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Die vorliegende Erfindung betrifft
neue Furane, die mit einer gerinnungshemmenden, Thrombinik-hemmenden
und Thrombose-hemmenden Aktivität
ausgestattet sind, ihre Herstellungsverfahren aus Braunalgen oder
Phaeophycee und ihren relevanten Mischungen für parenterale, orale und topische
Verwendung.
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Es ist seit mehreren Jahren bekannt,
daß Furane,
die aus Braunalgen extrahiert werden, mit einer gerinnungshemmenden
Aktivität
einhergehen (Springer G. F. et Alii "Isolation of anticoagulant fractions
from crude fucoidin" Proc.
Soc. Exp. Biol. Med. 1957 94 404– 9). Das Wissen in diesem
technischen Gebiet zielt darauf ab einige Gesichtspunkte des Verhältnisses
zwischen der Struktur und der pharmakologischen Aktivität dieser Substanzen
zu verstehen. Es wurde festgestellt, daß die gerinnungshemmende Wirkung
direkt vom Sulfat-Gehalt abhängt;
und das sie weiterhin mit sinkendem Uronsäure-Gehalt ansteigt (T. Nishino et Alii "Isolation, purification
and characterization of fucosecontaining sulfated polysaccharides
from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant
activities, Carbohyd. Res. 186, 119 1989; H. Mori et Alii "Sugar constituents
of some sulfated polysaccharides from the sporophylls of wakame
(Undaria pinnatifida) and their biological activities" Mar. Algae Pharm.
Sci. 2.109 1982). Es ist weiterhin bekannt, daß beide, die Gerinnungszeit APTT
und die Thrombinzeit TT in Furan-Fraktionen mit dem Molekülgewicht
zwischen 10000 und 50000 DA ansteigen (Nishino et Alii "The relationship
between the molecular weight and the anticoagulant activity of two types
of fucan sulfates from the brown seaweeds Ecklonia kurome" Agr. Biol. Chem.
55, 791 1991). Andere Autoren (V. Grauffel et Alii "New natural polysaccharides
with potent antithrombotic activity: fucans from brown algae" Biomaterials 10
363 1989) hoben hervor, daß für Furan-Präparate,
die aus A. nodosum, P.canalicculata e F. vesiculosus hergestellt
werden, der hier aufgeführte
Bereich größer ist
und von 18000 bis 80000 Da reicht. Für die letzteren Verbindungen
wurde daneben eine antithrombinische Wirkung nachgewiesen (ausgedrückt in internationalen
Einheiten/mg der Verbindung) die auf die gleiche Weise vom Molekulargewicht
abhängt,
wie die gerinnungshemmende Wirkung. Die Lehren dieses Gebiets zeigen
für beide,
die pharmakologischen Eigenschaften von Furanen und ihren Zusammenhang
zwischen ihrer Struktur und deren pharmakologischen Aktivitäten, daß die wirksamsten
Präparate
unter denen gefunden werden, die Molekülgewichte unterhalb von 80.000
Da haben, die daneben einen hohen Schwefelgehalt aufweisen. Daraus
wird das potentielle therapeutische Interesse an besagten Furanen
verständlich.
Sofern insbesondere die Herstellungsverfahren in der Literatur des
besagten Gebiets betroffen sind, so wurden viele beschrieben, die
im wesentlichen zwei unterschiedliche Vorgehensweisen entsprechen.
In der, der am häufigsten
gefolgt wird, wird das hohe Extrakt aufeinanderfolgenden Trennschritten
unterworfen, wobei jeder eine unterschiedliche physikalische Eigenschaft der
besagten Furanpolymere ausnutzt. Die normalerweise verwendeten Trenntechniken
sind Gelfiltration, Ionentauscher-Chromatographie, fraktionierte
Fällung,
die mittels quartärer
Ammoniumtenside bewirkt wird, oder durch die Zugabe von Wasser-mischbaren
organischen Lösungsmitteln,
wie Ethanol oder Aceton. Die zweite Vorgehensweise basiert auf Methoden,
bei denen das Molekulargewicht verringert wird und angewendet auf
Furane mit hohem Molekulargewicht, d. h. Substanzen, die unter chemischen
Gesichtspunkten homogener sind als die oben aufgeführten Rohextrakte.
Soweit die erste Vorgehensweise betroffen ist, muß hinzugefügt werden,
daß in
der Literatur aus dem betreffenden Gebiet häufig beobachtet wurde, daß die Anzahl
der erforderlichen Schritte in direktem Zusammenhang mit dem Umfang
der pharmakologischen Wirkung, die im Endprodukt vorhanden sein
soll, ansteigt. Geeignete Beispiele hierfür liegen in zwei Veröffentlichungen
vor, die nachstehend zusammengefasst werden. In S. Mauray et Alii "Venous antithrombotic
and anticoagulant activities of a fucoidan fraction" Thromb. and Haemost.
74(5) 1280 1995, wurde ein Furan beschrieben, das aus Ascophyllum
nodosum isoliert wurde, gekennzeichnet durch folgendes unter chemischen
und physiko-chemischen Gesichtspunkten: Durchschnittliches Molekulargewicht
20,000 Da, Fucose 48,6%, Uronsäure
5,8%, Schwefel 9%. Auf der Basis der darin angegebenen Referenzen
bestand der relevante Herstellungsprozess aus folgenden Schritten:
(a) Extraktion in einem wässrigen
Medium aus vegetabilischem Material (b) Trennung mittels quartären Ammoniumsalzen
(c) Trennung durch Säulenausschlußchromatographie.
Die so erhaltene Verbindung induzierte eine signifikante Verlängerung
der Zeit sowohl bei APTT- als auch TT-Tests, die mit einer Dosis
von 20 mcg/ml begannen. Um die gleichen APTT und TT-Werte wie Heparin
zu erhalten, waren Gewichtsmengen besagter Furane erforderlich,
die das 30-40-fache von dem bei Heparin verwendeten ausmachten.
Daneben wurde aus der Untersuchung der ED50-Werte,
die in einem dort beschriebenen experimentellen Thrombose-Model
erhalten wurden, geschlossen, daß die Wirkung besagter Verbindungen
die gleiche war wie die, die von einer Gewichtsmenge Heparin erhalten
wurde, die 17-mal geringer war. In der Veröffentlichung von T. Nishino
et Alii Carbohyd. Res. 186 (1989) 119 (s.oben) wurde ein Herstellungsverfahren
beschrieben, das aus den folgenden Schritten besteht: (a) Extraktion
des getrockneten und geriebenen Ecklonia kurome-Pulvers in kochendem
Wasser , (b) Fällung
mit Cetylpyridinchlorid und Lösen
der Fällung
in 4 M NaCl, (c) Fällung
durch Zugabe von Ethanol und Auflösen in Wasser, (d) Fällung mittels
Kalziumchlorid, Rückgewinnung des Überstands
und Lyophilization, (e) Ionenaustausch-Säulenfraktionierung und Rückgewinnung
der eluierten Fraktionen durch Anwendung auf Bettharz, 0,95 M NaCl
und jeweils 2 M NaCl-Lösungen,
(f) fraktionierte Fällung
die mit den gesammelten Lösungen
durchgeführt
wird, indem Kalziumacetat enthaltendes Ethanol zugefügt wird,
(g) Gel-Filtrationschromatographie.
Die zwei Furan-Präparationen
sind jeweils gekennzeichnet durch die folgenden physiko-chemischen
und chemischen Parameter: Molekulargewicht 32 0000 und 21 000 Da,
Schwefel 14,6 und 13,3%, Fucose 50,1 und 49,5%, Uronsäure 1,5
und 3,9%, spezifische Rotation 142° und 129°. APTT und TT-Aktivitäten der
besagten Verbindungen zeigten einen gegenläufigen Trend. APTT Titer, ausgedrückt in Einheiten/mg
bezogen auf einen Referenzstandard eines Heparin-Präparats,
das eine Stichprobe von 167 I. U./mg hatte, wurde ermittelt als
136 und 142 und damit ziemlich nahe an dem Standard. TT Titer war
dagegen sehr gering, jeweil bei 13 und 11 I. U./mg. Besagte Verbindungen
sind sehr wirksam bei der Hemmung des globalen Mechanismus der Koagulation,
aber selten effektiv bei der Hemmung von Thrombin, welches das Enzym
ist, das bei dem letzten Schritt der Koagulation eine Rolle spielt.
