CN116693712A - 木芙蓉叶多糖粗提物、木芙蓉叶多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
木芙蓉叶多糖粗提物、木芙蓉叶多糖及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物提取及医用、医美应用领域，具体涉及一种木芙蓉叶多糖粗提物、木芙蓉叶多糖及其制备方法和应用。本发明采用溶剂提取法提取纯化得到木芙蓉多糖成分，能够同时保证多糖的含量、纯度，本发明制备方法效率高，操作简单，易大规模生产。同时发明人还发现了木芙蓉多糖粗提物和木芙蓉多糖的保湿功效，尤其是木芙蓉叶多糖具有如透明质酸同等较好的保湿性能，为公众提供了一种全新的具有保湿性能的产品。
Description
技术领域
本发明属于植物提取及医用、医美应用领域，具体涉及一种木芙蓉叶多糖粗提物、木芙蓉叶多糖及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤干燥是机体受到季节更替、环境改变、个体差异、年龄、生活习惯等多种因素的影响，长时间处于皮肤干燥状态，会使皮肤的屏障功能减退,容易导致皮肤过敏,发生皮肤老化以及色素沉着等问题。因此，维持皮肤水饱和状态，可以有效预防皮肤干燥造成的各种损伤和症状。皮肤角质层是人体肌肤一道强大的护盾，能提供皮肤屏障的功能，其含水量的多少对屏障功能的完整性起着重要的作用。因此，角质层的含水量是关键，所有影响角质层含水量的因素，都可影响皮肤保湿状况。
中药成分复杂多样，通常含有糖类、氨基酸、蛋白质、鞣质、挥发油、生物碱、甙类等成分，而各成分具有相同或不同的药理功效，所以使得中药具有广泛的应用领域。近年来，许多学者从中药中提取和分离多糖物质，探究其生物功能，成功发现了一些具有显著生物活性的多糖类成分，其药理功效涉及延缓皮肤衰老、美白、晒后修复、祛痘抗炎、促进创伤愈合等。因此，中药多糖在化妆品领域具有广泛的应用前景。中药多糖为天然大分子物质，其具有的高保湿性，可以形成皮肤保护层，给皮肤提供充足的水分。
中药多糖提取方法多样，主要有热水浸提法、超声提取法、酶法提取等，不同的中药多糖，需要依据其分子结构和理化性质，选择合适的提取方法。提取工艺的差异，不仅影响植物多糖的提取率，对多糖的分子结构及生物活性等均产生影响。因此，选择适宜的提取技术，不仅能够保证中药多糖的分子结构完整性和生物活性，还能避免成本浪费，实现经济效益最大化。
近年来，由于环境气候因素、疾病、内分泌紊乱、精神因素等原因，皮肤干燥人群逐年增加，皮肤干燥已成为影响人体健康的一大因素。随着人们生活水平的提高，对各种具有保湿功效的化妆品的需求逐年增高，但化妆品中的成分多样，保湿效果和安全性不一，很难满足消费者日益增长的皮肤护理需求。目前以原料安全性及功效显著性为特点的护肤品越来越受到消费者的欢迎。
木芙蓉Hibiscus mutabilis.L为锦葵科木槿属植物，其花、叶均可以入药。药用价值记载始于宋代的《本草图经》，“地芙蓉，生鼎州。味辛，平，无毒。花主恶疮，叶以敷贴肿痛，九月采”。木芙蓉又名桦木、拒霜、下排杯(壮语)、奔娘咋(苗名)。经过十多年的研究，成都市植物园成功研究培育出18个木芙蓉品种。木芙蓉叶收载于2020版《中国药典》，其花收载于2019版《广东省中药材标准第三册》。味辛，性平，具有解毒消肿，清热凉血排脓之功效，外用可治疗痈疽疔疮发背、烧烫伤、乳腺炎、跌打损伤等，内服用于治疗肺热咳嗽，月经、白带过多等。《本草纲目》记载：“木芙蓉花并叶，气平而不寒不热，味微辛而性滑涎粘，其治痈肿之功，殊有神效”，“治一切大小痈疽，肿毒恶疮，消肿，排脓，止痛”。其叶在民间常用于治疗痈疽焮肿、烫伤、目赤肿痛、跌打损伤等。现代药理研究表明其不仅具有抗炎镇痛、抗氧化、抗过敏、以及免疫调节等药理学作用，目前国内外关于木芙蓉叶化学成分的研究主要集中在黄酮类物质的提取及活性研究方面，并未对木芙蓉多糖进行深入研究，消费市场也没有木芙蓉多糖的相应化妆产品。
基于以上应用背景，本发明的发明人利用溶剂提取法筛选木芙蓉多糖成分，挖掘其保湿功效，开发相应护肤产品。
