DE68910051T2 - Verfahren zur herstellung von aloe-erzeugnissen. - Google Patents
Verfahren zur herstellung von aloe-erzeugnissen.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft das Gebiet der Verarbeitung von Aloepflanzen und die Entfernung van Teilen dieser Pflanze für ihre Verarbeitung in Zusammensetzungen für örtliche und innere Anwendungen.
- Aloe vera ist keine Kaktuspflanze, wie weit verbreitet angenommen wird, sondern ein Mitglied der Lilienfamilie. Es sind etwa 360 Arten von Aleopflanzen bekannt. Harding, Aloes of the world: A Checklist, index and code, Excelsa 9: 57-94 (1979). Sie scheinen in heißen ariden Gebieten zu gedeihen und sind weit verbreitet im Mittelmeergebiet, Mittelost, Afrika, China, Japan, Mexiko und den südlichen USA. Einige wenige der wesentlichen Arten, die wegen ihrer medizinischen Eigenschaften ausgenutzt werden, sind Aloe barbadensis Miller (aloe vera), A. arborescens, A. plicatilis, A. vahombe, A. saponaria, A. africana, A. ferox und Aloe perryi. Reynolds, Aloes of Tropical Africa and Madagascar, The Trustees, The Aloe Book Fund, Mbadane Swaziland. Jedoch wird A. barbadensis Miller im allgemeinen als die "richtige Aloe" wegen ihrer weit verbreiteten Verwendung und wiederholt berichteten stärksten effektiven Heilkraft angesehen, obwohl in Japan A. arborescens Miller traditionell als Volksheilmittel für verschiedene Leiden, welche von gastrointestinalen Beschwerden bis zum Athletenfuß reichten, verwendet wurde.
- Aloe vera ist eine mehrjährige Pflanze mit geschwollenen grünen Blättern, die am Stamm in einer Rosettenanordnung zusammenkommen. Die Blätter einer reifen Pflanze können mehr als 63,5 cm lang sein mit sägeähnlichen Spitzen an ihren Rändern.
- Das transversale Aufschneiden des Blattes, wie in Fig.1 und 2 gezeigt, zeigt, daß die äußeren Wände der Epidermis 3 mit dicken Kutikeln bedeckt ist. Unterhalb der Epidermis 3 befindet sich das Mesophyll, welches in Chlorenchymzellen und dünnerwandigen Zellen, welche als Parenchym bekannt sind, unterteilt ist. Die Parenchymzellen verbergen eine transparente schleimige Gallerte 1. Die Gefäßbündel 2 mit inneren Bündelhüllenzellen enthalten den gelben Saft, welcher laxative Eigenschaften besitzt, und befinden sich sandwichartig zwischen den zwei größeren Zellen. Nadelförmige Kristalle von Calciumoxalat, welches als metabolisches Nebenprodukt in Pflanzenzellen gebildet wird, finden sich hauptsächlich in dem zentralen Abschnitt des Blattes.
- Aloe vera enthält zwei größere Flüssigkeitsquellen, einen gelben Latex (Exudat) und das klare Gel (Pflanzenschleim). Das getrocknete Exudat aus Aloe barbadensis Miller wird als Aloe bezeichnet. Der Handelsname ist Curacao aloe. Es ist hauptsächlich aus Aloin, Aloe-emodin und Phenolen zusammengesetzt. Bruce, South African Medical Journal, 41: 984 (1967); Morrow et al., Arch. Dermatology, 116: 1064-1065 (1980); Salek et al., Corrosion Prevention & Control, 9-10 (1983); Mapp et al., Planta Medica, 18: 361-365 (1970); Ranwald, Arch. Pharmacology, 315: 477-478 (1982). Eine Anzahl von Phenolverbindungen einschließlich Anthrachinonen und deren Glycoside sind als pharmazeutisch aktiv bekannt. Bruce, Excelsa 5: 57-68 (1975); Suga et al., Cosmetic and Toiletries 98: 105-108 (1983).
- Die schleimige Gallerte aus den Parenchymzellen der Pflanze wird als Aloe vera-Gel bezeichnet. Im allgemeinen erfolgt keine Zersetzung von Anthrachinonen und das Hervorrufen einer Verfärbung des Geles, falls das Gel nicht durch eine ungeeignete Verarbeitungstechnik kontaminiert wird.
- Aloe vera-Gel enthält etwa 98,5 Gew.-% Wasser. Mehr als 60% der Gesamtfeststoffe besteht aus Polysacchariden von Kohlehydratursprung. Organische Säuren und anorganische Verbindungen, insbesondere Calciumoxalat, machen den Rest der Feststoffe aus.
- Ganze Blätter, Exudate und frische Gele aus Aloepflanzen wurden bei einer Vielzahl von menschlichen Leiden angewandt. Der Nachweis ihrer Anwendung als medizinisches Heilmittel kann bis zu den Ägyptern 400 vor Christus zurückverfolgt werden. Aloe vera wurde auch zur Einbalsamierung von Toten wie auch zum Schutz der die Einbalsamierung durchführenden Personen vor totbringendem Mittel eingesetzt. Andere frühe Zivilisationen verwendeten Aloe vera für die Hautpflege, das Lindern von Insektenstichen und -bissen, die Behandlung von leichten Verwundungen, die Wundheilung, Haarverlust, als Abführmittel und für Hautgeschwüre. Sie war die traditionelle Medizin für zahlreiche Kulturen als Anthelminthika, Mittel zum Abführen, Magenmittel, und sie wurde u.a. bei Lepra, Verbrennungen und allergischen Zuständen verwendet. Cole et al. Archives of Dermatology and Syphilology, 47: 250 (1943); Chopra et al., Glossary of Indian Medicinal Plants, Council of Scientific and Insutrial Research, New Delhi; Ship, Journal of American Medical Association, 238: 1770-1772 (1977); Morton, Atlas of Medicinal Plants of Middle American Bahamas to Yucatan, Charles C. Thomas ED., 78-80 (1981); Diez-Martinez, La Zabila, Communicado No. 46 Sobre Recursos Bioticos Potenciales del Pais, INIREB, Mexico (1981); Dastur, Medicinal Plants of India and Pakistan; D.B. Taraporevala Sons & Co., Private Ltd., Bombay 16-17 (1962).
- Aloe vera hat eine lange Geschichte der Akzeptanz durch Laien als Mittel mit "lindernden" oder "heilenden" Eigenschaften. Während der letzten Jahre wurden zahlreiche Bücher und Aufsätze, welche wissenschaftliche Standards erfüllen, über Aloe vera geschrieben. Organisationen wie der Aloe Vera Council und anerkannte medizinische Institutionen haben durch Veröffentlichungen und Fallstudien von Ärzten, Veterinären und anderen Wissenschaftlern dem "Aloe-Phänomen" Glaubwürdigkeit gegeben. Aloe vera wurde extensiv auf dem Gebiet der Dermatologie, insbesondere zur Behandlung von durch Strahlung hervorgerufenen Hautzuständen, herausgestellt. Mackee, X-Rays and Radium in the Treatment of Diseases of the Skin, 3.Aufl., Lea and Febiger, Philadelphia, 319-320 (1938); Rovalti et al., Industrial Medicine and Surgery, 28: 364-368 (1959); Zawahry et al., Quotations From Medical Journals on Aloe Research, Ed. Max B. Skousen, Aloe Vera Research Institute, Cypress, California 18-23 (1977); Cera et al., Journal of the American Animal Hospital Association, 18: 633-638 (1982). Der Umfang der wissenschaftlichen Literatur zur Dokumentation medizinischer Anwendungen bei Verdauungsproblemen, als Virusmittel,bakterizides Mittel und fungizides Mittel und bei gynäkologischen Zuständen ist umfangreich und wurde in angemessener Weise von Grindley and Reynolds (Journal of Ethnopharmacology, 16: 117-151 (1986)) abgehandelt.
- Die Wichtigkeit von in Aloearten gefundenen chemischen Verbindungen wird durch die Tatsache gezeigt, daß sie in jeder bekannten nationalen Pharmakopöe aufgeführt sind. U.S. Pharmacopeia, 20. Ausgabe, The National Formulary, 14.Aufl., United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland, 1. Juli 1980. Jedoch beschreibt die U.S. Pharmacopeia den Wirkstoffteil in Form des gelben Saftes von Aloearten jedoch nicht die Schleimstoffe. Das frische, nichtkonservierte Gel besteht zu etwa 98,5-99,2% aus Wasser. Der Gesamtfeststoffgehalt, der nach Entfernung des Wassers zurückbleibt, reicht von 0,8 bis 1,5%. Die Hauptbestandteile des Feststoffes umfassen Schleimstoffe, Zucker, Fasern, Proteine, Asche, Fette, Aloin und Harz. Robson et al., Journal of Burn Care Rehabilitation, 3: 157-163 (1982). Berichte von Zusammensetzungen, welche Enzyme, organische Säuren, anorganische Salze, Aminosäuren und Alkaloide einschließen, wurden gefunden. Rowe et al., Journal of the American Pharmaceutical Association, 30: 262-266 (1941): Roboz et al., Journal of the American Chemical Society, 70: 3248-3249 (1948): Waller et al., Proceedings of Oklahoma Academy of Science, 58: 69-76 (1978). In Abhängigkeit von der Verarbeitung der Blätter sind Schleimstoffe und Zucker die Hauptbestandteile des dehydratisierten Gels. Die gefunden Zucker sind Galactose, Glucose, Mannose, Rhamnose, Xylose und Uronsäuren. Obwohl sich widersprechende Berichte gefunden wurden, bestehen die Schleimstoffe hauptsächlich aus Mannan oder Glucomannan. Eberendu et al., The Chemical Characterization of Carrisyn (in Vorbereitung): Mandal et al., Carbohydrate Research, 87: 249-256 (1980b), Roboz et al., Journal of the American Chemical Society, 70: 3248-3249 (1948); Gowda et al., Carbohydrate Research, in: 201-205 (1979); Segal et al., Lloydia, 31: 423 (1968).
- Derzeit ist die Kontroverse über die Identität der aktiven Substanz(en) in Aloe vera noch nicht abgeschlossen. Es ist daher wesentlich, klar zwischen den in dem Gel vorhandenen Komponenten und den in den Exudaten gefundenen Komponenten zu unterscheiden. Ein größerer Teil des Gels ist ein Schleim von hauptsächlich Polysaccharidnatur mit kleineren Mengen an verschiedenen anderen Verbindungen. Es ist verständlich, daß eine gewisse synergistische Wirkung zwischen der Polysaccharidbasis und anderen Komponenten bei einigen der beobachteten Aktivitäten vorliegen kann. Leung, Excelsa 8: 65-68 (1978); Henry, Cosmetic and Toiletries, 94: 42-50 (1979). Beispielsweise berichten mehrere Forscher, daß die wirksamen Komponenten für die Wundheilung Traumatinsäure (Freytag, Pharmazie, 9: 705 (1954)) and eine Sorte von Polysaccharid sein können. Kawashima et al., Chemical Abstracts, 93: 13075 (1979). Mackee, siehe oben, gab an, daß das Gel und nicht die Rinde oder das Exudat für die günstigen Effekte bei der Behandlung von Strahlungsverbrennungen verantwortlich war, und er wies auf die Wichtigkeit der Verwendung von frischen Blättern für eine wirksame Behandlung hin. Polysaccharide bauen mit der Zeit ab und bestimmte Molekulargewichtsschnitte können erforderlich sein, um spezifisches pharmakologisches Ansprechen hervorzubringen. Goto et al., Gann, 63: 371-374 (1972).
- Es gibt viele Beispiele in der Literatur von Polysacchariden, welche pharmakologische und physiologische Aktivitäten ohne bekannte synergistische Unterstützung von anderen Komponenten zeigen. Ohno et al., Chem. Pharm. Bull., 33: 2564-2568 (1985); Leibovici et al., Chem. Biol. Interactions, 60: 191-200 (1986); Ukai et al., Chem. Pharm. Bull., 31: 741-744 (1983); Leibovici et al., Anticancer Research, 5: 553-558 (1985). Hyperlipämie in der allgemeinen Population und insbesondere bei familiärer Hypercholesterinämie ist mit Koronaherzbeschwerden und Tod verbunden. In Ländern, wo die Faseraufnahme über die Diät hoch ist, scheint Atherosklerose nicht üblich zu sein. Trowell et al., Editors, Refined Carbohydrate Foods and Disease, London, Academic Press, 207 (1975). Von Pectin und Guar wird berichtet, daß sie Cholesterin bei normalen und hyperlipidämischen Patienten erniedrigen. Kay et al., American Journal of Clinical Nutrition, 30: 171-175 (1977). Johannisbrotkerngum, ein aus Mannose und Galactose bestehendes Polysaccharid setzt die Lipoproteincholesterinwerte in Fällen von normalen und familiär bedingten hypercholesterinämischen Personen herab. Zavoral et al., American Journal of Clinical Nutrition, 38: 285-294 (1983). Zugabe von Guargum zu Kohlehydratmehlen erniedrigte den Anstieg von Glucose nach der Mahlzeit sowohl bei normalen Personen als auch Diabetisindividuen. Jenkins et al., Lancet, 2: 779-780 (1977). Kuhl et al., (Diabetes Care, 6 (2): 152-154 (1983)) zeigte, daß Guargum die glykämische Steuerung von Insulin abhängigen schwangeren Diabetispatienten aufwies.
- Über die Antitumoraktivität von Polysacchariden wird weit verbreitet berichtet. Aus Lentinus cyathiformishergestellte Polysaccharide erhöhen bekannterweise die Wirtsabwehr gegenüber Tumoren. Rethy et al., Annuals of Immunology Hungary, 21: 285-290 (1981). Es gibt mehrere Berichte über Polysaccharide aus Pilzen, Hefen oder Bakterienextrakten, welche ein hohes Ausmaß an Wirtsabwehraktivität gegenüber viralen und tumorartigen Infestationen hervorrufen. Chihara et al., Nature, 222: 687 (1969); Schwartzmann, Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 29: 737 (1932); Rethy, X. International Congress of Microbiology; Moscow, 642 (1966). Suzuki et al., (Journal of Pharm. Dyn., 7: 492-500 (1984)) berichtete ebenfalls von der Antitumoraktivität einer Polysaccharidfraktion, welche aus gezüchteten Fruchtkörpern eines Pilzes, Grifola frondosa, extrahiert wurde. Die Fraktion (GF-1) zeigte äquivalente Werte von höherer Hemmaktivität bei der intraperitonealen Applikation (IP) der intravenösen Applikation (IV) und der Introtumorapplikation (IT). Jedoch wurde die orale Applikation (PO) als nicht wirksam beschrieben. Das GF-1 zeigte ebenfalls Antitumorwirkung gegen die feste Form von Meth A fibrosarcoma und MM 46 Carcinoma bei Mäusen. Lentinan, welches ein 6-verzweigtes β-(1-3)-vernetztes Glucan, ähnlich zu GF-1, ist, war gegen Meth-A fibrosarcoma unwirksam. Chihora, The antitumor pclysaccharide Lentinan: eine Übersicht; "Manipulation of Host Defense Mechanisms"; herausgegeben von Aoki et al., Excerpta Medica, North Holland, 1-16 (1981); Sasaki et al., Carbohydrate Research, 47: 99-104 (1976). Von synthetisierten, verzweigten Polysacchariden wurde berichtet, daß sie Bioaktivitäten gegenüber Tumoren zeigen. Matsuzaki et al., Makromol. Chem., 186: 449 (1985). Matsuzaki et al., (Makromol. Chem., 187: 325-331 (1986)) synthetisierten verzweigte Polysaccharide aus Steinnußmannan, β-(1-4)-D-Mannopyranose und β-(1-4)-gebundenem-Glucomannan, welche signifikante Aktivitäten zeigten. Ein partiell acetyliertes, lineares β-(1-3)-D-Mannan, extrahiert aus den Fruchtkörpern von Dictyophoria Indusiata Fisch, zeigte Antitumoraktivität. Hara et al., Carbohydrate Research, 143: 111 (1982). Es scheint, daß die Antitumorwirkung von der Art der Polymerhauptkette und ihrem Ausmaß an Polymerisation abhängt, da β-(1-3)-Glucantyppolymere höhere Antitumiraktivität als β-(1-4)-Glucan- und Hemicellulosepolymere zeigen. Matsuzaki et al., Makromol. Chem., 187: 325-331 (1986). Ein carboxymethyliertes Derivat von β-(1-3)-Glucan, erhalten aus bakteriellem Kulturfiltrat, bewirkte starken Zellverlust aus aufgebauten Sarcoma-180-Tumoren innerhalb zwei Stunden nach der Injektion des Derivates. Baba et al., J.. of Immunopharmacology, 8: 569-572 (1986). Derselbe Autor beobachtete eine kompensatorische Zunahme der polymorphonuklearen Leukocyten als Folge der Injektion der Substanz. Zusätzlich, Bestatin, ein bekanntermaßen immunmodulierende Aktivität und Antitumoraktivität aufweisendes Dipeptid (Ishizuka et al., Journal of Antibiotics, 32: 642 - 652 (1980), beeinflußte weder die Tumorausbeute noch die Anzahl der polymorphonuklearen Leukocyten. Baba et al., siehe oben.
- Es gibt zahlreiche Berichte für den Antitumoreffekt von sulfatierten Polysacchariden einschließlich Heparain (Jolles et al., Acta Univ. Int. Cancer, 16: 682-685 (1960); Suemasu et al., Gann, 61: 125-130 (1970)), sulfatiertem Laminaran und Dextran. Jolles et al., British Journal of Cancer, 17: 109-115 (1963). Yamamoto et al., (Japan Journal of Experimental Medicine, 54: 143-151 (1984) berichteten über die Steigerung der Antitumoraktivität einer Fucoidanfraktion durch weitere Sulfatierung. Das sulfatierte Produkt zeigte Aktivität gegen L-1210-Leukämie. Die Autoren postulierten, daß der Mechanismus der Antitumorwirkung teilweise der Hemmung des invasiven Wachstums von L-1210-Zellen zuzuschreiben sei, welche aus der elektrostatischen Abstoßung zwischen der Tumorzelle und Mesothelzellen herrührt. Yamamoto et al., siehe oben. Polysaccharide mit Sulfatgruppen werden ebenfalls als Mitogene für menschliche T-Zellen und Aktivatoren für polyclonale Mäuse-B-Zellen beschrieben. Sugawara et al., Microbiological Immunology, 28: 831-839 (1984). Im allgemeinen besitzen Homopolysaccharide mit höherem Molekulargewicht mit Sulfatgruppen diese Eigenschaften. Dorries et al., European Journal of Immunology, 4: (19 ): Sugawara et al., Cell Immunology 74: 162-171 (1982).
- Es wurde berichtet, daß aus der Hefe Saccharomyces cerbisiae extrahiertes Glucan ein Modulator für zelluläre und humorale Immunität ist. Wooles et al., Science, 142: 1078-1080 (1963). Das Polysaccharid stimulierte ebenfalls die Vermehrung von mehrfachpotenten, blutbildenden Stammzellen von Mäusen, Granulocyten-Macrophagenkolonien bildenden Zellen und Myeloid- und Erythroidkolonien bildenden Zellen. Pospisil et al., Experientia, 38: 1232-1234 (1982); Burgaleta et al., Cancer Research, 37: 1739-1742 (1977). Maisin et al., (Radiation Research, 105: 276-281 (1986)) berichteten ebenfalls eine IV-Applikation eines Polysaccharids, das Schutz von blutbildenden Stammzellen von Mäusen gegenüber Röntgenstrahlungsexposition induzierte, wodurch die Mortalität der so bestrahlen Mäuse herabgesetzt wurde.
