förderten. Sie erwiesen sich ebenfalls bei der Behandlung von Lepra als wirksam.

Wie oben beschrieben wurde, können gemäß dem Verfahren dieser Erfindung die stickstoffhaltigen Polysaccharide, die eine hervorragende antitumorerzeugende Wirksamkeit nicht nur bei intraperitonealer Verabreichung sondern auch bei oraler Verabreichung zusätzlich zu den anderen Wirkungen wie sie oben erwähnt sind, erzeugen, in einer hohen Ausbeute und mit einem relativ einfachen Verfahren erhalten werden, wie es in den folgenden Ausführungsformen der Erfindung noch näher beschrieber; wird. Daher liefert die vorliegene Erfindung einen hohen technischen Beitrag zur industriellen Herstellung von Antikrebssubstanzen von Basidiomycetes.

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand einiger bevorzugter Ausführungsbeispiele detaillierter beschrieben.

Beispiel 1

Myzele von Coriolus versicolor (Fr.) Quel, die durch künstliche Kultur erhalten worden waren, wurden bis auf 10% Wassergehalt getrocknet und in fünf Abschn'tte unterteilt, und dann wurde jeder Abschnitt mit der 12,5fachcn Wassermenge (bezogen auf das Gewicht) gemischt und in einen Autoklav gegeben, woraufhin Extraktion in dem Autoklav unter den in Tabelle 2 angegebenen Extraktionsbedingungen folgte. Der von jedem Abschnitt erhaltene Extrakt wurde dann filtriert, um die Extraktlösung allein '.u fraktionieren, und die erhaltene Extraktlösung wurde einer 72stündigen Fließwasserdialyse bei 5°C unterworfen, indem ein bialyserohr (Visking Tube Mfd. von Union Carbide Corp.) gemäß einem normalen Verfahren verwendet wurde. Durch diese dialytische Behandlung wurden die Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht (solche mit Molekulargewicht von weniger als 5000) aus dem Extrakt eliminiert. Die Dialysatlösung wurde weiter konzentriert, um leberbraunes Pulver mit Wassergehalt von 7% zu erhalten. Dieses pulverförmige Material

besaß ein mittleres Moleklargewicht von mehr als 10 000, und die Ergebnisse der Elementaranalyse und verschiedene Farbreaktionstests, die in Tabelle 1 angegeben sind, bestätigen, daß dieses Material ein stickstoffhaltiges Polysaccharid war.

Tabelle 1 Farbreaktionstests

Farbreaktion

Farbe Bemerkungen

ff-Naphthol-Schwefelsäurereaktion Rot (Molish-Reaktion)

Indol-Schwefelsäure-Reaktion (Dish-Reaktion) Braun

Anthron-Schwefelsäure-Reaktion Grünlich-blau

Phenol-Schwefelsäure-Reaktion Braun

Trypiophan-Schwefelsäure-Reaktion Rötlich-braun

Lowry-Folin-Verfahren Blau

Ninhydrin-Reaktion nach Chlorwasserstoff- Rötlich-blau säure-Hydroiyse

Saccharid wurde festgestellt

Dito

Peptidbindung wurde festgestellt

«-Aminosäure wiv ^e festgestellt

Aus den Ergebnissen von den oben angegebenen Tests ist ersichtlich, daß die Produkte dieser Erfindung Polysaccharide sind, die hauptsächlich peptidgebundenen Stickstoff enthalten.

Um die antitumorerzeugende Wirkung der gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen stickstoffhaltigen Polysaccharide zu bestimmen, wurde der folgende Test durchgeführt.

Testverfahren:

Sarcoma-180-Tumorzellen wurden in die Abdominalhöhlen von Mäusen verpflanzt, und sieben Tage später (nach ausreichender Vervielfältigung der Zellen) wurden iö⁶ Stücke der Zelien weiter in subcutane Bereiche der Achselhöhlen von anderen Gruppen von Mäusen transplai/.iert, um feste Tumore zu entwickeln. Intraperitoneale Verabreichung der Substanz dieser Erfindung wurde von der 24. Stunde nach der Transplantation begonnen. Die Substanz wurde zehnmal, einmal am Tag, jedoch nur jeden zweiten Tag, in der Dosis von 10 mg/kg pro Verabreichung für die gesamte Menge von 0,2 ml/20 g (Körpergewicht der Maus) verabreicht. Am 25. Tag nach der Transplantation wurde der Tumor in jeder Maus ausgeschält und dessen Gewicht gemessen. Die Leistungsfähigkeit der Tumorwachstumshemmung der Substanz dieser Erfindung wurde aus dem mittleren Gewicht von Tumoren in der Gruppe von Mauser* denen die Substanz dieser Erfindung verabreicht worden war, und dem mittleren Gewicht von Tumoren in dem Kontrollbeispiel berechnet.

Im folgenden werden das Testverfahren sowie Einzelheiten näher beschrieben, nach denen die in Tabelle 2 angegebenen Daten erhalten wurden.

