DE69330767T2

DE69330767T2 - Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors

Info

Publication number: DE69330767T2
Application number: DE69330767T
Authority: DE
Inventors: Murayama Ryuji; Morimoto Toshihisa; Miyazaki Toshiyuki
Original assignee: Nagata Sangyo Co Ltd; Nisshin Pharma Inc
Current assignee: Nisshin Pharma Inc
Priority date: 1992-04-22
Filing date: 1993-04-21
Publication date: 2002-09-05
Anticipated expiration: 2013-04-22
Also published as: CA2094481A1; CA2094481C; EP0567088A3; EP0567088A2; EP0567088B1; JPH05301898A; AU3708093A; US5332803A; DE69330767D1; AU666531B2; JP3195937B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Amylase- Inhibitors aus Weizen, Weizenmehl oder Weizengluten.
Seit einigen Jahren nimmt die Zahl der Stoffwechselkrankheiten, wie Diabetes, stark zu, da die Ernährungsgewohnheiten reichhaltiger werden. Die Aufnahme von übermäßigen Nahrungsstoffen induziert die Sekretion einer großen Menge an Insulin, welches indirekt einen Zusammenbruch des Stoffwechselgleichgewichtes bewirkt und so zu einer Reduktion der Glucose tolerierenden Funktion (Hyperglykämie), zu Diabetes, Hyperlipämie, Arteriosklerose, etc. führt. Insbesondere bei Diabetes-Patienten ist die Insulinfunktion nicht ausreichend und die Glucosetoleranz ist herabgesetzt, so dass die Glucosekonzentration im Blut nach Mahlzeiten stark ansteigt, was Komplikationen herruft, wie Schäden an den Blutkapillaren und Arteriosklerose.
Für die Prophylaxe und die Behandlung von solchen Krankheiten sind Nahrungsmittel oder Materialien wirksam, die kaum einen Anstieg der Glucosekonzentration im Blut induzieren, oder die zur Hemmung der Sekretion einer großen Menge an Insulin nach Aufnahme der notwendigen Nahrungsstoffe in der Lage sind. Somit besteht ein Bedarf für ein Material, welches die Hydrolyse der aufgenommenen Stärke in Glucose hemmen kann oder das vor einer Sekretion von Insulin bewahrt.
Unter obigen Aspekten wurden verschiedene Studien mit einem Amylase- Inhibitor durchgeführt, der die Aktivität der Amylase, welche Stärke in Glucose hydrolysiert, hemmen kann. Es ist bekannt, dass Amylase-Inhibitoren im Weizen vorkommen. Seit dieser Erkenntnis werden Amylase-Inhibitoren aus dem Weizen untersucht.
Das U.S.-Patent 3,950,319 offenbart, dass der Amylase-Inhibitor, der aus dem Weizen mit Wasser, einer Säure oder einem wässrigen Alkohol extrahiert wird, für die Behandlung von Diabetes, Fettsucht und ähnliches verwendet werden kann.
Der frühere Amylase-Inhibitor aus dem Weizen erreicht nicht die erwartete Wirkung, wenn er oral verabreicht wird. Er hat ferner den Nachteil von hohen Kosten und einer reduzierten Hemmung des Abbaus zu Glucose, insbesondere hinsichtlich des Abbaus von erhitzter Stärke, wie gekochter Reis.
Es hat sich herausgestellt, dass ein Amylase-Inhibitor selektiv mit einer hohen Ausbeute aus Weizen, Weizenmehl und Weizengluten gewonnen werden kann, indem zu einem wässrigen Extrakt davon ein Polysaccharid, wie Natriumalginat, hinzugefügt wird, um einen unlöslichen Komplex zu bilden, sowie durch Abtrennung des Polysaccharids von dem Komplex. Die weiteren Studien mit dem Amylase-Inhibitor, der wie oben hergestellt wurde, haben ergeben, dass er eine hohe Amylase-Hemmaktivität, aber auch eine bemerkenswerte Trypsin-Hemmaktivität aufweist.