Soweit Depolymerisations-Verfahren betroffen sind, offenbart das
Europäische
Patent Nr. 403 377 Verfahren zur Verringerung des Molekulargewichts
von Furanen, wobei Furane als Startmaterialien verwendet werden,
die einen hohen Schwefelgehalt aufweisen. Letztere Verbindungen
werden durch Extrahieren des getrockneten und geriebenen Pulvers
aus Seegras unter sauren Bedingungen (HCl 0,01 N) im Beisein von
Kalziumchlorid gewonnen. Der Überstand
der Extraktion wird dann neutralisiert und der gelöste Stoff wird
durch Fällung
mit Cetylphyridiniumchlorid wieder gewonnen. Die DEpolymerization
kann mit chemischen Verfahren erreicht werden, indem die Verbindungen
mit hohem Molekulargewicht sauren Bedingungen (1 N Schwefelsäure) bei
einer Temperatur von 45°C
unterworfen werden oder sonst mittels spezifischer Enzyme, die in
den Rohextrakten von Haliotis tuberculata oder Aplysia californica
enthalten sind, oder durch Gammastrahlung unter Verwendung einer
Gesamtdosis von 11,5 Mrad. Die am Ende erhaltende Verbindung wird
einem Gel-Filtrationsschritt unterzogen um die Fraktion zu isolieren,
die ein Molekulargewicht von 13 bis 23 KDa und einen Schwefelgehalt
von 7,8 bis 11% hat. Es kann geschlußfolgert werden, daß die Produkte
der Erfindung einen Schwefelgehalt haben muß, der in Prozent zwischen
2 bis 20% höher
als der des Ausgangsfurans liegt.
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Aus den pharmakologischen Tests,
die in dem Europäischen
Patent beschrieben sind, kann gefolgert werden, daß APTT Titer
(oder Kaolin-Cephalin-Zeit) sehr gering ist, da er unterhalb von
7 I. U./mg liegt. Aus den Tabellen und der Beschreibung geht hervor,
daß zum
Erreichen etwa der gleichen Thrombinzeit von Heparin eine Furanmenge
erforderlich ist, die wenigstens 15-fach höher ist, als das des Referenzstandards.
Weiterhin wurde über
Furan-Depolymerisation in einer weiteren Veröffentlichung in diesem Gebiet
publiziert (S. Colliec et Alii "Anticoagulant
properties of a fucoidan fraction" Thromb. Res. 64 143 1991) und die Ergebnisse dargestellt,
die bei APTT und TT-Tests erhalten wurden, die mit einem Furan-Präparat mit
einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20 000 durchgeführt wurden,
das durch Depolymerisation unter sauren Bedingungen mit nachfolgenden
Fraktionierungsschritten erhalten wurde, wie in dem oben aufgeführten Europäischen Patent
offenbart. Es wird weiterhin darauf Bezug genommen, daß zum Erhalten
der gleichen Wirkung von Heparin in besagten Tests eine Gewichtsmenge
an Furan erforderlich war, die 50-fach höher war. In der Veröffentlichung
von A. Nardella et Alii "Anticoagulant
low molecular weight fucans produced by radical process and ion
exchange chromatography of high molecular weight fucans extracted
form the brown seaweed Ascophyllum nodosum" Carbohyd. Res. 289 (1996) 201–208, wird
ein Radikal-Depolymerisationsverfahren beschrieben, das im Beisein
von Wasserstoffperoxid und Kupfersalzen bei einer Temperatur von
60°C über 5 Stunden für zwei Furane
mit hohem Molekulargewicht durchgeführt wird, nachstehend als F1
und F2 bezeichnet, die folgende analytische Daten und pharmakologische
Wirkungen haben: Präparat
F1: Sulfat 8,1%, Fucose 31,3%, Uronsäure 5,7%, Molekulargewicht
556000 Da, APTT-Aktivität
9,1 I.U/mg; Präparat
F2: Schwefel 5,7%, Fucose 35,8%, Uronsäuren 11,6%, Molekulargewicht
516 000 Da, APTT-Aktivität
12,1 I. U./mg. Das depolymerisierte Produkt, das auis F1 erhalten
wurde, in der Veröffentlichung
als DF1 bezeichnet, war wie folgt gekennzeichnet: Schwefel 9,2%,
Fucose 36,4%, Uronsäuren
2,6%, Molekulargewicht 8300 Da, APTT-Aktivität 8,2 I. U./mg. Das depolymerisierte
Produkt, das aus F2 (DF2) erhalten wurde, hatte einen Schwefelgehalt
von 9,3%, Fucose 32,2%, Uronsäuren
6,5%, Molekulargewicht 7800 Da, APTT-Aktivität 7,3 I. U./mg.
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Aus dem oben zusammengefassten Stand
der Technik können
die folgenden Schlußfolgerungen
gezogen werden. Um Furanpräparate
mit geringem Molekulargewicht und hoher APTT-Aktivität zu erhalten,
die als Hemmer von Koagulationskaskaden verwendet werden können, sollte
den Lehren von T. Nishino et Alii (s.oben) gefolgt werden, aber
das dort offenbarte Verfahren zur Isolierung besagter Verbindungen
ist nur wenig nützlich
für die
industrielle Anwendung. Es besteht jedoch aus einigen Trennschritten.
Andererseits sind die Depolymerisations-Verfahren, die in dem Europäischen Patent
Nr. 403 377 offenbart sind, vorzuziehen, wenn Furan-Präparate mit
geringem Molekulargewicht erforderlich sind, die mit einer höheren Thrombinhemmenden Wirkung
oder Antithrombinischen Wirkung (TT test) verbunden sind. Es wurde
jedoch gezeigt, daß die APTT-Aktivität der so
erhaltenen Substanzen recht gering ist.
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Es kann aus obigem die Schlußfolgerung
gezogen werden, daß Furane
mit geringem Molekulargewicht, die aus Braunalgen oder Phaeophycee
gewonnen werden können,
mit einer signifikanten gerinnungshemmenden Wirkung sowohl als APTT-Wirkung/globaler
Mechanismus der Koagulation als auch als antithrombinische Wirkung
verbunden ist und daneben mit einer signifikanten antithrombotischen
Wirkung, die durch die folgenden chemischen, physiko-chemischen
und pharmakologischen Parameter gekennzeichnet sind (Daten auf Basis
des Trockengewichts): Schwefel 12,5–15%, Fucose 43–57%, Uronsäuren 2–9%, Molekulargewicht
14000–29000
Da, spezifische Rotation von –137° bis 170°, APTT Titer
40–80
I. U./mg, TT Titer 18–30
I. U./mg. Die Fraktionen mit geringem Molekulargewicht, Furansulfate
mit einem Schwefelanteil zwischen 14 und 15%, Fucose 44 bis 56%,
Uronsäuren
2–3,5%,
spezifischer Rotation zwischen –160° und –170°, Molekulargewicht
17000–25000
Da, APTT Titer zwischen 60 und 80 I. U./mg und TT Titer zwischen
23 und 30 I. U./mg werden bevorzugt.
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Es soll vermerkt werden, daß die Verbindungen
der vorliegenden Erfindung die folgenden Unterschiede gegenüber denen
des Standes der Technik aufweisen:
- – Die Thrombinzeit
ist zwischen 1,5 und 2,5 Mal höher
im Vergleich zu den Furan-Fraktionen
mit geringem Molekulargewicht, die in der Veröffentlichung von T. Nishino
et Alii Carbohyd. Res. 186, 119 1989 (s.oben) offenbart sind,
- – Die
APTT Wirkung und der Schwefelgehalt ist höher als bei den entsprechenden
Substanzen, die in der EP 403
377 offenbart sind.
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Die Verwendung besagter Verbindungen
als Medikamente, insbesondere als Gerinnungshemmer und Antithrombose-Mittel
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung Gerinnungshemmende Wirkung
wurde als APTT und TT-Aktivität
entsprechend den unten angegebenen Verfahren gezeigt.
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Die APTT Bioverfügbarkeit gegenüber Heparin
infolge subcutaner Darreichung wurde ebenfalls untersucht und es
wurde ein Wert von 20% für
den Referenzstandard Kalziumheparin (APTT Titer 186 I. U./mg) gefunden
udn jeweils 39 und 40% für
Präparate
VO264.A und VO264.B die entsprechend der Erfindung (siehe Beispiele)
hergestellt wurden. Die beanspruchten Substanzen zeigten die zweifache
Bioverfügbarkeit
von Kalziumheparin, verglichen auf der Gewichtsbasis zu Heparin.
Die gerinnungshemmende Wirkung der neuen Furane in vivo, die in
APTT-Einheiten dosiert werden, ist also von der gleichen Größenordnung
wie die, die nach der Verabreichung von Heparincalzium erhalten
wird.
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Die gerinnungshemmende Wirkung wurde
in dem experimentellen, Stasis-Venenthrombose-Modell gezeigt,
auf das nachstehend Bezug genommen wird. Bei der Untersuchung des
Präparats
VO246.B bei einer Dosis von 10 mg/Kg wurde kein Thrombus gebildet.
Unter gleichen experimentellen Bedingungen war die minimale Dosis
an Kalziumheparin (Referenzstandard), die die Thrombus-Bildung verbindet
1 mg/Kg, d. h. nur zehn-fach geringer.
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Die analytischen Verfahren, die zur
Kennzeichnung der Furane verwendet wurden, waren die folgenden:
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Die Fucose-Bestimmung erfolgte nach
R. J. Winzler, Methods of Biochem. Anal. Bd. 2 294 1955, wobei L(–) Fucose
als Referenzstandard verwendet wurde.