Einer Maus vom ICR-JCL-Stamm, die 20 g wog, wurden Sarcoma-180-Tumorzellen vom festen Typ intraperitoneal eingeimpft. Nach einer Woche, als sich die transplantierten Zellen in der Maus hineichend vermehrt hatten, wurden die Tumorzellen der Maus in den Achselhöhlenbereich einer anderen Gruppe von Mäusen des gleichen Stammes mit einer Rate von IxIO⁶ Zellen/Maus subkutan transplantiert. Diese Mäuse wurden in mehrere Gruppen unterteilt (in diesem Falle in siebe".Gruppen, wobei eine Gruppe aus 10 Mäusen bestand), und die siebente Gruppe wurde für Vergleichszwecke verwendet. Die erste Verabreichung der Polysaccharide wurde intraperitoneal nach 24 Stunden nach der Transplantation durchgeführt, und die Verabreichung wurde danach einen um den anderen Tag neunmal wiederholt. Diese Mäuse wurden bis fünf Tage nach der letzten Verabreichung (der zehnten) jo beobachtet, und nachdem ihrejeweilgen Körpergewichie durch Wiegen bestimmt worden waren, wurden sie getötet, und jeder Tumor wurde aus dem Körper herausgeschnitten.

Das Gewicht (g) des Tumors in jeweils einer Maus der J5 Gruppe 5 (Probe Nr. 5 wurde in diesem Falle verabreicht) betrug:

40 0,3 (T₁), 0.4(T₂), 0,3 (T₃), 0,2(T₄). 0,1 [T₅), v,2 (T₆).
0,3 (T₇), 0,2(T₈), Oj (T₉), 0,2(T₁₀).

45 wobei T, die spezifische Zahl von jedem Tumor von jeder Maus war, die mit dem Produkt Nr. 5 der vorliegeden Erfindung behandelt worden war.

Das Gewicht (g) des Tumors einer jeden Maus der Vergleichsgruppe (bei der transplantiert worden war.

der jedoch nur eine wäßrige (Koch-) Salzlösung, die nicht das Produkt der Erfindung enthielt, verabreicht worden war) betrug:

5,2 (C₁), 5,6 (C₂). 5.2 (C₃), 5,0(C₄), 4,7 (C₅), 4,4 (C₆),
4,2(C₇), 3.5 (C₈), 3,8 (C₉), 3,5 (C₁₀).

55

60 wobei Ci die spezifische Zahl von jedem Tumor jeder Maus für den Vergleich war.

Das »Hemmur.gsverhältnis (%)«, das die Antitumorwirksamkeit des Produktes Nr. 5 in der vorliegenden Erfindung darstellt, wurde durch die folgende Formel erhalten:

Hemmungsverhältnis (%)
C-T

100

4,51 - 0,23
0,23

100 = 94,9% .

Die Ergebnisse der Messungen sind in Tabelle 2 in zusammengefaßter Form angegeben. Die speziellen Daten zur Herstellung der jeweiligen Proben, die in diesem Test verwendet wurden, d. h. die Menge des verwendeten wäßrigen Lösungsmittels (Wasser), Extraktionstemperatur und -zeit, Extraktionsrate, Selektivität und Ausbeute sind ebenfalls in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Probe-Nr.	Wassermenge	Tempe ratur	Zeit	/»	F.xtraktions- rate	Selek tivität	Ausbeute bzgl. Pilz	Hemmung gegen Sarcoma-180	Stickstoff gehalt
	(Gewichts verhältnis zum Pilz)	( Ο	(Min.)	(kg/cm²)	(%)	(%)	(%)	(%)	(%)
1	12,5	120	360	2,0	34,5	52.2	18.1	89.9	0.71
2	12,5	150	60	5,0	51.5	52.5	27,1	87,9	0.72
3	12,5	160	60	6.3	62,0	68.1	42,4	91.0	0,72
4	12.5	165	30	7.2	68.8	59,0	40,6	93.0	0.73
5	12,5	180	20	10,2	80,6	70,6	57,0	94.9	0.73
Vergl. Beispiel	12,5	98	360		21.6	-»7,9	10,4	89,8	0.71

Bemerkungen:

(1) Das Vergleichsbeispiel ist eine Probe, die unter Verwendung der gleichen Basidiomycetes wie bei den erfindungsgemäßen Proben 1 bis 5 hergestellt worden war. wobei jedoch unter einem normalen Druck gemäß einem herkömmlichen Verfahren extrahiert worden war.

(2) »Extraktionsrate« ist der gelöste Anteil Pilze, der als Ausgangsmaterial verwendet wurde, ausgedrückt durch Gewichts-%.

(3) »Selektivität« ist ^ie prozentuale Ausbeute an stickstoffhaltigen Polysacchariden mit Molekulargewichten von mehr als 10000, die von dem Extrakt erhalten wurden.

