CN103131730A - 利用吸附剂的红景天发酵物的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用吸附剂的红景天发酵物的制造方法。本发明涉及包括以下步骤的红景天发酵物的制造方法，上述步骤包括：为了制造红景天发酵物，在用选自酸性白土、膨润土、硅藻土、活性炭及弱碱性阴离子交换树脂中的一种以上的吸附剂处理红景天提取物而得到的滤液中接种乳酸菌进行发酵。通过本发明的方法制造的红景天发酵物中的有利于人体吸收的红景天苷苷元的含量高，因此可作为新型健康功能食品或药品的有效成分而应用。
Description
技术领域
本发明涉及红景天发酵物的制造方法。尤其涉及利用吸附剂制造红景天发酵物的方法，所制造的红景天发酵物能够作为普通食品、功能性食品、药品或化妆品的原料来应用。
背景技术
红景天（rhodiola rosea）是广发分布生长在欧洲和亚洲高山地带的植物，是对刺激神经系统、减少抑郁症、提高作业能力、恢复疲劳以及预防高山病等有效的传统药物，在东欧和亚洲有很长的使用历史。尤其是，作为多在长白山海拔1800m～2300m之间的长有苔藓的原始森林中的白桦林和峡谷的岩石缝生长的多年生草本植物，具有在温差大、干燥、缺氧和紫外线强的高山地带的环境中也能生长的特殊的适应力，因此还称为高山景天或高山红景天等。
红景天的主要成分有红景天苷（Salidroside）、酪醇（Tyrosol）及配糖体，除此之外还包含淀粉、蛋白质、脂肪、糖类、黄酮类化合物、氨基酸、无机元素、微量的精油等。对红景天的现代研究是从19世纪50年代开始的。已知具有一部分优于人参的药理作用，被证明为完全不具有人参所具有的副作用的新药物，因此，近来在国内外受到广泛关注。
已报道红景天的主要功能有恢复元气、长寿、预防肌无力、恢复疲劳等。近来在人们的关注中，对红景天的效果进行了活跃的研究，特别是其作为红景天酒、口服药
胶囊、茶、口香糖、糖等30多种各种健康功能食品或药品的原料的价值得到了认可，因此对其产品的开发进一步增加。
纵观以往有关红景天提取物的授权专利技术，有含有红景天提取物的血中酒精浓度降低用组合物（韩国专利第10-0179087号），含有红景天提取物的糖尿病预防及治疗用组合物（韩国专利第10-0179088号）、具有循环器官疾病的预防及治疗功能的红景天提取物（韩国专利第10-0265385号）、含有高山红景天提取物的肝纤维化抑制组合物（韩国专利第10-0316790号）、含有红景天根提取物的免疫功能强化剂组合物（韩国专利第10-0386809号）、含有红景天提取物的美白组合物（韩国专利第10-0445404号）、含有红景天提取物的病毒性疾病的预防及治疗用组合物（韩国专利第10-999872号）等。但是，上述专利均对红景天提取物本身或将此进行分馏之后的馏分的功能进行了确认，并未公开将已知为红景天有效成分之一的红景天苷从配糖体生物转化为苷元而使之有利于人体吸收的方法。
本发明的发明人在为了生物转化成有利于被人体吸收的红景天苷的苷元而对红景天乳酸菌发酵物的制造方法进行研究的过程中，发现将几乎不进行单独发酵的红景天提取物用特定吸附剂处理时，能够进行乳酸菌发酵，从而提高红景天苷的苷元的含量比例，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供难于单独进行发酵的红景天的发酵方法，从而提供有利于人体吸收的红景天苷的苷元的含量高的红景天发酵物。
本发明提供一种红景天发酵物的制造方法，其中，包括：用选自酸性白土、膨润土、硅藻土、活性炭及弱碱性阴离子交换树脂中的一种以上的吸附剂处理红景天提取物的步骤；以及在未吸附于上述吸附剂的滤液中接种乳酸菌进行发酵的步骤。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，上述吸附剂为酸性白土或膨润土。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，上述弱碱性阴离子交换树脂为Dowex MWA-1。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，相对于上述红景天提取物100重量份，混合5～60重量份的吸附剂。