CN110818811B - 一种从水仙鳞茎中提取分离高粘度水仙多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然植物活性成分提取分离技术领域,具体涉及一种从水仙鳞茎中提取分离高粘度水仙多糖的方法;水仙花鳞茎在受到昆虫啃食等物理损伤时会分泌一种粘质液,该粘质液的主要成分为大分子多糖‑水仙多糖;本发明提供了一种提取分离水仙多糖的方法,该方法所得的水仙多糖粘度高,无淀粉、生物碱残留。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学技术领域,涉及天然植物活性成分提取分离技术,具体涉及一种从水仙鳞茎中提取分离高粘度水仙多糖的方法。
背景技术
多花水仙(Narcissus tazetta L.)为石蒜科水仙属多年生宿根草本植物,花清香文雅,具有很高的观赏价值,是中国十大传统名花之一。多花仙花在我国福建、江浙等地均有种植,其中以漳州的多花水仙最为出名,种植面积也最大。据文献报道[1],水仙鳞茎中含有多种生物活性化学物质,如多花水仙碱、伪石蒜碱等生物碱类化合物,葡萄糖、甘露糖、淀粉、黏性多糖、纤维素等糖类物质,水仙苷、芦丁等黄酮类化合物。其中,生物碱类物质由于具有抗癌活性而受到普遍关注,而对于黏性多糖的研究较少。实验发现,该黏性多糖具有很好拉丝、特异的剪切变稀、良好的增稠等性质,在化妆品等领域具有潜在的应用价值。
专利2010105077001[1]提供了一种从中国水仙球茎中提取分离水仙多糖的方法,该方法采用热水浸提法提取水仙球茎多糖,会造成水仙球茎中的淀粉随着多糖同时被萃取,并发生糊化,从而造成所制备的水仙多糖中含有大量糊化淀粉,后续纯化相当困难。文献[3,4]报道了一种从水仙鳞茎提取水仙多糖的工艺,该工艺先用乙醇/石油醚回流脱脂,经冻干粉碎后用热水浸提。与上述专利一样,采用热水提取容易造成所制备的水仙多糖中含有大量糊化淀粉,同时采用冻干成本非常高。另外,采用热水浸提的另一个缺点是易造成水仙多糖降解,导致制备所得产品的粘度严重降低。
以上专利或文献所提供的工艺,存在以下问题:(1)需先用乙醇或石油醚脱脂、再真空干燥或冷冻干燥,最后才能粉碎,工艺复杂且耗时,同时生产成本较高;(2)采用热水浸提,造成淀粉糊化,难以与多糖分离;(3)浸提时所使用的热水温度较高(80~100℃),容易造成多糖降解。
发明内容
针对以上问题,本发明提供了一种从水仙鳞茎中提取分离高粘度水仙多糖的方法。
为实现上发明目的,本发明采用如下技术方案:
一种从水仙鳞茎中提取分离高粘度水仙多糖的方法,该方法包括以下步骤:
(1)清洗:取新鲜的水仙鳞茎,剥去外皮,切除根须,用清水冲洗干净;
(2)破碎或均浆:将清洗的水仙鳞茎和含防腐剂、水解酶抑制剂的水溶液倒入破碎机打浆;
(3)浸提:往匀浆液中补充含防腐剂、水解酶抑制剂的水溶液并不断搅拌;
(4)粗滤:浸提液用滤布过滤;
(5)调pH:用酸调节pH至弱酸性,并搅拌均匀;
(6)离心:分别收集上清液和底部沉淀物;
(7)凝集素分离:沉淀物经冷冻干燥,得凝集素粗品;
(8)浓缩:上清液真空浓缩;
(9)醇沉:浓缩液醇沉,醇沉物用醇水漂洗;
(10)干燥:醇沉物经真空干燥,即水仙多糖。
进一步,步骤(2)所述的原料破碎均浆方式包括均浆、挤压、切丝。
进一步,步骤(2)和(3)所使用浸提水溶液含有防腐剂和水解酶抑制剂;所述的浸提温度为0~50℃;所述的浸提时间为0~4h;浸提期间需搅拌,搅拌速度为0~120r/min。
进一步,步骤(2)和(3)所使用防腐剂为食品防腐剂为山梨酸钾;添加量为0~1%。
