CN112472634A

CN112472634A - 一种红景天提取物、其制备方法及应用

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Publication number: CN112472634A
Application number: CN201910743375.XA
Authority: CN
Inventors: 魏茂林; 李亨载; 陈超; 金恩智
Original assignee: Shanghai Ruidian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Ruidian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2021-03-12

Abstract

本发明提供一种红景天提取物、其制备方法及其应用，所述红景天发酵提取物为将德氏乳杆菌、红景天根的粉末、培养基混合发酵而得的发酵液经灭菌后，以乙醇等溶液提取获得红景天发酵初提物；离心过滤后获得红景天提取物；所述提取溶液的体积浓度为30‑80％。本发明制备工艺获得的红景天发酵提取物，其酪醇含量、美白抗氧化功效及ATP产活能力显著提升，且制备方便，成本较低，可以直接添加到化妆品中。

Description

一种红景天提取物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种化妆品原料，具体的涉及一种中草药提取物及制备方法。

背景技术

近些年来，红景天提取物具有抗肿瘤、抗衰、抗菌、抗氧化、抗疲劳等作用，能有效的增强机体免疫功能(谢朝晖2018年8月7日，申请的中国专利“一种保湿抗辐射美白护肤品及其制备方法”，专利公开号CN 108635308A)，其中红景天苷及红景天苷苷元酪醇，可通过改善自由基代谢提升机体抗老能力，提高二倍体细胞中SOD活性，降低脂质过氧化物LPO含量，延缓细胞老化，使红景天提取物在食品、医药化妆品领域得到越来越多的应用，红景天(学名：Rhodiola rosea L.)，多年生草本植物，我国各地均有分布。

然从目前的研究中可以发现，红景天在化妆品领域的应用仍存在一定的缺陷。如红景天提取物中活性成分含量较低，大大增加了提取成本，或者通过多种混合物复配才能表现一定效果。红景天发酵方面，单纯以红景天为原料进行的发酵工艺研究，以及发酵产物提取物在化妆品方面的应用研究则较少，且微生物发酵剂种类繁多(洪喜道等2014年9月10日申请的专利“利用吸附剂的红景天发酵物的制造方法”；专利公开号CN103131730B)，发酵条件各异，大大限制了红景天在美白、抗衰及抗氧化领域的应用。北京工商大学,上海仪玳化妆品有限公司2016年8月24日申请的中国专利“一种红景天发酵原浆化妆品及其制备方法”，专利公告号CN104257545B，采用酵母菌对红景天根进行全植物发酵，保留了植物的全部功效成分及其活性，产品中富含红景天苷、熊果苷等具有抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性，黑色素抑制能力较低。

因此，本领域迫切需要开发出天然的、具有较高含量活性物的美白抗氧化功效的红景天提取物及制备工艺。

发明内容

本发明的目的就是提供一种活性物含量较高的美白抗氧化高效的红景天提取物及制备方法和应用。

本发明提供了一种利用红景天发酵生产化妆品原料的方法。本发明所具有的优点是本发明采用德氏乳杆菌对红景天进行发酵，提取物中酪醇含量显著提升，其美白抗氧化及ATP产活能力显著提升，其制作流程工艺简洁，成本较低。本提取物可直接用于添加到化妆品中。本发明还提供了该红景天提取物及其应用。

本发明第一方面，提供了一种红景天提取物，所述红景天提取物为将德氏乳杆菌、红景天根的粉末、培养基混合发酵而得的发酵液经灭菌后，以乙醇、甲醇、丙酮、丁二醇或戊二醇溶液提取获得红景天发酵初提物；离心、过滤后获得红景天提取物；所述提取溶液的体积浓度为30-80％。

上述红景天为高山红景天(R.sachalinensis),大花红景天(R.crenulata)，四裂红景天(R.quadrifida)，云南红景天(R.yunnanensis)，小丛红景天(R.dumulosa),深红红景天(R.eoccinea),狭叶红景天(R.kirilowii),大紫红景天(R.atropupurea)，长园红景天(R.sorrestii)，紫绿红景天(R.purpureoviridis)，长鞭红景天(R.fastigata)中的一种或者两种以上。