Wie oben beschrieben, hat der Amylase-Inhibitor eine Aktivität, welche die Hydrolyse von Stärke in Glucose hemmt, wodurch eine Hemmung der Zunahme der Glucosekonzentration im Blut ermöglicht wird, ggf. durch Verhinderung einer Insulinsekretion. Andererseits hat ein Trypsin-Inhibitor allgemein eine Aktivität, die eine Hypersekretion des Pankreassaftes, der eine große Menge an Amylase enthält, fördert und so einer Einsparung der Insulinsekretion entgegensteht, die durch einen Amylase-Inhibitor erzielt wird. Ferner wird ein Trypsin-Inhibitor die Amylase-Hemmwirkung des Amylase- Inhibitors beeinflussen und wird eine Hypertrophie der Bauchspeicheldrüse induzieren, was ein Risikofaktor für die Entstehung eines Bauchspeicheldrüsen-Krebses darstellt. Somit sollte die Aufnahme eines solchen Trypsin-Inhibitors über einen längeren Zeitraum vermieden werden.
Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors aus einem Extrakt von Weizen, Weizenmehl oder Weizengluten bereit zu stellen, wobei der Amylase-Inhibitor eine sehr hohe Aktivität hinsichtlich der Amylasehemmung, aber keine oder nur eine sehr geringe Aktivität hinsichtlich einer Trypsinhemmung aufweist. Die Erfindung bezieht sich somit auf Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors, welches die Schritte umfasst:
(a) Extraktion von Weizen, Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer verdünnten Säure, einer verdünnten Lauge oder einem wässrigen Alkohol, um eine Lösung herzustellen, die den Amylase-Inhibitor enthält;
(b) Zugabe eines Polysaccharids zu der Lösung, um einen unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors mit dem Polysaccharid zu bilden, und Trennung des unlöslichen Komplexes von der Lösung;
(c) Lösen oder Dispergieren des Komplexes in einer Lösung, anschließende Trennung des Polysaccharids von der Lösung, um eine Lösung zu erhalten, die den Amylase-Inhibitor enthält; und
(d) Behandlung der erhaltenen Lösung mit einem Kationenaustauscher, um den Amylase-Inhibitor aus den Fraktionen zu gewinnen, die nicht an dem Kationenaustauscher adsorbiert wurden.
Am bevorzugtesten für die Extraktion eines Amylase-Inhibitors gemäß Schritt (a) ist Wasser, wobei aber eine verdünnte Säure, eine verdünnte Lauge oder ein wässriger Alkohol anstelle von Wasser auch verwendet werden können. Als verdünnte Säure kann eine saure, wässrige Lösung mit einem pH von etwa 2-6 verwendet werden, der mit einer anorganischen Säure, wie Salzsäure oder Phosphorsäure, oder mit einer organischen Säure, wie Essigsäure, eingestellt ist. Als verdünnte Lauge kann eine basische, wässrige Lösung mit einem pH von etwa 8-10 verwendet werden, der mit einer Base, wie Ammoniak oder Natriumhydroxid, eingestellt ist. Als wässriger Alkohol kann eine wässrige Alkohollösung verwendet werden, die eine Alkoholkonzentration von etwa 1-50% besitzt. Die verwendeten Alkohole umfassen Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol und dergleichen.
Bei der Extraktionsbehandlung können verschiedene Verfahren verwendet werden, wie (i) ein Verfahren, umfassend die Extraktion von Weizen, Weizenmehl oder Weizengluten mit einer ausreichenden Menge (normalerweise etwa die 3-50 -fache Menge) an Wasser, einer verdünnten Säure, einer verdünnten Lauge oder einem wässrigen Alkohol, wobei in der Regel bei einer Temperatur von etwa 10-40ºC gerührt und anschließend die Feststoffe durch geeignete Mittel, wie Zentrifugieren, Filtrieren oder Stehen lassen, entfernt werden, um eine Lösung zu erzielen, die einen Amylase-Inhibitor enthält, und (ii) ein Verfahren, welches als Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung die Abfallflüssigkeit oder die Waschwasser von der teigartigen Masse oder dem Rührteig verwendet, die bei dem Verfahren zur Herstellung von Stärke oder Gluten aus Weizenmehl ausgetragen werden.