进一步,步骤(2)和(3)所使用水解酶抑制剂为金属离子络合剂,包括地衣酸盐、柠檬酸盐、植酸等,优选地衣酸二钠盐;添加量为0~5%,优选0.1%;
进一步,步骤(5)所述的弱酸性为pH2~6;所使用的试剂为酸性化学试剂。
相对于现有技术的多糖提取工艺,本发明所述的工艺具有如下特点:
(1)水仙鳞茎分泌的黏性液体(即本发明所提取的多糖)主要贮存在胞间层,是植物用来抵抗昆虫啃食、微生物感染的一种机制,当水仙鳞茎表皮破损时能自行分泌。因此,采用只需将水仙鳞茎充分破碎,黏性液体很快就分泌并溶入水中,无需加热或超声辅助萃取。
(2)一般植物组织的浆液富含各种营养物质,室温下微生物很容易繁殖。因此,均浆液/提取液中要加入适量防腐剂。
(3)植物液泡中富含各种水解酶,能将水仙多糖水解,严重降低水仙多糖粘度,因此必须灭活。主流的酶灭活方法是加热灭活,但加热高温会导致水仙多糖降解。另外一种方法是化学试剂抑制酶活,实验发现EDTA等有较好的酶抑制效果,可有效保持浸提液的粘度。
(4)实验发现,水仙凝集素在pH3~4容易沉淀出来,而继续降低pH则又溶解,因此,初步判断其等电点位于pH3~4,同时采用等电点与离心结合的办法将其分离。
附图说明:
图1 工艺流程图;
图2 0.5%水仙多糖粘度测定结果;
图3 为水仙多糖样品的HPLC色谱图;
图4 为水仙鳞茎样品的HPLC色谱图;
图5 为水仙多糖对其组胺释放的抑制效果显示图。
具体实施方式
以下通过附图1-5及具体实施方式对本发明做进一步解释说明,所描述的仅是本发明的部分实施实例,不对本发明的内容有所限制。本领域相关研究人员在没有做出任何创新性贡献的前提下所进行的其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一种从水仙鳞茎中提取分离高粘度水仙多糖的方法,该方法包括以下步骤:
(1)清洗:取新鲜的水仙鳞茎,剥去外皮,切除根须,用清水冲洗干净;
(2)破碎或均浆:将清洗的水仙鳞茎和含防腐剂、水解酶抑制剂的水溶液倒入破碎机打浆;
(3)浸提:往匀浆液中补充含防腐剂、水解酶抑制剂的水溶液并不断搅拌;
(4)粗滤:浸提液用滤布过滤;
(5)调pH:用酸调节pH至弱酸性,并搅拌均匀;
(6)离心:分别收集上清液和底部沉淀物;
(7)凝集素分离:沉淀物经冷冻干燥,得凝集素粗品;
(8)浓缩:上清液真空浓缩;
(9)醇沉:浓缩液醇沉,醇沉物用醇水漂洗;
(10)干燥:醇沉物经真空干燥,即水仙多糖。
下面从几个实施例对上述方式进行详细阐述:
实施例一:水仙鳞茎多糖的制备
(1)取新鲜的水仙鳞茎,剥去外皮,切除根须,用清水冲洗干净;
(2)取水仙鳞茎200g,添加400mL含0.05%山梨酸钾+0.1%EDTA水溶液,用均浆机打浆;
(3)往匀浆液中补加1600mL含0.05%山梨酸钾+0.1%EDTA水溶液,并缓慢搅拌30min;
(4)用200目的尼龙布过滤,收集滤液;
(5)用三氯乙酸调节pH至3~4,15r/min搅拌30min;
(6)2000G离心30min,收集上清;
(7)上清液用碱调节pH至6左右,再用旋转蒸发仪浓缩至为3~5°brix;
(8)往浓缩液中加入3倍酒精,缓慢搅拌,静置60min,100目尼龙布过滤收集沉淀物,沉淀物用70%酒精漂洗2次;
(9)沉淀物经真空干燥,即水仙多糖8.21g。
实施例二:水仙鳞茎多糖的制备
(1)取新鲜的水仙鳞茎,剥去外皮,切除根须,用清水冲洗干净;
(2)取水仙鳞茎2kg,切丝,投入浸提罐;
(3)往浸提罐中加入10kg含0.05%山梨酸钾+0.1%EDTA水溶液,并搅拌120min,放料;再次浸提2次,每次溶剂为5kg;