上述红景天为大花红景天。

上述提取溶液为乙醇，所述乙醇的体积浓度为50-80％。

上述培养基为MRS肉汤，所述菌种先接种到少量MRS肉汤培养液中培养2-4天。

上述菌种和接种的液体培养基质量比为(0.5-1):100，发酵时培养液淹没红景天根的粉末。

上述红景天根的粉末质量与培养基质量之比为1:(2-3)。

上述红景天发酵时间为36-120h。

上述发酵时间为48-96h。

上述红景天提取物的制备方法包括步骤：

(1)德式乳杆菌加入到MRS肉汤培养基中进行菌种培养获得菌种培养液；

(2)菌种培养液加入到已灭菌的红景天粉末中发酵，发酵完成后进行灭菌；

(3)使用乙醇、丙酮或甲醇溶液对发酵液进行提取得到红景天发酵初提物，浓缩、离心、过滤后得到红景天提取物。

上述步骤(1)中菌种37℃±3℃条件下培养2-4天，菌种与接种的培养液的质量比为0.5-1:100。

上述步骤(2)中红景天粉末：培养基：菌种培养液的质量比为1:(2-3):0.5。在具体实施例中，所述培养基为MRS肉汤粉末调配好的液体培养基，本发明中MRS肉汤培养基和MRS肉汤培养液可以互换使用。

本发明中菌种培养液指将德式乳杆菌加入到少量MRS肉汤培养液中培养2-4天后获得的培养液，也可称为菌液，菌种培养液和菌液两者可以互换使用。较佳的，菌种与MRS肉汤培养液质量比为(0.5-1):100。

上述步骤(3)中提取溶液为乙醇，所述乙醇浓度为50-80％。

上述红景天提取物的制备方法包括步骤：

(11)德式乳杆菌加入到MRS肉汤培养基中进行菌种培养获得菌种培养液；

(21)将菌种培养液加入到已灭菌的红景天粉末中，再加入MRS肉汤培养基以淹没红景天粉末进行发酵，发酵完成后进行灭菌；

(31)使用丁二醇或戊二醇溶液对发酵液进行提取得到红景天发酵初提物，离心和过滤后得到红景天提取物。

上述步骤(31)中，离心条件：5000rpm，20min；过滤条件：用5C滤纸过滤。

上述红景天粉末及培养基均需灭菌后发酵。

本发明第二方面提供上述红景天提取物在制备化妆品中的应用。

上述化妆品用于美白、清除自由基或提升ATP产活能力的一种以上功能。

本发明第三方面提供一种化妆品，所述化妆品以上述红景天提取物为有效成分。

上述化妆品为具有美白、清除自由基或提升ATP产活能力中一种以上功能的产品。

本发明中，以红景天为原料，以德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)为微生物发酵剂进行发酵的制备工艺，并选用相比于已有(金元宝等2018年10月19日申请的中国专利“一种抗氧化的复合中药提取分离物及其制备方法”，专利公开号CN 108671067A；卜俊超2018年11月20日申请的中国专利“一种含有红景天提取物的祛皱精华液的制备方法”,专利公开号CN 108836909A)更为简便的活性物提取工艺，其中制备工艺参数明确，所制备的发酵红景天产物提取物酪醇的含量显著增加，红景天提取物的黑色素抑制能力相比已有提取物(李萌等2016年8月24日申请的中国专利“一种红景天发酵原浆化妆品及其制备方法”，专利公告号CN104257545B)，DPPH清除自由基能力，及ATP产活能力均得到显著提升。

因此，本发明的有益效果是：本发明制备工艺简单方便，成本较低，获得的红景天发酵提取物(即本发明中红景天提取物)，其酪醇含量、美白抗氧化功效及ATP产活能力显著提升，而且制备得到的红景天提取物可以直接添加到化妆品中作为有效成使用。

附图说明

图1为不同红景天提取物成分图。

图2为红景天发酵提取物制备工艺流程图。

图3为红景天发酵提取物制备工艺流程图。

具体实施方式

以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。

实施例1红景天发酵方法和功能测定方法

1材料与方法

材料名称	购买厂家
		德氏乳杆菌冻干粉	上海复祥生物科技有限公司
大花红景天(原产地四川)	河北金叶子药业有限公司
		MRSBroth培养基	杭州百思生物科技有限公司
SK-MEL-2(人皮肤恶性黑色素瘤)细胞	上海奥陆生物科技有限公司
		B16F10(小鼠黑色素瘤)细胞	上海晶抗生物工程有限公司
BYJC0090超微量ATP酶测试盒	上海恪敏生物科技有限公司
		人皮肤成纤维细胞	上海信裕生物科技有限公司

1.1，大花红景天用粉碎机研磨成粉末(20-80目)，经高压灭菌后待用，灭菌条件：121℃，30min。

1.2，培养基制备：取MRS肉汤49.25g，加入蒸馏水1L,搅拌加热至完全溶解，校正pH＝6.2±0.2℃，121℃高压灭菌30min。

1.3，德氏乳杆菌菌种培养及浓度要求:

购买的菌种适量(0.5g-1g)加入到灭菌完成的MRS肉汤培养基中，37℃±3℃，培养2-4天，培养完成条件以吸光度值为参照，吸光度测定条件：测定波长λ＝600nm，以灭菌后MRS肉汤(未加入菌种)为空白样，以加入德氏乳杆菌培养2-4天的MRS肉汤为测定样，测定样吸光度OD＝1时为最佳，此时的菌种用量及灭菌MRS肉汤用量最佳，菌种与接种的MRS肉汤培养基的质量比为(0.5-1):100，大花红景天粉末：培养基：菌种培养液在1：2：0.5的条件下刚好，淹没原料，利于发酵。发酵过程注意观察培养基，如发现培养基液面低于原料，适当补充液体培养基，本发明控制大花红景天粉末：培养基：菌种培养液在1:(2-3):0.5的比例内。一般为隔天适当补液，及1，3，5天时适当补液。

1.4，红景天发酵培养条件

培养温度：37℃±3℃；培养时间：0-5天，测定不同发酵时间内活性物质的含量。发酵完成后，对不同发酵时间的红景天进行灭菌操作，灭菌条件：121℃，30min。(此培养基发酵条件完成后，进行灭菌，无滤液产出，需用70％乙醇将活性成分提取出来，并不局限于70％的乙醇)。通常可以28-40℃发酵。

1.5，红景天发酵物提取工艺

可以采用30-80％乙醇提取，也可以采用丁二醇，丙酮，丁二醇，戊二醇或甲醇溶液提取，优选50-80％乙醇作为提取溶液，本发明实施例中以70％(体积比)的酒精，对已灭菌的红景天发酵物进行提取，提取时间3h，进一步浓缩去除酒精得到发酵红景天提取物至浓度0.33g/g。(即浓缩液为红景天发酵提取物，每g原材料可得3g发酵红景天提取液，70％的乙醇，去除乙醇后仍有部分去离子水，提取物呈现为液态溶液，便于直接添加到水剂和乳液中)

其中采用乙醇，丙酮，甲醇作为提取溶剂时制备流程如附图2所示工艺。采用丁二醇，戊二醇为提取溶剂时，制备流程如附图3所示工艺。优选乙醇。

1.6，高效液相色谱检测条件

高效液相色谱法(安捷伦2100系列)；色谱柱：Zorbax C18色谱柱，柱温：30℃，进样量：5ul。流量：1ml/min，检测器：紫外线检测器，214nm，溶剂：甲醇:水＝2:8。

1.7，红景天发酵产物提取物美白功效测定

以人皮恶性黑色素瘤黑色素抑制率与小鼠黑色素瘤黑色素抑制率为参照标准。

黑色素生成抑制实验：SK-MEL-2(人皮肤恶性黑色素瘤)和B16F10(小鼠黑色素瘤)细胞，放进6孔孔板里各1×10⁵/孔的浓度接种，在37℃，5％CO₂恒温箱里培养24小时。每次实验取自同一传代细胞，细胞接种12h后，添加一定浓度梯度的红景天发酵产物提取物，培养24h后用于后续，用磷酸缓冲盐洗涤细胞后用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，回收的细胞在4℃，12000rpm分离10分钟，去掉上清液后，在65℃条件下干燥1小时。添加1mol/L NaOH水溶液，在65℃条件下反应1小时，在96孔板里各放入溶菌产物,各100ul，采用ELISA reader测试490nm的吸光值，得到细胞内的黑色度。

1.8，黑色素含量抑制率计算：以空白对照组抑制率T_control＝0，T_抑制率＝(C_control-C_抑制物)/C_control，其中C_提取物表示添加提取物后细胞生成的黑色素含量；C_control表示空白对照组的细胞黑色素含量。

1.9，红景天发酵产物提取物ATP产活能力测定

ATP酶测试盒法，对照组，Coenzyme Q10(辅酶10)，将人皮肤成纤维细胞(HDF)，以7x10⁵细胞/孔浓度注入6孔板里，以37℃，5％CO₂恒温条件下培养24小时。用不含血清的培养基，将稀释到适量浓度的ATP产活促进剂注入各孔3ml后培养48小时。200μmol/L H₂O₂处理1小时，用PBS洗涤细胞，将配置显色反应试剂与待测培养细胞混合，避光条件下反应15分钟，测吸光值。