发明内容
本发明所解决的第一个技术问题是提供一种全新的木芙蓉叶多糖粗提物的制备方法，该方法能有效提取到木芙蓉的多糖成分。本发明木芙蓉叶多糖粗提物的制备方法包括如下步骤：
A、粉碎干燥木芙蓉叶，用水提取，收集滤液，得到木芙蓉叶水提液；
B、步骤A所得木芙蓉叶水提液中，加入乙醇，搅拌静置，沉淀完全，弃去上清液；
C、步骤B所得沉淀，用乙醇洗涤，弃滤液，干燥，得到木芙蓉叶多糖粗提物。
上述提取方法中：
步骤A中，用水提取为回流提取或直接煎煮，两种方法均可用于实际生产，本发明中首选回流提取。
步骤A中，收集滤液采用抽滤方式过滤。
步骤B中，乙醇为质量分数为60-99.9％，优选乙醇质量分数为70-95％。
步骤B中，乙醇添加量为60-85％v/v，优选乙醇添加量为70-80％v/v。
步骤B中，沉淀完全是指沉淀完全沉入容器底部，且不再有新的沉淀产生。
步骤B中，收集沉淀的方法采用离心或过滤收集。
步骤C中，乙醇为质量分数为50-85％，优选质量分数80％乙醇。
步骤C中，洗涤次数为1-3次，优选2次。
本发明所解决的第二个技术问题是提供一种木芙蓉叶多糖的纯化方法，具体涉及两种脱色步骤和两种纯化步骤可以择一采用，能有效获得高纯度木芙蓉多糖。本发明木芙蓉叶多糖的纯化方法包括如下步骤：
D、步骤C所得木芙蓉叶多糖粗提物采用脱色处理；
E、步骤D所得脱色木芙蓉叶多糖粗提物配制成质量分数为0.01-10％的木芙蓉叶多糖溶液，采用纯化处理得到木芙蓉叶多糖。
上述纯化方法中：
所述步骤D的脱色方法包括两种：
其中步骤D中，所述脱色处理方法一为：将木芙蓉叶多糖粗提物制成料液比为20-30％的水溶解，加入0.1％-10％的活性炭颗粒，用0.1mol/l的NaOH溶液调节pH＝7，恒温50-70℃并搅拌，直至溶液颜色不再改变，然后冷至室温，过滤，滤液离心，过滤，得脱色木芙蓉叶多糖粗提物；
其中步骤D中，所述脱色处理方法二为：将木芙蓉叶多糖粗提物制成料液比为20-30％的水溶解，加入质量分数为30-50％，用量为10-20％v/v的过氧化氢，维持溶液温度在40-60℃，反应3-6h进行脱色，即得脱色木芙蓉叶多糖粗提物；
E、步骤D所得脱色木芙蓉叶多糖粗提物配制成质量分数为0.01-10％的木芙蓉叶多糖溶液，采用纯化处理得到木芙蓉叶多糖；
所述步骤E的纯化方法可以采用两种纯化方法得到木芙蓉叶多糖。
纯化方法E1：DEAE-52层析纯化法
E1.1(1)DEAE-52预处理：将DEAE-52浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5mol/l的盐酸溶液中浸泡1-2h，过滤；再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或pH4以上，抽滤抽干；将抽干的DEAE-52浸泡在0.5mol/l的NaOH溶液中1-2h，过滤，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性；
E1.1(2)装柱：将清洗干净的层析柱垂直固定到层析架上，加入1/3-1/2体积的无离子水，打开下出液口，使其流通畅通，立即将预处理的DEAE-52柱材轻轻倒入层析柱中，待凝胶自然沉降至层析柱底部，直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱；层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接收集设备，待层析柱的平衡；
E1.1(3)平衡：利用恒流泵将依次将蒸馏水和氯化钠溶液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，平衡30min-60min即可；
E1.2将质量分数为0.01-10％的木芙蓉叶多糖溶液加入DEAE-52层析柱，然后用蒸馏水、氯化钠溶液进行洗脱，收集合并洗脱液，低温真空干燥或喷雾干燥即得木芙蓉叶多糖；
优选的，E1.2中木芙蓉叶多糖溶液的质量分数为8％。
纯化方法E2：微滤-超滤联用膜分离法