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，上述红景天提取物的固体成分含量为0.1～10重量%。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，上述乳酸菌为选自乳酸杆菌属乳酸菌、双歧杆菌属乳酸菌及片球菌属乳酸菌中的一种以上的乳酸菌。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，上述乳酸菌为选自嗜酸乳杆菌[KCTC 2182]、长双歧杆菌[ATCC 15707]、短双歧杆菌[ATCC 15700]及戊糖片球菌[KCCM 11088P]中的一种以上的乳酸菌。
本发明的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，上述进行发酵的步骤在25～40℃进行24～96小时。
本发明提供一种红景天发酵物，其特征在于，是在用选自酸性白土、膨润土、硅藻土、活性炭及弱碱性阴离子交换树脂中的一种以上的吸附剂处理红景天提取物而得到的滤液中接种乳酸菌进行发酵的发酵物，在红景天苷配糖体和苷元的合计100重量份中，苷元的含量为30～100重量份。
本发明提供含有上述红景天发酵物的食品组合物。
本发明提供难以单独发酵的红景天的发酵方法，另外，通过本发明的方法制造的红景天发酵物的有利于人体吸收的红景天苷苷元的含量高，因此可作为新型普通食品、健康功能食品、药品或化妆品的的原料来应用。
附图说明
图1是本发明的制造例、实施例及比较例中使用的红景天的照片。
图2a、2b、2c以及2d分别是表示在实验例1中红景天提取物固体成分含量为0.5重量%、1重量%、3重量%以及5重量%时，根据乳酸菌种类及培养时间的pH变化的图表。
图3是表示在实验例2中将根据酸性白土或膨润土处理量的红景天提取物吸附48小时后测定的滤液的pH的图表。
图4是在未用吸附剂处理的红景天提取物（●）、红景天提取物的酸性白土吸附滤液（○）、红景天提取物的Dowex MWA-1吸附滤液
红景天提取物的膨润土吸附滤液(△)中接种乳酸菌进行发酵后，确认根据发酵时间的菌数变化的图表。
图5是实验例3的红景天苷及其苷元的标准品、红景天提取物（Con）、酸性白土吸附滤液（1B）、酸性白土吸附滤液的发酵物（1A）、Dowex MWA-1吸附滤液（2B）、Dowex MWA-1吸附滤液的发酵物（2A）、Diaion HP-2MG吸附滤液（3B）、Diaion HP-2MG酸性白土吸附滤液的发酵物（3A）、膨润土吸附滤液（4B）、膨润土吸附滤液的发酵物(4A)的TLC分析结果照片。
图6a、6b、6c及6d分别是实验例3的红景天苷及其苷元的标准品的HPLC图谱、用酸性白土吸附处理之前的红景天提取物的图谱、用酸性白土吸附处理的红景天提取物滤液的图谱、用酸性白土吸附处理的红景天提取物滤液发酵48小时后的发酵物的图谱。
图7是将实验例3的红景天提取物（Con）、酸性白土吸附滤液（1B）、酸性白土吸附滤液的发酵物（1A）、Dowex MWA-1吸附滤液（2B）、Dowex MWA-1吸附滤液的发酵物（2A）、Diaion HP-2MG吸附滤液（3B）、Diaion HP-2MG酸性白土吸附滤液的发酵物（3A）、膨润土吸附滤液（4B）、膨润土吸附滤液的发酵物(4A)的红景天苷及红景天苷苷元的含量进行比较而显示的图表。
具体实施方式
本发明涉及红景天发酵物的制造方法，该方法包括：用选自酸性白土、膨润土、硅藻土、活性炭及弱碱性阴离子交换树脂中的一种以上的吸附剂处理的步骤；以及在未吸附于上述吸附剂的滤液中接种乳酸菌进行发酵的步骤。
在本发明中，酸性白土（Fuller’s Earth,Acid clay）是蒙脱石(montmorillonite)系粘土矿物，是胶体含水硅酸铝，是淡黄色的微细粉末。将本发明的酸性白土1g加入到50ml水中进行混悬后，过滤而得到的液体的pH值为3～5。
另外，膨润土与酸性白土一样是蒙脱石(montmorillonite)系粘土矿物，是胶体含水硅酸铝。