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Die Uronsäure-Bestimmung erfolgte nach
T. Bitter, H. Muir anal. Biochem. 4 (1962) 330, wobei D(–) Glucuronische
Säure als
Referenzstandard verwendet wurde.
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Schwefel wurde nach der ICP-AES (Inductively
Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry)-Technik bestimmt, wobei
Kobaltnitrathydrat Co(NO3)2,
6H2O, gelöst bei einer Konzentration
von 1000 mg/l in 0,5 M HNO3 (Merck Katalog
N. 19785.0500) als interner Standard verwendet wurde, eine wässrige Lösung, die
eine bekannte Menge an Schwefel (Batch 302267E, C. A. 22831, Johnson
Matthey-ALFA) enthält,
als Referenzstandard. Mit Hilfe von zwei Büretten, die jeweils mit einer
Lösung
des Referenzstandards an Schwefel (Lösung A) und des internen Standards
(Lösung
B) gefüllt
waren, wurden 5 Lösungen
in 5 unterschiedlichen Meßkolben à 100 ml
mit einer Schwefelkonzentration von 100, 80, 60, 40 und 20 mg/l
angesetzt, indem die folgenden Mengen an Lösung A hinzugefügt wurden:
10 ml; 8 ml; 6 ml; 4 ml; 2 ml. In jedem Meßkolben wurden dann 0,8 ml
der Lösung
B hinzugefügt.
Die fünf
Lösungen
wurden dann mit destilliertem Wasser auf das gleiche Volumen gebracht.
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Die Lösung der Probe mit dem unbekannten
Schwefelgehalt wurde durch Einwiegen von etwa 60 mg in einem 100
ml Meßkolben
vorbereitet. Etwa 50 ml des destillierten Wassers wurde dann hinzugefügt und gemischt
bis eine klare Lösung
erhalten wurde.
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Vor dem Auffüllen zum Endvolumen mit destilliertem
Wasser wurden 0,8 ml der Lösung
B in den Meßkolben
gegeben.
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Die Bestimmung des Schwefelgehalts
in der Probe wurde durchgeführt,
indem der ausgelesene Wert, der mit der Probe mit unbekanntem Titer
erhalten wurde, auf der Kalibrationskurve eingefügt wurde, die mit den Standardlösungen erhalten
wurde, die auf der Abszisse die Schwefelkonzentration in mg/l aufweist
und auf der Ordinate das Verhältnis
zwischen der Intensität
der Schwefelemission, die bei der Wellenlänge von 182,037 nm erhalten
wurde, und der des internen Standards (Kobalt), die bei einer Wellenlänge von
222,626 nm erhalten wurde.
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Das Molekulargewicht wurde durch
Gelpermeations-Chromatographie (GPC) bestimmt, die auf zwei in Reihe
geschalteten Säulen
durchgeführt
wurden, Supelco Progel TSK-G 4000 SW® und
Supelco Progel TSK-G 3000 SW® mit den Abmessungen 30
cm × 7,5
mm (mit einer Vorsäule
Progel TSK-SW® mit
den Abmessungen 7,5 cm × 7,5
mm) mit einem Brechungsindex-Detektor. Der Puffer war 0,2 M Natriumsulfat
in Wasser (28,4 g in 1000 ml). Die Fließrate war 0,5 ml/min und das
Injektionsvolumen betrug 50 Mikroliter. Die Molekulargewicht-Standards,
die bei der Bestimmung verwendet wurden, waren die folgenden: Maltoheptaose Molekulargew.
1153 g/mol (Sigma® Code Nr. M-7753), Dextran T-10
(Pharmacia Biotech® Code Nr. 17-0250-01)
Molekulargew. 10000(Mw), Dextran T-40 (Pharmacia
Biotech® Code
Nr. 17-0270-01) Molekulargew. 40000 (Mw),
Dextran T-70 (Pharmacia Biotech® Code
Nr. 17-0280-01) Molekulargew. 69 100 (Mw),
Dextran T-500 (Pharmacia Biotech® Code
Nr. 17-0320-01) Molekulargew. 460500 (Mw).
50 mg jeder der obigen Verbindungen und der Probe wurden in einem
5 ml Meßkolben
eingewoben und in der Elutionslösung
gelöst. Die
resultierende Lösung
wurde dann auf Volumen gebracht und auf einer Millipore® Membran
mit 0,22 um Poren gefiltert. Die Kalibration wurde durchgeführt, indem
bei der Lösung
mit dem höchsten
Molekulargewicht begonnen wurde. Die Injektion wure drei Mal wiederholt
und ein Mittelwert der Retentionszeit ermittelt. Die Probe wurde
am Ende injeziert und die zugehörige
Retentionszeit bestimmt.
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Auf diese Weise wurde eine Kalibrierkurve
erstellt, in welcher die durchschnittliche Retentionszeit eingetragen
wurde, die durch Injektion der Probe erhalten wurde.
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Das durchschnittliche Molekulargewicht
(M) und die Retentionszeit (t) sind durch die Gleichung log M =
At3 + Bt2 + Ct +
D miteinander verknüpft.
Aus der Retentionszeit der Furansulfat-Probe wurde durch Verwendung
der Kalibrierkurve mit Hilfe eines Software-Programms das durchschnittliche Molekulargewicht
der Probe bestimmt.
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Die spezifische Rotation wurde auf
einem Perkin Elmer Model 241 Polarimeter bei einer Temperatur von
20°C auf
der Natrium D-Linie bestimmt.
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APTT Titer, ausgedrückt in I.U/mg,
wurde nach der U.S. Pharmacopeia XXIII-1995 (rif. heparin sodium,
Seite 737) bestimmt, wobei das Hemodiagnostica Stago® Kit,
Artikel Nr. 26551 und Hammelplasma (DITTA Glo. Ros, Vercelli) verwendet
wurde. Das Referenz Heparin war der internationale Standard III
(NIBSC – London).
In den Tests, die nachstehend beschrieben werden, wurden die Furansulfat-Präparate VO264.B
und VO264.A verwendet und als Referenzverbindung Kalziumheparin,
das vom Anmelder hergestellt wird (Batch Nr. 9, APTT Titer 186 I.
U./mg).
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Die APTT Aktivität Bioverfügbarkeit der Präparate wurde
bestimmt, indem der Wert der gerinnungshemmenden Aktivität, der nach
subkutaner Verabreichung bestimmt wurde, durch denjenigen dividiert
wurde, der für
die gleiche Verbindung nach intravenöser Verabreichung bestimmt
wurde. In beiden Fällen
wurden die Werte für
die Aktivität
aus der Fläche
unterhalb der Kurve berechnet, die durch Auftragen der APTT-Zeit
(in Ordinaten) über
die Zeit, bei welcher die Blutproben von den Tieren genommen wurden
(in Abszissen), für
jede Verabreichungsform erhalten wurde. APTT-Tests wurden nach den
Anweisungen durchgeführt,
die in der Packungsbeilage für
den oben angegebenen Diagnosekit aufgeführt waren.
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Die Zuführung durch subkutane Verabreichung
wurde durchgeführt,
indem die erfindungsgemäßen Furane
mit einer Konzentration von 20 mg/0,2 ml in einer physiologischen
Lösung
gelöst
wurden. Für
Kalziumheparin wurde eine Konzentration von 4 mg/0,2 ml verwendet.
Für jede
der getesteten Verbindungen wurden 4 Kanienchen (Neuseeland weiße Kanienchen – Allevamento
del Verbano di Conelli, Arona – Italien)
verwendet. Die Verabreichung auf dem subkutanen Weg wurde durchgeführt, indem
0,2 ml/Kg der oben aufgeführten Lösung an
einem Punkt auf dem Rücken
der Tiere injeziert wurde, der zuvor rasiert wurde. Es wurde Blut
(2 ml) von der Randvene des Ohrs unter basalen Bedingungen genommen
(Zeit 0), dann nach 30 Minuten, danach in 1-Stunden-Intervallen, die
bis insgesamt zu 8 Stunden, gezählt
vom Beginn des Experiments, andauerten. Als Plasma gerinnungshemmendes
Mittel wurde eine 3,8%-ige Natriumcitrat-Lösung verwendet, die mit dem
Blut im Verhältnis
1 Teil Citrat-Lösung
: 9 Teile Blut gemischt wurde. In 1 sind
den Kurven, die sich für
jede der getesteten Verbindungen ergeben, die folgenden Symbole
zugeordnet: Präparat
V0264.B: +, Präparat
V0264.A: *; Kalziumheparin: ☐. Experimentelle Punkte jeder
Kurve waren der Mittelwert aus vier Daten. Die Aktivität wurde
aus der Fläche
zwischen der Kurve und der Referenzkurve (gepunktet) berechnet.
Die Referenzkurve war, wie aus der Figur ersichtlich ist, parallel
zur Abszisse und schneidet die Ordinaten-Achse an einem Punkt, der
dem APTT Basalwert entspricht. 1 zeigt,
daß die
Bioverfügbarkeit
der erfindungsgemäßen Verbindungen
systematisch unterschätzt
wurde und die zugehörigen
Flächen
an dem Punkt, der der Zeit der letzten Blutabnahme entspricht, nicht
auf der Referenzkurve abschließt.