E2.1木芙蓉叶多糖溶液采用微滤过滤，微滤条件为微滤操作压为0.01～0.2MPa，过滤粒径为0.025～10μm，料液浓度为0.1-10％；得到微滤木芙蓉叶多糖液；
E2.2将步骤E2.1所得微滤木芙蓉叶多糖液进行超滤膜分离，超滤条件为操作压力0.1～0.3MPa，截留分子质量10-100kDa，室温，料液体积流量10-200ml/min，收集滤液，低温真空干燥或喷雾干燥即得木芙蓉叶多糖。
优选的，E2.1中料液浓度为8％。
优选的，E2.1所述微滤条件为微滤操作压为0.1～0.2MPa，过滤粒径为0.05～5μm，料液浓度为1-5％。
优选的，E2.2所述超滤条件为操作压力0.15-0.2MPa，截留分子质量10-60kDa，室温，料液体积流量50-100ml/min。
DEAE-52是一种阴离子交换剂，是在纤维素中引进二乙基氨基乙基这种交换基团而形成的高分子聚合物，由高分子聚合物基质、电荷基团、反离子3部分组成与溶液中的其他离子或离子化合物以离子交换的方式结合，不改变本身和被结合离子或离子化合物的性质，因其物理和化学性质稳定，在本发明中作为层析法的固定相。
由于产地不同，采收季节不同，所含有效成分和含量就存在差异，为了满足木芙蓉叶多糖粗提物和纯化后的木芙蓉叶多糖的有效含量，发明人对收集全国不同产地，不同季节的药用木芙蓉叶样品做了本发明提取和纯化方法的考察，最终确定了木芙蓉叶在不同产地的采收时期，保证相应功效和疗效稳定性；并且确定了采用前述提取方法、纯化方法及参数控制范围均可以得到满足条件的木芙蓉叶多糖粗提物和木芙蓉叶多糖，不同产地和不同季节所产木芙蓉叶多糖含量有明显变化，最低含量为1.0％，最高含量为10.0％，即所得木芙蓉叶多糖含量范围为1.0％～10.0％。
本发明所解决的第三个问题是提供了采用前述木芙蓉叶多糖粗提物的制备方法制备所得的木芙蓉叶多糖粗提物。该木芙蓉叶多糖粗提物还可以添加常规的辅料制成药品、化妆品、医美用品等外用制剂。
进一步的，所述外用制剂为溶液、外用药膏、霜、泡沫、营养化妆水、柔润化妆水、面膜、软化水、乳液、隔离霜、精华液、皂、液体清洁用品、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳化液、糊剂、凝胶、面乳、粉末、皂、含表面活性剂洗面奶、油、粉末粉底、乳化液粉底、膏状粉底、贴剂或喷雾剂。
本发明所解决的第四个问题是提供了采用前述木芙蓉叶多糖的制备方法制备所得的木芙蓉叶多糖。该木芙蓉叶多糖还可以添加常规的辅料制成药品、化妆品、医美用品等外用制剂。
进一步的，所述外用制剂为溶液、外用药膏、霜、泡沫、营养化妆水、柔润化妆水、面膜、软化水、乳液、隔离霜、精华液、皂、液体清洁用品、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳化液、糊剂、凝胶、面乳、粉末、皂、含表面活性剂洗面奶、油、粉末粉底、乳化液粉底、膏状粉底、贴剂或喷雾剂。
本发明所解决的第五个技术问题是提供木芙蓉叶多糖粗提物及木芙蓉叶多糖在制备具有保湿功效的药品、化妆品、医美用品中的用途。以及木芙蓉叶多糖粗提物及木芙蓉叶多糖在制备提高保湿基因蛋白AQP3和FLG水平的药品、化妆品、医美用品中的用途。
进一步的，所述药品、化妆品、医美用品为外用制剂。
进一步的，所述外用制剂为溶液、外用药膏、霜、泡沫、营养化妆水、柔润化妆水、面膜、软化水、乳液、隔离霜、精华液、皂、液体清洁用品、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳化液、糊剂、凝胶、面乳、粉末、皂、含表面活性剂洗面奶、油、粉末粉底、乳化液粉底、膏状粉底、贴剂或喷雾剂。
本发明采用溶剂提取法提取纯化得到木芙蓉多糖成分，能够同时保证多糖的含量、纯度，本发明制备方法效率高，操作简单，易大规模生产。同时发明人还发现了木芙蓉多糖粗提物和木芙蓉多糖的保湿功效，并制成具有保湿活性的衍生产品。尤其是，本发明将木芙蓉叶多糖、分子量100万透明质酸、壳聚糖三者进行保湿率检验和皮肤测试，发现木芙蓉叶多糖具有如透明质酸同等较好的保湿性能，为公众提供了一种全新的具有保湿性能的产品。
