CN114276468B - 一种天然成分和在美白并增加皮肤弹性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然成分和在美白并增加皮肤弹性中的应用。本发明提供的金缕梅精制多糖B为一种有效的酪氨酸酶抑制剂,可以抑制酪氨酸酶活性,进而抑制黑色素合成,具有祛斑美白活性;同时,金缕梅精制多糖B还具有提高皮肤弹性的活性。
Description
技术领域
本发明属于化妆品领域,具体涉及一种天然成分和在美白并增加皮肤弹性中的应用。
背景技术
经过近十年的发展,中国已经成为全球第二大化妆品消费市场,市场规模仅次于美国。 2019年国内化妆品市场规模达2444亿元。得益于消费升级和中国市场化妆品消费人群基数大,到2025年,中国化妆品市场规模预计将达到5400亿元,将会超越美国成为全球第一大化妆品市场。其中,以天然来源的成分作为有效成分的化妆品因为其纯净、天然、安全的特点占据了举足轻重的市场地位,且这种需求与日俱增。
金缕梅,别名木里香、牛踏果,为蔷薇目、金缕梅科、金缕梅属落叶灌木或小乔木,多分布于四川、湖北、安徽、浙江、江西、湖南及广西等省区。研究表明,金缕梅内含单宁质、槲皮素、山奈酚等化学成分,具有抑菌、调节皮脂分泌的作用,对龟裂、晒伤、粉刺也有治疗作用,因而常用于适用于青春期少年或是出油状况较严重的皮肤的化妆品中。
目前市面上金缕梅多糖对皮肤的影响研究以及含有金缕梅多糖的化妆品尚属空白。而且,金缕梅目前研究开发较多的是根,花的研究开发较少,资源浪费。
发明内容
本发明是为了提供一种天然成分金缕梅多糖和在美白并增加皮肤弹性中的应用。
本发明技术方案如下:
一种天然成分,通过如下步骤制备:
取适量金缕梅花瓣,用无水乙醇热回流提取脱脂脱色,过滤收集固体并挥干溶剂,用纯净水加热提取,水提液离心取上清液,减压浓缩,再加入4倍体积无水乙醇醇沉,收集沉淀得到粗多糖,将粗多糖用纯净水配制成粗多糖水溶液进行Sevag法脱蛋白;
DEAE-52柱层析:取适量脱蛋白粗多糖用纯净水配制成浓度为5mg/mL的溶液,上样于内径2.5cm、柱床高度30cm的DEAE-52纤维素层析柱中,上样体积为2.5mL,依次用0、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱,流速为2.5mL/min,每5mL收集1管,每个梯度收集20管,合并74~86管,浓缩、透析、冷冻干燥,得到多糖B;
Sephadex G-100纯化:取适量多糖B用纯净水配制成浓度为5mg/mL的溶液,上样于内径2.5cm、柱床高度30cm的Sephadex G-100层析柱中,上样体积为2.5mL,用0.1mol/L的NaCl溶液洗脱,流速为0.5mL/min,每2.5mL收集1管,合并4~14管,浓缩、透析、冷冻干燥,得到精制多糖B。
优选地,脱脂脱色的料液比为1kg:10L,每次提取2.5h,共提取3次。
优选地,纯净水加热提取料液比1kg:5L,提取温度80℃,每次提取2.5h,共提取3次。
优选地,水提液离心后的上清液在进行减压浓缩时优选浓缩至原体积的1/5。
优选地,Sevag法脱蛋白的具体方法为:将粗多糖水溶液与Sevag试剂按照体积比4:1混合,充分振荡,移入分液漏斗中静置0.5h,回收上层水溶液,重复多次直至观察不到明显的中间蛋白层,上层水溶液冷冻干燥。
上述任一所述的天然成分用于制备祛斑美白化妆品的用途。
上述任一所述的天然成分用于制备增加皮肤弹性的化妆品的用途。
有益技术效果:
本发明提供了一种金缕梅多糖JZ-B,该多糖为一种有效的酪氨酸酶抑制剂,可以抑制酪氨酸酶活性,进而抑制黑色素合成,具有祛斑美白活性;JZ-B还具有提高皮肤弹性的活性。
附图说明
图1为DEAE-52、Sephadex G-100纯化曲线和SEM图;
图2为Westernblot测定结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容,但不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1:
于花季收集金缕梅科金缕梅Hamamelis mollis Oliv.的花瓣(即丝缕状部分),洗净后于阴凉处风干,粉碎备用。取适量金缕梅花瓣,按照料液比1kg:10L用无水乙醇热回流提取 2.5h×3次脱脂脱色,过滤收集固体并挥干溶剂,按照料液比1kg:5L用纯净水80℃加热提取2.5h×3次,合并水提液,离心取上清液,减压浓缩至原体积的1/5,再加入4倍体积无水乙醇醇沉,收集沉淀得到粗多糖。