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Zur Bestimmung der der intravenösen Verabreichung
folgenden Aktivität
wurden Lösungen
der oben aufgeführten
Furane bei einer Konzentration von 5 mg/ml präpariert und für Heparin
eine Konzentration von 1 mg/ml. Jede der besagten Lösungen wurde
dann in die Marginalvene des Ohrs von Kanienchen (n. 4 Tiere) injeziert
(Volumen 1 ml/Kg). Die Blutproben (Volumen 2 ml, zugefügt zu einem
Aliquot der 3,8%-igen Natriumcitrat-Lösung in den gleichen Anteilen
wie oben aufgeführt)
wurden von der Marginalvene des anderen Ohrs genommen, unter basalen
Bedingungen und jeweils nach 2,5,10,15,20,30,60,90,120 Minuten,
dann danach regelmäßig in einstündigen Intervallen.
Die Auftragung der APTT-Werte über
der Zeit der Blutabnahme in einem Graph ergab die Kurven in 2. Die Flächen wurden
auf die gleiche Weise wie vorher oben detailiert beschrieben. Die
Bedeutung der Symbole, die in jeder der drei Kurven in 2 verwendet wurden, ist
die gleiche wie bei denen in 1.
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Die Bioverfügbarkeit der Testverbindungen
wurde aus der Fläche
der Kurve bestimmt, die jeweils aus dem Graph der relevanten subkutanen
Verabreichung und der intravenösen
Verabreichung erhalten wurde, indem folgende Formel angewendet wurde:
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Die Thrombinzeit (TT) ausgedrückt in I.
U./mg wurde mittels des Kit Hemodiagnostica Stago® Art.
Nr. 126594 bestimmt. Der Test wurde nach dem gleichen Verfahren
ausgeführt,
das in der U.S Pharmacopeia für den
APTT Test berichtet wurde.
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Das experimentelle Modell für Thrombose
von venöser
Stasis wurde grundsätzlich
entsprechend den folgenden Veröffentlichungen
durchgeführt:
P. Bacher et Alii „The
thrombolytic potency of LMW heparin compared to urokinase in a rabbit
jugular vein lysine model" Thromb.
Res. 66, 151–158
1992; I. Reyers et alii „Stasis-induced
venous thrombosis" in
Standardisation of animal models of thrombosis. 17th Angiological
Symposium Kitzbuhel – Proceedings
K. Breddin, R. Zimmermann, F. K. Schattiner editors, Stuttgart 1983,
pages 99–104;
I. Reyers et Alii „Failure
at different doses of aspirin to modify experimental thrombosis
in rats" Thromb. Res.
18, 669–674,
1980.
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In einer physiologischen Lösung (Volumen
10 ml) wurden jeweils die folgenden Verbindungen gelöst: Kalziumheparin
(lot 9, hergestellt von Crinos) bei einer Konzentration von 2 mg/ml
und Furansulfat Präparat Nr.
V0264.B bei einer Konzentration von 10 mg/ml. Die Tiere (Neuseeland
weiße
Kanienchen, Allevamento del Verbano di Conelli, Arona – Italien)
wurden in drei Gruppen (4 Kanienchen/Gruppe) aufgeteilt und nach
der Anästhesie
der Tracheotomie mit folgender Intubation unterzogen. Die Gewebe,
die die rechte Jugularvene umgeben wurden vorsichtig über eine
länge von
3 cm isoliert, wobei eine distale Ligatur durchgeführt wurde, um
den Blutfluß zu
mindern. Nach 10 Minuten wurde ein i. v. Bolus von 1 ml/kg durch
die Marginalvene des Ohrs verabreicht, entsprechend dem folgenden
Schema:
- – Kontrollgruppe:
Physiologische Lösung
- – Heparin-behandelte
Gruppe: 2 mg/Kg
- – VO264.B-behandelte
Gruppe: 10 mg/kg.
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5 Minuten nach der Injektion wurde
oberhalb der Ligatur eine gekrümmte,
hemostatische Zange auf die Vene angewendet, um eine endotheliale
Lesion von 2 cm Länge
zu erzeugen. Unmittelbar danach wurde distal eine zweite Zange angewendet
um den Blutfluß vollständig zu
stoppen. die gekrümmte
hemostatische Zange wurde nach 30 Minuten entfernt. Nach 60 Minuten
wurde das gleiche für
die zweite Zange ausgeführt. Die
Ligatur wurde dafür
auf der Vene belassen. Der Thrombus wurde zwei Stunden nach dem
Beginn des Experiments, entsprechend einer Stunde nach der Zeit,
als die zweite Zange entfernt wurde, aufgenommen. Der Thrombus wurde
in einem Ofen bei 80°C über 24 Stunden
getrocknet und gewogen. Besagtes experimentelles Modell für Thrombose
repräsentiert
recht genau das, was in der realen Thrombose-Pathologie passiert.
In besagtem Modell behindert eine venöse Stenose nicht vollständig den
Blutfluß in
dem Gefäß analog
zu dem, was in vivo passiert, wenn sich ein Thrombus bildet. Es
wird angemerkt, daß in
der Stunde, die auf die Entfernung der zweiten Zange folgt, sich
der Thrombus weiter vergrößern kann,
da die anfängliche
Stenose, wie bereits ausgeführt,
etwas Blutfluß zulässt.
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Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung
ein Verfahren zu schaffen, mit dem neue Polymere mit geringem Molekulargewicht
erhalten werden, welches die folgenden Schritte umfasst:
- a. Extraktion des geriebenen und getrockneten
Pulvers aus Algen mit Wasser bei Siedetemperatur oder in diesem
Bereich (92–100°C) unter
Rühren über 16 Stunden.
Dieser Schritt ist bereits aus der Veröffentlichung von W. A. P. Black
et Alii „Manufacture
of algal chemicals IV. Laboratory scale isolation of fucoidin from
brown marine algae" J.
Sci. Food Agric.3 1952 pages 122–129 bekannt;
- b. Filtration der vorgehenden Suspension, pH-Einstellung des
Filtrats auf einen Wert zwischen 2 und 2.5. An diesem Punkt wurde
ein Fällungsprodukt
gebildet, das aus einem Teil der Alginate gebildet war, die in der
extrahierten Masse enthalten waren. Besagter Gelee-artiger Feststoff
wurde vom Überstand
durch Filtration getrennt und der pH-Wert des Filtrats auf Neutral
eingestellt;
- c. die Lösung
wurde dann auf etwa 1/4–1/5
des Anfangsvolumens in einem Ultrafiltrationsgerät konzentriert, welches mit
einer Membran ausgestattet ist, die ein Cut-off von 100 000 Da hat.
Im gleichen Gerät
wurde das Retentat nachfolgend gegen 3 Volumen Wasser dialysiert
und konnte am Ende konzenteriert werden, falls notwendig, um das
engültige
Volumen zu reduzieren.
- d. das Rohextrakt wurde aus der Retentat-Lösung, die am Ende des vorhergehenden
Schrittes durch Fällung
erhalten wurde, nach Versalzen und Zugabe von zwei Volumen Ethanol
oder Aceton zu der Lösung wiedergewonnen.
- e. das Rohextrakt wurde in wässriger
Lösung
gelöst
und die Degradation und gleichzeitige Depolymerisation erfolgte
dann im Beisein von anorganischem Kupfersalz und Wasserstoffperoxid
bei einer Temperatur von 55°C.
Mittels vorläufiger
Labortests wurde die Reaktionszeit bestimmt die benötigt wird,
um eine Verbindung zu erhalten, die ein Molekulargewicht zwischen
14000 und 29000 aufweist. Das prozentuale Gewichtsverhältnis zwischen
den Kupferionen und dem Rohextrakt war 1.3% und das Verhältnis zwischen dem
Volumen (ml) von 8% Gew./Vol. des verwendeten Wasserstoffperoxid
und dem Gewicht (g) des Rohextrakts lag zwischen 5.5 und 36 ist.
Der pH während
dieses Schrittes lag zwischen 6,0 und 7,7. (Ref. U.S. Patent B 408030
und in der Veröffentlichung
von N. Volpi: „Analytical
techniques for studying structures of dermatan sulfate and low molecular
weight heparin – Dermatan
sulfate" Il Farmaco,
47 (Anhang zu Nr. 5) 841 –853
1992);
- f. am Ende der Reaktion wurde die Lösung gefiltert, ein Salz zugefügt und die
Fällung
des gelösten
Stoffes durch Zugabe von zwei Volumen Ethanol bewirkt. Die Lösung wurde
dann dehydriert und getrocknet, wobei das entsprechende gemischte
Salz aus Natrium und Kupfer II der erfindungsgemäßen Produkte gewonnen wurde;
- g. die Verbindungen wurden dann durch Behandlung mit einem Ionentauscher
mit Na+-Harz in die zugehörigen Natriumsalze
konvertiert. Zu diesem Zweck wurde die Substanz in Wasser mit einer
Konzentration zwischen 5 und 7% gelöst und die sich ergebende Lösung konnte
in eine Harz enthaltende Säule
gefüllt werden
oder kann der Harz kann hinzugefügt
werden und die Suspension daraus für die Zeit gerührt werden,
die zum Auftreten des Kationentauschs erforderlich ist. Der Prozess
donnte mittels einer Kupferionen-selektiven Elektrode verfolgt werden.