附图说明
图1多糖含量测定标准曲线图。
图2木芙蓉叶多糖对HaCaT细胞的毒性。
图3木芙蓉叶多糖提取物对保湿基因蛋白AQP3表达的影响。
图4木芙蓉叶多糖提取物对保湿基因蛋白FLG表达的影响。
图5各样品保湿率与时间的变化关系。
图6涂抹木芙蓉叶多糖不同时间测定皮肤水分变化。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1.木芙蓉叶药材收集
同一品种药材，产地不同，采收季节不同，则其所含有效成分和含量就存在差异，从而使药理机制变化，造成功效和疗效不稳定。本发明收集全国不同产地，不同季节的药用木芙蓉叶样品(表1)，旨在明确木芙蓉叶多糖含量的变化规律，便于木芙蓉叶多糖的提取、含量测定，及保证相应功效和疗效稳定性。S1～S39于10月份采摘，D1～D13于12月份采摘，X1～X18于7月份采摘。
表1芙蓉叶药材信息
实施例2.木芙蓉叶多糖提取和纯化
使用实施例1中所列各批次木芙蓉叶，粉碎，过筛，称重，置于反应器中，加水适量，加热回流提取，抽滤，将滤液装于洁净容器中备用。量取95％v/v乙醇溶液加入滤液中，使溶液中乙醇含量为75％(v/v)，搅拌，静置，使沉淀完全沉入容器底部，然后离心，过滤，并用质量分数80％乙醇进行2次洗涤，弃去滤液，干燥，即得木芙蓉叶多糖粗提物。
木芙蓉叶多糖粗提物脱色处理：将木芙蓉叶多糖粗提物制成料液比20％的水溶解，加入质量分数为30％，用量为20％v/v的过氧化氢，维持溶液温度在40-60℃，反应3-6h进行脱色，即得脱色木芙蓉叶多糖粗提物。
木芙蓉叶多糖粗提物进行纯化处理：
首先将脱色木芙蓉叶多糖粗提物制备成溶液采用微滤过滤，微滤条件为微滤操作压为0.2MPa，过滤粒径为10μm，料液浓度为8％；得到微滤木芙蓉叶多糖液；然后进行超滤，超滤条件为操作压力0.3MPa，截留分子质量60kDa，室温，料液体积流量100ml/min，即得纯化木芙蓉多糖溶液，纯化木芙蓉多糖溶液可以采用低温真空干燥或喷雾干燥。
实施例3.木芙蓉叶多糖含量测定
实验方法：
分别精密量取葡萄糖对照品溶液60、80、100、120、140μL置刻度试管中，各加蒸馏水补至1mL，以1.0mL蒸馏水作空白，分别精密加入苯酚溶液和浓硫酸，摇匀，沸水浴加热，然后冰浴冷却，同法制备空白溶液，最后在481nm处测定吸收度。根据实验结果绘制标准曲线，实验结果见表2和图1。
精密量取实施例2方法制备所得供试品适量，制成溶液1.0mL，精密加入苯酚溶液和浓硫酸，摇匀，沸水浴加热，然后冰浴冷却，最后于481nm波长处测定吸收度，计算芙蓉叶各批次多糖含量，结果见表3。
实验结果：通过结果可知，所构建的标准曲线线性良好。不同产地和不同季节所产木芙蓉叶多糖含量有明显变化，最低含量为1.0％，最高含量为10.0％。因此，本发明明确木芙蓉叶多糖含量范围为1.0％～10.0％。通过本发明提供的实验结果，也为木芙蓉叶多糖资源的开发提供了参考依据，对不同产地和季节的木芙蓉叶提取多糖进行资源开发可进行前瞻性规划。
表2各浓度对照品溶液吸光度值
表3各样品多糖含量测定结果(％)
通过实施例1-3木芙蓉叶多糖提取及纯化方法，以及发明人所在课题组经验确定本发木芙蓉叶采用下述技术方案及参数范围均可以得到目标木芙蓉叶多糖提取物、纯化后的木芙蓉叶多糖：
本发明木芙蓉叶多糖粗提物的制备方法包括如下步骤：
A、粉碎干燥木芙蓉叶，用水提取，收集滤液，得到木芙蓉叶水提液；
B、步骤A所得木芙蓉叶水提液中，加入乙醇，搅拌静置，沉淀完全，弃去上清液；
C、步骤B所得沉淀，用乙醇洗涤，弃滤液，干燥，得到木芙蓉叶多糖粗提物。
上述提取方法中：
步骤A中，用水提取为回流提取或直接煎煮，两种方法均可用于实际生产，本发明中首选回流提取。
步骤A中，收集滤液采用抽滤的方式。
步骤B中，乙醇为质量分数为60-99.9％，优选乙醇质量分数为70-95％。
步骤B中，乙醇添加量为60-85％v/v，优选乙醇添加量为70-80％v/v。
步骤B中，沉淀完全是指沉淀完全沉入容器底部，且不再有新的沉淀产生。
步骤B中，收集沉淀的方法采用离心或过滤收集。