Das Verfahren (ii) ist aufgrund der effizienten Verwendung der Abfallflüssigkeit (Waschwasser), die bei der Herstellung von Stärke und Gluten nach den Martins und Batter's Verfahren ausgetragen wird, vorteilhaft. Das Verfahren (ii) umfasst das Kneten einer Mischung von Weizenmehl und Wasser, um eine teigartige Masse oder einen Rührteig herzustellen, dessen Altern durch sorgfältige Hydratisierung von Gluten, wiederholtes Waschen des Teigs mit zugefügtem Wasser, das Trennen des Glutens und der Stärkemilch (Gluten- Waschwasser) und die Gewinnung der Stärke aus der Stärkemilch durch Maßnahmen, wie eine mechanische Trennung. Die Abfallflüssigkeit, die von dem Waschen mit Wasser abstammt, enthält einen Amylase-Inhibitor und kann als eine einen Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung dienen, die im Schritt (a) der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird.
Die Amylase-Inhibitor enthaltende und in Schritt (a) extrahierte Lösung (im folgenden als "Extraktionslösung" bezeichnet) kann direkt dem folgenden Schritt (Schritt (b)) zugeführt werden, bei dem ein unlöslicher Komplex mit einem Polysaccharid gebildet wird. Die Extraktlösung enthält jedoch oft kontaminierende Substanzen, wie lösliche Proteine, lösliche Polysaccharide, anorganische Salze und lösliche Farbstoffe. Deshalb ist es wünschenswert, diese kontaminierenden Substanzen zu entfernen, insbesondere die löslichen Proteine, bevor mit dem Schritt (b) fortgefahren wird. Das Verfahren zur Entfernung der kontaminierenden Substanzen kann eine Erhitzung der Extraktlösung auf 70-90ºC, vorzugsweise auf 85-90ºC, oder eine Einstellung des pH's der Extraktlösung auf den Bereich von 2 bis 4 oder eine Kombination der Erhitzung und der pH-Einstellung umfassen. Bei diesem Verfahren werden die kontaminierenden Substanzen, wie lösliche Proteine, denaturiert und unlöslich, die dann durch geeignete Mittel von der Extraktlösung abgetrennt werden können.
Falls notwendig, kann die Extraktlösung, von der die kontaminierenden Substanzen entfernt wurden, durch eine Mikrofiltrationsmembran, wie eine poröse makromolekulare Membran mit einer Porengröße von 0,2 um, oder durch einen keramischen Filter für den Ausschluss von Mikroorganismen gefiltert werden.
Anschließend wird die Extraktlösung gemäß Schritt (b) behandelt, wobei diese Lösung mit einem Polysaccharid gemischt wird, welches zur Bildung eines unlöslichen Komplexes mit der Lösung in der Lage ist. Die Art der in Schritt (b) verwendeten Polysaccharide kann in Abhängigkeit von der Temperatur und dem pH der Extraktlösung variieren. Konkrete Beispiele für die Polysacchardie beinhalten solche mit einer Kationenaustauscherfunktion, wie Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, κ-Carrageenan, -Carrageenan und λ-Carrageenan, Pektin, Xanthan und Gellan, wobei Natriumalginat unter dem Aspekt einer Bereitstellung einer erhöhten Ausbeute des unlöslichen Komplexes bevorzugt ist.
Die Polysaccharide werden bevorzugt in einer Menge von 50-600 ppm der Extraktlösung zugesetzt. Die Bildung des unlöslichen Komplexes wird vorzugsweise unter Aufrechterhaltung eines pH's der Extraktlösung im Bereich von etwa 1-6 und vorzugsweise bei Zimmertemperatur oder unter Kühlung durchgeführt, wobei die Bildung aber auch unter Erwärmung durchgeführt werden kann. Im allgemeinen wird der unlösliche Komplex durch Zugabe des Polysaccharids zu der Extraktlösung gebildet. Anschließend wird der pH der Extraktlösung auf 2-5 eingestellt und die Mischung wird bei Raumtemperatur oder unter Kühlung (normalerweise bei etwa 1-30ºC) für einen Zeitraum von einigen zehn Minuten bis einigen Stunden gerührt. Der erzielte unlösliche Komplex wird von der Extraktlösung durch Filtration, Zentrifugationstrennung oder durch eine andere geeignete Methode getrennt.
Der in Schritt (b) abgetrennte unlösliche Komplex wird dann in einer Lösung gelöst oder dispergiert, z. B. in Wasser, einer wässrigen Lösung einer schwachen Lauge, wie Ammoniak oder Ammoniumhydrogencarbonat, einer wässrigen Lösung eines Salzes, das weder Calcium noch Kalium enthält, und ähnliches. Dieser Vorgang wird bei Raumtemperatur oder vorzugsweise bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt, normalerweise bei einer Temperatur von 30 bis 7000.