(4)合并浸提液,用200目的尼龙布过滤,收集滤液;
(5)用三氯乙酸调节pH至3~4,30r/min搅拌30min;
(6)用管式离心机离心,收集轻相;
(7)轻相用碱调节pH至6左右,再用降膜蒸发器浓缩至为3~5°brix;
(8)往浓缩液中加入3倍酒精,缓慢搅拌90min,100目尼龙布过滤收集沉淀物,沉淀物用70%酒精漂洗2次;
(9)沉淀物经真空干燥,即水仙多糖76.59g。
实施例三:水仙鳞茎多糖的制备
(1)取新鲜的水仙鳞茎,剥去外皮,切除根须,用清水冲洗干净;
(2)取水仙鳞茎100kg,过挤压机,投入浸提罐;
(3)往浸提罐中加入1000kg含0.05%山梨酸钾+0.1%EDTA水溶液,并搅拌120min,放料;再次浸提1次,溶剂为800kg;
(4)合并浸提液,用200目~400目滤袋过滤,收集滤液;
(5)用柠檬酸调节pH至3~4,60r/min搅拌30min;
(6)用管式离心机离心,收集轻相;
(7)轻相用碱调节pH至6左右,再用降膜蒸发器浓缩至为3~5°brix;
(8)往浓缩液中加入2.5倍酒精,缓慢搅拌120min,再用100目尼龙布过滤收集沉淀物,沉淀物再次用75%酒精漂洗2次;
(9)沉淀物经真空干燥,即水仙多糖3.7kg。
为了证明本发明的有效性,进行了以下实验:
(一)水仙多糖理化性质测试
1.水仙多糖粘度测定
主要试剂:0.5%水仙多糖(实施例三)
方法:用安东帕流变仪MCR92在25℃条件下选择粘性-剪切项目(剪切力范围0.1~10s-1)进行测定。
结果如图2所示,水仙多糖溶液的平均粘度为40mPa*s,其粘度随着剪切力增加先略有上升后快速下降,具有明显的剪切变稀,有利用料液的均质或乳化。
2.水仙多糖淀粉残留检测
主要试剂:2.5%I2/KI溶液(2.5gI2+5.0gKI,加水至100mL);2.0%本发明水仙多糖溶液(取2.0g水仙多糖(实施例一),加水至100mL,加热至沸腾,自然冷却至室温);0.2%文献-水仙多糖溶液(取0.2g水仙多糖(按照参考文献[2]提取),加水至100mL,加热至沸腾,自然冷却至室温);0.005%淀粉(取50mg淀粉,加水至1000mL,加热至沸腾,自然冷却至室温)。
鉴定方法:分别取待测试样5mL于25mL比色管内,加入0.1mLI2/KI溶液,摇匀,观察颜色变化。
测试结果如表1所示,采用本发明方法制得的水仙多糖样品经I2/KI测试显示阴性,即淀粉含量低于0.25%;参考文献2所制得的水仙多糖样品经I2/KI测试显示阳性,经比色推算,其淀粉残留量约为3%。
表1淀粉测试结果
3.水仙多糖生物碱类物质残留检测
样品处理:(1)取10g水仙鳞茎,打浆,用70%乙醇于60℃浸提2次,合并浸提液,用70%乙醇定容至100.0mL,取滤液用0.45μm微孔滤头过滤,取续滤液进液相色谱分析。(2)取10.0g水仙多糖(实施例2),粉碎,用70%乙醇于60℃浸提2次,合并浸提液,用70%乙醇定容至100.0mL,取滤液用0.45μm微孔滤头过滤,取续滤液进液相色谱分析。
色谱条件:岛津LC-16、自动进样器SIL-16、Colunm Oven CTO-16L柱温箱、检测器SPD-M20A、色谱柱(WondaSil C18-WR 5μm 4.6×150mm),进样体积5μL;流动相:10%甲醇→100%甲醇(35min);检测波长:225nm。