- Seljelid et al., (Experimental Cell Research, 131: 121 (1981)) haben beobachtet, daß unlösliche oder gelbildende Glycane Macrophagen in vitro aktivierten, während dies die entsprechenden löslichen Glycane nicht bewirkten. Sie forderten, daß der Weg, auf welchem das Glycan dem mononuklearen Phagocyten dargeboten wurde, für die Aktivierung entscheidend war. Bogwald et al., (Scand. Journal of Immunology, 20: 355-360 (1984)) immobilisierten Glycane, welche einen stimulierenden Effekt auf die Macrophagen hatten, in vitro. Dies führte die Autoren zu der Annahme, daß das Ausmaß von fixierter oder sterischer Anordnung des Glycans für den Effekt auf die Macrophagen in vitro entscheidend war. Ein gereinigtes Polysaccharid, isoliert aus Candida albicans, induzierte Antikörperansprechen in vitro durch menschliche periphere Blutlymphocyten. Wirz et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 33: 199-209 (1984). Es gab signifikante Unterschiede zwischen den Anticandida-Antikörpern in Seren von normalen und mit Candida infizierten Individuen. Wirz et al., siehe oben.
- Die antivirale Aktivität von Polysacchariden und an Peptide gebundenen Polysacchariden wurde beobachtet. Suzuki et al., Journal Antibiotics, 32: 1336-1345 (1979). Suzuki et al., siehe oben, berichteten die antivirale Wirkung von Peptidomannan (KS-2), extrahiert aus Kulturmycel von Lentinus edodes. Sowohl die orale (PO) als auch intraperitoneale (IP) Applikation ergab einen Seruminterferontiter mit erhöhter Spitze, welcher Mäuse gegenüber viralen Infektionen schützte. Dies war verschieden von Dextranphosphat (DP-40) (Suzuki et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 149: 1069-1075 (1975)) und 9-Methylstreptimidon (9-MS) (Saito et al., Antimier. Agent & Chemotherapy 10: 14-19 (1976)), welche höhere Titerwerte von Interferon nur induzierten, falls intravenös (IV) oder intraperitoneal (IP) an Mäuse appliziert wurde.
- Über antiinflammatorische Aktivität von Aloe vera-Gel wurde weit verbreitet sowohl durch mündliche Bezeugungen als auch durch angesehene wissenschaftliche Journale berichtet. Rubel (Cosmetics and Toiletries, 98: 109-114 (1983)) diskutierten vollständig den möglichen Mechanismus dieses antiinflammatorischen Effektes von Aloe-Gel. Ukai et al., (J. Pharmacology Dyn 6., 983-990 (1983)) beschrieben antiinflammatorische Aktivität für Polysaccharide, extrahiert aus Fruchtkörpern von mehreren Pilzen. Die Polysaccharide zeigten signifikanten Hemmeffekt bei durch Carrageenan induziertem Ödem. Eines der Polymere, O-acetyliertes-D-Mannan (T-2-HN), zeigte zusätzlich einen stärker ausgeprägten Hemmeffekt bei Verbrühungs-Hyperalgesie als Phenylbutazon. Ukai et al., siehe oben. Die Tatsache, daß das Polysaccharid als frei von Protein und Lipiden bezeichnet wird, legt es stark nahe, daß der antiinflammtorische Effekt nur dem acetylierten Mannan zuzuschreiben ist. Andere Forscher berichteten ebenfalls antiinflammatorische Effekte von komplexen Polysacchariden (Saeki et al., Japan J. Pharmacology 24: 109-118 (1974)), von Glycoproteinen (Arita et al., J. Pharmacology, 24: 861-869 (1974)) und von sulfatierten Polysacchariden (Rocha et al., Biochemical Pharmacology, 18: 1285-1295 (1969)).
- Literaturberichte über Polysaccharide, welche pharmakologische und physiologische Aktivitäten zeigen, füllen weiterhin die Seiten von hochangesehenen wissenschaftlichen Zeitschriften. Es ist daher nicht unlogisch, daß das Schleimgel von Aloe vera, welches im wesentlichen ein Polysaccharid ist, das Geheimnis der medizinischen Eigenschaften von Aloe vera beinhaltet. Die Diskrepanzen darüber, ob das Polysaccharid ein Glucomannan, Mannan, Pectin oder von irgendeiner anderen Zusammensetzung ist, sind ein Ergebnis der chemischen Reinigungsstufen. Bei Verarbeitung von Aloe gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine partiell acetylierte Polymannose übereinstimmend als das Hauptpolysaccharid, welches pharmakologische Aktivität besitzt, isoliert. Yagi et al., (Planta Medica, 31: 17-20 (1977)) isolierten unter Anwendung einer geringfügig modifizierten Extraktionsmethode acetyliertes Mannan (Aloemannan) aus Aloe arborescens Miller var. natalensis. Ovodova, (Khim. Prior. Soedin, 83: 93833 (1975)) sahen jedoch früher isoliertes Pectin als Hauptkomponente derselben Aloeart an.
- Die WO 87/00052 beschreibt Verfahren zur Herstellung von Aloeprodukten, hiermit erzeugte Produkte und Zusammensetzungen hiervon. Einige der beschriebenen Verfahren betreffen die Herstellung von praktisch anthrachinonfreiem Aloesaft, welcher solubilisiertes Material enthält. Darüber hinaus beschreibt dieses Dokument ein Verfahren zur Extraktion der aktiven chemischen Substanz in der Aloepflanze aus einem Baltt der Aloepflanze, wobei dieser Aloesaft, welcher solubilisiertes Material enthält, mit einem wasserlöslichen, niederen, aliphatischen, polaren Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol und Propanol vermischt wird, um die aktive chemische Substanz auszufällen und hierdurch eine heterogene Lösung zu bilden. Dann werden das Lösungsmittel und das solubilisierte Material aus der heterogenen Lösung entfernt, um die ausgefällte aktive chemische Substanz zu isolieren, welche anschließend getrocknet wird.
- In Carbohydrate Research, Vol. 86, 247-257 (1980) ist die Struktur des D-Galactans beschrieben, welches aus Aloe barbadensis Miller durch Heißwasserextraktion der Pulpe, welche durch Dehydratisierung der Gallerte der fleischigen Blätter von Aloe barbadensis erhalten wurde, isoliert wurde.
- In American Journal of Clinical Pathology, Vol. 88, No.4, 534 (1987) ist eine klinische Pilotstudie unter Verwendung von Carrisyn bei der Behandlung von Aids beschrieben.
- Die US-A-3 362 951 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Aloederivates, umfassend das Vermischen von Aloegel mit einer wäßrigen Lösung von Phosphomolybdänsäure, Abtrennen des unlöslichen Niederschlages, Ausfällen des Aloederivates mit einem wasserlöslichen aliphatischen Lösungsmittel und ein Klären mit unterchloriger Säure. Das isolierte Polymere hat ein ungefähr gleiches Verhältnis von Glucose und Mannose und Spuren von Glocoronat.
- Die US-A-3 892 853 zeigt ein Verfahren zur Konservierung und Stabilisierung eines klaren Gels aus Aloe vera-Blättern, um eine Dauerpräparation, welche die therapeutischen Qualitäten des Geles beibehält, herzustellen. Hierbei gibt es keine Extraktion des aktiven Inhaltsstoffes aus der Mischung mit anderen Inhaltsstoffen. Weiterhin wird eine Stufe unter Anwendung einer relativ hohen Temperatur angewandt.
- Die US-A-4 555 987 zeigt eine Vorrichtung zur Extraktion des Gels von Aloe vera aus den Blättern der Pflanze Aloe vera. Die Vorrichtung zerkleinert die ganzen Blätter von Aloe vera zur Erzeugung des Gels.
- Die US-A-3 920 816 beschreibt eine Zusammensetzung, bestehend aus dem Saft der Aloepflanze, extrahiert nach einem Verfahren in reinem unverfälschtem Bienenhonig. Die Extraktionsmethode bedient sich einer Siedestufe. Das Verfahren vermeidet die Verwendung von irgendwelchem Alkohol und der Feststoff wird verworfen.
- Die US-A-4 178 372 beschreibt ein Verfahren zur Konservierung und Stabilisierung des Gels von Aloe vera. Das Verfahren schließt die mechanische Abtrennung der Gelmatrix von Aloe vera aus dem Blatt selbst und danach die Zugabe einer katalytischen Menge eines nichttoxischen Oxidationsmittels zu dem frischen Gel, welches auf eine Temperatur von etwa 35º bis etwa 80ºC gebracht wird, ein. Ascorbinsäure wird dann als nichttoxisches Antioxidans verwendet, um die katalytische Oxidation anzuhalten, und ein nichttoxischer Puffer wird dann zugesetzt, um den pH der stabilisierten Gelzusammensetzung in einem Bereich von etwa 4 bis etwa 6 zu halten.
- Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze gerichtet, umfassend die Stufen von:
- A) Gewinnung eines Aloesaftes, der solubilisiertes Material enthält;
- B) Einstellen des pH dieses Aloesaftes auf von 3 bis 3,5;
- C) Zugabe eines wasserlöslichen, niederaliphatischen, polaren Lösungsmittels wie Methanol, Ethanol oder Propanol zu dem Aloesaft zum Ausfällen der aktiven chemischen Substanz und hierdurch Bildung einer heterogenen Lösung;
- D) Entfernen des wasserlöslichen, niederaliphatischen, polaren Lösungsmittels und des solubilisierten Materials aus der heterogenen Lösung zur Isolierung der ausgefällten aktiven chemischen Substanz; und
- E) Trocknen der ausgefällten aktiven chemischen Substanz.
- Es wurde gefunden, daß die nach diesem Verfahren hergestellte aktive chemische Substanz ein im wesentlichen nicht abbaubares lyophilisiertes lineares Polymeres von im wesentlichen acetylierten Mannosemonomeren ist. Die Mannosemonomeren sind vorzugsweise aneinander über β(1-4)-Bindungen gebunden. Die aktive chemische Substanz wurde durch analytische chemische Arbeitsweisen ausgemessen, standardisiert und charakterisiert.
- Der Ausdruck "aktive chemische Substanz", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Substanz, welche für die Wundheilung und andere günstige Eigenschaften von Aloe vera verantwortlich ist. Der Ausdruck "im wesentlichen nicht abbaubar", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Produkt, welche eine Abnahme in Molekulargewicht um weniger als 5% während einer Zeitdauer von zwei Jahren erfährt, und ein Produkt, welches mehr als 95% seiner biologischen Aktivität über eine Zeitdauer von zwei Jahren beibehält. Der Ausdruck "im wesentlichen acetylierte Mannosemonomere", wie er hier verwendet wird, bedeutet partiell oder praktisch vollständig acetylierte Mannosemonomere.
- Der Aloesaft, welcher solubilisiertes Material enthält, kann mittels der folgenden Stufen erhalten werden:
- (a) Waschen eines Aloeblattes in einer bakteriziden Lösung zur Entfernung im wesentlichen von allem Oberflächenschmutz und Bakterien;
- (b) Entfernen wenigstens eines ersten Endabschnittes von diesem gewaschenen Blatt;
- (c) Ablaufenlassen, Konservieren und Sammeln von an Anthrachinon reichem Saft von diesem geschnittenen und gewaschenen Blatt;
- (d) Entfernen von Rinde von diesem Blatt zur Herstellung eines im wesentlichen von Anthrachinon freien Gel-Filetstückes; und
- (e) Mahlen und Homogenisieren dieses im wesentlichen von Anthrachinon freien Aloegel-Filetstückes zur Herstellung von im wesentlichen von Anthrachinon freiem Aloesaft, der solubilisiertes Material enthält.
- Anstelle der Stufen (b), (c) und (d) kann man statt (b) die gewaschenen Aloeblätter zermahlen und (c) die zermahlenen Blätter unter chemischer Entfernung von nichtgewünschten Fraktionen, d.h. Anthrachinonen, Mineralstoffen und Säuren und der Rinde, dialysieren, um ein im wessentlichen anthrachinonfreies Gel zu erzeugen, das dann den Stufen (e) und (B) bis (E) unterworfen wird, um die aktive chemische Substanz zu extrahieren.
- Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt ebenfalls, daß anstelle der Stufen (b), (c), (d) und (e) stattdessen die gewaschenen Aloeblätter zermahlen und der anthrachinonreiche Aloesaft, welcher solubilisiertes Material aufweist, extrudiert werden kann und dann der Aloesaft den Stufen (B) bis (E) unterworfen werden kann, um die aktive chemische Substanz zu extrahieren. Die aktive chemische Substanz wird in effektiver Weise von Anthrachinonen und schädlichen Ionen nach diesem Verfahren abgetrennt, da die Anthrachinone und Ionen wasserlöslich sind und in der flüssigen Lösungsmittelphase verbleiben und nicht ausfällen.
- Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt ebenfalls, daß anstelle der Stufen (b), (c), (d) und (e) die ganzen gewaschenen Aloeblätter gemahlen werden können, faserartiges Material abfiltriert werden kann und der Rest homogenisiert werden kann, um einen anthrachinonreichen Aloesaft, welcher solubilisiertes Material enthält, herzustellen. Der Aloesaft kann dann den Stufen (B) bis (E) unterworfen werden, um die aktive chemische Substanz zu extrahieren. Die aktive chemische Substanz wird in effektiver Weise von Anthrachinonen und schädlichen Ionen nach diesem Verfahren aus den zuvor angegebenen Gründen abgetrennt.
- Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, daß ein zusätzliches Verfahren zur Extraktion der aktiven chemischen Substanz in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze die folgenden Stufen umfaßt:
- a) Waschen eines Aloeblattes in einer bakteriziden Lösung zur Entfernung im wesentlichen von allem Oberflächenschmutz und Bakterien;
- b) Entfernen der Rinde von diesem Blatt zur Bildung eines Aloegel-Filetstückes;
- c) Mahlen und Homogenisieren dieses Aloegel-Filetstückes zur Bildung eines Aloesaftes, welcher solubilisiertes Material enthält; und
- f) Unterwerfen dieses Saftes den Stufen (B) bis (E).
- Wie zuvor angegeben, wird die aktive chemische Substanz in effektiver Weise von Anthrachinonen und schädlichen Ionen durch diese Verfahrensweise abgetrennt, da Anthrachinone und Ionen wasserlöslich sind und in der flüssigen Lösungsmittelphase zurückbleiben und nicht ausfallen.
- Die Entfernung von "im wesentlichen allem Oberflächenschmutz und Bakterien", wie hier verwendet, bedeutet (1) die Entfernung von Schmutz bis zu einem Ausmaß, daß verbleibender Schmutz weniger als 0,1 Gew.-% des Blattgewichtes ausmacht, und (2) die Abtötung solcher Oberflächenbakterien, daß die verbleibenden Oberflächenbakterien weniger als 100 Auszählungen pro Gramm der Blätter ergeben.
- Weiterhin kann das bevorzugte Verfahren die Stufen der Ultrafiltration umfassen, um den Aloesaft oder die Fraktion von Aloe vera osmotisch einzustellen oder um die Gehalte an Anthrachinonen sogar noch auf weniger als 5 ppm und sogar bis herab zu weniger als 100 Teilen pro Milliarde, in Gewicht, zu reduzieren.
- Diese Stufen ermöglichen den Verarbeiter zum Einsatz von großen oder kleinen Blättern, selbst weniger als einem Jahr alten Blättern, da die in den reifen Blättern gefundene Polymergröße von kleineren, unreifen Blättern ausgewählt und verarbeitet werden kann.
- Einer der Vorteile des vorliegenden Verfahrens ist, daß beschädigte Blätter, die bislang als unbrauchbar als Folge starker Verwindungen oder schlechter Sammeltechniken angesehen wurden, verarbeitet werden können, und daß die unerwünschten kontaminierenden Stoffe durch Dialyse herausgeholt werden können.
- Die Ultrafiltrationsstufe (Dialysestufe) schließt die Membrantechnologie ein, welche die Auswahl von Filtern mit unterschiedlichen Porengrößen in Abhängigkeit von dem Zustand der geschnittenen Aloeblätter erlaubt und welche eine beliebige Kombination der folgenden Maßnahmen beinhalten kann:
- (1) Ein Filter mit kleiner Porengröße (bevorzugt etwa 100 Daltons), welches Wasser und Salze von dem Gel von Aloe vera abtrennt, falls erforderlich.
- (2) Filter mit größerer Porengröße (bevorzugt etwa 500 Daltons), welche die Säuren von dem Gel von Aloe vera abtrennen können, falls erforderlich.
- (3) Filter mit noch größerer Porengröße (bevorzugt etwa 2000 Daltons), welche die Komponenten des gelben Saftes von Gel von Aloe vera abtrennen können, falls erforderlich.
- (4) Filter von mit noch größerer Porengröße (bevorzugt von etwa 10 000 - 100 000 Daltons), welche der Größe der Polymere der Gelmatrix entsprechen und sie nach dem Molekulargewicht auftrennen.
- Eine Romicon -4-Säule (Romicon Co., 100 Cummings Park, Woburn, MA 01801, Modell No. HF4 555, Membrane Type PM50, Membrane Nos. H526.5 - 43 - pm50) wird als Vorrichtung für die Ultrafiltration empfohlen.
- Als zusätzliche bevorzugte Ausführungsform kann die Waschstufe des Verfahrens das Waschen des im wesentlichen anthrachinonfreien Aloegel-Filetstückes in einem Trommelwäscher vor dem Mahlen dieses Filetstückes umfassen.
- Während aller der zuvor beschriebenen Verfahren der Extraktion der aktiven Substanz aus dem Gel von Aloe vera finden sich kleinere Mengen von organischen und anorganischen Substanzen, welche mit dem Produkt zusammen ausfallen. Ein großer Bruchteil der organischen Salze umfaßt Calciumoxalat. Die Anwesenheit von anorganischen Salzen wie Calciumoxalat sollte ausgeschaltet oder zumindest auf ein Minimum gebracht werden wegen der Konsistenz des Produktes und aus Gesundheitsgründen. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Zugabe einer effektiven Menge einer Mineralsäure zur Einstellung des pH's des Gels auf 3,0 bis 3,5 vor der Zugabe von Alkohol ein Produkt ergibt, das einen wesentlich niedrigeren Gehalt an Oxalaten und anderen organischen Salzen hat. Bei allen der zuvor beschriebenen Verfahrensweisen zur Extraktion der aktiven chemischen Substanz in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze wird daher der pH des Gels auf 3 bis 3,5 vor der Zugabe des Alkohols eingestellt.
- Bei allen der zuvorgenannten Verfahrensweisen zur Extraktion der aktiven chemischen Substanz in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze werden bevorzugt vier Volumina des wasserlöslichen niederen aliphatischen polaren Lösungsmittels zu einem Volumen an Aloesaft zugesetzt, um die aktive chemische Substanz auszufällen. Bevorzugte wasserlösliche niedere aliphatische polare Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol und Propanol. Das am meisten bevorzugte Lösungsmittel ist Ethanol. Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, daß andere wasserlösliche niedere aliphatische polare Lösungsmittel die bevorzugten Lösungsmittel ersetzen können, solange die aktive chemische Substanz hieraus ausfällt.
- Bei den zuvorgenannten Extraktionsverfahren wird es bevorzugt, daß die aktive chemische Substanz aus der Mischung von wasserlöslichem niederem aliphatischem polarem Lösungsmittel und Aloesaft für etwa vier Stunden austallen kann. Es wurde bestimmt, daß die Ermöglichung des Ausfällens der Mischung während vier Stunden die optimale Ausbeute an aktiver chemischer Substanz ergibt, und daß nach vier Stunden die ausgefällte aktive chemische Substanz mit dem Abbau beginnt. Es wurde jedoch weiter festgestellt, daß signifikante Mengen von aktiver chemischer Substanz nach einer Ausfällungsperiode von 24 Stunden gewonnen wurden.Der Fachmann auf dem Gebiet erkennt, daß die optimale Ausfällungszeitspanne von Umgebungstemperatur und Druck wie auch der Natur des wasserlöslichen niederen aliphatischen polaren Lösungsmittels abhängig ist.
- Ebenfalls wird es bei den zuvor beschriebenen Extraktionsverfahren bevorzugt, daß die ausgefällte aktive chemische Substanz durch Lyophilisieren anstelle eines Ofentrocknens getrocknet wird, da Hitze die Hydrolyse oder den Abbau der aktiven chemischen Substanz erhöhen kann.