Dann wird der Lösung oder der Dispersion, die den Amylase-Inhibitor und das Polysaccharid enthält, ein Metall-Ion, wie Kalium-, Calcium-, und Magnesium-Ionen, zugefügt, um eine Gelierung des Polysaccharids zu bewirken, wodurch ein unlöslicher Feststoff gebildet wird, während der Amylase-Inhibitor gelöst in der Lösung verbleibt. Eine den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung kann durch Abtrennung und Entfernung des Polysaccharids-Gels von der Lösung mittels eines geeigneten Verfahrens (Schritt (c)) gewonnen werden.
Von den oben erwähnten Polysacchariden können insbesondere Natriumalginat, κ-Carrageenan, -Carrageenan und λ-Carrageenan ein unlösliches Gel durch Zugabe von Metall-Ionen, wie Kalium-, Calcium- oder Magnesium- Ionen, einfach bilden.
Die den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung, von der das Polysaccharid entfernt wurde, wird anschließend mit einem Kationenaustauscher behandelt, um den gewünschten Amylase-Inhibitor aus den Fraktionen zu gewinnen, die nicht an dem Kationenaustauscher adsorbieren (Schritt (d)).
In diesem Fall kann die in Schritt (c) erzielte und den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung als solche mit einem Kationenaustauscher in Schritt (d) behandelt werden oder einem anderen Reinigungsschritt, sofern notwendig, unterworfen werden und anschließend der Kationenaustauscher-Behandlung. Im allgemeinen ist die Behandlung mit einem Kationenaustauscher nach dem anderen Reinigungsschritt wünschenswert, um einen Amylase- Inhibitor mit einer hohen Amylase-Hemmaktivität und einem geringen Gehalt an nicht erwünschten Substanzen, wie einen Trypsin-Inhibitor, herzustellen.
Wenn andere Reinigungsschritte vor der Kationenaustauscher-Behandlung nach Schritt (d) angewendet werden sollen, wird die in Schritt (c) erzielte und den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung erhitzt, z. B. auf 70-90ºC, um die noch in der Lösung befindlichen, kontaminierenden Substanzen, wie Hitze instabile Proteine, zu denaturieren und zu verfestigen. Die Feststoffe werden abgetrennt und entfernt. Die verbleibende Lösung wird, falls gewünscht, weiteren Behandlungen unterworfen, wie Durchgang durch eine Ultrafiltrationsmembran oder einer Gelfiltrations-Chromatographie, um überschüssige Salze und andere niedrigmolekulare, kontaminierende Substanzen vor der Konzentrierung zu entfernen. Als Ultrafiltrationsmembranen werden vorzugsweise solche verwendet, die ein Polyacrylnitril, Polyolefin, Polyimid oder eine Cellulosematerial umfassen und ein Ausschlussfraktionier-Molekulargewicht von 20000 Dalton haben.
Bei der Behandlung der den Amylase-Inhibitor enthaltenden Lösung mit einem Kationenaustauscher können Kationenaustauscher wie Kationenaustausch-Polymerharze, Kieselsäure und Aluminiumsilikat verwendet werden. Kationenaustausch-Polymerharze, wie Diaion HPK-55 (Handelsname; hergestellt von Misubishi Kasei Kogyo K. K), sind bevorzugt. Die Behandlung mit einem Kationenaustauscher kann entweder mit einem diskontinuierlichen Verfahren, welches das Rühren eines zu der Lösung hinzugefügten Kationenaustauscher beinhaltet, oder mit einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt werden, welches die Passage der Lösung durch einen in einer Säule eingebrachten Kationenaustauscher beinhaltet. Das kontinierliche Verfahren ist bevorzugt. Bei der Behandlung mit dem Kationenaustauscher wird die den Amylase-Inhibitor enthaltende Lösung vorzugsweise auf einen pH von 6 bis 9 eingestellt, wodurch der Amylase-Inhibitor in der Lösung als Fraktion gewonnen wird, welche die Säule passiert, oder als Fraktion, die nicht an dem Kationenaustauscher adsorbiert (im Falle des diskontinuierlichen Verfahrens). Durch diese Kationenaustauscher-Behandlung wird ein schädlicher Trypsin-Inhibitor an dem Kationenaustauscher adsorbiert und ein Amylase- Inhibitor, der keinen oder nur einen sehr geringen Trypsin-Inhibitor enthält, wird in großer Ausbeute gewonnen.