步骤C中，乙醇为质量分数为50-85％，优选质量分数80％乙醇；洗涤次数为1-3次，优选2次。
本发明木芙蓉叶多糖的纯化方法包括如下步骤：
D、步骤C所得木芙蓉叶多糖粗提物采用脱色处理；
E、步骤D所得脱色木芙蓉叶多糖粗提物配制成质量分数为0.01-10％的木芙蓉叶多糖溶液，采用纯化处理得到木芙蓉叶多糖。
上述纯化方法中：
所述步骤D的脱色方法包括两种：
其中步骤D中，所述脱色处理方法一为：将木芙蓉叶多糖粗提物制成料液比为20-30％的水溶解，加入0.1％-10％的活性炭颗粒，用0.1mol/l的NaOH溶液调节pH＝7，恒温50-70℃并搅拌，直至溶液颜色不再改变，然后冷至室温，过滤，滤液离心，过滤，得脱色木芙蓉叶多糖粗提物；
其中步骤D中，所述脱色处理方法二为：将木芙蓉叶多糖粗提物制成料液比为20-30％的水溶解，加入质量分数为30-50％，用量为10-20％v/v的过氧化氢，维持溶液温度在40-60℃，反应3-6h进行脱色，即得脱色木芙蓉叶多糖粗提物；
E、步骤D所得脱色木芙蓉叶多糖粗提物配制成质量分数为0.01-10％的木芙蓉叶多糖溶液，采用纯化处理得到木芙蓉叶多糖；
所述步骤E的纯化方法可以采用两种纯化方法得到木芙蓉叶多糖。
纯化方法E1：DEAE-52层析纯化法包括以下步骤：
E1.1(1)DEAE-52预处理：将DEAE-52浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5mol/l的盐酸溶液中浸泡1-2h，过滤；再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或pH4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的DEAE-52浸泡在0.5mol/l的NaOH溶液中1-2h，过滤，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。
(2)装柱：将清洗干净的层析柱垂直固定到层析架上，加入1/3-1/2体积的无离子水，打开下出液口，使其流通畅通，立即将预处理的DEAE-52柱材轻轻倒入层析柱中，待凝胶自然沉降至层析柱底部，直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接收集设备，待层析柱的平衡。
(3)平衡：利用恒流泵将依次将蒸馏水和氯化钠溶液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，平衡30min-60min即可。
E1.2将质量分数为0.01-10％的木芙蓉叶多糖溶液加入DEAE-52层析柱，然后用蒸馏水、氯化钠溶液进行洗脱，收集合并洗脱液，低温真空干燥或喷雾干燥即得木芙蓉叶多糖。
纯化方法E2：微滤-超滤联用膜分离法包括以下步骤：
E2.1木芙蓉叶多糖溶液采用微滤过滤，微滤条件为微滤操作压为0.01～0.2MPa，过滤粒径为0.025～10μm，料液浓度为0.1-10％；得到微滤木芙蓉叶多糖液；
E2.2步骤E2.1所得微滤木芙蓉叶多糖液进行超滤膜分离，超滤条件为操作压力0.1—0.3MPa，截留分子质量10-100kDa，室温，料液体积流量10-200ml/min，得到木芙蓉叶多糖溶液。
优选的，E2.1所述微滤条件为微滤操作压为0.1～0.2MPa，过滤粒径为0.05～5μm，料液浓度为1-5％。
优选的，E2.2所述超滤条件为操作压力0.15-0.2MPa，截留分子质量10-60kDa，室温，料液体积流量50-100ml/min；
纯化E2.2所述木芙蓉叶多糖溶液可以采用低温真空干燥或喷雾干燥。
以下采用本发明实施例2方法及参数控制制备所得的木芙蓉叶多糖进行功效性实验，以突出本发明的有益效果。
实施例4.木芙蓉叶多糖对HaCaT细胞的细胞毒性检测