- Bei allen der zuvorgenannten Extraktionsverfahren wird irgendwelches faserartiges Material (Cellulose), welches in dem Aloesaft enthalten ist, ebenfalls durch das wasserlösliche niedere aliphatische polare Lösungsmittel ausgefällt, jedoch wird es frühzeitig bei der Zugabe des Lösungsmittels ausgefällt und ist weniger dicht als die aktive chemische Substanz. Das faserartige Material verbleibt auf der Oberfläche des Lösungsmittels, nachdem sich die aktive chemische Substanz hat absetzen können, und es kann daher sehr leicht entfernt werden. Für den Fachmann ist klar, daß man stattdessen den Aloesaft zur Entfernung von faserartigem Material vor der Zugabe des Lösungsmittels filtrieren kann.
- Bei allen der zuvorgenannten Verfahrensweisen können Aloeblätter oder ganze Pflanzen mehr bevorzugt von dem Feld mit ausreichender Sauberkeit geerntet werden, um die Waschstufe auszuschalten.
- Der getrocknete ausgefällte aktive Inhaltsstoff kann wahlweise durch Gammastrahlung oder Mikrowellenstrahlung bestrahlt werden, wodurch die aktive chemische Substanz sterilisiert und konserviert wird.
- Es ist daher anzunehmen, daß die vorliegende Erfindung neue und verbesserte Verfahren zur Herstellung von Produkten von Aloe vera liefert.
- Es ist weiterhin anzunehmen, daß die vorliegende Erfindung verbesserte Verfahren zur Verarbeitung der Blätter der Pflanze Aloe vera in einer Weise liefert, welche die unerwünschte Kombination oder Mischung von unterschiedlich charakteristischen Teilen eines solchen Pflanzenblattes vermeidet.
- Weiterhin ist anzunehmen, daß die vorliegende Erfindung verbesserte Verfahren zur Herstellung von verschiedenen Extrakten des Blattes der Pflanze Aloe vera liefert, welche die Konzentrationen von unerwünschten Komponenten in den fertigen Extrakten minimiert.
- Auch ist anzunehmen, daß die vorliegende Erfindung neue und verbesserte Verfahren zur Herstellung von Extrakten des Blattes der Pflanze Aloe vera liefert, welche die Konzentration von bestimmten Komponenten maximieren, die für besondere Abschnitte oder Segmente des Blattes charakteristisch sind, während sie bestimmte Komponenten, welche für andere Abschnitte oder Segmente des Blattes charakteristisch sind, auf ein Minimum bringen oder eliminieren.
- Auch ist anzunehmen, daß die vorliegende Erfindung neue und verbesserte Verfahren zur Herstellung von Extrakten aus dem Blatt der Pflanze Aloe vera liefert, welche eine niedrige Konzentration des gelben Saftes des Blattes aufweisen.
- Schließlich ist anzunehmen, daß die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Extraktion der aktiven chemischen Substanz des Gels von Aloe vera liefert. Diese chemische Substanz hat Brauchbarkeit als nichttoxische, immunstimulierende Verbindung. Die Substanz wird im folgenden als Carrisyn oder Acemannan bezeichnet. Wie zuvor erwähnt, wurde gefunden, daß Acemannan ein praktisch nicht abbaubares lyophilisiertes lineares Polymeres aus im wesentlichen acetylierten Mannosemonomeren ist, welches durch Arbeitsweisen der analytischen Chemie standardisiert und charakterisiert ist.
- Die Fig. 1 und 2 zeigen herausgeschnittene Abschnitte eines Blattes von Aloe vera.
- Fig. 3 zeigt ein Schema einer bevorzugten Blattwaschvorrichtung, die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
- Fig. 4 zeigt ein Schema einer bevorzugten Vorrichtung für das Unterteilen und Einweichen von Aloe vera-Blättern.
- Fig. 5 zeigt ein Schema einer bevorzugten Vorrichtung zum Schneiden der Aloeabschnitte zu Filetstücken und für das Grobmahlen.
- Fig. 6 zeigt ein Schema einer bevorzugten Vorrichtung für die Feinhomogenisierung und Filtration.
- Fig. 7 zeigt ein Schema einer bevorzugten Verwendung einer Dialyseausrüstung für Feintrennungen von verarbeitetem Aloematerial.
- Fig. 8 zeigt IR-Spektren für zwei Proben von Carrisyn unter verschiedenen pH-Bedingungen.
- Fig. 9 zeigt ein Differentialthermogramm von Carrisyn .
- Fig.10 zeigt ein Differentialthermogramm von Carrisyn , kontaminiert mit Calciumoxalat.
- Fig.11 zeigt ein Schema für die Charakterisierung von Carrisyn .
- Fig.12 zeigt ein Größenausschlußchromatogramm von Pullulanpolysaccharidstandards.
- Fig.13 zeigt ein Größenausschlußchromatogramm von Carrisyn .
- Fig.14 zeigt ein IR-Spektrum von nicht mit Protease behandeltem Carrisyn .
- Fig.15 zeigt ein IR-Spektrum von mit Protease behandeltem Carrisyn .
- Fig.16 zeigt ein Differentialthermogramm von Carrisyn .
- Fig.17 zeigt ein HPLC-Chromatogramm einer Standardmischung von Glucose, Galactose, Mannose und Inosit.
- Fig.18 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von Carrisyn .
- Fig.19 zeigt ein GLC-Chromatogramm einer Standardmischung von Rhamnose, Fucose, Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose, Glucose und Inosit in Form ihrer Glycitolacetate.
- Fig.20 zeigt ein GLC-Chromatogramm von Carrisyn .
- Fig.21 zeigt eine Eichkurve des Verhältnisses Mannose/Inosit gegen den Gehalt von Acemannan.
- Fig.22 zeigt ein Gesamtionenchromatogramm von partiell methyliertem und partiell acetyliertem Glycitol von Carrisyn .
- Fig.23 zeigt ein Massenspektrum des partiell acetylierten Glycitols von Carrisyn .
- Fig.24 zeigt ein Schema für partiell methylierte Mannitacetate.
- Fig.25 zeigt ein Schema für Fragmentionen von methylierten Mannitacetat bei der massenspektrometrischen Analyse.
- Es wurde gefunden und festgestellt, daß Unterportionen des gelben Saftes und der internen Gelmatrix Merkmale besitzen, welche für solche Unterportionen einzigartig sind, wobei Extrakte hieraus daher potentiell unterschiedliche Anwendungszwecke untereinander haben können. Eine Zusammenfassung dieser unterschiedlichen Portionen und einige ihrer Merkmale und potentiellen Anwendungszwecke ist wie folgt: Portion Unterportion Anwendungen Gelber Saft (1) Sediment (2) Überstehende Flüssigkeit laxativ, antifungal, antibiotisch, pestizid und sonnenschützend mucosal schutzwirkend, sonnenschützend Interne Gelmatrix Äußere Rinde (1) Schleim (2) Gel-Filets (3) Zwischenraum fasern (4) Restliche Matrix eindringend, hypoallergen, Befeuchtungsmittel ulceroprotektiv, zellstimulierend, Befeuchtungsmittel, wundheilend natürlicher Konservierungsstoff, blutstillend Zellwachstumsstimulans pestizides Insektenrepellens, Papierpulpenfaser
- Basierend auf dem zuvorgenannten Wissen und den zuvorgenannten Erkenntnissen und zur Optimierung der Qualität und Konzentration der gewünschten Komponenten in dem fertigen Extrakt in Abhängigkeit von dem beabsichtigten Anwendungszweck hiervon, ist das Verfahren dieser Erfindung auf die anfängliche Fraktionierung der Blätter der Pflanze Aloe vera in besondere unterschiedliche Portionen und Unterportionen, wie zuvor definiert, wie auch auf die Trennung und Isolierung von besonderen Komponenten solcher zuvor definierten Unterportionen gerichtet. Die spezifischen Details und Merkmale solcher Verfahren sind aus der folgenden detaillierten Beschreibung leichter zu verstehen und ergeben sich hieraus. Die vorliegende Erfindung ist auch auf besondere Komponenten gerichtet, welche nach den zuvor beschriebenen Verfahrensweisen isoliert wurden.
- Die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Produkte werden bevorzugt aus den äußeren, niederen Blättern von reifen, im Freien gewachsenen Pflanzen von Aloe vera erhalten. Eine zwei Jahre alte Pflanze ist normalerweise reif; jedoch enthalten die breiteren Blätter einer vier oder fünf Jahre alten Pflanze typischerweise größere Mengen der gewünschten Extrakte und sind auch leichter zu handhaben. Vier oder fünf Jahre alte Blätter von Aloe barbadensis Miller, gewachsen im Rio Grande Valley von Texas, sind am meisten bevorzugt. Diese Blätter wiegen im allgemeinen jeweils etwa 0,68 - 1,14 kg. In Abhängigkeit von der besonderen Verwendung oder besonderen Produkten, welche gewünscht werden, können die Blätter unmittelbar nach ihrem Abschneiden von der Pflanze verarbeitet werden, oder sie können unter geeigneten Bedingungen für unterschiedliche Zeitspannen vor ihrer Verarbeitung gelagert werden. Zusätzlich wird die Konzentration von verschiedenen Komponenten des Blattes durch saisonale Veränderungen und die Umweltbedingungen, denen die Blätter unterworfen sind, beeinflußt, wobei diese insgesamt mit Hinblick auf den spezifischen beabsichtigten Verwendungszweck, für welche die Pflanzenextrakte vorgesehen sind, in Betracht gezogen werden.
- Die Blätter sollten nahe der Pflanzenbasis herausgezogen oder abgeschnitten werden, vorzugsweise ohne Brechen oder Beschädigung irgendeines Teiles des Blattes vor dem Verarbeiten. Bevorzugt verwendet man ein kleines Messer von weniger als 15,2 cm, z.B. ein Taschenmesser, und schneidet das Blatt an der Basis unmittelbar über dem Stiel ab und schält das Blatt von dem Stiel ab, um ein Lecken des klaren zellulären Gels oder eine Verunreinigung des Gels mit dem gelben Saft zu vermeiden. Jedes Brechen oder Quetschen des Blattes kann in dem unerwünschten Vermischen der verschiedenen Portionen enden und damit der charakteristischen Komponenten des Blattes.
- Nach der Entfernung von der Pflanze werden die Blätter normalerweise durch Waschen unter milder Reibeinwirkung oder Besprühen mit einer geeigneten Tensidlösung (wie OLYMPIC POOL CHLOR 65 , vertrieben von York Chem Co., Dallas, Texas), gereinigt. In einigen Fällen erfolgt die Reinigung unter Zuhilfenahme weicher Bürsten. Nach dem Reinigen werden die Blätter gründlich in sauberem Wasser abgespült, um irgendwelche Rückstände irgendeiner Tensidlösung zu entfernen.
- Der weiße oder leicht gefärbte Fußabschnitt eines jeden Blattes und der oberste Abschnitt hiervon werden durch sorgfältiges Schneiden mit einem kleinen scharfen Messer entfernt. Diese Abschnitte, welche im wesentlichen die Enden des Blattes darstellen, können getrennt zur Gewinnung des gelben Saftes hieraus für solche Anwendungen verarbeitet werden, bei denen die Herstellung von Produkten mit Komponenten mit den Eigenschaften des gelben Saftes, wie sie zuvor genannt wurden, gewünscht ist.
- Der restliche Abschnitt eines jeden Blattes von Aloe vera wird dann in kurze Segmente quergeschnitten, vorzugsweise von 1,3 cm Länge, und jedes Segment wird aufrecht in einer wäßrigen Lösung (vorzugsweise entionisiertem Wasser) angeordnet, wobei diese hypertonisch, isotonisch oder hypotonisch sein kann, was das Abtropfen des gelben Saftes aus den Segmenten ergibt. Bei solchen Anwendungen, bei denen das Sammeln des gelben Saftes zur Verwendung in anderen Präparationen mit den zuvorgenannten Merkmalen gewünscht wird, können die Segmente alternativ aufrecht in einem Trockensammelbehälter, vorzugsweise aus rostfreiem Stahl, mit einem Bodensieb aus rostfreiem Stahldraht, angeordnet werden, um das Abtropfen und den Kontakt mit Wasser zur Ermöglichung der Dialyse der Blätter durch das Wasser zu ermöglichen.
- Die Segmente werden für annähernd 20 bis 30 Minuten auf diese Weise abtropfen gelassen. Die geschnittenen Segmente bilden gegebenenfalls eine Abdichtung und Beenden das Abtropfen. Der gelbe Saft, der gesammelt wird, trennt sich dann nach dem Stehenlassen für eine angemessene Zeitspanne in zwei Unterportionen, nämlich Sediment, bzw. überstehende Flüssigkeit, auf. Der gelbe Saft ist zur Herstellung eines guten Sonnenschutzmittels für intakte Haut (nicht gerissene Haut) brauchbar, und liefert auf der Haut eine olive Braunfärbung und ist ebenfalls für die Herstellung von Laxativen anwendbar.
- Nach Abschluß der Arbeitsweise, welche den gelben Saft aus den geschnittenen Blattsegmenten entfernen, werden die Segmente dann unter Bildung von Filets unter Benutzung irgendeiner geeigneten Ausrüstung wie einem Draht (Käsedraht) Schlitzer oder Schälklingen (z.B. Schälmesser) zur Entfernung der äußeren Rinde oder Haut der Blattsegmente und der Schicht, welche unmittelbar unter einer solchen äußeren Haut liegt, zugerichtet. Die Blattsegmente können zur Erleichterung dieses Abhäutungsvorganges gefroren werden. Nach dem Zurichten bleibt der innere Gelmatrixabschnitt (Filet) zurück, und dieser Abschnitt bzw. diese Portion wird sortiert und von Hand gereinigt, um irgendwelche anhaftende Hautteile oder verfärbte Teile unter Ausschaltung irgendwelchen restlichen gelben Saftes hieraus zu reinigen. Es wird ein Sprühvorgang mit weichem Wasser, vorzugsweise entionisiertem Wasser (und frei von Alkohol) angewandt, oder der Gelmatrixabschnitt wird unter fließendem sauberem Wasser untergetaucht, um die Entfernung solcher Reste von gelbem Saft zu erleichtern.
- Das erhaltene Filet (interne Gelmatrix) kann dann für annähernd 1 Stunde abtropfen gelassen werden. Während dieses Abtropfvorganges bildet sich üblicherweise ein schleimiger Überzug auf den Oberflächen der Gelmatrix, wobei dieser Überzug durch Schwerkraft oder unterstützt durch geeignete Mittel wie Zentrifugieren gesammelt wird. Dieser gesammelte Überzug ist die zuvorgenannte Schleimstoff-Unterportion.
- Der restliche Teil der Gelmatrix in Form von Gelmatrixstreifen kann dann gemahlen, zerkleinert oder gemischt werden, um die hierin vorhandenen Zwischenraumfasern zu brechen, oder die Gelmatrixstreifen können durch ein Drahtsieb oder Filtersieb gepreßt werden, um die Verflüssigung zu erreichen. Diese erhaltene Substanz kann dann anschließend homogenisiert werden. Alternativ können die Gelmatrixstreifen gefroren und aufgetaut und anschließend gemischt werden, um eine flüssige Substanz mit Fasern zu bilden (wobei eine solche Substanz die zuvorgenannte Gelfilet-Unterportion bildet). Diese Substanz kann dann filtriert werden, um die Unterportion-Zwischenraumfasern zu erhalten, wobei die zuvorgenannte Unterportion der restlichen Matrix zurückbleibt.
- Der so erhaltene homogenisierte Extrakt hat typischerweise einen pH von etwa 4 bis etwa 5, vorzugsweise von etwa 4.
- Alle Stufen bei dem beschriebenen Verfahren werden bei etwa Zimmertemperatur durchgeführt.
- Die Fig. 3-7 beschreiben in noch weiterem Detail bevorzugte Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens. Spezifisch wird in Fig. 3 eine Vorrichtung zum Waschen der Blätter beschrieben. Die Waschausrüstung für Blätter von Aloe vera (Thompson Manufacturing Company, Harlington, Texas) A wird verwendet, bei welcher Blätter zuerst in den Trog 4 eingeweicht werden. Die ganzen Blätter α werden dann von Hand auf einem Förderband 8 angeordnet, durch welches sie unterhalb von zwei Bürsten 9a und 9b durchgezogen werden. Das Förderband 8 wird über eine Kette 7 angetrieben, welche an einem zweiten Ende von einem Motor und Riemenscheibe 6, welche aus einem Gehäuse 5 herausragt, in Rotation versetzt wird, ebenfalls geliefert von Thompson Manufacturing Company. Wenn die Blätter beim Durchführen unter der zweiten Bürste 9b gebürstet und gewaschen sind, werden die Blätter am Ende 10 des Förderbandes 8 inspiziert, wobei die Blätter visuell inspiziert werden und bestimmt wird, ob sie ausreichend rein oder nicht sind. Falls die Blätter nicht ausreichend sauber sind, werden sie in den Trog 12 für das weitere Waschen eingebracht; falls die Blätter ausreichend sauber sind, werden sie auf einem sich nach oben bewegenden Förderer B, welcher Stufen 13 aufweist und wobei jedes einzelne Blatt weiter mit Leitungswasser durch die Sprühdüsen 11 gewaschen werden kann, angeordnet. Die Fördereinrichtung B wird von Dallas Mill Wright Co., Seagoville, Texas, geliefert. Die Spülsprühdüsen 11 werden von Key Plumbing, Seagoville, Texas, geliefert. Der Trog 12 aus rostfreiem Stahl ist aus rostfreiem Stahl 316 hergestellt und entsprechend Kundenwunsch von National Sheet Metal Company, Dallas, Texas, angefertigt.
- Nach dem Waschen werden die Blätter, wie in Fig.4 angezeigt, in Stücke geschnitten und eingeweicht. Nach der Bewegung über die Stufen 13 der Fördereinrichtung B nach oben fallen die sauberen, rohen Blätter α auf eine Schale 14, welche mit einem Loch 15 zur Entfernung von Ausschuß versehen ist. Die Schale 14 ist ein Teil der Unterteilungs- und Einweichvorrichtung C aus rostfreiem Stahl 316, geliefert von National Sheet Metal Company, Dallas, Texas. Diese Ausrüstung ist nach Kundenangaben hergestellt. Auf der Schale 14 werden die Blätter manuell an beiden Enden abgeschnitten, wobei die Spitzen und die Endstücke durch das Loch 15 in einen (nicht gezeigten) Behälter für Ausschuß abgegeben werden. Die geschnittenen Blätter β werden dann in einem beliebigen Korb einer Anzahl von Körben 16 aus rostfreiem Stahl, wovon jeder einen aus rostfreiem Stahl hergestellten Siebboden aufweist, gestapelt. Dann werden diese Körbe 16 auf einer Führungsbahn aus rostfreiem Stahl, welche den oberen Teil eines trapezförmigen Trichters 17 bildet, durch den gelber Saft von dem Unterteil der Blätter durch die Körbe abtropft und in den Bodenabschnitt des Trichters 17 fällt, aufgesetzt. Der gelbe Saft wird periodisch entfernt und für die Aufbewahrung gefroren gehalten. Die Stufe des Abtropfens des gelben Saftes erfordert etwa 30 min.
- Nach dieser Stufe werden die geschnittenen Blätter β, welche immer noch in dem Korb 16 gehalten werden, manuell in das Wasserbad 18 in Stellungen möglichst nahe an den trapezförmigen Trichter 17 bewegt. In Gegenstrom kommt Wasser in das Bad 18 durch das Einlaßwasserrohr 19 an einem Punkt am weitesten entfernt von dem trapezförmigen Trichter 17 und wird anschließend durch ein Austrittswasserrohr 20 in einer Stellung nächstliegend zu dem trapezförmigen Trichter 17 entfernt. Die Schalen werden allmählich manuell durch das Wasserbad in einer Richtung weg von dem trapezförmigen Trichter 17 geführt, und die Waschstufe, bei welcher die Körbe in dem Wasserbad 18 verbleiben, erfordert annähernd 1 Stunde.
- Nach dem Waschen werden die Körbe auf einer Schale 21 zum Trocknen angeordnet, welches nur wenige Minuten dauert. Die gesamte Anordnung in Fig.4 betreffend die Körbe einschließlich Drahtsieb, Ausrüstung zum Abtropfen des gelben Saftes und der Selbstwaschung ist aus rostfreiem Stahl 316 nach Kundenwunsch von National Sheet Metal Company, Dallas, Texas, hergestellt.