将粗多糖用纯净水配制成质量分数为3%的粗多糖水溶液进行Sevag法脱蛋白,具体方法为:将粗多糖水溶液与Sevag试剂(氯仿与正丁醇按体积比4:1混合而成)按照体积比4:1混合,充分振荡,移入分液漏斗中静置0.5h,回收上层水溶液,重复多次直至观察不到明显的中间蛋白层(通常共重复3次即可),上层水溶液冷冻干燥得到脱蛋白粗多糖。
DEAE-52柱层析:取适量脱蛋白粗多糖用纯净水配制成浓度为5mg/mL的溶液,上样于 DEAE-52纤维素层析柱(内径2.5cm、柱床高度30cm)中,上样体积为2.5mL,依次用0、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱,流速为2.5mL/min,每5mL收集1管,每个梯度收集20管,苯酚-硫酸法测定洗脱液中多糖含量(490nm吸光度值),绘制洗脱管数与吸光度值的曲线(如图1)。分别合并50~68管、74~86管,浓缩、透析、冷冻干燥,得到多糖A、多糖B。重复上述过程多次,可以获得更多多糖A、多糖B。
Sephadex G-100纯化:分别取适量多糖A、多糖B用纯净水配制成浓度为5mg/mL的溶液,上样于Sephadex G-100层析柱(内径2.5cm、柱床高度30cm)中,上样体积为2.5mL,用0.1mol/L的NaCl溶液洗脱,流速为0.5mL/min,每2.5mL收集1管,苯酚-硫酸法测定洗脱液中多糖含量(490nm吸光度值),绘制洗脱管数与吸光度值的曲线(如图1)。对于多糖A,合并14~30管;对于多糖B,合并4~14管。分别浓缩、透析、冷冻干燥,得到精制多糖A(JZ-A)、精制多糖B(JZ-B)。重复上述过程多次,可以获得更多JZ-A、JZ-B。
通过DEAE-52柱层析洗脱曲线可以看出,多糖A、多糖B为不同极性的多糖;通过Sephadex G-100柱层析洗脱曲线可以看出,JZ-A、JZ-B为不同分子量的多糖(洗脱参数一致但洗脱出峰管数不同)。可见,JZ-A、JZ-B为极性不同、分子量不同的两种多糖。从SEM 观察到的形貌来看(如图1),二者均具有片层状结构,但是JZ-A没有JZ-B片层上的孔洞。
实施例2:活性测试实施例
一、酪氨酸酶抑制活性
1、试验材料
金缕梅多糖JZ-A、JZ-B按照实施例1方法制备,干燥保存。
阳性对照β-熊果苷的纯度不低于98%。
实验过程中使用的水为哇哈哈纯净水,化学试剂均为常规试剂。
2、试验方法
参考文献方法(肉桂酸-香豆素酯类似物的合成及抑制酪氨酸酶活性研究,有机化学,Chin.J.Org.Chem.2020,40)测定金缕梅多糖JZ-A、JZ-B和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率:
将金缕梅多糖JZ-A、JZ-B和阳性对照β-熊果苷分别用50%DMSO水溶液溶解,并稀释成不同浓度的溶液。将130μL磷酸缓冲溶液(50mM,pH=6.8)、10μL酪氨酸酶溶液(终浓度33.3U/mL)和10μL待测多糖或阳性对照混匀后,加入50μL L-Dopa(终浓度0.5mM)混匀,10min后于490nm波长下测定OD值。同时设置对照组,对照组加入10μL溶媒代替多糖或阳性对照溶液。各设5个复孔,计算均值,根据如下公式计算不同浓度多糖或阳性对照对酪氨酸酶的抑制率:
抑制率(%)=(OD对照-OD药物)/OD对照×100%。
3、试验结果
不同浓度金缕梅多糖JZ-A、JZ-B和阳性对照对酪氨酸酶的抑制率如表1所示,金缕梅多糖JZ-A、JZ-B具有较强的酪氨酸酶抑制活性,JZ-A活性明显强于阳性对照β-熊果苷,JZ-B 活性略弱于阳性对照β-熊果苷。
表1不同浓度JZ-A、JZ-B和β-熊果苷对酪氨酸酶的抑制率
酪氨酸酶是一种氧化酶,且是调控黑色素生成的限速酶,直接影响黑色素的合成。抑制酪氨酸酶的活性可以有效抑制黑色素的合成。目前市面上大多数美白化妆品中均含有抑制酪氨酸酶活性的成分。上述试验结果说明,金缕梅多糖JZ-A、JZ-B为有效的酪氨酸酶抑制剂,可以抑制酪氨酸酶活性,进而抑制黑色素合成,具有祛斑美白活性。
二、弹性蛋白激活活性
1、试验材料
金缕梅多糖JZ-A、JZ-B按照实施例1方法制备,干燥保存。