Das Volumenverhältnis
zwischen dem Bettharz und der Lösung variierte
von 1/2 bis 2/3.
- h. Am Ende wird eine Filtration der Lösung durchgeführt, der
pH-Wert auf einen Wert zwischen 6.0 und 6.5 eingestellt, der Lösung Salz
hinzugefügt,
die erfindungsgemäßen Verbindungen
durch Zugabe von zwei Volumen Ethanol ausgefällt, und dann das Natriumsaltz
der erfindungsgemäßen Furane
gewonnen.
-
Es ist eine weitere Aufgabe dieser
Erfindung das Rohextrakt zu schaffen, welches aus Braunalgen oder
Pheophycee durch die Schritte a.–d. des obigen Verfahrens herstellbar
ist, und gekennzeichnet durch die folgenden chemischen, physiko-chemischen
und pharmakologischen Parameter (Daten auf der Basis des Trockengewichts):
Schwefel 6-8%, Fucose
31–36%,
Uronsäure
23–27%,
Molekülgewicht
450 000 – 800
000, APTT 40– 60
I. U./mg.
-
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist es möglich
das Rohextrakt zu depolimerisieren, nachdem es von dem pflanzlichen
Material extrahiert wurde und die Alginate durch saure Fällung entfernt
wurden. Es ist also keine Isolierung eines reineren Furans mit hohem
Molekulargewicht notwendig, wie dies bei dem Verfahren, das in der
EP 403 377 offenbart ist,
der Fall ist.
-
Die Anmelderin hat dies (Beispiel
6) durch Depolymerisieren eines reinen Furans mit einem Molekulargewicht
von 652000 (APTT Titer 67,5) gezeigt, das aus dem Rohextrakt VO246.B
erhalten wurde, durch Natriumacetat/Wasserstoffperoxid für 24 Stunden,
d. h. bei den gleichen Bedingungen, durch welche aus dem gleichen
Rohextrakt die Präparate
V0264.A und V0264.B (Referenzbeispiele 7 und 9) erhalten wurden,
wobei das Polymer von geringem Molekulargewicht (8800 Da), das am
Ende isoliert wurde, eine sehr verringerte pharmakologische Aktivität (APTT
Titer 22.1 I. U./mg) im Vergleich zu den erfindungsgemäßen Präparaten
aufwies. Dies bedeutet, daß die
erfindungsgemäßen Produkte
nicht aus einem reinen Furan mit hohem Molekulargewicht erhalten
werden können.
-
Es ist erwähnenswert, daß die Depolymerisationsverfahren,
die im Stand der Technik verfügbar
sind, unterschiedliche Verbindungen ergeben, wenn das Rohextrakt,
das nach den Schritten a)–d)
des erfindungsgemäßen Verfahrens
isoliert wird, als Ausgangsmaterial verwendet wird. Durch Depolymerisation
des Rohextrakts in sauren Bedingungen (pH 2.2 bei 60°C über 16 Stunden – Ref. Beisp.
4) werden Verbindungen erhalten, die eine höhere Menge an Uronsäuren als
an Fucose enthalten. Durch Depolymerisieren des Rohextrakts durch
Gammastrahlung (Ref. Beisp. 5) wurden Verbindungen mit sehr geringem
Schwefelgehalt isoliert, welche eine große Menge an Zerfallsprodukten
enthielt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen
können
nur durch Verringern des Molekulargewichts des Zwischenprodukts
im Beisein von anorganischem Kupfersalz und Wasserstoffperoxid (Bsp.
7) erhalten werden.
-
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung
Dosierformen und Zubereitungen zu schaffen, die als aktiven Hauptbestandteil
erfindungsgemäße Furane
mit geringem Molekulargewicht enthalten. Letztere können auch
in Form ihrer pharmakologisch akzeptablen Salze verwendet werden.
Besagte Zubereitungen können
sowohl für
parenterale, als auch für
die orale Verabreichung verwendet werden.
-
Zubereitungen für die topische Verwendung (Ref.
Beisp. 16) können
auch für
nichtpharmazeutische Verwendungen verwendet werden und haben eine
geeignete Zusammensetzung für
einen solchen Zweck.
-
Die Dosierformen für die parenterale
Verwendung können
sterile, apyrogenische Lösungen
in versiegelten Ampullen sein oder sonstige Liophylisate, die zum
lösen in
wässrigen
sterilen Lösungsmitteln
in versiegelten Flaschen enthalten sind. Als wässrige Lösungsmittel können isotonische
Lösungen
verwendet werden, die mit konventionellen Puffern (Citrat, Phosphat)
zusammen mit bekannten Haltbarkeitsmitteln hergestellt werden. Orale
Zubereitungen könen
in Form von Tabletten, beschichteten Tabletten, Gelatine-Kapseln
und Granulat bereitgestellt werden.
-
Besagte Dosierformen können entsprechend
bekannten Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel können, soweit
besonders orale Dosierformen betroffen sind, diese mit den üblichen
Techniken hergestellt werden, zum Beispiel dem direkten Pressen
von Pulver oder Granulat und kann Bindemittel, Schmiermittel und Trennmittel
umfassen.
-
Dosierformen für die parenterale Verabreichung
können
1 bis 90 mg/ml des aktiven Hauptbestandteils enthalten (für Liophylizate
müssen
die vorstehenden Werte auf die Endkonzentration der Verbindung in
sterilem Lösungsmittel
bezogen werden), jene für
die orale Verabreichung 20 bis 400 mg/Dosiereinheit.
-
Zusammensetzungen für die örtliche
topische Anwendung kann in Form von Gels, Cremes, Lösungen, die
0,1 bis 20 Gew.-% des aktiven Hauptbestandteils enthalten, vorliegen.
-
Analytische Daten, die in den folgenden
Beispielen angegeben werden, sind auf der Basis des Trockengewichts
berechnet.
-
Die folgenden Beispiele werden für das bessere
Verständnis
der Erfindung angegeben und sollen nicht als deren Begrenzung verstanden
werden.
-
Beispiel 1
-
Extraktion des rohen Furansulfats
Präparat
Nr. VO246.A
-
1 kg Fucus vesiculous Trockenpulver
wurde unter Rühren
in 7 Liter destilierten Wasser in einem 15-Liter-Reaktionsgefäß, der mit
einer Kühlung
ausgestattet ist, suspendiert. Wenn die Suspension fertig ist (etwa 15
Minuten), wurde ein Erhitzen im Ölbad
bei 100°C über 16 Stunden
durchgeführt.
Die Suspension wurde dann auf 40°C
gekühlt
und bei 3000 Umdrehungen/Minute für 20 Minuten zentrifugiert,
wobei Nr. 4 1-Liter Zentrifugier-Reagenzgläser verwendet wurden. Die Gelee-artige
Masse, die am Boden besagter großer Reagenzgläser verblieb
wurde erneut in Wasser bei einer Temperatur von 60°C unter Rühren für etwa 15
Minuten suspendiert. Es wurde erneut zentrifugiert und dann zu dem
opaleszenten Überstand
200 mg Clarcel FLO/MA® (geriebenes kalziniertes
Perlit) hinzugefügt.
Nach Filtration wurden 6,3 Liter erhalten und 50 ml 37%ige HCl hinzugefügt um den
pH auf einem Wert von etwa 2,1 zu verringern. Es wurde erneut zentrifugiert
und die Gelee-artige Masse (Gewicht 44,4g – Präparate-Code Nr. 0195/95005-D-
Schwefel 0,7%, Uronsäuren
51%) wurde entsorgt und der Überstand
auf einen neutralen pH gebracht, indem eine 30%ige NaOH-Lösung zugefügt wurde.
Es wurde dann konzentriert, wobei ein konstantes Volumen von 1,5
Liter in einem Ultrafiltrationsgerät Amicon® CH2-A
beibehalten wurde, das mit einer 100000 Dalton Molekulargew. Cut-Off
Membran ausgestattet ist. Nach dem Konzentrationsschritt wurde die
Lösung
auf der gleichen Membran gegen 3 Volumen destilliertes Wasser dialysiert.
Dem Retentat (1,6 Liter) wurden 112 g (7% Gew./Vol) wasserfreies
Natriumacetat hinzugefügt
und dann gerührt
bis eine homogene Lösung
erhalten wurde. Der gelöste
Stoff wurde mit 2 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach Dekantieren über nacht
wurde der Feststoff dehydriert und getrocknet. 79,68 g einer Verbindung
(Präparat
Nr. VO246.A) wurden am Ende erhalten (Ausbeute etwa 8%), die folgende
analytischen Daten auf der Basis des Trockengewichts hat: Schwefel
6,5%, Fucose 31,7%, Uronsäuren
23,8%, Molekulargewicht 493 000 Da, APTT Titer 53,4 I. U./mg, TT
Titer 18,2 I. U./mg.