(4) »Ausbeute bzgl. Pilzen« ist die prozentuale Ausbeute bezüglich der gesamten zugeführten Pilze an stickstoffhaltigen Polysacchariden mit Molekulargewichten von mehr als 10000.

Aus den in Tabelle 2 angegebenen Ergebnissen ist ersichtlich, daß in den Tests, die an den Mäusen durchgeführt worden waren, denen subcutan Sarcoma-180-Tumorzellen eingepflanzt worden waren, jedes der stickstoffhaltigen Polysaccharide, die unter den Extraktionsbedingngen gemäß der Erfindng erhalten worden waren, eine gleiche oder höhere antitumorerzeugende Wirksamkeit im Vergleich zu den ähnlichen Präparationen zeigte, die unter den herkömmlichen Extraktionsbedingungen erhalten worden waren, und es soll besonders festgestellt werden, daß die Ausbeute bezüglich der Menge der verwendeten Pilze bemerkenswert verbessert wurde.

Beispiel 2

Die Mycele des gleichen Basidiomycete, der in Beispiel 1 verwendet worden war, wurden in acht Gruppen unterteilt, und jede Gruppe wurde zusammen mit der 12^>fachen Menge (bezogen auf das Gewicht der Mycele) einer alkalischen oder im wesentlichen neutralen wäßrigen Lösung, die in Tabelle 3 angegeben

4) ist. in einen Autoklav gegeben, worauf Extraktion unter den Druck- und Temperaturbedingungen erfolgte, die ebenfalls in Tabelle 3 angegeben sind. Nach der Extraktion wurde das Material in dem Autoklav neutralisiert und filtriert, ·τη die Extraktlösung durch Abtrennen der unlöslichen bestandteile als Extraktionsrest zu fraktionieren. Diese Extraktionslösung wurde einer Dialysebehandlung gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, unterworfen um die Substanzen mit einem mittleren Molekulargewicht von mehr als 10 000 zu gewinnen. Als diese Substanzen durch verschiedene Farbreaktionen, die in Tabelle 1 angegeben sind, getestet wurden, wurde bestätigt, daß sie stickstoffhaltige Polysaccharide waren. Um die antitumorerzeugende Wirkung der so erhaltenen stickstoffhaltigen Polysaccharide zu bestimmen, wurden die Proben 1 bis 8 dieser Substanzen Mäusen verabreicht, denen subcutan Sarcoma-180 transplantiert worden war. Die Ergebnisse zeigten, daß diese Substanzen gleiche oder höhere antitumorerzeugende Wirkung im Vergleich zu den stickstoffhaltigen Polysacchariden, die gemäß dem herkömmlichen Heißwasser-Extraktionsverfahren unter normalem Druck erhalten worden waren, erzeugten.

ίο

Tabelle 3	Lösungsmittel	Tempe ratur	Zeit	P	Extrak tionsrate	Selek tivität	Ausbeute bzgl. Pilze	Hemmung gegen Sarcomat- 180	Stickstoff gehalt
Proben- Nr.		CO	(Min.)	(kg/cm²)	(%)	(%)	(%)	(%)	(%)
	0.1 N-NaHCO,	120	60	2.0	40.0	58,0	21,2	92	4,92
1	2 N-NaHCO₃	160	60	6.3	74,4	36,6	27,0	90	4,12
2	0,1 N-NaHCO,	160	60	6.3	50,7	46,8	24,6	92	3,65
3	0,1 N-NaHCO₃	180	20	10,2	57,4	51,9	29,8	92	2,12
4	0,1 N-NaHCO₃	200	20	15.5	84,3	50,3	42,4	98	1,25
5	0,1 N-NaC)H	180	60	10.2	72,6	50,0	38,1	91	2,39
6	14% NHjOH	180	180	18.0	68.9	30.5	21.0	94	5.29
7	I % L-Glutamin	200	10	15.5	85,1	55,1	46,9	92	3,42
8	O.I N-NaOH	98	60		22.3	38,1	8,5	90	4,91
Vergl. Beispiel

Bemerkungen:

(1) Das Vergleichsbeispiel ist eine Probe, die unter Verwendung desselben Basidiomycetes wie bei den erfindungsgemäßen

Proben 1 bis 8 nach dem herkömmlichen Normaldruck-Heißwasser-Extraktionsverfahren hergestellt worden war. (2l Die anderen Angaben sind die gleichen, wie sie in Verbindung mit Tabelle 2 erklärt wurden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung antitumorwirksamer Substanzen, die aus stickstoffhaltigen Polysacchariden zusammengesetzt sind, durch Extraktion des Pilzes der Klasse Basisdiomycetes mit einem wäßrigen Lösungsmittel und Reinigen des erhaltenen Extraktes, dadurch gekennzeichnet, daß der zu der Coriolus genus der Polyporaceae-Familie gehörende Pilz mit einem wäßrigen Lösungsmittel unter einem Druck von 1,8 bis 20 kg/cm² bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 120 bis 200⁰C extrahiert und das so erhaltene Produkt so lange gereinigt wird, bis alle niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt sind.