- Nach dem Waschen werden die geschnittenen Blätter β im Korb 16 auf der Schale 21 dann in einen Bereich für das weitere Schneiden zu Filets, wie in Fig.5 gezeigt, bewegt. Die Rinde 22 wird von den Filets entfernt, so daß praktisch nur sauberes Material zurückbleibt. Der Rest der Rinde 22 wird verworfen. Filets τ werden dann in den Bottich 23 gebracht, welcher eine Grobmahleinrichtung D versorgt. Der Bottich 23 ist aus rostfreiem Stahl 316 von National Sheet Metal Company, Dallas, Texas, angefertigt. Die Mahleinrichtung ist ein Modell No. 5150-N-Sink-erator (Watson Food Service Industries, Inc., Dallas, Texas). Nach dem Grobmahlen mittels der Mahl- bzw. Schleifvorrichtung D tritt das verarbeitete Material τ', welches aus der Mahleinrichtung austritt, zu einem transportierbaren Tank E von annähernd 379 l Fassungsvermögen, welcher aus einem senkrechten Einmanteltank aus rostfreiem Stahl 316 besteht (Perma-San, Hersteller, vertrieben durch Van Tone, Inc., Dallas Texas). Grobes gemahlenes Filet τ' wird in dem Tank E durch einen Perma-San-Rührer (Modell No. AAPH2), ebenfalls vertrieben durch Van Tone, Inc., Dallas, Texas, gerührt.
- Nach grober Homogenisierung wird das Material aus dem Tank E zu einem getrennten, in Stufen unterteilten Bereich für die Feinhomogenisierung und (wahlweise) Filtration geführt. In Fig.6 wird Material aus dem Tank E mittels der Pumpe 26 (von Crepaco, Inc., Dallas, Texas gelieferte Zentrifugenpumpe Modell No. 4V-81 aus rostfreiem Stahl) angetrieben vom Reliance -Motor Modell No. B76Q2139M-VF von Reliance Electric Company, Cleveland, Ohio, in einen Feinhomogenisator F (Crepaco, Inc., Dallas, Texas, Modell No. 3DD13) gepumpt. Nach der Feinhomogenisierung wird das Material zu einem großen senkrechten Einmantelmischtank G von 3790 l, hergestellt aus rostfreiem Stahl 316 (Perma-San, Hersteller, vertrieben von Van Tone, Inc., Dallas, Texas) transportiert. Das feingemahlene Filet A wird mit einem Perma-San -Rührer 26a (Perma-San, Modell No. AAPH2, vertrieben von Van Tone, Inc., Dallas, Texas) gerührt. Das Material A in dem Tank G kann entfernt und zur Pumpe 27a gefördert werden, welche eine Einheit mit dem Filter 27b zur Entfernung von Pulpe über die Entsorgungsleitung 28 bildet. Die Pumpe 27a und das Filter 27b bilden Teil eines Lomart -Diatomit-Filters (Modell No. 99-2138, vertrieben von Allen Recreation Company, Dallas, Texas). Gefiltertes Material wird dann in den Tank H gepumpt, welcher wie der Tank E mit einer Klappe 25 versehen sein kann.
- In Fig.7 wird feingemahlenes Filet Δ partiell filtriert, wird im Mischer 29 gerührt und über die Pumpe 30 in eine Dialyseeinrichtung gepumpt. Der Mischer 29 ist ein Perma-San -Rührer (Modell No. AAPH2), verteilt durch Van Tone, Inc. Company, Dallas, Texas. Die Pumpe 30 ist eine Superior -Prozeßpumpe aus rostfreiem Stahl, Modell SCS45 (Superior Stainless Company, Delavan, Wisconsin). Mit der Prozeßpumpe 30 ist der Motor 30a von 2,24 kW, hergestellt von Baldor Motor, mit 4450 Upm (Katalog No. CM3559T der Baldor Electric Company, Ft. Smith, Arkansas) verbunden. Durch die Pumpe 30 gepumptes Material tritt durch die Dialyseeinheit J (ein Romicon - Modell HF4SSS Ultrafiltrationssystem, hergestellt von Romicon Inc., Woburn, Massachusetts), welche 4 Filter 31 (nicht gezeigt) besitzt, wobei jedes Filter in einem Filtergehäuse 32 untergebracht ist. Das Material tritt senkrecht zu einem Punkt, wo Portionen durch Trennleitungen 34 entnommen werden können, und in Trennabgabeleitungen 35. Anderes nicht getrenntes Material wird durch die Rückführleitung 33 zurück in die Dialyseeinheit rückgeführt oder - alternativ - durch die Trennrückführleitung 36 zurück in den Trog I.
- In Abhängigkeit von der gewünschten Aloefraktion und dem gesuchten Endprodukt kann das gewünschte Material entweder über die Trennabgabeleitung 35 nach der Verarbeitung oder in dem Trog I erhalten werden. Falls beispielsweise überschüssiges Wasser und Mineralien entfernt werden sollen, kann ein Ultrafilter mit kleiner Porengröße verwendet werden, um das Wasser und die Mineralien abzutrennen, welche über die Leitung 35 verworfen werden, und die gewünschte Aloefraktion wird zu dem Trog I rückgeführt. Dieses Verfahren kannn wiederholt werden, bis die gewünschte Menge an Salz und Wasser aus dem in dem Behälter I enthaltenen Produkt lediglich durch dessen Zirkulation durch die Dialyseeinheit entfernt wird. Dieses Verfahren kann mehr als eine Dialysestufe einschließen. Wie zuvor beschrieben, können beispielsweise die Salze, Säuren von niedrigem Molekulargewicht und nicht erwünschte Anthrachinone in einer ersten Dialysestufe entfernt werden. Das nichterwünschte Material wird durch die Trennabgabeleitung 35 verworfen, und die gewünschte Fraktion wird zu dem Behälter I rückgeführt. Diese Stufe wird durch Verwendung von Ultrafiltern, erhalten von Romicon mit Poren von 10 000 Dalton erreicht. Als nächstes werden die Ultrafilter mit 10 000 Dalton durch Ultrafilter mit 50 000 Dalton, ebenfalls erhalten von Romicon, ersetzt, und der Dialyseprozeß wird wiederholt. Der Dialyseprozeß trennt nun die Gelmatrixpolymere in zwei Fraktionen; eine erste Fraktion besteht aus Gelmatrixpolymeren mit einer Größe im Bereich von 10 000 bis 50 000 Daltons und wird über die Trennabgabeleitung 35 abgegeben, eine zweite Fraktion besteht aus Gelmatrixpolymeren mit einer Größe von größer als 50 000 Daltons und wird zu dem Behälter I rückgeführt. Dieser Prozeß kann von Minuten bis zu Stunden dauern in Abhängigkeit von der Menge an Salz und Wasser, welche aus einem gegebenen Produkt entfernt werden sollen.
- In Fig. 7 ist die Trennrückführleitung 36 aus Tygon - Schlauch (für Nahrungsmittel geeignet), geliefert von Texas Rubber Supply Company, Dallas, Texas, hergestellt. Die Trennabgabeleitung 35 ist ein Rohr aus rostfreiem Stahl 316, vertrieben von Van Tone, Inc., Dallas, Texas.
- Die restliche Unterportion der Matrix kann dann behandelt werden, um die aktive chemische Substanz, Acemannan, im Gel von Aloe vera abzutrennen, zu isolieren und zu reinigen. Zur Trennung von Acemannan von der restlichen Unterportion der Matrix wird ein Überschuß eines wasserlöslichen niederen aliphatischen polaren Lösungsmittels zu der restlichen Unterportion der Matrix zugesetzt. Acemannan beginnt dann aus dieser Mischung auszufällen. Die Lösung wird für eine ausreichende Zeitspanne absetzen gelassen, damit möglichst viel aktiver Inhaltsstoff aus der Lösung ausfallen kann, jedoch nicht so lange, daß der Abbau von Acemannan beginnt. Nach dieser Zeitspanne wird überstehende Flüssigkeit dekantiert oder über ein Siphon entfernt, ohne den abgesetzten Niederschlag zu stören. Der Niederschlag und verbleibende Lösung werden dann in einer geeigneten Zentrifugenapparatur angeordnet und der Niederschlag wird zu einem Pellet gesammelt. Nach dem Zentrifugieren wird überstehende Flüssigkeit dekantiert und verworfen. Wahlweise wird das Pellet mit einer frischen Teilmenge des wasserlöslichen niederen aliphatischen polaren Lösungsmittels gewaschen und erneut gesammelt, und die überstehende Flüssigkeit wird wiederum verworfen.
- Das Pellet wird dann zur Trockne lyophilisiert und über Nacht trocknen gelassen. Das erhaltene Produkt ist eine im wesentlichen nicht abbaubare, lyophilisierte Form von Acemannan. Das erhaltene Produkt kann zur Bildung eines Pulvers gemahlen werden. Es wird eine geeignete Säure zu dem Gel von Aloe vera vor der Zugabe des niederen aliphatischen polaren Lösungsmittels zugesetzt. Die Säure wird zur Solubilisierung von in dem Gel von Aloe vera enthaltenen Calciumoxalat zugesetzt, um dessen Entfernung zu erleichtern. Die Säure wird bevorzugt mit einer ausreichenden Stärke zugesetzt, um die Verunreinigung von Calciumoxalat zu solubilisieren, jedoch nicht die Acemannanpolymerkette abzubauen.
- Ein anderes und bevorzugtes Verfahren zur Abtrennung und Isolierung von Acemannan schließt die folgenden Stufen ein.
- Blätter aus reifen, im Freien gewachsenen Pflanzen von Aloe vera werden nahe der Basis der Pflanze herausgezogen oder abgeschnitten, vorzugsweise ohne Brechen oder Beschädigung irgendeines Teiles des Blattes vor dem Verarbeiten. Das Blatt wird bevorzugt an der Basis der Pflanze unmittelbar über dem Stiel geschnitten und von dem Stiel abgeschält, um ein Lecken des klaren zellularen Gels oder Kontamination des Gels mit dem gelben Saft zu vermeiden.
- Nach Entfernung von der Pflanze werden die Endstück- und Spitzenabschnitte der Blätter entfernt und die geschnittenen Blätter werden zur Bildung von Filets, wie zuvor bei dem Fraktionierungsprozeß beschrieben, zugeschnitten.
- Das erhaltene Filet (interne Gelmatrix) wird dann gemahlen, zerrissen oder gemischt, um die hierin vorhandenen Zwischenraumfasern aufzubrechen, oder die interne Gelmatrix kann durch ein Drahtmaschensieb oder Filtersieb gepreßt werden, um eine Verflüssigung zu erreichen. Die erhaltene verflüssigte interne Gelmatrix wird dann homogenisiert. Der so erhaltene homogenisierte Extrakt hat typischerweise einen pH von annähernd 4 bis etwa 5, vorzugsweise etwa 4. Der homogenisierte Extrakt wird dann zur Entfernung der Zwischenraumfasern filtriert. Der homogenisierte und filtrierte Extrakt kann dann in identischer Weise wie die Unterportion der rückständigen Matrix behandelt werden, auf welche unmittelbar zuvor Bezug genommen wurde, um Acemannan abzutrennen und zu isolieren.
- Ein weiteres alternatives und bevorzugtes Verfahren zur Trennung und Isolierung von Acemannan schließt die folgenden Stufen ein.
- Blätter aus reifen im Freien gewachsenen Pflanzen von Aloe vera werden nahe der Basis der Pflanze herausgezogen oder abgeschnitten, vorzugsweise ohne Brechen oder Beschädigung irgendeines Teiles des Blattes vor dem Verarbeiten. Das Blatt wird bevorzugt an Basis der Pflanze unmittelbar oberhalb des Stiels abgeschnitten und von dem Stiel abgezogen, um ein Lecken des klaren zellularen Gels oder Kontamination des Gels mit dem gelben Saft zu vermeiden.
- Die Blätter können dann durch geeignete Einrichtungen, beispielsweise einen "Thompson Aloe Extruder", hergestellt von Thompson Manufacturing Company, Harlingen, Texas, zerkleinert werden, um Aloesaft herauszupressen. Der herausgepreßte Aloesaft kann dann in identischer Weise wie die Unterportion der rückständigen Matrix, auf welche zuvor Bezug genommen wurde, behandelt werden, um Acemannan abzutrennen und zu isolieren.
- Alle Stufen der hier beschriebenen Verfahren werden bei etwa Zimmertemperatur durchgeführt, ausgenommen die Lyophilisierungsstufe, welche bevorzugt bei etwa -50ºC durchgeführt wird.
- Verschiedene Modifikationen der beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung wie auch alternative Modifikationen, Veränderungen und Äquivalentmaßnahmen sind für den Fachmann auf dem Gebiet beim Lesen der zuvor gegebenen allgemeinen Beschreibung offensichtlich. Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen den Umfang der Patentansprüche, welche beliebige solcher Modifikationen, Äquivalent oder Variationen umfassen, beschränken.
- 1. Zuvor gereinigte Tanks, Mischer und Verbindungen wurden mit 50% Isopropylalkohollösung (IPA) keimfrei gemacht und mit heißem entionisierten Wasser von IPA freigespült.
- 2. Pumpen und angeschlossene Schläuche wurden mit 5%igen "HTH" Chlorschwimmbeckenlösungen durchspült, dann mit Wasser gespült.
- 3. Pumpen und angeschlossene Schläuche wurden mit 50% Isopropylalkohollösung keimfrei gemacht. Pumpen und angeschlossene Schläuche wurden mit heißem entionisiertem Wasser gespült, bis sie frei von Isopropylalkohol waren.
- 4. Ein Homogenisator und angeschlossene Schläuche und Pumpen wurden mit 50% Isopropylalkohollösung keimfrei gemacht. Der Homogenisator und die angeschlossenen Schläuche wurden mit heißem entionisiertem Wasser gespült, bis sie frei von Isopropylalkohol waren.
- Blätter von Aloe barbadensis Miller, gesammelt im Rio Grande Valley, wurden in einem Kühllastzug bei 4,4 bis 7,2ºC innerhalb 8 Stunden nach der Ernte überführt und unter Kühlung bei 4,4 bis 7,2ºC bis zur Verarbeitung gelagert, um den Abbau zu reduzieren.
- 9 bis 27 kg der gelagerten Blätter wurden dann in einem Vorwaschbad aus einer wäßrigen Lösung von Calciumhypochlorit bei Zimmertemperatur angeordnet, um Oberflächenschmutz von den Blättern im wesentlichen zu entfernen und Oberflächenbakterien auf den Blättern im wesentlichen abzutöten. Die wäßrige Lösung von Calciumhypochlorit wurde durch Zugabe von annähernd 0,125 g 98%igem Calciumhypochlorit zu 1 l Wasser unter Herstellung einer Lösung mit einem Gehalt von 50 ppm an freiem Chlor hergestellt. Die Blätter verblieben in dem Vorwaschbad für eine Zeitspanne von annähernd 5 min.
- Als nächstes wurden die im wesentlichen schmutz- und bakterienfreien Blätter auf dem waagerechten Förderband eines "Thompson Aloe Wäscher", hergestellt von Thompson Manufacturing Company, Harlingen, Texas, angeordnet. Der "Thompson Aloe Wäscher" wusch die Blätter mit Wasser von Zimmertemperatur zur Entfernung des Oberflächenschmutzes und zum Abwaschen der wäßrigen Lösung von Calciumhypochlorit von den Blättern. Die Blätter wurden erneut visuell inspiziert und erforderlichenfalls von Hand gebürstet, um irgendwelchen auf den Blättern verbliebenen Oberflächenschmutz zu entfernen. Solche Blätter wurden dann mit Wasser von Zimmertemperatur gespült.
- Der Spitzen- und Endstückabschnitt wurde dann von jedem Blatt entfernt, und die Blätter wurden in den korbartigen Behältern aus rostfreiem Stahl angeordnet, die zusammen auf dem Oberteil eines trichterförmigen Kollektors aus rostfreiem Stahl angeordnet wurden, wobei jeder Behälter einen Siebboden besaß. Der gelbe Saft wurde aus den Blättern für annähernd 30 min abtropfen gelassen. Der gelbe Saft trat durch den Siebboden des Korbes aus rostfreiem Stahl durch und wurde in dem trichterförmigen Kollektor gesammelt.
- Die korbförmigen Behälter aus rostfreiem Stahl, welche die Aloeblätter enthielten, wurden von dem Kollektor entfernt und wurden dann in einem zweiten Kessel aus rostfreiem Stahl untergetaucht, der ein Wasserbad bei Zimmertemperatur von kontinuierlich waagerecht strömendem Spülwasser enthielt, welches sich im Gegenstrom zu den Behältern bewegte, die langsam von Hand von einem Ende des Kessels zu dem anderen bewegt wurden für annähernd 30 min bis 1 Stunde. Dies ermöglicht ein weiteres Abtropfen des gelben Saftes aus den Blättern. Die Blätter wurden in dieser Lösung für 30 min eingeweicht.
- Die Blätter wurden dann aus dieser Lösung entfernt und die Rinde wurde von jedem Blatt mit einem scharfen Messer oder einer Käsedrahtschlitzvorrichtung entfernt, um ein Filet von Aloegel aus jedem Blattabschnitt herzustellen. Die Filets von Aloegel wurden visuell inspiziert und irgendwelche verunreinigten Filets von Aloegel oder Filetstücke, welche eine charakteristische gelbe Verfärbung zeigten, wurden verworfen. Die Gesamtmasse von nichtverunreinigten Filets von Aloegel betrug 20 bis 60% der Ausgangsblattmasse in Abhängigkeit von der Blattgröße und dem Zustand.
- Die nichtverunreinigten Filets von Aloegel wurden dann in einer Abfallentsorgungseinheit aus rostfreiem Stahl mit einer Kapazität für ein Restaurant mit 750 Sitzplätzen angeordnet, welche die Filets bis zu einer Durchschnittsteilchengröße der Konsistenz einer dicken, jedoch freifließenden (grob homogenisierten) Flüssigkeit grob zerkleinert. Die Abfallentsorgungseinheit aus rostfreiem Stahl war von der N-sink-erator Division von Emerson Electric Co., Racine, WI, hergestellt, Modell No. 55-150-13, Serien-Nr. 115132.
- Die grobgemahlenen Filets von Aloegel wurden dann in einen Aufbewahrungstrog aus rostfreiem Stahl von 379 l überführt. Der Aufbewahrungstrog war von Process Equipment Corp., Belding, Michigan, hergestellt, Modell No. 100 gallon OVC, Serien-Nr. 40865-3.
- Aus dem Aufbewahrungstank wurde die Lösung aus grobgemahlenen Filets von Aloegel in einen Homogenisator gepumpt. Der Homogenisator war von Crepaco Food Equipment and Refrigeration, Inc., Chicago, Illinois, hergestellt, Serien- Nr. 04-03. Der Homogenisator war von dem Typ, wie er typischerweise bei Molkereiprozessen zur Homogenisierung von Milch verwendet wird. Die Lösung aus grobgemahlenem Filet von Aloegel wurde unter einem Druck von etwa 103 bar fein homogenisiert.
- Aus dem Homogenisator wurde die fein homogenisierte Lösung von Filets von Aloegel in einen Lagertank aus rostfreiem Stahl gepumpt. Der Lagertank war von Process Equipment Corp., Belding, Michigan, hergestellt, Modell No. 1000 gallon OVC, Serien-Nr. 40866-2. Die Gesamtmasse der Lösung von homogenisiertem Gel von Aloe betrug 20 bis 60% der Ausgangsblattmasse. Dann wurde, falls erforderlich, das homogenisierte Produkt unter Anwendung von Ultrafiltration dialysiert.
- Die Lösung von fein homogenisiertem Filet von Aloegel wurde dann zur Entfernung der Zwischenraumfasern unter Verwendung eines Leslie's Diatomeenerdefilters Modell DE-48 filtriert. Die Zwischenraumfasern selbst wurden anstelle von Diatomeenerde als Filtermedium benutzt, wobei die Fasern auf einem Filterträger aus Nylonmaschengewebe gehalten wurden. Das Gel wurde durch das Filter für mehrere Minuten vor dem Öffnen des Austrittes gepumpt, so daß eine ausreichende Menge der Fasern sich aufbauen konnten, um als Filtermedium zu dienen.