检测结果如图3、图4所示。图3为实施例所制备的水仙多糖样品,除了溶剂峰及4.5min、10min附近,其他位置基本没有出峰,而石蒜科的生物碱一般具有多个共轭双键(发色基团),能被紫外检测器检出,这说明样品几乎不含有生物碱。而水仙鳞茎样品在10~20min出现8个峰,其中峰(Rt为15.5min)为秋水仙碱,按照峰面积外标法计算,秋水仙碱的含量为0.23%。综上所述,本发明所提出的水仙多糖制备工艺能将原料中的中秋水仙碱有效除去,避免因生物碱的残留而影响水仙多糖的安全性。
(二)水仙多糖生物活性测试
1.保湿功效
实验样品:纯水、0.5%甘油、0.5%透明质酸、0.5%β-葡聚糖、0.5%水仙多糖;
测试方法:试验在40%湿度和25℃环境中进行。将受试者手臂内侧皮肤划分一块区域,并平均划分为5块(2.5cm×4cm),分别涂抹0.2mL以上溶液,60min后用多功能皮肤测试仪(CK-MPA10)的Corneometer CM825探头测定水分变化,测取数据三次,取平均值。
测试结果如表2所示,测试结果表明,水仙多糖具有较好的保湿效果,其保湿效果与透明质酸相当。
表2保湿效果评价
2.抗敏功效
利用RBL-2H3细胞模型,探究水仙多糖对其组胺释放的抑制效果。RBL-2H3细胞经IgE(0.2μg/mL)敏化和15min的DNP-BSA(1μg/mL)刺激后,获取细胞培养上清,利用试剂盒检测上清中的组胺含量。试验结果显示如图5所示,100~250μg/mL水仙多糖浓度对RBL-2H3细胞组胺的释放有显著的抑制效果。
本发明实施例所使用的防腐剂为山梨酸钾,目前市面上防腐剂很多,在此不一一列举;本发明实施例所使用的水解酶抑制剂为EDTA、柠檬酸钠,其共同点是具有一定的化学络合能力,相关化学品很多,在此不一一列举;本发明实施例所使用破碎方式有切丝、均浆、挤压及冻融破碎等,类似破碎水仙鳞茎的操作方法有很多,在此不一一列举。
本发明所引用的文献或专利:
[1]付卡利.中国水仙化学成分与生物活性研究[D].第二军医大学,2013。
[2]王石发,高健,谷文,等.中国水仙多糖的提取分离方法,CN105078872A[P].2015。
[3]牛炜.水仙多糖及生物碱的提取、纯化与检测[D].福建农林大学,2013。
[4]牛炜,潘东明,贾媛颖.水仙鳞茎中粗多糖的提取工艺优化[J].北方园艺,2012(10):64-66。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例,如前所述,应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述发明构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围,则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种高粘度水仙多糖在制备抗敏药物中的应用,其特征在于,制备方法包括:
(1)清洗:取新鲜的水仙鳞茎,剥去外皮,切除根须,用清水冲洗干净;
(2)破碎或均浆:将清洗的水仙鳞茎和含山梨酸钾、金属离子络合剂的水溶液倒入破碎机打浆;
(3)浸提:浸提温度为0~50℃,往匀浆液中补充含山梨酸钾、金属离子络合剂的水溶液并不断搅拌;
(4)粗滤:浸提液用滤布过滤;
(5)调pH:用酸调节pH至pH2~6,并搅拌均匀;
(6)离心:分别收集上清液和底部沉淀物;
(7)凝集素分离:沉淀物经冷冻干燥,得凝集素粗品;
(8)浓缩:上清液真空浓缩;
(9)醇沉:浓缩液醇沉,醇沉物用醇水漂洗;
(10)干燥:醇沉物经真空干燥,即水仙多糖。
2.根据权利要求1所述的一种高粘度水仙多糖在制备抗敏药物中的应用,其特征在于,步骤(3)中,所述的浸提时间为0.5-4h。