从吸附剂处理后收率高、能够将抑制乳酸菌生长的物质吸附而使红景天的发酵得以进行的方面考虑，优选上述酸性白土及膨润土。这种红景天提取物的发酵特性不是所有的吸附剂都能够改善，活性白土、沸石、氧化铝完全不改善发酵特性。
此外，硅藻土（Diatomite）是由硅藻（diatom）或单细胞植物的保护被膜（硅酸质外皮）构成的物质。就硅藻土而言，吸附剂处理后的收率非常高，但是使红景天发酵的发酵特性稍低于酸性白土或膨润土。
此外，活性炭（Activated carbon）是将木屑、木片、椰子树皮的植物性纤维质、或者褐煤或石油等含碳物质进行碳化后活化而得到的。活性炭与上述酸性白土或膨润土相比，吸附剂处理收率低，使红景天发酵的发酵特性与酸性白土或膨润土相比稍低。
此外，弱碱性阴离子交换树脂是交换阴离子的离子交换树脂，是在3维缩聚的高分子母体中结合1至3元胺而得到的。弱碱性阴离子交换树脂的使红景天发酵的发酵特性优秀，但是与酸性白土或膨润土相比，吸附剂处理收率低。弱碱性阴离子交换树脂可以使用例如Dowex MWA-1或者Diaion HP-2MG。相反，即使使用阳离子交换树脂例如Amberlite IRC-50或Amberlite XAD-4等吸附红景天提取物，也完全无法改善红景天提取物的发酵特性。
在本发明中，用吸附剂处理上述红景天提取物时，相对于上述红景天提取物100重量份，混合5～60重量份的吸附剂，优选混合20～50重量份的吸附剂，更优选混合25～40重量份。如果吸附剂的含量超过上述上限值，吸附剂的量过多而无法使红景天提取物与吸附剂均匀混合，不容易分离红景天提取物滤液，收率也降低。此外，吸收剂的比例不足上述下限值时，不能充分吸附抑制乳酸菌发酵的物质，因此发酵无法充分进行。
在本发明中，不需要对吸附剂处理时间或温度特别进行限定，处理时间为12小时以上，优选为24小时以上，更优选为36～54小时。即用吸附剂处理上述上限值以上的时间，也不能进一步改善发酵特性，如果不足上述下限值，抑制乳酸菌发酵的物质吸附不充分，而发酵无法充分进行。处理温度可以为5～40℃，也可以在更高的温度中进行处理，但是通过加热无法增加吸附效率。
在本发明的上述红景天和红参的混合提取物中，红景天的固体成分含量为0.1～10重量%，优选为0.2～5重量%，更优选为0.3～1重量%，超过上述上限值时，即使通过吸附剂也无法充分进行乳酸菌的增殖及发酵；如果不足上述下限值，源自红景天的有效成分含量减少，制造收率低而没有效率。
本发明的红景天发酵物的制造中，可以使用选自乳酸杆菌属乳酸菌、双歧杆菌属乳酸菌及片球菌属乳酸菌中的一种以上的乳酸菌。优选上述乳酸菌为嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌或戊糖片球菌，更优选选自在韩国食品研究院保藏中的嗜酸乳杆菌[KCTC 2182]、长双歧杆菌[ATCC 15707]、短双歧杆菌[ATCC 15700]及戊糖片球菌[KCCM11088P]中的一种以上的乳酸菌，最优选嗜酸乳杆菌[KCTC 2182]、长双歧杆菌[ATCC15707]。
本发明的红景天发酵物的制造方法的进行发酵的步骤在25～40℃进行24～96小时。
对于通过上述方法制造的红景天发酵物，在红景天苷配糖体和苷元的合计100重量份中，苷元的含量为30～100重量份，优选为50～100重量份，更优选为70～100重量份，与红景天提取物相比，含有更多有利于人体吸收的苷元，能够进一步提高红景天固有的功能。
例如，本发明的红景天发酵物显示抗氧化效果，抑制肌细胞的氧化应激，具有提高运动能力的活性，因此可以制造出将在红景天和红参的混合提取物中接种乳酸菌进行发酵而得到的发酵物作为有效成分的食品组合物。上述食品组合物可以是作为有效成分含有红景天发酵物的恢复疲劳及提高运动能力的健康功能食品。