- 75,7 l der Lösung von gefiltertem Filet aus Aloegel wurden dann in einen 379 l Tank gepumpt, und es wurden 303 l nichtdenaturiertes Ethanol, 190 Proof (= 95 %) (Ethylalcohol 190 Proof, U.S.P., punctilious, 54 gal. Batch I.D. CT185JO4, erhältlich über U.S. Industrial Chemicals, Co., P.O. Box 218, Tuscola, Illinois 61953) zu der Lösung der Filets von Aloegel zugesetzt. Die Lösung wurde dann für 20 bis 30 min unter Verwendung eines Perma-San -Flügelrührers, Modell PGF-4A, Process Equipment Corp., Belding, Michigan, gerührt.
- Die Alkohol-Gel-Lösungen wurden dann sofort in mehrere 10,4 l (11 quart) Pfannen von 26,7 cm Durchmesser und 20,3 cm Höhe aus rostfreiem Stahl 18-8 (Bloomfield Industries Inc., Chicago, Illinois, erhältlich über Watson Food Service Equipment and Supplies, 3712 Hagger Way, Dallas, Texas) überführt.
- Die Alkohol-Gel-Lösungen wurden dann für annähernd 4 h sich absetzen gelassen.
- Die klare überstehende Flüssigkeit wurde dann dekantiert oder mittels eines Siphons abgezogen, wobei darauf geachtet wurde, daß der Niederschlag, der sich auf dem Boden der Pfannen abgesetzt hatte, nicht gestört wurde. Der Niederschlag und die verbleibenden Lösungen wurden dann in vier Zentrifugengefäß von 0,47 l (1 pint) überführt, wobei etwa 500 g Niederschlag und verbleibende Lösung in jeden Behälter überführt wurden. Die Behälter wurden dann bei 2000 x g für etwa 10 min unter Verwendung einer IEC Centra-7-Centrifuge ) (International Equipment Co., 300 2nd Avenue, Needham Heights, Massachusetts 02194, erhältlich über American Scientific Products, P.O. Box 1048, Grand Prairie, Texas 75050) zentrifugiert.
- Nach dem Zentrifugieren wurden die überstehenden Flüssigkeiten dekantiert und verworfen. Die Pellets wurden dann mit frischem nichtdenaturiertem Ethanol, 190 Proof, gewaschen und erneut bei 2000 x g für etwa 10 min gesammelt. Nach erneutem Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen.
- Das Pellet wurde dann in mehrere 600 ml VIRTIS Lyophilisierungsstandgefäße überführt und in flüssigem Stickstoff bis zum Einfrieren bewegt. Die Lyophilisierungsstandgefäße wurden dann an einer Lyophilisierungsvorrichtung befestigt, bestehend aus einem Welch Duo-seal Vacuum Pump (Modell No. 1402, erhältlich von Sargeant-Welch, P.O. Box 35445, Dallas, Texas 75235), einem Virtis Immersion Coil Cooler , Modell Nr. 6205-4350, Kühler in Acetonbad) und einem Virtis 18 Port Vacuum Drum Manifold (Modell Nr. 6211-0350 Manifold = Rohrverteiler). Alle Ausrüstungen von Virtis ist von American Scientific Products, P.O. Box 1048, Grand Prairie, Texas 75050, erhältlich. Die Lyophilisierungstrommel wurde mit Aceton gefüllt, welches auf -50ºC gehalten wurde.
- Die Proben wurden dann über Nacht zur Trockne lyophilisiert und dann auf einer Waage Mettler AE 163 ausgewogen. Die verbleibenden Proben bestanden im wesentlichen aus nicht-abbaubarem lyophilisierten Carrisyn , Die Ausbeute aus 75,7 l Gel von Aloe vera betrug etwa 145-155 g Carrisyn .
- Blätter von Aloe barbadensis Miller, gesammelt aus dem Rio-Grande-Tal, wurden in einen gekühlten Lastwagen bei 4,4 bis 7,2ºC innerhalb von 8 h nach der Ernte überführt und unter Kühlung bei 4,4 bis 7,2ºC bis zur Verarbeitung zur Herabsetzung des Abbaues gelagert.
- Die Spitzen- und Endabschnitte wurden von jedem Blatt entfernt. Die Rinde wurde dann von jedem Blatt mit einem scharfen Messer oder einer Käsedrahtschneideinrichtung zur Herstellung eines Aloegelfilets von jedem Blattabschnitt entfernt.
- Die Aloegelfilets wurden dann in einer Abfallbeseitigungseinheit aus rostfreiem Stahl mit ausreichender Größe für ein Restaurant mit 750 Sitzen angeordnet, welche die Filets zu einer Durchschnittsteilchengröße der Konsistenz einer dicken, jedoch freifließenden (grob homogenisierten) Flüssigkeit zermahlte. Die Abfallbeseitigungseinheit aus rostfreiem Stahl wurde von der N-sink-erator Division of Emerson Electric Co., Racine, WI, hergestellt, Modell No. 55-150-13, Serien Nr. 115132.
- Die grobgemahlenen Filets des Aloegels wurden dann in einen 379 l Aufbewahrungstank aus rostfreiem Stahl überführt. Der Aufbewahrungstank war von Process Equipment Corp., Belding, Michigan, hergestellt, Modell Nr. 100 Gallon OVC, Serien Nr. 40865-3.
- Aus dem Aufbewahrungstank wurde die Lösung der grobgemahlenen Aloegelfilets in einen Homogenisator gepumpt. Der Homogenisator war von Crepaco Food Equipment and Refrigeration, Inc., Chicago, Illinois, hergetellt, Serien Nr. 04-03. Der Homogenisator gehörte zu einem Typ, wie er typischerweise bei Milchverarbeitungsvorgängen zur Homogenisierung von Milch verwendet wird. Die Lösung der grobgemahlenen Aloegelfilets wurde unter einem Druck von 103 bar fein homogenisiert.
- Aus dem Homogenisator wurde die Lösung der fein homogenisierten Aloegelfilets in einen Lagertank aus rostfreiem Stahl gepumpt. Der Lagertank war von Process Equipment Corp., Belding, Michigan, hergestellt, Modell Nr. 1000 Gallon OVC, Serien Nr. 40866-2. Die Gesamtmasse der Lösung von homogenisierten Aloegelfilets betrug 20 bis 60% der Ausgangsblattmasse. Falls erforderlich wurde das homogenisierte Produkt dann unter Verwendung einer Ultrafiltration dialysiert.
- Das homogenisierte Gel wurde dann zur Entfernung der Zwischenraumfasern unter Verwendung eines Leslie Diatomeenerdefilters , Modell DE-48, filtriert. Die Zwischenraumfasern selbst wurden anstelle von Diatomeenerde als Filtermedium verwendet, wobei die Fasern von einem Träger aus Nylonmaschenfiltergewebe getragen wurden. Das Gel wurde dann durch das Filter für mehrere Minuten vor Öffnung der Austrittsöffnung gepumpt, so daß eine ausreichende Menge von Fasern sich unter Bildung des Filtermediums aufbauen konnten.
- 75,7 1 des gefilterten Gels wurden dann in einen 379 l Tank eingepumpt, und es wurden 303 l nichtdenaturiertes Ethanol von 190 Proof (Ethylalkohol, 190 Proof, U.S.P., Ethanol von 190 Proof (Ethylalkohol, 190 Proof, U.S.P., punctilious, 54 gal. Batch I.D. Nr.CT185J04, erhältlich über U.S. Industrial Chemicals, Co., P.O. Box 218, Tuscola, Illinois 61953) wurden zu der Lösung der Aloegelfilets zugegeben. Die Lösung wurde für 20 bis 30 min unter Verwendung eines Perma-San Flügelrührers, Modell Nr. AAPGF-4A, Process Equipment Corp., Belding, Michigan, gerührt.
- Die Alkohol-Gel-Lösungen wurden dann sofort in mehrere 10,4 l (11 quart) Pfannen von 26,7 cm Durchmesser und 20,3 cm Höhe aus 18-8 rostfreiem Stahl (Bloomfiled Industries Inc., Chicago, Illinois, erhältlich über Watson Food Service Equipment and Supplies, 3712 Hagger Way, Dallas, Texas) überführt.
- Die Alkohol-Gel-Lösungen wurden dann sich für annähernd 4 h absetzen gelassen.
- Die klare überstehende Flüssigkeit wurde dann dekantiert oder über einen Siphon entfernt, wobei dafür Sorge getragen wurde, den Niederschlag, der sich auf dem Boden der Pfannen abgesetzt hatte, nicht aufzurühren. Der Niederschlag und die verbleibenden Lösungen wurden dann in vier 0,47 l (1 pint) Zentrifugenbehälter aus rostfreiern Stahl überführt, wobei etwa 500 g Niederschlag und verbleibende Lösung in jeden Behälter überführt wurden. Die Behälter wurden dann bei 2000 x g für etwa 10 min unter Verwendung einer IEC Centra-7 Zentrifuge (International Equipment Co., 300 2nd Avenue, Needham Heights, Massachusetts 02194, erhältlich über: American Scientific Products, P.O. Box 1048, Grand Prairie, Texas 75050) rotieren gelassen.
- Nach Zentrifugieren wurden die überstehenden Flüssigkeiten dekantiert und verworfen. Die Pellets wurden dann mit frischem nichtdenaturiertem Ethanol von 190 Proof gewaschen und erneut bei 2000 x g für etwa 10 min zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit erneut verworfen.
- Das Pellet wurde dann in mehrere 600 ml Lyophilisierungsbehälter VIRTIS überführt und in flüssigem Stickstoff bis zum Einfrieren bewegt. Die Lyophilisierungsbehälter wurden dann an eine Lyophilisierungsapparatur angeschlossen, bestehend aus einer Welch Duo-seal Vacuum Pump (Modell Nr. 1402, erhältlich von Sargeant-Welch, P.O. Box 35445, Dallas Texas 75235) einem Virtis Immersion Coil Cooler (Modell Nr. 6205-4350-Kühler in Acetonbad) und einer Virtis 18 Port Vacuum Drum Manifold , Verteiler (Modell Nr. 6211-0350). Alle Virtis -Ausrüstung ist von American Scientific Products, P.O. Box 1048, Grand Prairie, Texas 75050, erhältlich. Die Lyphilisierungstrommel war mit Aceton gefüllt, das auf -50ºC gehalten wurde.
- Die Proben wurden über Nacht trocknen gelassen und wurden dann auf einer Waage, Mettler AE 163, ausgewogen. Die verbliebenen Proben bestanden im wesentlichen aus nichtabbaubarem, lyophilisierten Carrisyn , Die Ausbeute aus 75,7 l Aloe-vera-Gel betrug annähernd 145-155 g Carrisyn ,
- Annähernd 22,7 kg Blätter von Aloe barbadensis Miller wurden mit Wasser gewaschen und zur Entfernung des Schmutzes, von getrocknetem Latex und anderen verunreinigenden Stoffen gewaschen. Die äußere Haut jedes Blattes wurde dann entfernt, und die ganzen Filets wurden in einem großen Becher (auf Eis) angeordnet.
- Ein Waring -Mischer wurde mit Ansätzen von 1,5 l mit den ganzen Aloe-Filets beladen. Die Filets wurden bei hoher Geschwindigkeit zweimal für 2 min bei Zimmertemperatur behandelt. Die behandelten Filets wurden dann auf 4ºC abgekühlt, um den während des Mischens erzeugten Schaum sich absetzen zu lassen.
- Der gemischte Aloesaft wurde dann durch vier Schichten von Baumwolle (Cleveland Baumwolle) zur Entfernung irgendwelcher faserartigen Cellulosepulpe filtriert. Das Filtrat wurde dann durch sechs Schichten Baumwolle passiert, und es wurden etwa 4 l Aloesaft gesammelt.
- Der Aloesaft wurde dann in einem großen Behälter von fünf Gallonen aus rostfreiem Stahl angeordnet. Zu dem gefilterten Saft wurden 16 l abgekühltes Ethanol (Fisher Ethanol , Reagensqualität, Katalog Nr. A995) zugesetzt. Das Ethanol wurde langsam unter Rühren des Aloesaftes zugegeben. Es bildete sich ein flockenförmiger Niederschlag, und die Mischung wurde für 15 bis 30 min gerührt und dann bei Zimmertemperatur für etwa 2 h sich absetzen gelassen.
- Die überstehende Flüssigkeit wurde dann abdekantiert, und das Pellet wurde in einem kleinen Mischer angeordnet, zu welchem 1 l entionisiertes Waser zugesetzt wurden. Diese Mischung wurde für mehrere Minuten bei niedriger Geschwindigkeit zum Waschen des Pellets gemischt und dann in einem Kunststoffbehälter (Nalgene-Behälter) angeordnet. Zu dieser Mischung wurden weitere 4 l Ethanol zugesetzt, und die Mischung wurde für 30 min gerührt. Der Niederschlag, welcher sich gebildet hatte, wurde sich für etwa 2 h absetzen gelassen.
- Der größere Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde dann abdekantiert, und das erhaltene Pellet wurde bei 2000 x g für 20 min bei Zimmertemperatur zentrifugiert, um den Niederschlag für ein einfaches Dekantieren des verbleibenden Lösungsmittels in ein Pellet zu überführen. Das Pellet wurde dann in einem Virtis Lyophilisator über Nacht lyophilisiert.
- Das lyophilisierte Pulver wog 10,9 g. Die prozentuale Ausbeute betrug 0,273% oder 2,73 x 10&supmin;³ g/ml.
- Während des Prozesses der Extraktion von Acemannan aus Aloe-vera-Gel durch Alkohol wurde gefunden, daß kleinere Mengen von organischer und anorganischer Substanz mit dem Produkt zusammen ausfallen. Ein großer Teil der anorganischen Salze und tatsächlich der größere Teil der Verunreinigungen in der Alkoholextraktion von Aloe-vera-Gel zu Acemannan ist Calciumoxalat. Die Anwesenheit von Calciumoxalat wird durch optische Mikroskopie, IR-Spektroskopie und thermogravimetrische Analyse bestätigt. Obwohl die Menge von Calciumoxalat von Ansatz zu Ansatz variieren kann, wurden etwa 30 Gew.-% des Gesamtextraktes ausmachende Calciumoxalatmengen beobachtet. Der Zweck des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens ist es, den Oxalatgehalt in Acemannan herabzusetzen. Calciumoxalat ist in Wasser und Alkohol sehr unlöslich. Durch Behandlung von Aloegel mit Alkohol wird das Oxalat in dem Carrisyn-Niederschlag konzentriert. Diese Konzentration von Oxalat wird durch die starke IR-Absorption von Carrisyn zwischen 1600-1587 cm&supmin;¹ als Folge der asymmetrischen Carbonylschwingung des Oxalates und durch den hohen Aschegehalt von Carrisyn bei der thermogravimetrischen Analyse gezeigt. Da Acemannan die aktive Substanz in Carrisyn ist, sollten anorganische Salze wie Calciumoxalat entfernt oder zumindest auf ein Minimum für die Konsistenz der Produktqualität und aus Gesundheitsgründen gebracht werden.
- Eine Arbeitsweise zur Abtrennung der Oxalate und anderer anorganische Salze wäre durch Membrandialyse. Jedoch hat diese Methode zahlreiche Nachteile und Mängel. Das Verfahren ist sehr zeitaufwendig, da das rohe Carrisyn rehydratisiert, in Alkohol reextrahiert und erneut gefriergetrocknet werden muß. Am wichtigsten ist jedoch, daß ein mikrobieller Abbau und eine Verunreinigung ein sehr inaktives Carrisyn ergeben, falls das Produkt nicht während der Dialysestufe geschützt wird.
- Im allgemeinen werden Carbonsäuresalze in ihre entsprechenden Säuren bei Behandlung mit verdünnten Mineralsäuren umgewandelt. Durch Behandlung von Calciumoxalat mit Salzsäure würden Oxalsäure und Calciumsalze der Salzsäure nach folgendem Mechanismus gebildet werden:
- CaC&sub2;O&sub4; + 2H&spplus; T Cl&supmin; C&sub2;H&sub2;O&sub4; + Ca&spplus;&spplus; + 2Cl&supmin;
- (Calciumoxalat) (Oxalsäure)
- Oxalsäure ist in Wasser und Alkohol stark löslich und wird daher bevorzugt in die Wasser/Alkoholmischung extrahiert. Das Ergebnis ist, daß das Carrisyn einen sehr viel geringeren Gehalt an Oxalaten und anderen anorganischen Salzen enthält.
- Etwa 2 l Aloe-vera-Gel, welche zuvor bei einem Druck von 34,5 bar oberhalb Atmosphärendruck homogenisiert und durch ein neues Swimmingpool-Filter filtriert worden waren, wurden für dieses Beispiel gesammelt. Ein Anfangs-pH des Gels wurde nach dem Rühren bestimmt. Gelproben von bekanntem Gewicht wurden in mehrere 600 ml Becher eingegeben, und der pH wurde entsprechend mit einer geeigneten Säure, hier einer verdünnten Mineralsäure (bevorzugt 6N Salzsäure) oder konzentrierter Natriumhydroxidlösung wie folgt eingestellt: Probe Nr. Gewicht (Gel) pH
- Nachdem der pH jeder Probe eingestellt worden war, wurden vier (4) Volumina SDA-3A-Ethanol sobald wie möglich hinzugegeben, um die Zeit auf ein Minimum zu bringen, welche das Gel unter aufgezwungener pH-Bedingung verbleibt. Nach Rühren der Mischung für weniger als 2 min wurde jede Mischung für etwa 3-4 h stehengelassen. Jeder Extrakt wurde dann zentrifugiert, gefriergetrocknet und ausgewogen, um die Ausbeute unter verschiedenen pH-Bedingungen zu bestimmen.
- Die IR-Spektren der neun festen Carrisyn-Proben wurden mit einer Scheibe erhalten, welche durch Vermischen einer geeigneten Menge der Substanz in Kaliumbromid hergestellt worden war. Jede Scheibe wurde von 4000 bis 400 cm&supmin;¹ (Wellenzahlen) auf einem IBM FT-IR-Spektrometer abgetastet. Die Spektren der Carrisyn -Proben bei unterschiedlichen pH-Bedingungen wurden qualitativ verglichen.
- Der thermische Gewichtsverlust von Carrisyn hat ein definieretes charakteristisches Profil. Etwa 10 mg einer jeden Probe wurden in einer Mettler -Thermoanalyseapparatur von 25ºC bis 780ºC bei einer Geschwindigkeit von 20ºC/min erhitzt. Es wurde eine Stickstoffgasatmosphäre angewandt, bis eine Temperatur von 600ºC erreicht war, gefolgt von oxidierender Umgebung bis 780ºC, und dann wurde jede Probe bei dieser Temperatur 2 min belassen. Aus dem Thermogramm des Gewichtsverlustes wurden der Feuchtigkeitsgehalt, der Gehalt an Kohlehydrat, oxidierbarem Kohlenstoffskelett, Oxalat und Asche bestimmt.
- Der wichtigste Faktor bei einer Säurebehandlung von Carrisyn ist, ob die physiochemischen Eigenschaften der Substanz durch das Verfahren schädlich beeinflußt wurden. Eine geeignete Säure muß ausgewählt werden: (i) eine Säure, die in der Lage ist, den geeigneten pH-Bereich (von etwa 3,0 bis etwa 3,5) in vernünftigen Volumina zu erreichen, (ii) die nicht in schädlicher Weise mit vorteilhaften Komponenten (polydispersem Acemannan) der Lösungsmittelmischung (Ethanol) und den Aufbewahrungsbehältern und der Ausrüstung reagiert; und (iii) zusätzlich in einer solchen Konzentration ausgewählt, daß die Acemannan-Kette nicht abgebaut wird. Zahlreiche verdünnte Mineralsäuren und organische Säuren in höheren Konzentrationen sind geeignet, obwohl eine nichtoxidierende Mineralsäure am meisten im Hinblick auf die Minimierung von Veresterung und Abbau geeignet ist. Bei der Auswahl einer geeigneten Säure, z.B. 6N Salzsäure, wird sogar statt einer schädlichen Beeinflussung die Qualität des Carrisyns anscheinend beträchtlich bei Bedingungen eines niedrigeren pH verbessert. Beispielsweise ergab die gleiche Konzentration (Gew./Vol.) an Carrisyn eine stärker viskose, rehydratisierte Lösung, wenn mit Säure behandelt. Eine viskose Lösung bedeutet gutes Produkt. Eine chromatographische Größenausschlußtrennung der Lösung zeigte dasselbe chromatographische Profil wie ein nichtbehandeltes Carrisyn . Daher wurde unter den angewandten Bedingungen kein Abbau beobachtet.