3.根据权利要求1所述的一种高粘度水仙多糖在制备抗敏药物中的应用,其特征在于,步骤(2)和(3)中,山梨酸钾的添加量为0.05-1%。
4.根据权利要求1所述的一种高粘度水仙多糖在制备抗敏药物中的应用,其特征在于,步骤(2)和(3)中,金属离子络合剂包括依地酸盐、柠檬酸盐或植酸;添加量为0.1-5%。
5.根据权利要求4所述的一种高粘度水仙多糖在制备抗敏药物中的应用,其特征在于,金属离子络合剂为依地酸二钠盐,添加量为0.1%。
6.一种高粘度水仙多糖在制备抗敏药物中的应用,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)取新鲜的水仙鳞茎,剥去外皮,切除根须,用清水冲洗干净;
(2)取水仙鳞茎200g,添加400mL含0.05%山梨酸钾和0.1%EDTA水溶液,用均浆机打浆;
(3)往匀浆液中补加1600mL含0.05%山梨酸钾和0.1%EDTA水溶液,并缓慢搅拌30min;
(4)用200目的尼龙布过滤,收集滤液;
(5)用三氯乙酸调节pH至3~4,15r/min搅拌30min;
(6)2000G离心30min,收集上清;
(7)上清液用碱调节pH至6左右,再用旋转蒸发仪浓缩至为3~5°brix;
(8)往浓缩液中加入3倍酒精,缓慢搅拌,静置60min,100目尼龙布过滤收集沉淀物,沉淀物用70%酒精漂洗2次;
(9)沉淀物经真空干燥,即水仙多糖8.21g。
7.一种高粘度水仙多糖在制备抗敏药物中的应用,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)取新鲜的水仙鳞茎,剥去外皮,切除根须,用清水冲洗干净;
(2)取水仙鳞茎2kg,切丝,投入浸提罐;
(3)往浸提罐中加入10kg含0.05%山梨酸钾和0.1%EDTA水溶液,并搅拌120min,放料;再次浸提2次,每次溶剂为5kg;
(4)合并浸提液,用200目的尼龙布过滤,收集滤液;
(5)用三氯乙酸调节pH至3~4,30r/min搅拌30min;
(6)用管式离心机离心,收集轻相;
(7)轻相用碱调节pH至6左右,再用降膜蒸发器浓缩至为3~5°brix;
(8)往浓缩液中加入3倍酒精,缓慢搅拌90min,100目尼龙布过滤收集沉淀物,沉淀物用70%酒精漂洗2次;
(9)沉淀物经真空干燥,即水仙多糖76.59g。
8.一种高粘度水仙多糖在制备抗敏药物中的应用,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)取新鲜的水仙鳞茎,剥去外皮,切除根须,用清水冲洗干净;
(2)取水仙鳞茎100kg,过挤压机,投入浸提罐;
(3)往浸提罐中加入1000kg含0.05%山梨酸钾和0.1%EDTA水溶液,并搅拌120min,放料;再次浸提1次,溶剂为800kg;
(4)合并浸提液,用200目~400目滤袋过滤,收集滤液;
(5)用柠檬酸调节pH至3~4,60r/min搅拌30min;
(6)用管式离心机离心,收集轻相;
(7)轻相用碱调节pH至6左右,再用降膜蒸发器浓缩至为3~5°brix;
(8)往浓缩液中加入2.5倍酒精,缓慢搅拌120min,再用100目尼龙布过滤收集沉淀物,沉淀物再次用75%酒精漂洗2次;
(9)沉淀物经真空干燥,即水仙多糖3.7kg。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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