实验方法：将HaCaT细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5％(体积分数)CO2恒温培养箱中培养至细胞融合，换培养液。取对数生长期细胞接种于96孔板。按照实验设计，用培养液稀释实施例2提取制备的木芙蓉多糖供试品，浓度分别为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml、100mg/ml。待细胞铺板率达到60％时进行给药，实验组加入不同浓度木芙蓉多糖提取物，空白组加入新鲜培养液，每组设3个复孔。培养板放置在37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养。细胞孵育培养24h，弃掉上清，加入5mg/ml的MTT溶液，混匀，37℃避光孵育。4h后弃掉上清，每孔加100μL二甲基亚砜，490nm处测定吸光度。实验结果见图2。
实验结果采用“均值±标准差”表示，两两比较采用t检验，P<0.05表示有显著性差异。
实验结果：从图2实验结果可知，木芙蓉叶多糖供试品各实验浓度对HaCaT细胞没有明显的细胞毒性。浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml和10mg/ml时，对细胞活性无影响(P>0.05)。因此，后续细胞实验采用的木芙蓉叶多糖提取物浓度将维持在0.01-10mg/ml。
实施例5.基于HaCaT细胞检测木芙蓉叶多糖对皮肤保湿相关基因蛋白表达的分析
实验方法：将处于对数生长期的HaCaT细胞以2×105/孔的接种密度接种至6孔板中，于37℃的CO2培养箱中孵育，待6孔板中细胞铺板率达到60％时加入供试品。实验设立供试品组与对照组，每组设4个复孔，供试品组加入不同浓度木芙蓉叶多糖提取物(0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml)，对照组加入新鲜培养液，于37℃、体积分数5％CO2培养箱中继续培养24h。孵育培养结束后，弃掉培养液，每孔加入1mL Trizol，吹打裂解细胞后，收集保湿基因表征蛋白水通道蛋白3(AQP3)和丝聚蛋白(FLG)，然后按照Elisa kit操作说明书进行相应蛋白含量测定。实验结果见图3和图4。
实验结果采用“均值±标准差”表示，两两比较采用t检验，P<0.05表示有显著性差异。
实验结果：表皮细胞之间的水通道蛋白构成了细胞间水分输送的主要通路，AQP3保持表皮水合作用方面发挥重要作用，AQP表达量的变化、功能缺失可以影响皮肤屏障和导致皮肤干燥、弹性下降等皮肤损伤。因此，调控AQP3蛋白表达对皮肤水合及屏障功能起着重要作用。由图3实验结果可知，与对照组相比，木芙蓉叶多糖提取物在0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml浓度时，均对AQP3蛋白的表达有极其显著的上调作用(P<0.01)，说明木芙蓉叶多糖具有良好的保湿功效。
FLG是参与皮肤屏障的重要因子，FLG参与人表皮角质形成细胞终末分化时细胞间交叉联结膜的形成，随着角质细胞成熟脱水，FLG分解生成大量的天然保湿因子，这对保持皮肤的水合作用和皮肤屏障十分重要。由图4实验结果可知，浓度为0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml木芙蓉叶多糖提取物对FLG蛋白的表达也有显著上调作用(P<0.01)，表明木芙蓉叶多糖具有良好的保湿功效。
可见木芙蓉叶多糖提取物，不仅通过上调AQP3蛋白表达来增加细胞间水分的输布，还能同时调控FLG而增加天然保湿因子的生成，表现出协同增效的保湿功效。
实施例6.称重法测试木芙蓉叶多糖保湿功效
各称取1g木芙蓉叶多糖、分子量100万透明质酸、分子量50万透明质酸和壳聚糖的干燥样品，加入10％的去离子水，置于干燥器内。每隔一段时间，分别称量样品，平行3次实验。根据下式计算保湿率：
式中，Ho为样品放置前含水量，Hn为放置一段时间后样品含水量。
实验结果：由图5可知，木芙蓉叶多糖对比其他样品的保湿率，从图中可以看出，随着时间的延长，各样品的保湿率逐渐降低。其中，分子量50万透明质酸的保湿效果优于其他三种样品，木芙蓉叶多糖、分子量100万透明质酸和壳聚糖三者的保湿率随时间变化的趋势曲线相近。因此，木芙蓉叶多糖具有如透明质酸同等较好的保湿性能，可以在化妆品中作为保湿剂使用。