- Die folgenden Ergebnisse zeigen, daß die Ausbeute von Carrisyn, angegeben in Gesamtfeststoffen in einem Einheitsvolumen von Gel, nach Säurebehandlung reduziert wird: Probe Nr. pH Ausbeute (%)
- Jedoch zeigen nachfolgende Analysen der Produkte durch IR-Spektroskopie und thermogravimetrische Analyse, daß die hohe Ausbeute deutlich mit dem Gehalt von Oxalat und Asche zusammenfiel.
- Die IR-Spektroskopie kann umfassend angewandt werden, um Carrisyn sowohl qualitativ als auch quantitativ zu charakterisieren. Die Zunahme des Absorptionspeaks der Acetylgruppe, gelegen bei etwa 1740 cm&supmin;¹, und die Abnahme des Oxalatpeaks bei etwa 1590 cm&supmin;¹ von Carrisyn bei niedrigerem pH zeigt eine Reduzierung des Oxalatgehaltes (Fig. 8).
- Die thermogravimetrische Analyse ergibt ein charakteristisches Profil des Gewichtsverlustes mit der Temperatur. Im allgemeinen ergibt reines Carrisyn 3 Hauptpeaks beim Differentialthermogramm, nämlich; (a) Feuchtigkeit 30-100ºC, (b) Kohlehydrat (Acemannan) 200-400ºC und (c) oxidierbares Kohlenstoffskelett 600-630ºC (Fig. 9). Andererseits zeigt mit Calciumoxalat verunreinigtes Carrisyn beispielsweise zwei weitere Peaks, welche zwischen 456-500ºC und 650-720ºC angeordnet sind, zusammen mit hohem Aschegehalt (Fig.10).
- Die folgenden Tabellen 1A-E zeigen thermogravimetrische Analysen von Carrisyn bei verschiedenen pH-Bedingungen. Tabelle 1A THERMOGRAVIMETRISCHE ANALYSE VON CARRISYN , pH 4.56 Oxalat Probe Nr. % Rückstand % Kohlehydrat Durchschnitt (X) Standard abweichung Tabelle 1B THERMOGRAVIMETRISCHE ANALYSE VON CARRISYN , pH 3,60 Oxalat Probe Nr. % Rückstand % Kohlehydrat Durchschnitt (X) Std. Abw. Tabelle 1C THERMOGRAVIMETRISCHE ANALYSE VON CARRISYN , pH 3,20 Oxalat Probe Nr, % Rückstand % Kohlehydrat Durchschnitt (X) Std. Abw. Tabelle 1D THERMOGRAVIMETRISCHE ANALYSE von recyceltem CARRISYN (20 min Rühren) Oxalat Probe Nr, % Rückstand % Kohlehydrat Durchschnitt (X) Std. Abw. Tabelle 1E THERMOGRAVIMETRISCHE ANALYSE von recyceltem CARRISYN (40 min Rühren) Oxalat Probe Nr, % Rückstand % Kohlehydrat Durchschnitt (X) Std. Abw.
- Die Tabellen zeigen, daß:
- 1. Carrisyn , hergestellt aus einem Ausgangsgel mit einem pH im Überschuß von 4,56, zeigte einen Durchschnittsgesamtkohlehydratgehalt und Rückstandsgehalt (Asche) von 52,2% bzw. 18,1%.
- 2. Bei Einstellung des pH des Ausgangsgels von etwa 4,56 auf 3,60 betrugen die Gehalte an Kohlehydrat und Asche 71,4% bzw. 8,55%. Dies ist eine Verbesserung von 36,8% und 52,8% für jeden gemessenen Parameter.
- 3. Bei einem pH von 3,20 stieg jedoch der durchschnittliche Kohlehydratgehalt auf 79,3%, während der Aschegehalt auf 3,86% abnahm, dies bedeutet eine Zunahme an Kohlehydrat von etwa 51,2% und eine Abnahme der Asche von 78,7%,
- 4. Vorläufige Werte zeigen, daß Ansätze von Carrisyn mit erhöhtem Kohlehydratgehalt und niedrigerem Aschewert bessere antivirale Aktivität zeigten; es wird daher empfohlen, daß die Verarbeitung bei einem pH zwischen 3,00 und 3,50 durchgeführt wird. Tabelle 2 Effekte von pH auf die Qualität von Carrisyn - (TGA-Methode) Feuchtigkeit Acemannan Kohlenstoffskelett Calciumoxalat Asche Ausbeute(%)
- Die Ausbeute an Carrisyn (Gesamtfeststoffe), Calciumoxalat, Aschegehalt und Feuchtigkeit scheinen mit zunehmendem pH bis zu 4 - 5 zuzunehmen. Jedoch nehmen Acemannan und das entsprechende Kohlenstoff skelett mit abnehmendem pH zu. Daher wird ein pH von größer als 4,0 nicht empfohlen, falls die Gehalte von Asche und Calciumoxalat herabgesetzt werden müssen. Eine Ausbeute von Carrisyn von größer als 0,2 % muß auf Calciumoxalatverunreinigung analytisch untersuch werden.
- Durch Behandlung von Aloe-vera-Gel mit einer geeigneten Säure, z.B. einer verdünnten Mineralsäure, vorzugsweise Salzsäure, zur Eichung des PH des Gels auf Werte zwischen 3,0 bis 3,5 mit anschließender Ethanolextraktion bewirkte eine signifikante Herabsetzung der Menge an Oxalaten. Durch diese Stufe können sowohl der Calciumoxalatgehalt als auch der Aschegehalt um mehr als 80% reduziert werden. Die Behandlung konzentrierte ebenfalls die Menge des aktiven Carrisyns ohne Abbau des Polymeren, wie durch physikalisch-chemische Analysenmethoden gezeigt wurden.
- Zwei Ansätze von Carrisyn wurden verarbeitet, wie in Beispiel 1 beschrieben, jedoch mit der zusätzlichen Stufe der Ansäuerung auf pH 3,6 vor der Ausfällung mit Ethanol. Beim Ansatz Nr. 70315 wurde konzentrierte Salpetersäure (61 ml) zu 20 Gallonen homogenisiertem Aloe-vera-Gel zugesetzt. Beim Ansatz Nr. 70321 wurde konzentrierte Salzsäure (171 ml) zu 45 Gallonen von homogenisiertem Aloe-vera-Gel zugegeben. Die Ausbeuten betrugen 55,6 g (0,07%) bzw. 186,6 g (0,11%). Die chemische Analyse durch IR und TGA zeigte, daß beide Ansätze vergleichbare Qualität und reduziertes Calciumoxalat aufwiesen. Die Analysen dieser beiden Ansätze sind in Tabelle 1B enthalten.
- Dem Fachmann auf dem Gebiet wird offensichtlich, daß Salpetersäure nur für die Ansäuerung wie auch Salzsäure oder irgendwelche andere geeigneten Säuren verwendet werden kann.
- Unter Anwendung pharmazeutischer Screeningtechniken wurde jetzt ein Polysaccharid, extrahiert aus Aloe vera, als aktive chemische Substanz in Aloe vera gefunden. Dieses Polysaccharid wird im folgenden als Acemannan bezeichnet. Acemannan ist ein geordnetes lineares Polymeres von im wesentlichen acetylierten Mannosemonomeren. Andere Inhaltsstoffe wie Proteine, organische Säuren, Anthrachinone, Vitamine und Aminosäuren machen weniger als 1% von Carrisyn aus. Es wurde gefunden, daß die Konzentration von Carrisyn in Aloe vera annähernd 0,05 bis 0,3 Gew.-% des Saftes von Aloe vera ausmacht. Die Ausbeute oder Konzentration an Carrisyn in den Blättern hängt von der Reife der Blätter ab.
- Die pharmakologischen Daten, welche zeigen, daß Acemannan die aktive chemische Substanz in Aloe vera ist, können wie folgt zusammengefaßt werden:
- 1. Das Dosis-Ansprechen von Acemannan war dasselbe wie von Aloe-vera-Saft mit einer äquivalenten Menge von Acemannan.
- 2. Acemannan wurde bei dem Modell des Schutzes vor Geschwüren auf unterschiedlichen Wegen der Applikation, nämlich intravenös, intraperitoneal und oral effektiv.
- 3. Acemannan war für 100% der Effekte bei beiden pharmakologischen Modellen verantwordlich.
- 4. Die chemische Substanz, Glucomannan, eine Substanz ähnlich zu Acemannan aus einer vollständig unterschiedlichen Quell, der Konjac-Pflanze, zeigte ein gewisses pharmakologisches Ansprechen.
- In Laborstudien hat zich gezeigt daß Carridyn die Replikation von Fibroblasten in Gewebekultur, welche bekannterweise für das Heilen von Verbrennungen, Magengeschwüren und anderen Wunden der Haut und der gastrointestinalen Bahnen verantwordlich sind, um bis zu 300% in 48 h erhöht.
- Ebenfalls wurde gezeigt, daß Carridyn die DNA-Synthese in dem Nukleus von Fibroblasten erhöht. Die Zunahme der DNA-Synthese steigert ihrerseits die Rate der metabolischen Aktivität und der Zellreplikation, welches fundamentale Stufen beim Ausheilprozeß sind.
- Es wurde gezeigt, daß Carrisyn in kontrollierten Studien die Rate der Heilung bei Tieren erhöht.
- Ebenfalls wurde gezeigt, daß Carrisyn eine effektive Behandlung für Magengeschwüre bei Tierstudien is. Wahrend einer Periode von drei Jahren bei Laborratten wurden deren Mägen, welche vergleichbar zu denjenigen von Menschen reagieren, untersucht. Es wurde gefunden, daß Carrisyn äquivalent oder überlegen gegenüber derzeitigen Medikationen ist, welche zur Behandlung von Magengeschwüren angewandt werden. Die meisten dieser Produkte wirken unter Hemmung von Salzsäure im Magen. Carrisyn wirkt auf einem hiervor verschiedenen Prinzip und verändert den natürlichen Fluß der Verdauungssäuren nicht.
- Wie zuvor angegeben, kann Carrisyn aus dem verflüssigsten Gel von Aloe vera durch Zugabe eines wasserlöslichen niederen aliphatischen polaren Lösungsmittels, vorzugsweise von Ethylalkohol, ausgefällt werden. Pulver von Carrisyn kann durch Lyophilisieren hergestellt werden, und wahlweise kann das Lyophilisierungsprodukt zu einem Pulver mit einer Mahlapparat wie einer Moulinex -Kaffeemühle (erhältlich von Dillard, Dallas, Texas) gemahlen werden. Pulver von Carrisyn ist hochelectrostatisch und ist ein schmutzigweißes bis rosa-purpurfarbenes amorphes Pulver in Abhängigkeit von dem Oxidationzustand und irgendwelche veruntreinigendem Anthrachinon. Carrisyn wird durch Gefriertrocknen oder durch Lyophilisieren, welches das die Hydrolyse bewirkende Wasser entfernt, stabilisiert. Gefriergetrocknes Gel von Aloe vera mit einer vorgegebenen Menge an Carrisyn hat seine Wirksamkeit für zwei Jahre beibehalten. Es wird angenommen daß Carrisyn in gefriertrokneter Form bis zu 10 Jahre stabil sein wird.
- Es wurde gefunden, daß Wärme und Zeit wichtige Faktoren bei der Herstellung von gepulvertem Carrisyn sind. Wärme kann die Hydrolyse oder den Abbau von Carrisyn unterstützen, und je länger es dauert, das Carrisyn bei einer vorgegebenen Temperatur herauszuhohlen, umso stärker ist der Abbau. Daher wird es bevorzugt, daß das Verfahren, welches die raschestmögliche Extraktion von Carrisyn aus ganzen Blättern von Aloe vera ermöglicht, angewandt wird, wenn ein Carrisyn -Pulver mit hohem Molekulargewicht gewünscht wird, und es wird bevorzugt, daß das Verfahren, welches die langsamste Extraktion von Carrisyn aus ganzes Blättern von Aloe vera ermöglicht, angewandt wird, wenn ein Carrisyn - Pulver mit niedrigem Molekulargewicht gewünscht wird.
- Die Rehydratisierung von Carrisyn -Pulver bei einer Gewichts/Volumen-Konzentration von 0,2 bis 1% ergab die Bildung eines viskosen "Gels" wie bei frischer Aloe vera. Die gelähnliche Konstistenz, welche bei der Rehydratisierung von Carrisyn -Pulver widerkehrt, ist ein Anzeichen der Natur von Carrisyn als Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht. Wenn Polysaccharide abgebaut oder hydrolysiert werden wird ihre Viskosität im allgemeinen erniedrigt. Daher ergibt die Viskosität von dehydratisiertem Carrisyn -Pulver ein gutes Anzeichen der Qualität und kann als Parameter für die Qualitätsicherung benutzt werden.
- Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestelltes Carrisyn kann als im wesentlichen nichtabbaubares, lyophilisiertes, geordnetes, lineares Polymers aus im wesentlichen acetylierten Mannosemonomeren, die vorzugsweise durch β(1-4)-Bindungen aneinander gebunden sind, charakterisiert werden.
- Verschiedene Modifikationen der beschriebenen Zusammensetzungen der Erfindung wie auch alternative Modifikationen, Variationen und Äquivalente sind für den Fachmann auf dem Gebiet beim Lesen der vorangegangenen allgemeinen Beschreibung offensichtlich. Die folgenden Beispiele (Beispiele 5-8) wurden durchgeführt, um Carrisyn weiter zu charakterisieren und zu identifizieren. Die folgenden Beispiele sind lediglich erläuternd und nicht dazu bestimmt, den Umfang der folgenden Ansprüche zu beschränken, welche beliebige dieser Modifikationen, Äquivalente oder Variationen umfassen.
- Ein Aloeblatt wurde gewaschen, offen geschnitten und filettiert. Das saubere innere Gel wurde zurückbehalten, während die grüne Rinde und Latexmaterialien verworfen wurden. Das filettierte Material wurde homogenisiert und umfassend mit einem Finisher Modell 75 (FMC, Chicago, IL) filtriert, um das meiste der Pulpe zu entfernen. Das klare, viskose Gel wurde auf einen pH von annähernd 3,20 mit verdünnter HCl zur Solubilisierung der Oxalate und Lactate von Calcium und Magnesium, welche üblicherweise vorliegen, in ihre entsprechenden wasserlöslichen Salze angesäuert. Das mit Säure behandelte Gel wurde dann für 4-5 h mit vier Volumina von 95%igem Ethanol bei Umgebungstemperatur extrahiert. Aufschwimmende Fasern wurden entfernt, dann wurde die Alkohol/Wassermischung über einen Siphon abgeführt, während der feste Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt wurde. Das meiste der in Alkohol/Wasser löslichen Substanzen wie organische Säuren, Oligosaccharide, Monozucker, Anthrachinone und anorganischen Salze wurden bei dem Verfahren entfernt. Der Feststoff wurde dann mit frischem Alkohol gewaschen, zentrifugiert, gefriergetrocknet und zu einem weißen amorphen Pulver vermahlen.
- In dieser Stufe ist Carrisyn im allgemeinen mit Proteinen, Monozuckern, Oligosacchariden und anorganischen Salzen verunreinigt. Diese Verunreinigungen beeinträchtigen die Bioaktivität des Produktes nicht, daher ist eine weitere Reinigung für hergestelltes Massenmaterial nicht erforderlich.
- Jedoch wurden als weitere Stufe bei der Charakterisierung von Carrisyn weitere Reinigungsstufen eingefügt. Die zuvorgenannten Verunreinigungen wurden durch erneutes Auflösen des Massenpulvers in Phosphatpuffer und Behandlung mit einer nicht-spezifischen Protease (Sigma Lot Nr.5147) gefolgt von extensiver Dialyse entfernt. Das nicht-filtrierbare Produkt, welches hauptsächlich acetylierte Polymannose ist, wurde gefriergetrocknet und unter Anwendung einer Anzahl von analytischen Methoden charakterisiert, welche IR-Spektroskopie, thermogravimetrische Analyse (TGA), HPLC, GLC und GC/MS einschließen, wie in Fig. 11 gezeigt.
- Für die Standardisierung von Produkten von Aloe vera werden HPLC und GC empfohlen. Die Gas/Flüssigkeits-chromatographische Methode (GLC) wird angewandt, um Mannose in dem Gelextrakt von Aloe vera abzutrennen und zu quantifizieren. Um das Auftreten von Produkten mit Mannose unter Inerscheinungtreten eines Produktes mit einem höheren Gehalt an Aloegel zu vermeiden, kann eine Dialysestufe angefügt werden (MG-Schnitt 12.000 - 14.000). Zusätzlich kann ein Versetzen mit Johannisbrotgum, Guargum oder Glucomannan durch ein hohes Verhältnis von Galactose oder Glucose zu Mannose nachgewiesen werden.
- Acemannan (AM) ist ein Pflanzenextraktpolysaccharid. Es ist polydispergiert, was bedeutet, daß es aus mehr als einer Molekulargröße besteht.
- Das Ziel der Untersuchung ist die Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung von Acemannan durch Größenausschlußchromatographie.
- 0,05% Natriumazid.
- 0,2% (Gew./Vol.) eines jeden Standards, Pullulan 853K, 100K und 12,1K Daltons in 0,05% Natriumazid (Shodex P-82, Showa Denko, K.K.).
- Hochleistungsflüssigkeitschromatograph, Modell 590 (Waters Associates, Milford, MA)
- Differentialrefraktometer, Modell 1770 (Bio-rad)
- Integrator SP 4290 (Spectra-Physics)
- - Einwiegen von 20 mg Carrisyn in einen Glasbehälter (105-25 mm) mit einer Teflon ausgekleideten Kappe.
- - Zugabe von 10 ml 0,05%igem Natriumazid und Auflösen durch Schütteln (4 h) in einem Junior -Kreiselschüttler (Lab-Line Instruments, Mel Rose Park, IL).
- - Filtrieren durch eine 1,2 um Membrane (Acrodisc Galman Sciences). Auffangen des Filtrates für eine Injektion in den HPLC.
- Säule: Spherogel TSK 5000 PWHR (Beckman Instruments)
- Detektor: Differentialrefraktometer (Bio-rad)
- Mobile Phase: 0,05 % Natriumazid
- Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min bei 40ºC
- Injektionsvolumen: 50 ul
- Acemannan ist ein polydispergiertes Polysaccharid, von dem wenigstens 73% des Polymeren größer als 10.000 Daltons sind, bestimmt durch Größenausschlußchromatographie (SEC) und Pullulanpolysaccharid als Standard. Fig. 12 gibt das SEC-Chromatogramm des Pullulanstandards von bekannten Molekulargewichten wieder; 853K, 100K bzw. 12,1K Daltons. Das entsprechende Chromatogramm von Carrisyn ist in Fig.13 gezeigt. Das Chromatogramm zeigt drei (3) Hauptpeakfraktionen, bezeichnet mit A, B und C. Der Peak A gibt die Acemannanfraktion größer als 100.000 Dalton wieder und der Peak B ist die Fraktion mit größer als 10.000, jedoch kleiner als 100.000 Dalton. Der Peak C gibt die Bestandteile mit niedrigerem Molekulargewicht wieder. Die Summe der Peaks A und B stellt die aktive Fraktion dar.
- Die funktionellen Gruppen des Acemannans, des aktiven Produktes von Carrisyn , absorbieren bei charakteristischen IR-Frequenzen. Die IR-Spektroskopie ist daher eine wichtige Methode zur Charakterisierung dieses Materials.