Die nicht an dem Kationenaustauscher adsorbierten Fraktionen, die in der obigen Kationenaustauscher-Behandlung (Schritt (d)) erzielt werden, können, falls notwendig, einer mikrobiellen Eliminations- oder Sterilisationsbehandlung (zum Beispiel Erhitzung, Alkoholsterilisation oder Filtration, um Mikroorganismen zu eliminieren) oder einer Konzentrierungsbehandlung unterworfen werden. Anschließend wird eine Trocknung durchgeführt, um den gewünschten Amylase-Inhibitor in Festform, wie Pulver, herzustellen. Die Trocknungsbehandlung kann mit jeder geeigneten Methode durchgeführt werden, wie Gefriertrocknung, Trocknung unter reduziertem Druck, Sprühtrocknung, Kugeltrocknung oder ähnliches.
Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren kann ein Amylase-Inhibitor mit hoher Ausbeute hergestellt werden, der keine oder nur eine sehr gering Trypsin-Hemmaktivität, aber eine sehr hohe Amylase-Hemmaktivität aufweist. Dieser Amylase-Inhibitor mit einer hohen, hemmenden Aktivität gegen Amylase, die in dem Pankreassaft enthalten ist, ist wirksam hinsichtlich einer Hemmung der Insulinsekretion und ist ferner auch hochwirksam bei der Hemmung des Abbaus von gekochter Stärke, wie gekochter Reis, oder der Hemmung der Hydrolyse zu Glucose.
Die Analyse des vorliegenden Amylase-Inhibitors durch eine Polyacrylamid- Elektrophorese gemäß der Methode von Davis et al. (Annals New York Academy of Sciences, Bd. 121, Seite 404, 1985) ergab, dass darin eine große Menge eines Proteins mit einem Molekulargewicht von etwa 24000 und einer elektrophoretischen Beweglichkeit von etwa 0,19 enthalten war.
Der durch das vorliegende Verfahren hergestellte Amylase-Inhibitor kann allein oder in Kombination mit bekannten Trägerstoffen und Hilfsstoffen für pharmazeutische Zubereitungen in Form einer flüssigen Zubereitung oder als feste Zubereitung, wie Körner und Tabletten, als Mittel zur Hemmung eines Anstiegs der Glucosekonzentration im Blut oder als Mittel zur Steuerung einer Insulinsekretion verwendet werden. Ferner kann der Amylase-Inhibitor der gemäß dem erfinderischen Verfahren hergestellt wurde, als Nahrungsmittelzusatz, insbesondere für Kohlenhydrat-Nahrungsmittel, die reich an Stärke sind, wie Brot und Plätzchen, oder als Zusatz zu Tee, Suppen, gewürzte Fischessen und Brotaufstrich, wie Butter und Marmelade, verwendet werden. Die Menge des Amylase-Inhibitors, der Menschen verabreicht oder den Nahrungsmitteln zugesetzt wird, kann adäquat in Abhängigkeit von den Bedingungen und Symptomen des Patienten oder der Natur und der Menge an aufzunehmender Nahrung kontrolliert werden. Die Menge an Amylase-Inhibitor, der als Zusatz zu Nahrungsmitteln aufgenommen wird, kann zum Beispiel in dem Bereich von 0,1 bis 20 g, vorzugsweise bei etwa 0,4 bis 8 g pro Mahlzeit liegen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen dargestellt, bei denen die folgenden Methoden durchgeführt wurden: Bestimmung des Gesamtproteingehaltes; des Gehaltes eines Proteins mit einer elektrophoretischen Beweglichkeit von etwa 0,19 (im folgenden als "0,19 Al" bezeichnet), wenn eine Polyacrylamid-Elektrophorese gemäß dem Verfahren von Davis et al., wie oben dargestellt, durchgeführt wurde; der Trypsin-Hemmaktivität; der Glucosekonzentration im Blut sowie der Insulinmenge.