实施例7.木芙蓉叶多糖的皮肤测试
招募志愿者50名，年龄20-45岁且皮肤健康，无过敏史和皮肤病的女性。测试环境要求温度25℃，相对湿度(RH)60％恒定。实验前，志愿者需清洗皮肤测试区域，洗净后擦拭干净，并静坐10min。样品涂抹前，使用CM825型皮肤油水酸碱测试仪测定被测部位的水分含量。实验时在志愿者手臂内侧标记6块3cm*3cm的实验部位，并进行编号，依次涂抹蒸馏水(空白组)，3％的透明质酸液，0.1％、1％、10％的木芙蓉叶多糖液，每种样品涂抹2min，使样品与皮肤充分接触。在30min、60min、120min、和180min时，用CM825型测试仪分别测试出不同样品涂抹的皮肤含水量(以a.u.为度量单位)，平行测定3次，取平均值。以皮肤保湿性提高率作为评价指标，评价木芙蓉叶多糖是否具有保湿性。
实验结果：参照MMV法(mean moisture value)，采用CM825型皮肤测试仪，进行化妆品保湿功效的测定。测定50名志愿者在涂抹不同浓度的木芙蓉叶多糖液，2％透明质酸液及蒸馏水后，在30min，60min，120min，180min后较涂抹前水分含量变化情况。由图6可知，涂抹不同浓度的木芙蓉叶多糖液和透明质酸液的受试部位水分含量增加较明显，且随着木芙蓉叶多糖含量的增加，皮肤含水量也随之提高。10％的木芙蓉叶多糖液与2％透明质酸液的趋势线基本重合，其水分含量的增值率远高于空白组。实验数据表明，涂抹样品前皮肤水分含量无差异，涂抹不同浓度的木芙蓉叶多糖液后，皮肤含水量存在显著差异。
综上，本发明采用溶剂提取法提取纯化得到木芙蓉多糖成分，能够同时保证多糖的含量、纯度，本发明制备方法效率高，操作简单，易大规模生产。同时发明人还发现了木芙蓉多糖粗提物和木芙蓉多糖的保湿功效，尤其是木芙蓉叶多糖具有如透明质酸同等较好的保湿性能，为公众提供了一种全新的具有保湿性能的产品。
Claims (10)
1.木芙蓉叶多糖粗提物的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、粉碎干燥木芙蓉叶，用水提取，收集滤液，得到木芙蓉叶水提液；
B、步骤A所得木芙蓉叶水提液中，加入乙醇，搅拌静置，沉淀完全，弃去上清液；
C、步骤B所得沉淀，用乙醇洗涤，弃滤液，干燥，得到木芙蓉叶多糖粗提物。
2.根据权利要求1所述的木芙蓉叶多糖粗提物的提取方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
步骤A中，用水提取为回流提取或直接煎煮；
优选的，步骤A中，用水提取为回流提取；
步骤A中，收集滤液采用抽滤方式过滤；
步骤B中，乙醇为质量分数为60-99.9％，优选乙醇质量分数为70-95％；
步骤B中，乙醇添加量为60-85％v/v，优选乙醇添加量为70-80％v/v；
步骤B中，沉淀完全是指沉淀完全沉入容器底部，且不再有新的沉淀产生；
步骤B中，收集沉淀的方法采用离心或过滤进行收集；
步骤C中，乙醇的质量分数为50-85％；
优选的，步骤C中，乙醇的质量分数为80％；
步骤C中，洗涤次数为1-3次；
优选的，步骤C中，洗地次数为2次。
3.木芙蓉叶多糖纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
D、步骤C所得木芙蓉叶多糖粗提物采用脱色处理；
E、步骤D所得脱色木芙蓉叶多糖粗提物配制成质量分数为0.01-10％的木芙蓉叶多糖溶液，采用纯化处理得到木芙蓉叶多糖。
4.根据权利要求3所述的木芙蓉叶多糖纯化方法，其特征在于：步骤D所述脱色处理择一采用以下方法：
步骤D中，所述脱色处理方法一为：将木芙蓉叶多糖粗提物制成料液比为20-30％v/v的水溶解，加入0.1％-10％的活性炭颗粒，用0.1mol/l的NaOH溶液调节pH＝7，恒温50-70℃并搅拌，直至溶液颜色不再改变，然后冷至室温，过滤，滤液离心，过滤，得脱色木芙蓉叶多糖粗提物；