在本发明中，健康功能食品是指将上述红景天发酵物添加到饮料、茶类、香料、口香糖、饼干类等的食品原料中，或者制造成胶囊、粉末、混悬液等的食品，意味着人体将其摄取后能够为健康带来特定效果，与普通药品不同，是以食品为原料，因此具有不会产生长期服用药品时发生的副作用等的优点。如上进行而得到的本发明的健康功能食品由于能够日常摄取，因此非常有用。在上述健康功能食品中，红景天发酵物的添加量根据作为对象的健康功能食品的种类而不同，无法进行统一的规定，但是在不影响食品原来的口味的范围内添加即可，相对于对象食品，通常为0.01～50重量%，优选为0.1～20重量%的范围。另外，如果是丸剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态的健康功能食品时，通常在0.1～100重量%、优选为0.5～80重量%的范围进行添加即可。在一具体实施方式中，本发明的健康功能食品可以是丸剂、片剂、胶囊剂或饮料的形态。
本发明的健康功能食品除了作为有效成分的红景天发酵物之外，还可以含有制造食品时通常添加的成分，例如含有蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂以及香味剂。上述碳水化合物的例子有例如葡萄糖、果糖等单糖；例如麦芽糖、蔗糖、寡糖等双糖；以及例如糊精、环糊精等多糖等通常的糖；以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。香味剂可以使用天然香味剂[索马甜、甜菊叶提取物（例如，莱鲍迪苷A、甘草甜素等）]以及合成香味剂（糖精、阿斯巴甜等）。例如，本发明的健康功能食品制造成饮剂
和饮料时，除了本发明的红景天发酵物之外，还可以进一步含有枸橼酸、液状果糖、白糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁以及各种植物提取液等。
此外，还可以制造以上述红景天发酵物为有效成分的本发明的用于抗疲劳及运动障碍治疗及预防的药物组合物
另一方面，在本说明书中用语“作为有效成分含有”是指含有用于达到本发明的红景天发酵物的效能或活性所充分的量。在本发明的一实施方式中，本发明的组合物中含有例如0.001mg/kg以上、优选为0.1mg/kg以上、更优选为10mg/kg以上、进一步优选100mg/kg以上、更进一步优选250mg/kg以上、最优选0.1g/kg以上的红景天发酵物。红景天发酵物是天然物，即使过量使用，人体也不会产生副作用，因此本发明组合物中所含有的红景天发酵物的含量的上限可以由本领域技术人员在适当范围内进行选择而实施。
本发明的药物组合物，除了上述有效成分之外，还可以使用适于药剂学并且生理学上所允许的助剂来制造，上述助剂可以使用赋形剂、崩解剂、甜味剂、结合剂、包覆剂、膨胀剂、润滑剂、滑剂
或香味剂等。
为了将上述药物组合物进行给药，除了上述记载的有效成分之外，还可以含有药学上可允许的1种以上的载体而制成制剂。
上述组合物的制剂形态可以是颗粒剂、散剂、片剂、包衣片、胶囊、栓剂、液体制剂、糖浆、汁、混悬剂、乳剂、点滴剂或可注射的液体剂等。例如，为了制成片剂或胶囊剂的形态，有效成分可以与乙醇、甘油、水等口服无毒性的药学上可允许的非活性载体结合。此外，需要或必要的情况下，可含有适合的结合剂、润滑剂、崩解剂及发色剂或它们的混合物。适合的结合剂包括淀粉、明胶、葡萄糖或β-乳糖之类的天然糖；玉米甜味剂、刺槐、黄蓍胶或油酸钠之类的天然及合成胶；硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等，但不限于此。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等，但不限于此。
作为制成液状溶液的组合物中的可允许的药物载体，可灭菌且适合生物体的载体，可以使用生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、以及这些成分中的1种以上成分的混合物。根据需要，还可以添加抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等其他通常的添加剂。另外，还可以进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂以及润滑剂，制成水溶液、混悬液、乳液等注射用剂型，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂。