-
Beispiel 2
-
Extraktion des rohen Furansulfat-Präparats Nr.
VO246.B.
-
In einen 300-Liter Reaktionsgefäß wurden
175 Liter destilliertes Wasser gefüllt. 25 Kg Fucus vesiculosus
Trockenpulver wurden hinzugefügt
und eine Dampfmantel-Aufheizung
ausgeführt
um eine Temperatur von 92°C über 16 Stunden
zu erreichen und beizubehalten. Am Ende wurde die Temperatur auf
30°C abgesenkt
und 5 Kg Clarcel FLO/MA® hinzugefügt. Es wurde
auf einem Filterpressgerät,
das mit Seitz K800® Zellulose-Filtern ausgestattet
war, gefiltert. Das Filtrat wurde gesammelt und der Feststoff in
Wasser (20 Liter) bei 60°C
unter Rühren
dispergiert, und anschließend
für 1 Stunde
beibehalten. Es wurde erneut eine Filtration auf Seitz K800® Filtern
durchgeführt
und die Filtrate vereinigt, wobei sich insgesamt 220 Liter ergaben.
Die Lösung wurde
in ein Reaktionsgefäß überführt, 5,5
kg Clarcel CBR® (geriebener,
kalzinierter Diatomit) zugefügt,
dann auf 25 –30°C gekühlt und
die Fällung
eingeleitet, indem der pH auf 2 durch Hinzufügen von etwa 1,5 Liter HCl 37%
gesenkt wurde. Das Rühren
wurde wieder aufgenommen und für
15 Minuten fortgesetzt und der Schlamm auf Seitz K800® Filtern
gefiltert. Die Filterkuchen wurden dann mit 20 Litern saurer Lösung (pH2)
gewaschen und die am Ende aufgenommenen Flüssigkeiten hatten ein Gesamtvolumen
von 220 Liter. Die Lösung
wurde dann in einen Ultrafiltrations Alfa Laval® Gerät, das mit
einer Molekulargew. Cut-off 100 000 Millipore®-Kartusche
ausgestattet war, gefüllt.
Zunächst
wurde die Lösung
konzentriert, wodurch das Volumen auf 50 Liter verringert wurde,
dann bei konstantem Volumen gegen 3 Volumen Wasser dialysiert. Wenn
der Schritt durchgeführt
war, wurde das Volumen der Lösung
weiter auf 25 – 30
Liter reduziert. Die Lösung
wurde dem Gerät
entnommen, mit NaCl bis zu einer Konzentration von 2% Gew./Vol eingesalzt
und 2 Volumen Aceton hinzugefügt. Die
sich ergebende gebildete Suspension wurde zum absetzen stehen gelassen
und dann der Niederschlag entnommen, dehydriert, gerieben und getrocknet.
1665 g des Rohextrakts Batch Nr. VO246.B (Ausbeute 6,7%) wurden
dann gesammelt. Seine analytischen Daten auf der Basis des Trockengewichts
waren die folgenden: Schwefel 7,1%, Fucose 32,0%, Uronsäuren 25,0%,
Molekulargewicht 800 000 Da, APTT Titer 55 I. U./mg.
-
Beispiel 3
-
Extraktion des rohen Furansulfat-Präparats Nr.
VO246.C.
-
Das experimentelle Verfahren des
vorgehenden Beispiels wurde wiederholt, wobei mit 25 Kg einer weiteren
Charge Fucus vesiculosus begonnen wurde. Der pH der Zwischenfällung in
diesem Fall war 2,5. 2100 g (Ausbeute 8,4%) des Präparats VO246.C
wurden erhalten, das durch die folgenden analytischen Daten gekennzeichnet
ist: Schwefel 7,6%, Fucose 35,8%, Uronsäuren 26,1%, Molekulargewicht
470 000 Da, APTT Titer 44 I. U./mg.
-
Beispiel 4
-
Depolymerisation unter
sauren Bedingungen des rohen Furansulfat-Präparats Nr. VO246.B.
-
5 g VO246.B wurden in 500 ml destilliertem
Wasser in einem 1 lMeßkolben,
der mit einer Kühlung
verbunden ist, aufgelöst.
10 ml 1 N HCl wurden hinzugefügt
um den pH auf 2,2 zu senken und es wurde im Öl-Bad bei 60°C über 16 Stunden
erwärmt.
Am Ende wurde die Lösung
gekühlt,
der pH wurde mit einer NaOH-Lösung auf
7 korrigiert. Die Flüssigkeit
wurde in einem Amicon® CH3-A Ultrafiltrationsgerät bei konstantem
Volumen in drei aufeinanderfolgenden Schritten jeweils gegen 5 Volumen
destilliertes Wasser dialysiert. In der ersten Phase (Schritt A)
hatte die verwendete Dialysemembran einen 3000 Da Molekulargew.
Cut-off. Im zweiten Schritt (Schritt B) hatte die Membran einen
10000 Da Molekulargew. Cut-off und im dritten Schritt (Schritt C) einen
von 100 000 Da. Die gelösten
Stoffe des Permeats aus Schritt A, B und C wurden nach Konzentration der
Lösungen
durch Eindampfen unter reduziertem Druck und Einsalzen mit NaCl
zu einer Salzkonzentration von 2% Gew./Vol und nachfolgendem Hinzufügen von
zwei Volumen Aceton ausgefällt.
Drei verschiedene Fraktionen wurden so gesammelt, jede wog jeweils
57 mg (Präparat
0195/95026-A), 6,5 mg (Präparat 0195/95026-B),
welches anschließend
verworfen wurde, und 496 mg (Präparat
0195/95026-C).
-
Die Uronsäure- und Fucose-Analyse ergab
die folgenden Resultate: Präparat
0195/95026-A Uronsäuren
38,0%, Fucose 8,9%; Präparat
0195/95026-C Uronsäuren
20,1%, Fucose 21,2%.
-
Das Retentat, das aus dem letzten
Dialyseschritt (Schritt C) kam, wurde mit NaCl zu einer Salzkonzentration
von 2% Gew./Vol. eingesalzt und der gelöste Stoff mit zwei Volumen
Aceton gefällt.
2,4 g (Präparat 0195/95026-D)
wurden erhalten, die 32,5% Uronsäuren
und 16,25% Fucose enthielten.
-
Beispiel 5
-
Depolymerisation des Rohextrakts
VO246.B mit Gammastrahlung
-
1,5 g des Rohextrakts wurden in einem
150 ml Meßkolben
in einem Phosphatpuffer 0,1 M pH 7 gelöst und nachdem die Substanz
aufgelöst
war auf Volumen gebracht. Besagte Lösung wurde dann auf Nr. 5 30
ml Glasfläschen
verteilt, die dann hermetisch versiegelt wurden und zu der Firma
Gammaton (Guanzate – Como) für die Gammastrahl-Behandlung versandt
wurden. Nr. 2 Glasfläschen
wurden mit einer 2,5 Mrad Gammastrahlung behandelt und die anderen
zwei mit 20 Mrad. Für
jede der zwei behandelten Proben wurde ein Glasfläschen genommen
und mit NaCl bis zu einer Konzentration von 2% versetzt und der
gelöste
Stoff mit zwei Volumen Aceton ausgefällt.
-
Aus der Lösung, die mit 2,5 Mrad behandelt
wurde, wurden 460 mg einer Verbindung (Präparat 0195/96041-A) erhalten,
die einen Phosphat-Titer von 51 Gew.-% der Substanz hatte. Das Gewicht
des enthaltenen Rohextrakts war also 225 mg mit einer Ausbeute von
75%, berechnet aus dem Anfangs-Rohextrakt. Die analytischen Daten,
die aus der reinen Verbindung berechnet wurden, waren wie folgt:
Schwefel: 5,1%; Uronsäuren
16,1%, Fucose 19,3%, Molekulargewicht 38 500 Da.
-
Das Gewicht des Produkts, das aus
der Lösung
gewonnen wurde, die mit 20 Mrad Gammastrahlung behandelt wurde,
(Präparat
0195/96041-D) war 211 mg mit einem Phosphat-Gehalt von 71 Gew.-%
der Substanz. Als Konsequenz daraus war das echte Gewicht des enthaltenen
Rohextrakts 61,2 mg (Ausbeute 20% des Anfangs-Rohextrakts). Die
analytischen Daten waren wie folgt (Bezogen auf die reine Verbindung): Schwefel:
5,55%; Uronsäuren
3,38%, Fucose 5,79%, Molekulargewicht 5600 Da.
-
Beispiel 6
-
Herstellung der reinen
Furansulfate mit hohem Molekulargewicht (Präparat Nr. VO248.A) und nachfolgende Depolymerisation über 24 Stunden
in Kupferacetat im Beisein von Wasserstoffperoxid (Präparat VO269.A)
-
200 g des Rohextrakt-Präparats Nr.