- Das Ziel der Untersuchung ist die weitere Charakterisierung von Carrisyn nach einer IR-spektroskopischen Methode.
- IR-reines Kaliumbromid (KBr)-pulver (Mallinckrodt Inc., Paris, Kentucky).
- IBM-Fourier Transformations-IR-Spektrometer (Ft-Ir), Modell Nr.32, ausgerüstet mit einem Computer IBM 9000 und einem Drucker/Plotter.
- - Carrisyn wird zu einem feinen Pulver unter Verwendung einer Mühle Wiley Mill (Thomas Scientific Co.) und eines Siebes vorgemahlen, welches Teilchen kleiner als 0,250 mm (60 mesh Größe) ermöglicht.
- - Eine vorgemahlene Probe von 5 mg wird mit 495 mg trockenem KBr zu einer Gesamtmenge von 500 mg Mischung vermischt.
- - Die Mischung wird von Hand unter Verwendung eines Achatmörsers und -pistills zu einem homogenen Material erneut gemahlen.
- - Eine repräsentative Probe (80-100 mg) wird zu einer transparenten Scheibe unter Verwendung einer Hydraulikpresse (Walker ) bei einem Druck von 275,8 MPa gepreßt.
- - Die Scheibe wird von 4000 cm&supmin;¹ bis 400 cm&supmin;¹ abgetastet. Eine Mehrfachabtastung (30 Abtastungen) wird bei einer Auflösung von 4 cm&supmin;¹ zur Verbesserung des Signal/Rauschverhältnisses durchgeführt.
- Die Analyse des in Fig.14 aufgezeichneten Spektrums zeigt die folgenden charakteristischen Absorptionspeakfrequenzen (cm&supmin;¹): Wellenzahl (cm&supmin;¹) Zuordnung C-O-Streckschwingung der Pyranoseringstruktur O-H-Streckschwingung C-O-C-Streckschwingung (Acetylgruppe) C=O-Streckschwingung (Acetyl) C-H-Spreizschwingung C=O-Streckschwingung (Amid I) Interne Rotationsschwingungen etc. N-H-Deformationsschwingung (Amid II) Axiales H am Ring bei C&sub1; Ringdehnung
- Es ist darauf hinzuweisen, daß das Spektrum von Carrisyn eine starke Absorption als Folge der O-H- Streckung bei etwa 3422 cm&supmin;¹ aufweist. Die Carbonyl- und C-O-C-Streckschwingungen der Acetylgruppe liegen nahe bei 1740 bzw. 1250 cm&supmin;¹. Die starke Einzelbande des C-O-C- Systems ist ein Anzeichen der O-Acetylgruppe, welche äquatorial an der Monomereneinheit gebunden ist. Die Amidcarbonyl- Streckschwingung (Amid I) bei etwa 1649 cm&supmin;¹ ist von dem Feuchtigkeitsabsorptionspeak überlagert, und die N-H-Deformation (Amid II) bei etwa 1541 cm&supmin;¹ ist den Verunreinigungen von Protein/Proteoglycan zuzuschreiben.
- Die Absorptionsbanden zwischen 960-730 cm&supmin;¹ können mit bestimmten stereochemischen Merkmalen von Acemannan in Verbindung gesetzt werden. Beispielsweise zeigen das Fehlen einer Bande nahe bei 844 cm&supmin;¹ als Folge der äquatorialen C&sub1;-H und der Anwesenheit der axialen C&sub1;-H nahe bei 897 cm&supmin;¹, daß Acemannan B-gebunden ist. Die Ringschwingung (955 cm&supmin;¹ Schulter) und die Ringdehnung, lokalisiert bei etwa 773 cm&supmin;¹, zeigen ein D-Mannan mit beta-glycosidischer Bindung.
- Die folgende Tabelle 3 zeigt die Peakabsorptionsfrequenzen mit entsprechenden spezifischen Absorptionswerten, angeordnet nach der Intensität: TABELLE 3 SPEZIFISCHE ABSORPTION DER PEAKFREQUENZEN FÜR NICHT MIT PROTEASE BEHANDELTEM CARRISYN Peak Peakbeginn Peakende Spezifische Absorption
- Das IR-Spektrum von Massen-Carrisyn zeigte Spuren von Verunreinigungen von Protein oder Proteoglycan, wie durch Anwesenheit der Spitzen des Amids I und des Amids II gezeigt wird. Weitere Reinigung des Massenmaterials mit nicht-spezifischer Protease, welche das Protein und Proteoglycan hydrolysieren, gefolgt von umfassender Dialyse, beseitigte diese Verunreinigungen.
- Das Spektrum der mit Protease behandelten Probe ist in Fig.15 gezeigt. Die Analyse des Spektrums zeigt einige Unterschiede im Vergleich zu dem nicht mit Protease behandelten Carrisyn von Fig.14. Beispielsweise fehlen die Peaks von Amid I und II, welche bei etwa 1649 und 1541 cm&supmin;¹ in Fig.14 lokalisiert sind, bei der mit Protease behandelten Probe. Zusätzlich ist der Feuchtigkeitsabsorptionspeak, lokalisiert bei etwa 1639,7, deutlich aufgelöst. Die Tabelle 4 zeigt die Peakabsorptionsfrequenzen mit den entsprechenden spezifischen Absorptionswerten, angeordnet entsprechend den Intensitäten, für mit Protease behandeltem Carrisyn wie folgt: TABELLE 4 SPEZIFISCHE ABSORPTION DER PEAKFREQUENZEN FÜR MIT PROTEASE BEHANDELTEM CARRISYN Peak Nr. Peakbeginn Peakende Spezifische Absorption
- Die Werte der spezifischen Absorption sind nicht in Intensitäten mit denjenigen des nicht mit Protease behandelten Carrisyn von Fig.14 vergleichbar, da dies qualitativ ist und kein Versuch unternommen wurde, dieselbe Konzentration bei der Herstellung der Probenscheiben anzuwenden.
- Auf Basis der IR-Spektroskopie alleine ist Carrisyn ein Polysaccharid von im wesentlichen B-gebundener D-Mannose mit O-Acetylgruppenseitenketten. Die Anwesenheit von N-Acetylgruppen kann den Verunreinigungen von Protein/Proteoglycan zugeschrieben werden.
- Die thermogravimetrische Analyse (TGA) ist eine wichtige analytische Methode zur Untersuchung von Polymeren. Der Massenverlust bei der Zersetzung eines Polymeren als ein Ergebnis der Temperaturänderung ist für dieses Polymere charakteristisch. Darüber hinaus hilft TGA bei der Bestimmung von Feuchtigkeit (H&sub2;O) und Aschegehalt von gepulverten Substanzen.
- Ein Ziel dieser Untersuchung ist die Anwendung von TGA zur weiteren Charakterisierung von Carrisyn .
- Keine.
- 1. Thermoanalyseeinrichtung Mettler Thermoanalyser , System TA 3500 mit einer TC 10A Auswerteinrichtung und Steuercomputer wie auch einem Ofen TG 50 mit Mikrowaage M3-03.
- 2. Drucker/Plotter Modell MP3 (Print Swiss Matrix)
- 3. Personalcomputer zur Datenaufzeichnung IBM PC .
- - Eine 10 mg Probe in einem 70 ml Aluminiumoxidtiegel wird in einer Mikrowaage mit einer Genauigkeit von ±1 ug ausgewogen.
- - Der Tiegel mit Inhalt wird in dem Ofen TG 50 mit einer Temperaturprogrammgeschwindigkeit von 20ºC/min aufgeheizt. Diese Aufheizgeschwindigkeit entspricht dem Standard und ist für das zu analysierende Material angemessen.
- - Das Aufheizen wird in einer Stickstoffgasatmosphäre von 25ºC bis 600ºC und dann von 601ºC bis 780ºC in einer Luftatmosphäre (Oxidationsmittel) durchgeführt.
- - Die Temperatur wird auf dieser Endtemperatur für weitere (2) zwei Minuten gehalten. (Die Maximaltemperatur von 780ºC wird gewählt, da sowohl organische als auch anorganische Substanzen sich zersetzen, bevor diese Temperatur erreicht ist.)
- Das Zersetzungsprofil von Carrisyn ist charakteristisch. Fig.16 zeigt die Realzeitauftragung und den entsprechenden Auftrag der ersten Ableitung des Zersetzungsprofils von Carrisyn , Das Zersetzungsmuster von Acemannan (der aktiven Substanz von Carrisyn) ist von demjenigen der anderen Polysaccharide verschieden. Beispielsweise ist unter identischen Betriebsbedingungen die Temperatur, bei welcher Acemannan größere Zersetzung zeigt, von derjenigen von Cellulose, Dextran oder Amylan verschieden. Der mit Acemannan verbundene Gewichtsverlust liegt zwischen 200ºC bis 630ºC. Die Zersetzung der Masse von Carrisyn tritt zwischen 200ºC bis 540ºC und 600ºC bis 630ºC auf. Die Acemannanfraktion wird durch die Beiträge dieser zwei Temperaturbereiche bestimmt, während Asche und Feuchtigkeit zusammen etwa 10 Gew.-% beitragen. Die folgende Tabelle 5 zeigt eine Wiederholungsanalyse von Carrisyn mit TGA. Tabelle 5 TGA-ANALYSE VON CARRISYN Probe Nr. Gewicht (mg) Asche* % Durchschnitt** Standardabweichung * Die Asche besteht aus den Oxiden von Ca (1,51), Si (0,1), Na (0,55), Mg (0,37), Fe (0,02) und Al (0,00). ** Der Durchschnittswert ergibt nicht 100%, da das Verfahren Peaks mit weniger als 2% des Basispeaks nicht wiedergibt.
- Diese Methode der Analyse ist sowohl qualitativ als auch semi-quantitativ. Beispielsweise kann der Prozentsatz von Acemannan wie folgt bestimmt werden:
- 1. Prozentsatz (%) AM = mg (200-630ºC) x 100/mg Probe
- oder
- 2. Prozentsatz (%) AM = mg (200-630ºC) Probe x 100/mg (200-630ºC) Bezugsstandard
- Die Gehalte von Feuchtigkeit und Asche sind wichtige Parameter bei gepulverten Wirkstoffsubstanzen. Diese Parameter werden einfach unter Verwendung der thermogravimetrischen Methode bestimmt.
- Polysaccharide werden hinsichtlich der sie bildenden Monomere durch Säurehydrolyse oder enzymatische Hydrolyse hydrolysiert. Eine 2M Trifluoressigsäure (TFA) wird zur Hydrolyse gewählt, da sie stark genug ist, um die glycosidischen Bindungen zu hydrolysieren, jedoch im Gegensatz zu Schwefelsäure sanft genug ist, so daß die monomeren Zuckerreste nicht zerstört werden.
- Das Ziel ist die Bestimmung der monomeren Zuckerbestandteile der Acemannanfraktion von Carrisyn ,
- 1. 2M TFA mit einem Gehalt von 0,5 mg/ml Inosit als interner Standard.
- 2. Isopropanol
- 1. Hochleistungsflüssigkeitschromatograph Hewlett Packard HPLC, Modell 1084B, ausgerüstet mit einem Autoprobensammler HP79842A und einem Autoinjektor HP79841A.
- 2. Bio-rad-Differentialrefraktometer Modell 1770.
- - Exaktes Einwiegen von 2,0 mg Carrisyn auf Wägepapier und quantitative Überführung in ein (13x100 mm) Wegwerfkulturglas mit einer mit Teflon ausgekleideten Kappe.
- - Zugabe von 1 Milliliter (ml) von 2M TFA mit einem Gehalt von 0,5 mg/ml Inosit als interner Standard.
- - Anordnen des Gefäßes in einem Heizblock (Hycel Thermal Block ) bei 120ºC für annähernd 1 h.
- - Eindampfen der Hydrolysatmischung zur Trockne unter trockener Luft.
- - Redispersion des Feststoffes in 1 ml Isopropanol und Eindampfen zur Trockne mit trockner Luft.
- - Auflösen des Feststoffes in 1 ml entionisiertem Wasser bei der Präparation für die Injektion in die HPLC-Säule.
- Kolonne: Aminex Carbohydrate HPX-87P (Bio-rad Labs., Richmond, CA)
- Mobile Phase: Entionisiertes Wasser bei 80ºC
- Strömungsgeschwindigkeit: 0, 6 ml/min
- Ofentemperatur: 40ºC
- Aufzeichnungspapiergeschwindigkeit: 0, 2 cm/min
- Detektor: Refraktionsindex (Bio-rad Nr.1770)
- Dämpfung: 2
- Die Fig.17 zeigt das Chromatogramm einer Standardmischung, umfassend Glucose, Galactose, Mannose, jeweils 1 mg/ml und 0,5 mg/ml Inosit als interner Standard. Die Fig.18 zeigt das Chromatogramm von Carrisyn unter identischen bedingungen. Es ist anzumerken, daß Mannose der Hauptbestandteil des Polymeren ist, was bedeutet, daß das Polysaccharid im wesentlichen aus Mannosezuckereinheiten besteht.
- Das Polysaccharid von Carrisyn ist in Natur hauptsächlich neutral. Neutrale Polysaccharide werden besser durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) als ihre Glycitolacetate analysiert.
- Das Ziel dieser Untersuchung ist die weitere Charakterisierung von Carrisyn durch Abtrennung und Quantifizierung der Zuckermonomere in Form ihrer Glycitolacetate. Bei dieser Arbeitsweise werden die Glycitolacetate mit einer Kapillarsäule getrennt und nach einer Flammenionisationsmethode nachgewiesen.
- 1. 2M TFA mit einem Gehalt von 0,2 mg/ml Inosit als interner Standard.
- 2. Isopropanol
- 3. 1M NH&sub4;OH mit einem Gehalt von 10 mg/ml Natriumbordeuterid (NaB²H&sub4;) oder Natriumborhydrid (NaBH&sub4;)
- 4. Eisessig
- 5. Methanol
- 6. Pyridin
- 7. Essigsäureanhydrid
- 8. Toluol und Dichlormethan
- 9. Aceton von gaschromatographischer Reinheit (G.C.-Reinheit)
- 1. Gaschromatograph Vista 6000 (Varian Instrument Group, Palo Alto, CA)
- 2. Integrator SP4290 (Spectra-Physics, San Jose, CA)
- - Es werden exakt 2 mg Probe ausgewogen und in ein Kulturgefäß (13x100 mm) mit einer mit Teflon ausgekleideten Kappe überführt.
- - Es werden 500 ul Trifluoressigsäure TFA-(2M, mit einem Gehalt von 200 mg/ml Inosit) zugesetzt, auf 120ºC erhitzt (Hycel Thermal Block ) für etwa 1 h.
- - TFA wird entfernt (Wasserbad bei 40ºC) unter Luftströmung und der Rückstand mit Isopropanol zur Entfernung rückständiger Säure gewaschen.
- - Auflösen des Rückstandes in 1M NH&sub4;OH (300 ml) mit einem Gehalt von 10 mg/ml Natriumbordeuterid (NaB²H&sub4;), Stehenlassen bei Zimmertemperatur für 1 h.
- - Zerstörung von überschüssigem Reduktionsmittel mit Eisessig (wenige Tropfen bis kein Aufbrausen mehr erfolgt), Entfernung der Lösungsmittel unter Luft und Waschen des Rückstandes mit Methanol mit einem Gehalt von 10% Essigsäure (3x300 ul) und abschließend mit Methanol (3x300 ul).
- - Zu dem trockenen Rückstand werden 200 ul Pyridin und 200 ul Essigsäureanhydrid zugesetzt, für 20 min auf 120ºC erhitzt.
- - Zu der gekühlten Lösung werden 500 ul Toluol zugesetzt, das Lösungsmittel unter Luft entfernt, der Rückstand in Wasser aufgelöst und in Dichlormethan extrahiert.
- - Überführung der organischen Phase in ein sauberes Glas, Entfernung des organischen Lösungsmittels unter Luft und Auflösen des Rückstandes in Aceton (100 ul) vor der GLC.
- Säule: SP 2330, 15 m oder 30 m, 0,25 mm i.d., 0,25 um Dicke der Flüssigkeitsphase (Supelco, Inc.)
- Trägergas: Helium
- Ofentemperatur: 235ºC (Isotherm)
- Injektionstemperatur: 250 ºC
- Injektionsvolumen: 0,5 - 1 ul (gesplittet)
- Fig. 19 zeigt das GLC-Chromatogramm einer Standardmischung von Rhamnose, Fucose, Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose, Glucose und Inosit als ihre Glycitolacetate. Das Chromatogramm von Carrisyn ist in Fig.20 gezeigt. Der Hauptpeak in der Figur entspricht Mannose. Es gibt Spuren von Galactose, Glucose, Arabinose, Xylose und Fucose. Diese rühren von Zellwandverunreinigungen her. Der letzte Peak ist Inositacetat, welches der interne Standard ist.
- Da Mannitacetat der Hauptzuckerpeak bei dem hydrolysierten und acetylierten Material ist, ist Carrisyn im wesentlichen ein Polymannosepolysaccharid.
- Der Mannitacetatpeak kann unter Zuhilfenahme von Inosit als interner Standard quantifiziert werden. Fig. 21 gibt eine Eichkurve wieder, erzeugt durch Auftrag der Flächenverhältnisse Mannose/Inosit gegen die bekannten Gewichte von Acemannan. Mit der Eichkurve kann die Menge von Acemannan in einer vorgegebenen Probe von Carrisyn berechnet werden.
- Polysaccharide werden durch Bestimmung der Art und Weise, in welcher die Zuckereinheiten miteinander verbunden sind, charakterisiert. Die chemischen, physikalischen und biologischen Aktivitäten von Polysacchariden hängen davon ab, wo die Zucker in den fünf möglichen Stellungen für die Hexosen aneinander gebunden sind.
- Es ist Zweck dieser Untersuchung, die Art und Weise zu bestimmen, in welcher die Zuckereinheiten von Carrisyn - polysaccharid miteinander verbunden sind.
- 1. Trockenes Dimethylsulfoxid (DM50)
- 2. Natriumdimethylsulfinylanion (2M)
- 3. Methyljodid
- 4. 2M TFA
- 5. Isopropanol
- 6. NH&sub4;OH mit 50% Methanol, 10 mg/ml (NaB²H&sub4;)
- 7. Eisessig
- 8. 10%ige Essigsäure in Methanol
- 9. Essigsäureanhydrid
- 10. Natriumbicarbonat
- 11. Dichlormethan
- 12. Aceton, gaschromatographische Reinheit.
- Gaschromatograph/Massenspektrometer MSD (NP 5970).
- Die Gesamtcharakterisierung von Carrisyn schließt die Bindungsanalyse des Polymeren ein. Carrisyn wird nach der von Darvil et al., (Plant Physiology, 62: 418-422 (1978)) beschriebenen Methode permethyliert, zu den Monomeren hydrolysiert und zu methylierten Alditacetaten umgewandelt. Die flüchtigen Derivate werden auf einem GC/MS- System (Hewlett Packard auf einer Kapillarsäule, Supelco SP 2330 (30 m x 0,25 mm Innendurchmesser) analysiert. Die Fragmentierung des methylierten Glycitacetat der Monomeren wird mittels Elektronenstoßmethode (EI-Methode) erreicht. Das Gesamtionenchromatogramm (TIC) des derivatisierten Carrisyn als partiell methyliertes und partiell acetyliertes Glycit ist in Fig.22 gezeigt. Das Massenspektrum des partiell acetylierten Mannits ist in Fig.23 gezeigt.
- Die vollständige Arbeitsweise ist wie folgt:
- (1) Die Probe (1 mg) wird in einem Glas angeordnet, das mit einer mit Teflon ausgekleideten Kappe versehen und in einem Vakuumofen bei 50ºC getrocknet ist.
- (2) Zu der Probe wird trockenes DMSO (250 ul) zugesetzt und die Probe gerührt (Teflon-Rührstab) bis zur Auflösung (Schallbehandlung kann hilfreich sein). Das Glas wird mit Argon (oder Stickstoff) gespült.