进而，作为本领域的适当方法，可以利用在Remington'sPharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton PA中公开的方法，根据不同疾病或成分优选地进行制剂。
本发明的药物组合物可口服给药或非口服给药，非口服给药时，可通过静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、经皮给药等方式给药，优选口服给药。
本发明的药物组合物的适合的给药量，根据制剂方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病患状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性之类的因素而不同，一般熟练的医生能够容易的决定和开具对所期望的治疗或预防有效的给药量。根据本发明的优选实施方式，本发明的药物组合物的1日给药量为0.001～10g/kg。
本发明的药物组合物，根据本领域技术人员所能容易实施的方法，利用药学上可允许的载体和/或赋形剂进行制剂化，可制造成单位容量的形态或制造成装在大容量容器内。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、混悬液或乳化液形态，或者是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形态，还可以进一步含有分散剂或稳定剂。
以下参照下述实施例更具体地说明本发明。但下述实施例仅用于帮助理解本发明，本发明的范围并不由下述实施例所限定。
制造例1：红景天单独发酵物的制造
甲.材料
主原料红景天（Rhodiola rosea，图1）在2010年购自中国，微粉碎后，用粉碎机（CyclotecTM 1093,FOSS Co.,Denmark）进行粉末化而使用。红参使用市售的红参粉末（NH韩参人，6年根）。
本实验中使用的菌株利用了表1中所示的在韩国食品研究院中保藏的乳酸杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）及双歧杆菌属（Bifidobacterium）属的10种乳酸菌。菌株在灭菌的50%的甘油中将培养液进行混悬，并在-70℃深冷制冷器（deep freezer）中长期保存。
表1
| 区分 | 菌株名 | 使用的培养基 |
| L1 | 嗜酸乳杆菌128(Lactobacillus acidophillus 128) | MRS |
| L2 | 芽乳杆菌144(Lactobacillus plantarum 144) | MRS |
| L3 | 发酵乳杆菌164(Lactobacillus fermentum 164) | MRS |
| L4 | 弯曲乳杆菌166(Lactobacillus curvatus 166) | MRS |
| L5 | 加氏乳杆菌3162(Lactobacillus gasseri 3162) | MRS |
| L6 | 加氏乳杆菌3163(Lactobacillus gasseri 3163) | MRS |
| L7 | 嗜酸乳杆菌K-59(Lactobacillus acidophillusK-59) | MRS |
| B1 | 长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) | RCM/GAM |
| B2 | 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) | RCM/GAM |
| P0 | 戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) | MRS |
乙.红景天提取物的制造
红景天提取物是将红景天和蒸馏水一同加入到回流提取器中，然后在90℃下加热3小时而得到提取液，所得提取液在调节到4℃的离心机（Mega 17R,Hanil Science Indusrrial Co.Ltd.,韩国）中进行分离。分离的上清液用滤纸（Watman No.2）进行过滤后，将得到的滤液用作红景天提取物。
丙.红景天发酵物的制造