人皮肤成纤维细胞(HDF)购自赛默飞,为冻存的HDF-a细胞,来自成人皮肤的正常人皮肤成纤维细胞,于原代培养结束时冻存。
小牛血清、DMEM培养基、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司。
2、试验方法
2.1、细胞培养
将HDF细胞用含10%小牛血清、1%青霉素和1%链霉素的DMEM培养基于37℃、5%CO2、相对饱和湿度条件培养,2~3d传代,取对数生长期细胞进行试验。
2.2、Westernblot法测定弹性蛋白(Elasticin)的含量
取对数生长期HDF细胞,消化制成细胞悬液,接种于6孔板中,每孔2×105个细胞,在 37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养;24h后,多糖组更换为含有20、40μg/mL金缕梅多糖JZ-A、JZ-B的完全培养基,对照组更换为含有等体积溶媒的完全培养基,各设3个复孔,继续培养72h后,弃去上清液,PBS洗涤收集细胞,裂解,BCA法测定蛋白浓度,取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳,浓缩胶80V、30min,分离胶90min,将凝胶湿转到PVDF膜,5%脱脂牛奶常温封闭2h,4℃下一抗Elasticin、GAPDH孵育过夜,PBST洗膜3次,每次约15min,取相应的二抗常温孵育1.5h,PBST洗膜3次,每次15min,PVDF膜采用碧云天ECL发光液,用发光仪进行显影,拍照分析。
3、试验结果
Western blot结果如图2所示,与对照组相比,JZ-B组弹性蛋白含量显著升高,且具有明显的剂量效应;与对照组相比,JZ-A组弹性蛋白含量升高均不明显,说明金缕梅多糖JZ-B 可以有效提高HDF细胞中弹性蛋白的含量,金缕梅多糖JZ-A未检测到该活性。
Elasticin是一种直接关系到皮肤弹性的蛋白,人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量的高低直接关系到人皮肤的弹性,Elasticin蛋白含量高的皮肤不易产生皱纹、不易松弛。上述试验结果说明,金缕梅多糖JZ-B可以有效提高人皮肤成纤维细胞中Elasticin蛋白含量,具有提高人皮肤弹性的作用。
Claims (3)
1.一种天然成分,其特征在于,通过如下步骤制备:
于花季收集金缕梅科金缕梅HamamelismollisOliv.的花瓣,洗净后于阴凉处风干,粉碎备用;取适量金缕梅花瓣,按照料液比1kg:10L用无水乙醇热回流提取2.5h×3次脱脂脱色,过滤收集固体并挥干溶剂,按照料液比1kg:5L用纯净水80℃加热提取2.5h×3次,合并水提液,离心取上清液,减压浓缩至原体积的1/5,再加入4倍体积无水乙醇醇沉,收集沉淀得到粗多糖;
将粗多糖用纯净水配制成质量分数为3%的粗多糖水溶液进行Sevag法脱蛋白,具体方法为:将粗多糖水溶液与Sevag试剂按照体积比4:1混合,充分振荡,移入分液漏斗中静置0.5h,回收上层水溶液,重复多次直至观察不到明显的中间蛋白层,上层水溶液冷冻干燥得到脱蛋白粗多糖;其中,所述Sevag试剂由氯仿与正丁醇按体积比4:1混合而成;
DEAE-52柱层析:取适量脱蛋白粗多糖用纯净水配制成浓度为5mg/mL的溶液,上样于内径2.5cm、柱床高度30cm的DEAE-52纤维素层析柱中,上样体积为2.5mL,依次用0、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱,流速为2.5mL/min,每5mL收集1管,每个梯度收集20管,合并74~86管,浓缩、透析、冷冻干燥,得到多糖B;
SephadexG-100纯化:取适量多糖B用纯净水配制成浓度为5mg/mL的溶液,上样于内径2.5cm、柱床高度30cm的SephadexG-100层析柱中,上样体积为2.5mL,用0.1mol/L的NaCl溶液洗脱,流速为0.5mL/min,每2.5mL收集1管,合并4~14管,浓缩、透析、冷冻干燥,即得。
2.权利要求1所述的天然成分用于制备祛斑美白化妆品的用途。
3.权利要求1所述的天然成分用于制备增加皮肤弹性的化妆品的用途。
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