Bestimmung des Gesamtproteingehaltes

Der Gesamtproteingehalt wurde nach der Methode von Kjeldahl unter Verwendung eines KJELTEC AUTO 1030 Analysators, hergestellt von Tecator, Schweden, bestimmt.

Bestimmung des 0,19 Al Gehaltes

Eine Testprobe wurde in einer 0,1% wässrigen Lösung von Trifluoressigsäure gelöst, und die Lösung wurde unter den unten dargestellten Bedingungen einer Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie unterworfen, um den Peakbereich für 0,19 Al in dem Chromatogramm zu bestimmen. Eine authentische Probe von 0,19 Al (Reinheit 100%) wurde unter den gleichen Bedingungen, wie oben dargestellt, der Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie unterworfen, um den Peakbereich für 0,19 Al in dem Chromatogramm zu messen. Der 0,19 Al Gehalt in der Probe wurde nach der folgenden Gleichung berechnet:
0,19 Al Gehalt in der Testprobe (%) = (Sa/St) · 100, wobei
Sa = Peakbereich für 0,19 Al in der Testprobe und
St = Peakbereich für 0,19 Al in der authentischen Probe ist.

Chromatographische Bedingungen:

Säule
Packungsmaterial: CAPCELL PAK C18 SG120A (Partikelgröße 5 um) (hergestellt von Shiseido Co. Ltd.)
Größe: 4,6 mm Durchmesser · 250 mm
Temperatur: 50ºC
Fließrate: 1 ml/Min.
Nachweis: Absorption bei 280 nm
Mobile Phase: lineare Hochdruck-Gradientenelution mit einem unten gezeigten Zeit/Konzentrationsgradienten, bestehend aus
Lösung A: 0,1% wässrige Lösung von Trifluoressigsäure, und
Lösung B: wässrige Lösung von 80% Acetonitril und 0,1% Trifluoressigsäure.

Bestimmung der Trypsin-Hemmaktivität

Die Trypsin-Hemmaktivität wurde gemäß der Methode von Kakade (Kakade et el., Cereal Chem., Bd. 51; Seite 376, 1974) bestimmt. Eine wässrige Lösung der Testprobe wurde zu einem Enzym-Reaktionssystem von Rinder- Trypsin unter Verwendung von Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid als Substrat zugefügt. Ein Abfall der dadurch induzierten Trypsinaktivität wurde als Trypsin-Hemmaktivität, ausgedrückt in gehemmte Trypsin-Einheiten (TIU), definiert. Das Rindertrypsin wurde in einer Menge verwendet, die zu 60 TU äquivalent war, ausgedrückt in dem Aktivitätsausdruck, der bei dem Kakade- Verfahren definiert ist. Die Menge der zugefügten, wässrigen Probelösung wurde so eingestellt, dass die Enzymreaktion zu 40-60% gehemmt wurde.