稀释至红景天提取物的固体成分含量为0.5重量%、1重量%、3重量%、及5重量%，然后在121℃、1.5气压下，将稀释的红景天提取物灭菌15分钟。
上述表1的乳酸菌分别利用MRS肉汤（broth）和GAM肉汤（broth），在37℃静置培养20小时而进行活化后，将乳酸菌培养液1重量%（106CFU/ml）分别接种到红景天提取物中，在37℃培养48小时，从而制造了红景天单独发酵物。
实验例1：红景天单独发酵物的发酵特性的确认
为了确认制造例1的红景天提取物单独发酵物的发酵特性，确认了接种后第24小时及第48小时的发酵物的pH值及活菌数的变化。
活菌数如下计算：将试样1ml用灭菌生理盐水9ml稀释并充分混合后，分步进行稀释，取0.1ml，乳酸杆菌（Lactobacillus）属、片球菌（Pediococcus）属涂抹到MRS琼脂，双歧杆菌（Bifidobacterium）属涂抹到含有5%马血的BL琼脂，利用厌气培养罐（BBL Gas Pak厌氧系统），尽量在厌氧状态下保存，在37℃下培养24～48小时后，测定生成的集落数，在其平均集落数乘以稀释倍数从而计算出每种培养液中的集落。
甲.根据红景天提取物固体成分含量及乳酸菌种类的pH值变化
红景天提取物固体成分含量分别为0.5重量%、1重量%、3重量%及5重量%时，根据乳酸菌种类及培养时间的pH值变化在图2a、2b、2c以及2d中分别表示。
图2a显示红景天提取物的固体成分含量为0.5重量%时，初期pH值为6.25，48小时后最终pH值减少到5.25～5.50。
图2b显示红景天提取物的固体成分含量为1重量%时，初期pH值为6.21，48小时后最终pH值为5.61～5.70，虽然与0.5重量%相比是较小的幅度，但是出现了减少。
但是，如图2c及2d中所示，红景天的浓度升至3重量%及5重量%时，初期pH值为6.15及6.13，48小时后为5.95～6.00及6.04～6.11，根据乳酸菌种类有些差异，但是可知不存在发酵前后的pH值的差异。
从上述结果可以确认红景天含量在3重量%以上时，培养时间增加也不会引起pH值的减少，红景天含量在1重量%以下时，并没有出现在通常的乳酸菌培养中所能观察到的pH值的减少。
按照乳酸菌的种类比较pH的变化，确认了嗜酸乳杆菌128（Lactobacillus acidophillus 128）（L1）、长双歧杆菌（Bifidiobacteriumlongum）（B1）、短双歧杆菌（Bifidiobacterium breve）（B2）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（P0）的pH值与其他乳酸菌菌株相比相对地大幅减少，因此被选定为适合红景天发酵物制造的菌株。
乙.根据红景天提取物固体成分含量及乳酸菌种类的活菌数变化
选择在10种乳酸菌中pH值变化相对大的4种乳酸菌（L.acidophillus 128,B.longum,B.breve,P.pentosaceus）重新进行预培养，为了观察菌株的生长能力，在固体成分含量为0.5重量%及1重量%的红景天提取物中，分别接种乳酸菌1重量%，在37℃下发酵24小时后，测定活菌数并将其结果在表2中示出。
表2
如上表1所示，将红景天提取物利用嗜酸乳杆菌128（L.acidophillus128）培养，结果活菌数反而从最初接种时的7.10*106CFU/ml，在0.5重量%时减少到1.2*103CFU/ml，在1重量%时减少到1.3*102CFU/ml。这与其他微生物比较时，虽然相对菌数略高，但是可知红景天提取物的浓度越高活菌数减少地更显著。
利用长双歧杆菌（B.longum）进行培养，结果最初活菌数为2.10*106CFU/ml，0.5重量%时为2.59*103CFU/ml，1重量%时为1.32*102CFU/ml。
利用短双歧杆菌（B.breve）培养，结果活菌数从最初接种时的1.64*106CFU/ml，0.5重量%时减少到4.40*102CFU/ml，1重量%时减少到8.95*10CFU/ml，活菌数逐渐减少。