- (3) Zu dem Polysaccharid (in DMSO) werden 250 ul Natriumdimethylsulfinylanion (2M) zugesetzt, und für eine Minimaldauer von 4 h gerührt (die Reaktion sollte unter Argon durchgeführt werden). Es kann geeigneter sein, die Probe über Nacht in der Anionenlösung zu belassen.
- (4) Die Anionenlösung wird in Eis gekühlt, Methyljodid 200 ul werden langsam zugegeben, und die Lösung wird für etwa 1 h gerührt.
- (5) Zu der Lösung werden etwa 2,5 ml Wasser zugesetzt und überschüssiges Methyljodid mit Argon entfernt.
- (6) Die Mischung wird in einen Dialyseschlauch, 13,3 x 2,1 cm Durchmesser (M.G. Schnitt 12 000 - 14 000, Spectrum Medical, Inc., Los Angeles, CA) überführt.
- (7) Die nicht-dialysierbare Fraktion wird unter einer Luftströmung (50ºC) konzentriert.
- (8) Zu dem trockenen Rückstand werden 250 ul 2M TFA zugegeben und für 1 h auf 120ºC erhitzt.
- (9) TFA wird unter Luft entfernt, der Rückstand mit Isopropanol (2 x 250 ul) gewaschen.
- (10) Der Rückstand wird in wäßrigem NH&sub4;OH 50% Methanol (250 ul) mit einem Gehalt von 10 mg/ml NaB²H&sub4; aufgelöst, und es wird 1 h bei Zimmertemperatur belassen.
- (11) Überschüssiges Reduktionsmittel wird mit Eisessig (wenige Tropfen) zerstört, es wird zur Trockne konzentriert und der Rückstand mit 10% Essigsäure in Methanol (3 x 250 ul) gewaschen.
- (12) Zu dem trockenen Rückstand wird Essigsäureanhydrid (100 ul) zugesetzt und die Probe auf 120ºC für 3 h erhitzt. Zu der abgekühlten Probe wird Wasser (etwa 1,5 ml) zugesetzt und dann Natriumbicarbonat bis das Aufschäumen aufhört. Das Derivat wird in Dichlormethan extrahiert.
- (13) Die organische Phase wird zur Trockene konzentriert, der Rückstand wird in 100 ul Aceton vor der GLC und GLC/MS aufgelöst.
- Säule: SP 2330 Säule mit geschmolzenem Siliciumdioxid (30 m x 0,25 mm).
- Temp.: 3 min bei 170ºC gefolgt von 4ºC/min bis auf 240ºC, Haltezeit für 10 min.
- Detektor: FID
- Säule: SP 2330 (30 m x 0,25 mm)
- Temp.: 2 min bei 80ºC, Erhöhung auf 170ºC mit 30ºC/min, dann 40º/min auf 240ºC, Haltezeit für 10 min.
- MS: Hewlett Packard MSD .
- Bei dieser Arbeitsweise werden alle freien Hydroxylgruppen des Polysaccharids zu Methylethern umgewandelt (Stufe 4). Das methylierte Polysaccharid wird zu den es bildenden Monosacchariden hydrolysiert (Stufe 8), in die methylierten Aldite umgewandelt (Stufe 9) und acetyliert (Stufe 10). Diese flüchtigen Derivate werden durch GLC/MS (Stufe 13) analysiert, und aus den Fragmentierungsmustern werden die Stellungen der O-Methyl- und O-Acetylgruppen auf den Alditen bestimmt.
- Es wird ein Glycosylrest (Mannosylrest), welcher über die Stellungen 1 und 4 gebunden ist, betrachtet (d.h. ein (1-4)-gebundenes Mannan). Die Hydroxylgruppen in den Stellungen 2, 3 und 6 sind frei und können in Methylether umgewandelt werden. Bei Hydrolyse und Reduktion liegen die Hydroxylgruppen in den Stellungen 1, 4 und 5 frei und können acetyliert werden, um das Derivat 1,4,5-Tri-O-acetyl-2,3,6- tri-O-methylhexit zu ergeben (Fig. 24). Bei der Untersuchung mittels massenspektrometrischer Technik werden die dominanten primären Fragmentionen durch Spaltung zwischen benachbarten O-Methylgruppen oder zwischen O-Methyl- und O-Acetylgruppen gebildet. Die sekundären Fragmentionen werden durch Verlust von Essigsäure, Methanol, etc. gebildet (Fig. 25). Die Fig. 22 und 23 zeigen das Gesamtionenchromatogramm von Carrisyn bzw. das Massenspektrum von 4-gebundenem Mannan als der partiell acetylierte Mannit.
- Basierend auf dem Gesamtionenchromatogramm (TIC) des Carrisyns und der Bindungsanalyse wird abgeleitet, daß Carrisyn hauptsächlich ein (1-4)-gebundenes, lineares Polymeres von Mannose ist.
- Eine 32 Jahre alte Patientin wurde mit einer Krankheitsgeschichte von Dickdarmgeschwür für "viele Jahre" präsentiert. Während eines aktiven Zustandes war sie auf tägliche Dosis von 40 mg Prednison, 3 g Asulfidin und 50 mg 6-Mercaptopurin und Flagyl nicht ansprechend. Das Vorliegen eines schmerzenden Bauchs und 4-8 blutige Darmbewegungen pro Tag hielten an. Sie wurde auf Hyperalimentation gesetzt. Endoskopische Untersuchungen zeigten mehrere auf steigende Dickdarmgeschwürbildungen mit milder Hepatitis zu Transversum- Geschwürbildung. Der Patient wurde auf 50 mg Carrisyn q.i.d. (viermal am Tag) zusätzlich zu ihren eigenen Medikationen gesetzt und nach Hause geschickt. Nach einer Woche waren ihre Symptome tatsächlich vergangen. Der Bauch war schwächer empfindlich und die Endoskopie zeigte eine abgeheilte und schwach blutunterlaufene Mucosa. Bei der Patientin wurden die anderen Medikationen langsam abgesetzt, und die Verbesserung des klinischen Bildes hielt an. Die Patientin ist laufend auf Carrisyn als einzige Medikation zu dieser Zeit gesetzt. Physikalische Untersuchung und Symptome werden als vollständig normal bezeichnet.
- Fünf zusätzliche Fälle mit ähnlichen Ansprechverhalten auf Dickdarmgeschüre und Crohn'sche Krankheit waren sichtbar. Eine Patientin setzte Carrisyn -Kapseln ab. Innerhalb vier Wochen begannen schwache Symptome wieder aufzutreten (es gab erhöhten Stuhl mit schwachen Bauchbeschwerden), und sie kehrte zu der erneuten Medikation zurück. Nach drei Tagen hatte sie wieder eine vollständig normale Darmsymptomatik.
- Eine Anzahl von AIDS-Patienten erhielten für längere Zeit hohe Dosen von Carrisyn ohne Toxizität oder Nebeneffekte. Ein Anstieg der T-4- und T-8-Lymphocytenverhältnisse und eine Zunahme der absoluten T-4-Zählungen wurde bei diesen AIDS-Patienten mit einer Reduktion und Ausschaltung von klinischen Symptomen wie auch einer Reduzierung von opportunistischen Infektionen gefunden. Es wird angenommen, daß Carrisyn einen antiviralen oder immunmodulierenden Effekt bei den Patienten hatte.
- Eine Stimulierung für die Lymphocyten dieser Patienten wurde beobachtet, was nahelegt, daß Carrisyn bei der Immunmodulierung eine Rolle spielen kann.
- Hilltop-Blätter (7,2 kg) wurden gewaschen, filtriert und in einem Waring -Mischer zerkleinert, dann durch acht Schichten von Baumwollgewebe filtriert. Das Gel wurde dann in vier 10,4 l (11 quart) Pfannen aus rostfreiem Stahl überführt und es wurde kalter Ethylalkohol von USP-Qualität in jeden in Verhältnissen von zwei, drei, vier und fünf zu eins in Volumen zugesetzt. Die Mengen können wie folgt zusammengefaßt werden: Verhältnis (Ethanol: Aloegel) Gelmenge Ethylalkoholmenge
- Die Niederschläge wurden für 4 h sich absetzen gelassen, dann wurden die verbliebenen Alkohol-Gellösungen sorgfältig dekantiert und in getrennten Behältern aufbewahrt. Die Niederschläge wurden 10 min bei 2800 Upm unter Verwendung einer Zentrifuge IEC Centra-7 zentrifugiert, mit Alkohol gewaschen, dann erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Die Pellets wurden in 600 ml Becher überführt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht lyophilisiert.
- Ein zusätzliches Volumen Alkohol wurde zu der überstehenden Flüssigkeit aus dem 2:1-Verhältnis zugesetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur sich absetzen gelassen. Die verbliebenen überstehenden Flüssigkeiten wurden ebenfalls bei Zimmertemperatur belassen und über Nacht sich absetzen gelassen.
- Am nächsten Tag wurden die Niederschläge von den überstehenden Flüssigkeiten wie zuvor beschrieben gesammelt, mit der Ausnahme des Pellets aus dem 2:1-Verhältnis, welches mit einem zusätzlichen Volumen an Alkohol ausgefällt worden war. In diesem Fall wurden annähernd 5-10 ml Wasser zugesetzt, als das Pellet in den Lyophilisierungsbehälter überführt wurde.
- Die Ergebnisse der anfänglichen Alkoholniederschläge von 4 h können wie folgt zusammengefaßt werden: Verhältnis (Ethanol:Aloegel) Ausbeute (g) % Ausbeute (g. Carrisyn /g Gel)
- Nach Zugabe des weiteren Volumens von Ethylalkohol ergab die überstehende 2:1 Flüssigkeit weitere 178 mg Carrisyn . Nur durch Absetzen über Nacht ergaben die überstehenden Flüssigkeiten der Verhältnisse 3:1 und 4:1 weitere 89 bzw. 105 mg. Das 5:1-Verhältnis ergab nur vernachlässigbaren Niederschlag nach der Anfangsisolierung und wurde daher nicht aufgearbeitet.
- Im Fall der zweiten Ausfällung aus dem 2:1-Verhältnis (3:1), wurden 5-10 ml Wasser zum Ausspülen des Zentrifugenbehälters vor der Lyophilisierung benutzt. Dies ergab ein weißes, flockiges Carrisyn mit niedriger Dichte, daß sich stark von den dichteren, graugefärbten Carrisyn -Proben, welche die anderen Proben ergaben, unterschied.
- Carrisyn ist ein gereinigtes weißes amorphes Pulver, extrahiert aus dem Schleim von Aloe vera. Das Polymere besteht im wesentlichen aus linearem β(1-4)-D-Mannosyleinheiten. Es ist ein langkettiges Polymeres, das statistisch mit Acetylgruppen durchsetzt ist, welche an das Polymere über ein Sauerstoffatom gebunden sind. Das Ausmaß der Acetylierung beträgt annähernd 0,8 Acetylgruppen/Monomerem, bestimmt nach der alkalischen Hydroxamatmethode (Hestrin, S.: J. Biol. Chem., 180: 240 (1949)). Analyse auf neutrale Zuckerbindungen zeigt, daß an die Kette, wahrscheinlich über eine (2-6)-Bindung, ein D-Galactopyranoserest in einem Verhältnis von etwa 1 auf jeweils 70 Zucker gebunden ist. Das Verhältnis von Mannose zu Galactose von 20:1 zeigt, daß Galactoseeinheiten ebenfalls aneinandergebunden sind, hauptsächlich über β(1-4)-glycosidische Bindungen.
- Die chemische Struktur, entwickelt unter Anwendung moderner Techniken der Polysaccharidcharakterisierung ist wie folgt:
- Carrisyn ist polydispers, wobei wenigstens 70% des Materials ein Molekulargewicht größer als 10.000 Daltons besitzen.
- Carrisyn ist ein weißes bis schmutzigweißes amorphes Pulver, welches sich langsam in Wasser zu einer hochviskosen kolloidalen Lösung (0,4 % Gew./Vol.) auflöst. Unter kräftigem Schütteln für mehrere Stunden kann ein 1% (Gew./Vol.) dickes Gel erhalten werden. Carrisyn ist praktisch in üblichen organischen Lösungsmitteln einschließlich Propylenglykol unlöslich. Jedoch löst sich Carrisyn in 20% Wasser und 80% Propylenglykol zu einem glatten dicken Gel auf, das unbegrenzt stabil bleibt.
- Eine 0,2% (Gew./Vol.) Lösung von Carrisyn in Wasser hat einen pH von annähernd 6,31 ± 0,33.
- Die spezifische Drehung einer 0,2%igen (Gew./Vol.) wäßrigen Lösung von Carrisyn , geklärt durch Passieren über ein 0,45 um Membranfilter (Uniflo , Schleicher & Schuell Inc., Keene, NH), beträgt:
- [α]²&sup0;&sub5;&sub8;&sub9; = -20, was eine β-Bindung bedeutet.
- Entionisiertes Wasser wurde als Blindprobe verwendet.
- Alkalibehandlung von Carrisyn bewirkt Deacetylierung, welche seine Fähigkeit zur Bildung einer schleimartigen Gallerte zerstört, dies zeigt an, daß die O-Acetylierung von Carrisyn dessen Viskosität beeinflußt. Das Produkt der Deacetylierung löst sich offensichtlich nicht in Wasser auf als Folge der erhöhten starken Wasserstoffbindung.
- Die funktionellen Gruppen in Carrisyn werden durch IR-Spektroskopie (Fig. 14 + 15) identifiziert. Die starken IR-Absorptionsbanden nahe 1740 cm&supmin;¹ und 1250 cm&supmin;¹ bedeuten Acetylierung. Andere Absorptionen, lokalisiert bei etwa 3422 cm&supmin;¹, 1066 cm&supmin;¹, 1639 cm&supmin;¹, 897 cm&supmin;¹, 806 cm&supmin;¹ und 773 cm&supmin;¹, sind charakteristisch für Polysaccharide mit β-Mannosylbindungen. Schwache Amid I und Amid II Absorptionen sind bei etwa 1649 cm&supmin;¹ bzw. 1541 cm&supmin;¹ lokalisiert (Fig. 14), diese sind Proteinverunreinigungen zuzuschreiben, da diese Peaks fehlen (Fig. 15), wenn Carrisyn mit Protease behandelt und dialysiert wurde.
- Carrisyn ist polydispers mit wenigstens 73% des Materials größer als 10.000 Daltons, bestimmt durch Größenausschlußchromatographie. Ein Beispiel eines Hochdruckflüssigkeitschromatogramms (Fig. 13) zeigt drei Fraktionen, bezeichnet mit A, B und C. Der Peak A gibt Carrisyn mit größer als 100.000 Daltons wieder, und Peak B gibt Carrisyn mit größer als 10.000 Daltons, jedoch weniger als 100.000 Daltons wieder. Der Peak C stellt die Molekulargewichtsbestandteile von Carrisyn dar. Die Flächen der Peaks B und C nehmen zu, wenn sich Carrisyn zersetzt, was wiederum eine Abnahme der Fläche von Peak A bewirkt.
Claims (13)
1. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze, umfassend
die Stufen von:
A) Gewinnung eines Aloesaftes, der solubilisiertes Material
enthält;
B) Einstellen des pH dieses Aloesaftes auf von 3 bis 3,5;
C) Zugabe eines wasserlöslichen, niederaliphatischen, polaren
Lösungsmittels wie Methanol, Ethanol oder Propanol zu dem
Aloesaft zum Ausfällen der aktiven chemischen Substanz und
hierdurch Bildung einer heterogenen Lösung;
D) Entfernen des wasserlöslichen, niederaliphatischen,
polaren Lösungsmittels und des solubilisierten Materials aus
der heterogenen Lösung zur Isolierung der ausgefällten
aktiven chemischen Substanz; und
E) Trocknen der ausgefällten aktiven chemischen Substanz.
2. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin dieser Aloesaft erhalten wird durch:
a) Waschen eines Aloeblattes in einer bakteriziden Lösung
zur Entfernung im wesentlichen von allem
Oberflächenschmutz und Bakterien;
b) Entfernen wenigstens eines ersten Endabschnittes von
diesem gewaschenen Blatt;
c) Ablaufenlassen, Konservieren und Sammeln von an
Anthrachinon reichem Saft von diesem geschnittenen und
gewaschenen Blatt;
d) Entfernen von Rinde von diesem Blatt zur Herstellung
eines im wesentlichen von Anthrachinon freien Gel-
Filetstückes; und
e) Mahlen und Homogenisieren dieses im wesentlichen von
Anthrachinon freien Aloegel-Filetstückes zur Herstellung
von im wesentlichen von Anthrachinon freiem Aloesaft, der
solubilisiertes Material enthält.
3. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin dieser Aloesaft erhalten wird durch:
a) Waschen eines Aloeblattes in einer bakteriziden Lösung
zur Entfernung im wesentlichen von allem
Oberflächenschmutz und Bakterien;
b) Zerstossen des gewaschenen Aloeblattes; und
c) chemisches Dialysieren des zerstossenen Blattes zur
Entfernung und Abtrennung eines im wesentlichen von
Anthrachinon freien Gels aus verbliebenen Fraktionen des
zerstossenen Blattes.
4. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin dieser Aloesaft erhalten wird durch:
a) Waschen eines Aloeblattes in einer bakteriziden Lösung
zur Entfernung im wesentlichen von allem
Oberflächenschmutz und Bakterien;
b) Zerstossen des gewaschenen Aloeblattes; und
c) Mahlen und Homogenisieren dieses zerstossenen Aloeblattes
zur Herstellung eines Aloesaftes, der solubilisiertes
Material enthält.
5. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin dieser Aloesaft erhalten wird durch:
a) Waschen eines Aloeblattes in einer bakteriziden Lösung
zur Entfernung im wesentlichen von Oberflächenschmutz und
Bakterien;
b) Mahlen dieses gewaschenen Aloeblattes;
c) Filtrieren dieses gemahlenen Aloeblattes zur Entfernung
von Fasermaterial; und
d) Homogenisieren dieses gemahlenen Aloeblattes zur
Herstellung eines an Anthrachinon reichen Aloesaftes, der
solubilisiertes Material enthält.
6. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin dieser Aloesaft erhalten wird durch:
a) Zerstossen eines Blattes einer Aloepflanze zum
Extrudieren von Aloesaft, der solubilisiertes Material
enthält.
7. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin dieser Aloesaft erhalten wird durch:
a) Waschen eines Aloeblattes in einer bakteriziden Lösung
zur Entfernung im wesentlichen von allem
Oberflächenschmutz und Bakterien;
b) Entfernen von Rinde von diesem Blatt zur Herstellung
eines Aloegel-Filetstückes; und
c) Mahlen und Homogenisieren dieses Aloegel-Filetstückes zur
Herstellung von Aloesaft, der solubilisiertes Material
enthält.
8. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin dieser Niederschlag bestrahlt wird,
wodurch die aktive chemische Substanz sterilisiert und
konserviert wird.
9. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin vier Volumina dieses wasserlöslichen,
niederaliphatischen, polaren Lösungsmittels zu einem Volumen
Aloesaft zugesetzt werden, um diese aktive chemische
Substanz auszufällen.
10. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin dieses wasserlösliche, niederaliphatische,
polare Lösungsmittel Ethanol ist.
11. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin diese aktive chemische Substanz aus diesem
wasserlöslichen, niederaliphatischen, polaren Lösungsmittel
uns Aloesaft für annähernd vier Stunden ausgefällt wird,
bevor dieses wasserlösliche, niederaliphatische, polare
Lösungsmittel entfernt wird.
12. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, worin diese ausgefällte, aktive chemische
Substanz durch Lyophilisation getrocknet wird.
13. Verfahren zum Extrahieren der aktiven chemischen Substanz
in der Aloepflanze aus einem Blatt der Aloepflanze nach
Anspruch 1, weiter umfassend die Stufen von:
f) Wiederauflösen der ausgefällten, aktiven chemischen
Substanz in Phosphatpuffer;
g) Behandeln der wiederaufgelösten, ausgefällten, aktiven
chemischen Substanz mit einer nicht-spezifischen Protease
gefolgt von extensiver Dialyse; und
h) Lyophilisieren des nicht-filtierbaren Produktes.
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