步骤D中，所述脱色处理方法二为：将木芙蓉叶多糖粗提物制成料液比为20-30％v/v的水溶解，加入质量分数为30-50％，用量为10-20％v/v的过氧化氢，维持溶液温度在40-60℃，反应3-6h进行脱色，即得脱色木芙蓉叶多糖粗提物。
5.根据权利要求3所述的木芙蓉叶多糖纯化方法，其特征在于：步骤E所述纯化方法择一采用以下方法：
步骤E中，纯化方法一E1：DEAE-52层析纯化法包括以下步骤：
E1.1(1)DEAE-52预处理：将DEAE-52浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5mol/l的盐酸溶液中浸泡1-2h，过滤；再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或pH4以上，抽滤抽干；将抽干的DEAE-52浸泡在0.5mol/l的NaOH溶液中1-2h，过滤，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性；
E1.1(2)装柱：将清洗干净的层析柱垂直固定到层析架上，加入1/3-1/2体积的无离子水，打开下出液口，使其流通畅通，立即将预处理的DEAE-52柱材轻轻倒入层析柱中，待凝胶自然沉降至层析柱底部，直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱；层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接收集设备，待层析柱的平衡；
E1.1(3)平衡：利用恒流泵将依次将蒸馏水和氯化钠溶液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，平衡30min-60min即可；
E1.2将质量分数为0.01-10％的木芙蓉叶多糖溶液加入DEAE-52层析柱，然后用蒸馏水、氯化钠溶液进行洗脱，收集合并洗脱液，低温真空干燥或喷雾干燥即得木芙蓉叶多糖；步骤E中，纯化方法二E2：微滤-超滤联用膜分离法包括以下步骤：
E2.1木芙蓉叶多糖溶液采用微滤过滤，微滤条件为微滤操作压为0.01～0.2MPa，过滤粒径为0.025～10μm，料液浓度为0.1-10％；得到微滤木芙蓉叶多糖液；
E2.2将步骤E2.1所得微滤木芙蓉叶多糖液进行超滤膜分离，超滤条件为操作压力0.1～0.3MPa，截留分子质量10-100kDa，室温，料液体积流量10-200ml/min，收集滤液，低温真空干燥或喷雾干燥即得木芙蓉叶多糖。
6.根据权利要求5所述的木芙蓉叶多糖纯化方法，其特征在于：至少满足以下任意一项：
所述步骤E1.2木芙蓉叶多糖溶液的质量分数为8％；
所述步骤E2.1所述微滤条件为微滤操作压为0.1～0.2MPa，过滤粒径为0.05～5μm，料液浓度为1-5％；
优选的，所述步骤E2.1所述料液浓度为8％；
所述步骤E2.2所述超滤条件为操作压力0.15-0.2MPa，截留分子质量10-60kDa，室温，料液体积流量50-100ml/min。
7.权利要求1-2任一项所述的制备方法制备所得的木芙蓉叶多糖粗提物。
8.权利要求3-6任一项所述的制备方法制备所得的木芙蓉叶多糖。
9.权利要求7所述的木芙蓉叶多糖粗提物及权利要求8所述的木芙蓉叶多糖在制备具有保湿功效的药品、化妆品、医美用品中的用途；
优选的，权利要求7所述的木芙蓉叶多糖粗提物及权利要求8所述的木芙蓉叶多糖在制备提高保湿基因蛋白AQP3和FLG水平的药品、化妆品、医美用品中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：至少满足以下任意一项：
所述药品、化妆品、医美用品为外用制剂；
优选的，所述外用制剂为溶液、外用药膏、霜、泡沫、营养化妆水、柔润化妆水、面膜、软化水、乳液、隔离霜、精华液、皂、液体清洁用品、沐浴剂、防晒霜、防晒油、悬浮液、乳化液、糊剂、凝胶、面乳、粉末、皂、含表面活性剂洗面奶、油、粉末粉底、乳化液粉底、膏状粉底、贴剂或喷雾剂。
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