利用戊糖片球菌（P.pentosaceus）进行发酵时，活菌数从1.50*106CFU/ml，0.5重量%时减少至2.01*102CFU/ml，1重量%时减少至1.29*10CFU/ml，显示所有乳酸菌均根据红景天的浓度依赖性地减少。
为了比较红景天和红参的乳酸菌发酵特性，按照与制造例1的红景天提取物的制造方法相同的方法制造了红参提取物，分别接种上述各个微生物，并在37℃下发酵24小时，将此时的pH值和活菌数的变化在表3中示出。
表3
根据上述表3的结果，可以确认在0.5重量%的红参提取物中分别接种乳酸菌，在37℃下发酵24小时时，pH值小于4.2，显著地减少了约2以上，而乳酸菌的活菌数反而增殖到2对数周期。与这样的红参提取物的乳酸菌发酵进行比较时，推测红景天提取物的发酵由于红景天的抗菌作用而大大抑制了乳酸菌的生长，因此利用乳酸菌或乳酸菌分泌的酶的红景天有效成分的生物转化效果在红景天单独发酵中甚微。
但是，上述表2的结果中，选择24小时培养后残存的活菌数高于其余的微生物的嗜酸乳杆菌128（Lactobacillus acidophillus 128）利用到以下实验中。
制造例2：红景天发酵物的制造
甲.红景天提取物的吸附剂处理
将红景天提取物的吸附剂处理所使用的11种吸附剂的特性及应用领域进行整理并在表4中示出。
表4
在制造例1的红景天热水提取物（1%固体成分含量，pH6.46）100ml中将11种吸附剂分别处理50g，测定过滤后的滤液的pH及固体成分含量，在表5中示出。
表5
如表5所示，初期固体成分含量为1%的红景天提取物显示4.10的pH值，对于吸附剂处理之后过滤的滤液的pH值，在用活性炭、活性白土、酸性白土、Dowex MWA-1、Amberlite IRC-50等处理时降低到3.01～3.96，相反，使用氧化铝、Diaion HP-2MG、沸石、硅藻土、膨润土、Amberlite XAD-4等处理时上升到4.46～9.31。特别是，沸石显示出急剧的pH值的变化。
就固体成分含量而言，也在根据吸附剂的种类进行吸附剂处理后显示出很大变化，Amberlite XAD-4处理时反而增加2倍左右，相反，活性炭、Dowex MWA-1、Diaion HP-2MG处理时减少40～50%左右。这种固体成分含量的减少在以后会导致收率或主要活性成分的减少，因此判断为不理想的结果。
乙.红景天提取物滤液的发酵
先将上述甲中得到的吸附处理滤液调节为用于乳酸菌发酵的初期pH6.5水平，按照与制造例1的丙相同的方法，接种嗜酸乳杆菌128（Lactobacillus acidophillus 128）进行发酵，结果在表6中示出。
表6
将使用不同吸附剂处理后过滤的红景天提取物的pH再调节为用于乳酸菌发酵的初期pH6.5、固体成分含量为1%水平之后，接种乳酸菌，在37℃发酵48小时后，观察pH值和可溶性固体成分含量，并将结果在表6中示出。
观察发酵48小时之后的pH变化，发现未用吸附剂处理的红景天的提取物显示6.5的pH，即使接种了乳酸菌进行48小时的发酵，也未发生pH变化，因此可以知道没有进行发酵。
与此相对，可知就活性炭、酸性白土、Dowex MWA-1、DiaionHp-2MG、硅藻土以及膨润土而言，由于发酵而pH下降至不足5.0，并且，就活性白土、氧化铝、沸石、Amberlite IRC-50及XAD-4而言，pH为5.0以上，能够确认发酵进行的不充分。
因此，判断为活性炭、酸性白土、Dowex MWA-1、Diaion Hp-2MG、硅藻土以及膨润土处理对乳酸菌发酵有利，但是活性炭、Dowex MWA-1及Diaion HP-2MG处理显著减少红景天提取物的固体成分含量，因此推定酸性白土或膨润土为红景天发酵物制造中优选的吸附剂。
实验例2：吸附剂的适当处理量确认试验
为了观察上述制造例2中选择的酸性白土及膨润土的处理量对红景天提取物的乳酸菌发酵产生的影响，用70%MeOH和蒸馏水对吸附剂进行1次洗涤处理，每红景天提取物（0.8%）100ml，分别用1g、5g、10g、15g、20g、25g、30g、35g吸附剂进行处理，并以500rpm吸附处理一天后，对过滤得到的培养液，按照制造例2接种乳酸菌，发酵48小时，观察发酵物的pH变化，结果在图3中示出。