实施例2对比例的功能测定

2.1：红景天苷及酪醇含量的测定

未发酵红景天提取物(对比例)，加入甲醇溶液(色谱级)后配置不同梯度溶液，用0.2μm滤膜过滤后使用。以红景天苷及酪醇纯品分别加入甲醇溶液(色谱级)配置不同梯度溶液，建立标准曲线，参照实施例1中1.6的步骤测定未发酵红景天提取物中红景天苷及酪醇含量。

2.2：黑色素测定

按照实施例1中1.7的步骤进行人体恶性黑色素瘤细胞的黑色素测定及小鼠黑色素瘤细胞得黑色素测定，以未经发酵的红景天提取物配置不同浓度测定人体恶性黑色素瘤细胞的黑色素及小鼠黑色素瘤细胞的黑色素。

2.3：对细胞ATP产活能力的影响的测定

按照实施例1中1.8的步骤，以未经发酵的红景天提取物配置不同浓度测定对细胞ATP产活能力的影响。

实施例3各种不同条件下红景天的发酵和提取

按照实施例1的步骤进行红景天发酵产物提取物的制备，红景天粉碎后加入到灭菌后的液体培养基中，并接种培养好的德氏乳杆菌，比例为红景天粉末：液体培养基:菌液＝1:2-3:0.5。培养温度设定为37±3℃，以70％的乙醇为提取溶剂，提取时间3h，具体步骤见图2，浓缩、离心后获得上清液，再5C滤纸过滤得到的滤液即为红景天发酵产物提取物。发酵培养时间和条件不同，如下表所示：

本发明提取物	发酵培养时间	红景天粉末：培养基:菌液
			1	1天	1:2:0.5
2	2天	1:2.5:0.5
			3	3天	1:2.5:0.5
4	4天	1:3:0.5
			5	5天	1:3:0.5

实施例4发酵红景天提取物中红景天苷和酪醇含量的测定

4.1测定结果

参照实施例1中1.6的步骤测定不同红景天提取物中红景天苷和酪醇含量。结果如表2所示：

表2红景天提取物红景天苷及酪醇测定

提取物	发酵条件	红景天苷(ppm)	酪醇含量(ppm)
				对比例	未发酵	25183	2411
1	发酵1天	22371	3091
				2	发酵2天	18743	7190
3	发酵3天	13166	11740
				4	发酵4天	13210	11005
5	发酵5天	13659	10705

4.2红景天发酵提取物红景天苷含量分析

提取物1-5中，参照对比例数据可以发现，红景天发酵过程中，在1-3天内，红景天苷含量显著下降，在发酵三天基本达到平衡值。与此同时，作为红景天苷苷元的酪醇含量呈现出随着发酵天数的增加，含量显著提升。由图1趋势可见，在3至4天后到达最大值。其中与对比例相比较，提取物3中，红景天苷含量降为对比例的52.28％；提取物1中，红景天苷含量降为对比例的88.83％。

4.3红景天发酵提取物中酪醇含量的分析

提取物1-5中，参照对比例数据可以发现，酪醇含量在发酵3天时达到峰值，其中提取物3中酪醇含量，为对比例的487％，继续发酵为提取物4，此时提取物4酪醇含量为实施例3的93.74％；酪醇为抗氧化剂，可有效地保护细胞免受氧化地破坏。从红景天苷的下降趋势及酪醇含量的显著提升，初步可得到在发酵2-5天酪醇含量均提升了约3倍以上，2-4天内的酪醇含量为优化区间。

实施例5：发酵红景天提取物美白功能的评价

5.1发酵红景天提取物对美白功能的实验数据

参照实施例1中1.7的步骤测定不同红景天提取物对人体恶性黑色素瘤细胞黑色素影响，具体数据如表3所示。

表3红景天提取物的美白功效测定

5.2美白功效实验测定结果分析

以空白对照组抑制率T_control＝0，T抑制率＝(C_control-C_抑制物)/C_control×100％

由表3可知红景天发酵提取物对人皮恶性黑色素瘤黑色素的影响。

对比例：黑色素抑制率50(μg/mL)T对比例＝(C_control-C_对比例)/C_control＝(271-264.88)/271×100％＝2.26％

提取物1：黑色素抑制率50(μg/mL)T₁＝(C_control-C₁)/C_control＝(271-240.01)/271×100％＝11.44％

提取物2：黑色素抑制率50(μg/mL)T₂＝(C_control-C₂/C_control＝(271-185.39)/271×100％＝31.59％，提取物2抑制率相对比例有显著的提升。且提取物2黑色素抑制率50(μg/mL)条件下能达到熊果苷50(μM)相当水平：13.61μg/mL T_熊果苷＝(C_control-C_熊果苷)/C_control＝(271-180.52)/271×100％＝33.339％，相当于50(μg/mL)条件下，每μg/mL T₂≈0.25(μg/mL)T_熊果苷，结果显著优于CN104257545B中发酵红景天的制备后的数据(说明书第6页0060小节)。考虑到时间及其他成本，提取物2至4区间较佳，提取物3时，红景天发酵3天为最佳，优化区间为2-4天红景天发酵提取物。