VO 246.B wurden in 10 Liter Wasser aufgelöst. 200 g NaCL wurden dann
hinzugefügt
und es wurde gerührt
bis eine homogene Lösung
erhalten wurde. 7,5 Liter (0,75 Volumen) Aceton wurden dann hinzugefügt und über Nacht
stehengelassen. Das Fällungsprodukt
wurde dann aufgenommen und es wurden nach Dehydration und Trocken
126,5 g erhalten. Dem Überstand
wurden dann 12,5 Liter Aceton (2 Volumen des gesamten Lösungsmittels)
zugefügt,
wodurch 68,3 g des gereinigten Furansulfats (Präparat Nr. V0248.A) gewonnen
wurden, das das folgende analytische Profil aufweist: Schwefel 8,9%,
Fucose 48,5%, Uronsäuren
9,7%, Molekulargewicht 652 000 Da, spezifische Rotation –112,8°, APTT Titer
65,5 I. U./mg.
-
10 g der erhaltenen Verbindung wurden
in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde in ein Gefäß überführt und
dann mittels eines Öl-Bads
auf 55°C
unter Rühren
erwärmt.
400 mg Kupferacetat monohydrat wurden hinzugefügt und nach der Lösung wurde
der pH auf 7,5 mittels einiger Tropfen 1 N NaOH korrigiert.
-
Mittels einer peristaltischen Pumpewurde
wurde die 8%-ige Wasserstoffperoxid-Lösung bei einer Flußrate von
2,3 ml/h hinzugefügt.
Die Reaktionszeit war 24 Stunden und der pH lage zwischen 6,0 und
6,5 (Gesamtvolumen des zugefügten
Wasserstoffperoxids: 55 ml). Es wurde dann eine Filtration an Seitz
K 800® Filtern
durchgeführt,
wodurch 400 ml einer klaren Lösung
erhalten wurde, der 28 g wasserfreies Natriumacetat hinzugefügt wurde
und anschließend
zwei Volumen Ethanol. Das gummiartige Fällungsprodukt wurde in 70 ml destilliertem
Wasser gelöst,
dem 30 ml Amberlite® IRC 718 Harz (Na+-form)
zugefügt
wurde und für
6 Stunden unter Rühren
stehen gelassen wurde. Die Lösung
erschien am Ende farblos, etwas opalisch und sie wurde mit einem
Filter aus gesintertem Glas gefiltert, nachdem 10 g Clarcel CBR® hinzugefügt wurde.
Der pH wurde durch Hinzufügen
einiger Tropfen Eisessig auf einen Wert von 6,5 gebracht und die
Lösung
dann mit wasserfreiem Natriumacetat bis zu einer Konzentration von
7% Gew./Vol. versalzt und der gelöste Stoff mit zwei Volumen
Ethanol ausgefällt.
Nach Dehydration und Trocknung wurden 2,90 g des depolymerisierten
Produkts (Präparat
VO269.A – Ausbeute
29%) erhalten, das 12,9% Schwefel, Fucose 53,2%, Uronsäuren 2,5%
enthielt, Molekulargewicht 8800 Da, spezifische Rotation –14,8°, APTT Titer
22,1 I. U./mg.
-
Beispiel 7
-
Depolymerisation des Rohextrakts
VO246.B mit Kupfersalzen über
unterschiedliche Zeiten zur Erzeugung der Präparate VO260.A, V0264.A und
0195/96044-C.
-
50 g VO246.B wurden in 1 Liter Wasser
gelöst.
Die Lösung
wurde auf eine Temperatur von 55°C
erwärmt
und 2 g Kupferacetatmonohydrat hinzugefügt, wobei der pH mit 1 N NaOH
auf 7,5 eingestellt wurde. In diesem Stadium wurden mittels einer
peristaltischen Pumpe das Hinzufügen
einer 8%-igen Gew./Vol. Wasserstoffperoxid-Lösung auf eine Flußrate von
46 ml/h kalibriert, wobei der pH mittels einer 30%-igen NaOH-Lösung zwischen
6 und 6,5 gehalten wurde. Nach 6 Stunden wurden 1/3 (425 ml) des
Volumens der Lösung
entnommen, mit wasserfreiem Natriumacetat bis zu einer Konzentration
von 5% Gew./Vol. eingesalzt und 2 Volumen Ethanol hinzugefügt. Das
so erhaltene Fällungsprodukt
(9 g) wurde in Wasser bis zu einer Konzentration von 5% Gew./Vol.
(180 ml) gelöst
und dann in eine Säule
gegeben, die mit dem Harz Amberlite® IRC
718 (Na+ form) gefüllt ist, wobei sie ein Bett
von etwa dem halben Volumen an Wasser aufweist, daß verwendet
wird um den Rest aufzulösen.
Die Flußrate
war 40 ml/h. Das Säuleneluat
wurde mit wasserfreiem Natriumacetat eingesalzt und anschließend wurde
die Fällung
mit Ethanol entsprechend dem oben bereits beschriebenen Verfahren
durchgeführt.
7,0 g (Ausbeute 42%) des Präparats
Batch Nr. VO260.A wurden erhalten, das die folgenden analytischen
Eigenschaften aufwies: Schwefel 9,9%, Fucose 38,3%, Uronsäuren 15,1%,
Molekulargewicht 88 500 Da, spezifische Rotation –119,6°, APTT Titer
58,1 I. U./mg, TT Titer 14,8 I. U./mg.
-
Nach 24 Stunden betrug das Lösungsvolumen
2 Liter. 1 Liter wurde entnommen und den gleichen Schritten wie
oben bei Präparat
VO260.A unterzogen, was zu einer Ausbeute von 2,6 g (Ausbeute 15,6%)
des Präparats
Batch Nr. VO 264.A führte,
das 14,5% Schwefel aufweist, 56,2% Fucose, 2,3% Uronsäuren, Molekulargewicht
22500 Da, Spezifische Rotation –1650,
APTT Titer 74,9 I. U./mg, TT Titer 23 I. U./mg.
-
Bei einem weiteren Anteil der verbleibenden
Depolymerisations-Lösung
dauerte die Zugabe von Wasserstoffperoxid für weitere 24 Stunden an (totale
Depolymerisations-Zeit 48 Stunden). Am Ende wurde die Lösung genau
so verarbeitet, wie die beiden Anteile, die oben aufgeführt sind,
wobei in diesem Fall der pH mittels Essigsäure unmittelbar vor der Ethanolfällung auf
6,7 eingestellt wurde. 1 g (Ausbeute 6,2%) des Präparats Batch
Nr. 0195/06044-C wurde erhalten. Die Verbindung wurde gekennzeichnet
durch die folgenden analytischen Parameter: Schwefel 15%, Molekulargewicht
9700 Da. APTT Titer 23,6 I. U./mg, TT Tieter 6,7 I. U./mg.
-
Beispiel 8
-
Depolymerisation des rohen
Furanpräparats
VO246.C über
6 Stunden und Isolierung des Präparats
VO260.C.
-
200 g der Verbindung wurden in 4
Liter destilliertem Wasser gelöst.
Entsprechend einem vorläufigen Test,
der entsprechend dem im vorgehenden Beispiel 6 offenbarten Verfahren
durchgeführt
wurde, wurde ermittelt, daß die
Reaktionszeit 6 Stunden betrug. Die Lösung wurde auf 55°C erwärmt und
8 g Kupferacetatmonohydrat wurden unter Bewegung hinzugefügt. Der
pH wurde durch Zugabe von etwa 8 ml 30%-iger NaOH- Lösung auf 7,5 eingestellt. An
diesem Punkt würd
eine 8%-ige Gew./Vol. Wasserstoffperoxid-Lösung mit einer Flußrate von
etwa 183,3 ml/h (insgesamt 1,1 Liter) zugefügt. Während der Reaktion wird der
pH durch geeigneten Zusatz von kleinen Mengen einer 30%-igen NaOH-Lösung bei
einem Wert zwischen 6,5 und 7,0 gehalten. Am Ende wird Natriumacetattrihydrat
bis zu einer Konzentration von 11% Gew./Vol. zu der Lösung hinzugefügt und anschließend zwei
Volumen Ethanol. Das Fällungsprodukt
wurde aufgenommen, dehydriert und getrocknet. 79 g eines Feststoffes
wurden so erhalten, der anschließend in 1,2 Liter destilliertem
Wasser gelöst wurde.
Zentrifugieren bei 3000 Umdrehungen/Minute uwrd dann durchgeführt um zumindest
einen Teil der Trübung
in der Lösung
zu entfernen. 800 ml Amberlite® IRC 718 (Na+ form)
wurde hinzugefügt
und der Schlamm unter Rühren über Nacht
stehen gelassen. Die Lösung
wurde dann aufgenommen und der Harz mit zwei Volumen Wasser gewaschen.