Bestimmung des Anstiegs der Glucosekonzentration im Blut

Die Glucosekonzentration im Blut wurde mit dem Glucoseoxidase-Verfahren bestimmt und zwar sofort, nachdem Blut aus der Unterarmvene entnommen wurde. Der Anstieg in der Blutkonzentration wurde durch Subtraktion des Hunger-Wertes von dem gefundenen Wert bestimmt. Bei der Messung gemäß dem Glucoseoxidase-Verfahren wurde der Glucose-B-Test Wako (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) verwendet.

Bestimmung des Insulingehaltes

Blut wurde der Unterarmvene entnommen und sofort zentrifugiert, um das Serum zu gewinnen. Der Insulingehalt in dem Serum wurde mit einem Enzym-Immunoassay gemessen. Für den Enzym-Immungssay wurde der Glazyme Insulin-EIA Test (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) verwendet.

Beispiel 1

Zu 800 kg Weizenmehl wurden 110 Liter Wasser zugefügt und die Mischung wurde geknetet, um einen Teig zu erzielen. Der Teig wurde mit 7600 Liter Wasser gewaschen, wodurch 410 kg Gluten und 505 kg Weizenstärke gewonnen wurden. Bis zu diesem Stadium wurden 6200 Liter Abfallflüssigkeit hergestellt. Der pH der Abfallflüssigkeit (wässriger Extrakt) wurde mit Salzsäure auf 3 eingestellt, für 30 Minuten stehen gelassen und mit Ammoniak auf 6,5 eingestellt, wodurch unlösliche Materialien gefällt wurden. Die gefällten Materialien wurden entfernt und es wurden 5200 Liter Überstand (I) erzielt.
Zu dem Überstand (I) wurden 300 ppm Natriumalginat zugefügt. Die Mischung wurde auf pH 4,2 eingestellt und für 30 Minuten gerührt, wobei sich Wasser unlösliche Materialien bildeten. Diese wurden mit einer De Laval Zentrifuge gewonnen. Die erzielte Masse wurde in der zehnfachen Menge Wasser dispergiert. Die Dispersion wurde mit 4,7 kg Calciumchlorid gemischt, gründlich gerührt, mit Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt und stand für eine Stunde. Die festen Materialien wurden mit einer De Laval Zentrifuge abgetrennt und es wurden 600 Liter eines Überstandes gewonnen. In diesem Überstand wurde keine Lektinaktivität gefunden.
Der oben erzielte Überstand wurde mit Salzsäure neutralisiert und die neutralisierte Lösung wurde auf 80ºC für 30 Minuten erhitzt. Die so gebildeten unlöslichen Materialien wurden mit einer De Laval Zentrifuge abgetrennt und es wurde ein Überstand gewonnen. Der Überstand wurde mit einer Ultrafiltrationsmembran (hergestellt von Nitto Denko K. K.; NTU-3250 CIR (Ausschluss 20000 Dalton)) konzentriert, wobei überschüssiges Calciumsalz entfernt wurde, was die konzentrierte Lösung (II) ergab.
140 Liter der konzentrierten Lösung (II) wurden mit Ammoniak auf pH 7,5 eingestellt und durch eine Säule (900 mm in der Länge, 200 mm im inneren Durchmesser) mit einer Fließrate von 1 Liter pro Minute gegeben, wobei die Säule mit 28 Liter Kationenaustauscher-Harz (Diaion HPK-55, hergestellt von Mitsubishi Kasei K. K.) gepackt war. Die nicht an dem Kationenaustauscher- Harz adsorbierten und eluierten Fraktionen wurden gesammelt.
Die eluierten Fraktionen wurden durch einen Keramikfilter für die Elimination von Mikroorganismen gefiltert und wurden anschließend gefriergetrocknet, was zu 1400 g Trockenpulver (III) führte.
Der Überstand (I), die konzentrierte Lösung (II) und das Trockenpulver (III) wurden bezüglich des Gesamtproteingehaltes (%), des 0,19 Al Gehaltes (%) und der Trypsin-Hemmaktivität (TIU/mg) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
* bestimmt in Trockenform
Die Daten in Tabelle 1 zeigen, dass der Amylase-Inhibitor, der durch das Verfahren nach der Erfindung hergestellt wurde, d. h. das Trockenpulver (III), sehr effektiv ist und fast keine Trypsin-Hemmaktivität aufweist.