实施例6：发酵红景天提取物对ATP产活能力的评价

6.1ATP产活能力的测定结果

参照实施例1中1.9的步骤测定不同红景天提取物对细胞ATP产活能力的影响，具体结果见表4。

表4红景天发酵提取物ATP产活能力测定数据

6.2红景天发酵提取物ATP产活能力测试

提取物2-4中，ATP浓度在红景天发酵3天后达到稳定值。提取物3中，红景天发酵提取物在100(μg/mL)浓度时，ATP产活能力优于25(μg/mL)的辅酶Q10。

即ATP红景天发酵三天提取物100(μg/mL)＝94.0/90.6＝1.04辅酶Q1025(μg/mL)，可见红景天发酵提取物能显著提高ATP产活能力。

此外，应理解，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围和实质的情况下，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同替换。

Claims

1.一种红景天提取物，其特征在于，所述红景天提取物为将德氏乳杆菌、红景天根的粉末、培养基混合发酵而得的发酵液经灭菌后，以乙醇、甲醇、丙酮、丁二醇或戊二醇提取获得红景天发酵初提物；经离心、过滤后获得红景天提取物；所述乙醇的体积浓度为30-80％。

2.如权利要求2所述红景天提取物，其特征在于，所述红景天为高山红景天,大花红景天，四裂红景天，云南红景天，小丛红景天,深红红景天,狭叶红景天,大紫红景天，长园红景天，紫绿红景天，长鞭红景天中的一种或者两种以上。

3.如权利要求1所述红景天提取物，其特征在于，所述红景天为大花红景天。

4.如权利要求1所述红景天提取物，其特征在于，所述提取溶液为乙醇，所述乙醇的体积浓度为50-80％。

5.如权利要求1-4任一权利要求所述红景天提取物，其特征在于，所述培养基为MRS肉汤，所述菌种先接种到MRS肉汤培养液中培养2-4天获得菌种培养液后，与红景天根的粉末、培养基混合发酵。

6.如权利要求5所述红景天提取物，其特征在于，所述菌种和接种的培养液质量比为0.5-1:100，发酵时培养基淹没红景天根的粉末。

7.如权利要求6所述红景天提取物，其特征在于，所述红景天根的粉末、培养基与菌种培养液质量之比为1:(2-3):0.5。

8.如权利要求6所述红景天提取物，其特征在于，所述红景天发酵时间为36-120h。

9.如权利要求7所述红景天提取物，其特征在于，所述发酵时间为48-96h。

10.如权利要求1所述红景天提取物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)德式乳杆菌加入到MRS肉汤培养液中进行菌种培养获得菌种培养液；

(2)将菌种培养液加入到已灭菌的红景天粉末中，再加入MRS肉汤培养基以淹没红景天粉末进行发酵，发酵完成后进行灭菌；

(3)使用乙醇、丙酮或甲醇溶液对发酵液进行提取得到红景天发酵初提物，浓缩后离心、过滤得到红景天提取物。

11.如权利要求10所述红景天提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中菌种37℃±3℃条件下培养2-4天，菌种与接种的培养液的质量比为0.5-1:100。

12.如权利要求11所述红景天提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中红景天粉末：培养基：菌种培养液的质量比为1:(2-3):0.5。

13.如权利要求11所述红景天提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述提取溶液为乙醇，所述乙醇浓度为50-80％。

14.如权利要求1所述红景天提取物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(21)将菌种培养液加入到已灭菌的红景天粉末中，再加入MRS肉汤培养液以淹没红景天粉末进行发酵，发酵完成后进行灭菌；

15.如权利要求14所述红景天提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(31)中，离心条件：5000rpm，20min；过滤条件：用5C滤纸过滤。

16.如权利要求1-4、6-9任一权利要求所述红景天提取物在制备化妆品中的应用。

17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述化妆品用于美白、清除自由基或提升ATP产活能力的一种以上功能。

18.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品以权利要求1-4、6-9任一权利要求所述红景天提取物为有效成分。

19.如权利要求18所述化妆品，其特征在于，所述化妆品为具有美白、清除自由基或提升ATP产活能力中一种以上功能的产品。