Die Filtration wurde dann auf einem Buckner-Trichter durchgeführt, welche
zuvor mit 15 g Clarcel CBR® beschichtet wurde, wodurch
eine klare Lösung
mit einem Volumen von etwa 2,8 Liter und einem pH von 8,9 erhalten
wurde. Der pH wurde dann durch die Zugabe einiger Tropfehn Eisessig
auf 6,5 eingestellt. Anschließend
wurde wasserfreies Natriumacetat bis zu einer Konzentration von
7% Gew./Vol hinzugefügt
und die Fällung
durch Zugabe von zwei Volumen Ethanol ausgefiührt. Nach der Dehydration und Trocknung
wurden 60,1 g (Ausbeute 30,1%) des Präparats VO260.C erhalten, das
das folgende analytische Profil aufwies:
Schwefel 12,6%, Fucose
47%, Uronsäuren
8,1%, Molekulargewicht 29000 Da, spezifische Rotation 138,2°, APTT Titer
49,6 I. U./mg, TT Titer 21 i. U./mg.
-
Beispiel 9
-
Depolymerisation des rohen
Furansulfat-Präparats
VO246.B mit Kupfersalzen über
24 Stunden und Isolierung des Präparats
VO264.B.
-
100 g VO246.B wurden in 2 Liter Wasser
gelöst.
Entsprechend dem vorläufigen
Test, der entsprechend dem im vorgehenden Beispiel 6 offenbarten
Verfahren durchgeführt
wurde, wurde ermittelt, daß die
Reaktionszeit 24 Stunden betrug. 4 g Kupferacetatmonohydrat wurden
hinzugefügt.
Der pH wurde mit 30%-iger NaOH auf 7,5 korrigiert und dann auf 55°C erwärmt. Mit
einer peristaltischen Pumpe wurde eine 8%-ige Gew./Vol. Wasserstoffperoxid-Lösung (Flußrate 45,8
ml/h) zugefügt,
wobei der pH zwischen 6 und 6,5 gehalten wurde. Nach 24 Stunden
wurde die Menge an Volumen H2O2 von
1100 ml hinzugefügt.
Die Endlösung
erschien sehr opalig und wurde zentrifugiert. Dem Überstand
wurde Natriumacetattrihydrat bis zu einer Konzentration von 7% Gew./Vol.
hinzugefügt.
Der gelöste
Stoff wurde mit 2 Volumen Ethanol ausgefällt, dehydriert und getrocknet.
23,25 g wurden so erhalten, die in 400 ml Wasser gelöst wurden.
260 ml Amberlite® IRC 718 (Na+ form)
Harz wurde hinzugefügt
und Rühren
wurde begonnen und über
Nacht weitergeführt.
Die Filtration wurde dann auf einem gesinterten Trichter durchgeführt, wobei
der Filter anschließend
mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen wurde. Der pH des Filtrats
wurde durch die Zugabe einiger Tropfen Essigsäure auf 7 eingestellt, wasserfreies
Natriumacetat bis zu einer Konzentration von 7% Gew./Vol wurde hinzugefügt, gefolgt
von der Zugabe von zwei Volumen Ethanol. Nach der Dehydration und
Trocknung wurden 16,4 g eines Feststoffs (Präparat V0264.B – Ausbeute
16,4%) erhalten. Die folgenden analytischen Eigenschaften wurden
gefunden:
Schwefel 14,3%, Fucose 44,2%, Uronsäuren 3,4%,
Molekulargewicht 17 500 Da, spezifische Rotation 168,6°, APTT Titer
69,5 I. U./mg, TT Titer 28 I. U./mg.
-
Beispiel 10
-
Depolymerisation des rohen
Extrakts VO246.C mit Kupfersalzen über 48 Stunden und Isolierung
des Präparats
VO267.A.
-
200 g VO246.B wurden in 4 Liter destilliertem
Wasser gelöst.
Entsprechend dem vorläufigen
Test, der entsprechend dem im vorgehenden Beispiel 6 offenbarten
Verfahren durchgeführt
wurde, wurde ermittelt, daß die
Reaktionszeit 48 Stunden betrug. Es wurde auf 55°C erwärmt und dann 8 g Kupferacetatmonohydrat
unter Rühren
hinzugefügt.
Der pH wurde mit etwa 8 ml 30%-iger NaOH-Lösung auf 7,5 eingestellt. In
dieser Phase wurde eine 8%-ige Gew./Vol. Wasserstoffperoxid-Lösung bei
einer Flußrate
von 23 ml/h (insgesamt 1,1 Liter) zugefügt. Der pH wurde während der
Reaktion zwischen 6 und 6,5 gehalten, indem eine kleine Menge 30%-iger
NaOH-Lösung
zugefügt
wurde. Nach 48 Stunden wurde eine Filtration unter Verwendung von
Seitz K 800® Filtern
durchgeführt.
Natriumacetattrihydrat wurde bis zu einer Konzentration von 11%
Gew./Vol. hinzugefügt
und der gelöste
Stoff mit zwei Volumen Ethanol ausgefällt. Der gummiartige Rest wurde
dehydriert und getrocknet, wobei eine Ausbeute von 57,5 g erhalten
wurde. Es wurde wieder in 900 ml destilliertem Wasser gelöst und 600
ml Amberlite® IRC
718 Harz (Na+ form) wurde hinzugefügt. Der Schlamm wurde unter
Rühren über Nacht
stehen gelassen. Die Filtration wurde dann auf einem gesinterten
Trichter durchgeführt,
und die sich ergebende Lösung
wurde erneut durch den gleichen Trichter gefiltert, welcher zuvor
mit einem Bett aus Clarcel CBR® beschichtet wurde. Der
pH wurde durch die Zugabe einiger Tropfen konzentrierter Essigsäure auf
6,5 eingestellt, wasserfreies Natriumacetat bis zu einer Konzentration
von 7% Gew./Vol wurde hinzugefügt,
und der gelöste
Stoff durch Zugabe von zwei Volumen Ethanol ausgefällt. Der
Feststoff (Präparat VO267.A)
wurde gesammelt, dehydriert und getrocknet, was eine Ausbeute von
42,8 g (Ausbeute 21,4% des Rohextrakts) lieferte. Die Analyse der
Verbindung ergab folgende Resultate:
Schwefel 14,2%, Fucose
49,8%, Uronsäuren
5,3%, Molekulargewicht 14700 Da, spezifische Rotation –139,6°, APTT Titer
45 I. U./mg, TT Titer 19 I. U./mg.
-
Beispiel 11
-
Depolymerisation von rohem
Furansulfat VO246.A über
18 Stunden und Isolierung der Verbindung VO246.A/1
-
50 g der Verbindung VO246.A wurden
in Wasser gelöst.
Beispiel
12
Rezeptur für
die subkutane Verabreichung
| Niedermol.
Gew. Furansulfat | 20
mg |
| Bidestilliertes
Wasser | 0,2
ml |
Beispiel
13
Rezeptur für
die i. v. Verabreichung
| Niedermol.
Gew. Furansulfat | 80
mg |
| Bidestilliertes
Wasser | 4
ml |
Beispiel
14
Rezeptur für
die orale Verwendung (Tablette)
| Niedermol.
Gew. Furansulfat | 180
mg |
| Mannitol | 300
ml |
| Saccharose | 240
mg |
| Polyvinylpyrrolidon | 14
mg |
| Magnesiumstearat | 9
mg |
Beispiel
15
Zusammensetzung für
die lokale topische Verwendung
Gel
| Niedermol.
Gew. Furansulfat | 12
g |
| Isopropanol | 25
g |
| 1,2-Propylenglycol | 0,7
g |
| Triethanolamin | 1,2
g |
| Carbopol | 1,1
g |
| Parfums
und bidestilliertes Wasser genug | bis
100 g |
Creme
| Niedermol.
Gew. Furansulfat | 12
g |
| Polyoxyethylenglycolstearat | 11
g |
| Cetylstearylalkohol | 14
g |
| Propylenglycol | 9
g |
| Parfums,
Haltbarkeitsmittel und bidestilliertes Wasser genug | bis
100 g |
Wässrige Lotion
| Niedermol.
Gew. Furansulfat | 7
g |
| Glycerin | 7
g |
| Ethylalkohol | 10
ml |
| Parfums,
Haltbarkeitsmittel und bidestilliertes Wasser genug | bis
100 g |
Beispiel
16
Andere Rezepturen für
die topische Verwendung
Wässrige
Lotion für
die kosmetische Verwendung
| Niedermol.
Gew. Furansulfat | 0,5–5 g |
| Propylenglycol | 1,5
g |
| Ethylalkohol | 15
ml |
| Parfums,
Haltbarkeitsmittel und bidestilliertes Wasser genug | bis
100 g |
Emulsion
mit reinigender Wirkung
| Niedermol.
Gew. Furansulfat | 4
g |
| PEG
15 Glycerylricinoleat | 14
g |
| Polysorbat
21 | 7
g |
| Mandelöl | 3
g |
| Parfums
und bidestilliertes Wasser genug | bis
100 g |