Beispiel 2

Zehn gesunde Männer (Nicht-Diabetiker) wurden nach 10-stündigem Fasten jeweils 300 g gekochter Reis und 200 ml Tee ohne Zucker gegeben. Blut wurde in 30 Minuten Intervallen nach der Mahlzeit entnommen, um die Glucosekonzentration im Blut und den Insulingehalt zu bestimmen. Der Test wurde insgesamt dreifach für jeden Mann im Wochenabstand wiederholt, wobei der Tee ohne Zucker 0 g, 0,4 g, und 2 g des Trockenpulvers (III) (Amylase-Inhibitor), das im Beispiel 1 hergestellt wurde, enthielt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Die in der Tabelle 2 gezeigten Daten zeigen, dass der Amylase-Inhibitor nach der Erfindung hinsichtlich der Hemmung eines Anstiegs der Glucosekonzentration im Blut und einer Insulinsekretion wirksam ist.
Die Verfahren nach der Erfindung können effektive Amylase-Inhibitoren mit einer hohen Amylase-Hemmaktivität und im wesentlichen keiner Trypsin- Hemmaktivität bereit stellen. Die Amylase-Inhibitoren, die nach dem erfinderischen Verfahren hergestellt werden, haben insbesondere eine hohe Hemmwirkung gegen die Amylase, die in dem Pankreassaft enthalten ist, und können so wirksam eine Sekretion von Insulin hemmen, was für die Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, wie Hyperglykämie, Diabetes, Hyperlipämie, Arteriosklerose und Fettsucht, nützlich ist.
Die Amylase-Inhibitoren, die nach den Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt werden, sind ferner von keinen nachteiligen Reaktionen begleitet, wie Durchfall und Brechreiz, wenn sie aufgenommen werden. Sie sind gaumenfreundlich und einfach aufnehmbar.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Amylase-Inhibitors, welches die Schritte umfasst:

(a) Extraktion von Weizen, Weizenmehl oder Weizengluten mit Wasser, einer verdünnten Säure, einer verdünnten Lauge oder einem wässrigen Alkohol, um eine Lösung herzustellen, die den Amylase-Inhibitor enthält;

(b) Zugabe eines Polysaccharids zu dieser Lösung, um einen unlöslichen Komplex des Amylase-Inhibitors mit dem Polysaccharid zu bilden, und Trennung des unlöslichen Komplexes von der Lösung;

(c) Lösen oder Dispergieren des Komplexes in einer Lösung, anschließende Trennung des Polysaccharids von der Lösung, um eine Lösung zu erhalten, die den Amylase-Inhibitor enthält; und

(d) Behandlung der erhaltenen Lösung mit einem Kationenaustauscher, um den Amylase-Inhibitor aus den Fraktionen zu gewinnen, die nicht an dem Kationenaustauscher adsorbiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in Schritt (a) erzielte Lösung eine Abfallflüssigkeit oder Waschwasser sind, die bei der Herstellung von Stärke und Gluten durch die Martins und Batter's Verfahren ausgetragen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polysaccharid ein Material ist, das zur Bildung eines unlöslichen Komplexes mit der Extraktlösung, die den Amylase-Inhibitor enthält, in der Lage ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Polysaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, κ- Carrageenan, -Carrageenan, λ-Carrageenan, Pektin, Xanthan und Gellan besteht.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung, die den Amylase-Inhibitor enthält, vor der Durchführung von Schritt (b) einer weiteren Behandlung zur Entfernung von kontaminierenden Substanzen, wie lösliche Proteine, unterworfen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in Schritt (c) erhaltene Lösung, die den Amylase-Inhibitor enthält, vor der Durchführung von Schritt (d) einer Reinigungsbehandlung unterworfen wird.