酸性白土或膨润土处理的发酵特性的改善效果，以具有1重量%的固体成分的红景天提取物为基准，对红景天提取物100重量份，添加吸附剂1重量份开始有效果，优选5重量份以上，更优选20重量份以上才能达到充分的发酵改善效果，超过25重量份也不显示更好的发酵改善效果。
对1重量%固体成分的红景天提取物100ml，分别用25g的酸性白土、膨润土和Dowex MWA-1进行24小时吸附处理后，按照与制造例1的丙相同的方法接种嗜酸乳杆菌128（Lactobacillus acidophillus 128），观察48小时的乳酸菌数的变化，并在图4中示出。作为对照组使用了对未用吸附剂处理的红景天提取物以相同方法接种乳酸菌的组。
从最初接种量3.1×106CFU/ml，酸性白土吸附处理后红景天的乳酸菌发酵的情况下，在24小时后达到5.14×105CFU/ml，48小时后达到5.01×105CFU/ml，略有减少；Dowex MWA-1吸附处理时，发酵24小时后达到5.01×105CFU/ml，48小时后达到5.85×105CFU/ml；膨润土吸附处理时24小时后达到8.41×105CFU/ml，48小时后达到8.52×105CFU/ml，确认初期菌数略有降低。相反，未用吸附剂处理的红景天提取物的情况（对照组），在发酵初期开始活菌数显著减少，发酵2天后活菌数显著降低到6.10×102CFU/ml，因此可知吸附剂处理具有促进乳酸菌的增殖和发酵的效果。
实验例3：红景天发酵前后的红景天苷配糖体及苷元含量比较
对1重量%固体成分的红景天提取物100ml，分别用25g的酸性白土、膨润土进行24小时吸附处理后，分别在各个滤液中按照与制造例1的丙相同的方法接种嗜酸乳杆菌128（Lactobacillus acidophillus 128），发酵48小时而制造发酵物，该发酵物的可溶性总糖、酸性多糖及总酚含量与红景天提取物进行比较，并在表7中示出。
表7
总糖含量以D-葡萄糖（D-glucose）为标准物质，通过酚-硫酸（phenolsulfuric acid）法测定；酸性糖含量以D-半乳糖醛酸（D-galacturonicacid）为标准物质，通过间羟基联苯（m-hydroxydiphenyl）法测定；多酚化合物含量根据利用酚性物质与磷钼酸（phosphomolybdic acid）反应显示蓝色的性质的福林-丹尼斯（Folin Denis）法以五倍子酸（gallicacid）为标准物质以比色法进行测定。
初期红景天提取物的总糖含量为75.97%、酸性多糖含量为26.16%、总酚含量为20.12%水平，但是吸附剂处理时总糖和酸性糖没有大变化，相反，总酚化合物含量略有减少。认为这种结果可能是吸附处理时色素等影响总酚化合物含量的成分或部分酚性化合物被吸附去除而导致的。
相反，在乳酸菌发酵时大体显示出总糖和酸性多糖含量减少，总酚化合物含量略有增加的趋势。认为这种糖类的减少是由于糖类作为乳酸菌增殖的营养源而被消耗，相反，酚化合物与以往的研究一样，通过发酵而可溶性酚化合物含量增加。
实验例4：红景天发酵前后的红景天苷配糖体及苷元含量比较
对1重量%固体成分的红景天提取物100ml，分别用25g的酸性白土、膨润土、Dowex MWA-1及Diaion HP-2MG进行24小时吸附处理后，分别在各个滤液中按照与制造例1的丙相同的方法接种嗜酸乳杆菌128（Lactobacillus acidophillus 128），发酵48小时后，将发酵前的用吸附剂处理而得到的滤液和发酵物的活性成分用TLC和HPLC进行分析。
为了TLC分析，在硅胶薄层层析板（Silica gel TLC plate，60F254，Merck,Germany）点上试样，用氯仿/甲醇/水（chloroform/methanol/H2O，70:30:4）展开后，喷雾30%H2SO4试剂，在105℃显色30分钟确认个成分的位置，其结果在图5中示出。作为标准物质使用了红景天苷（S1）及作为红景天苷苷元的酪醇（ρ-tyrosol，S2）。
HPLC分析用Waters SunfireTM C18柱，使用20%甲醇（v/v）溶液作为流动相来进行，试样的进样量为20μl，溶剂的展开速度为1ml/min，利用UV检测器在278nm进行测定。作为标准物质使用红景天苷（S）、以及作为红景天苷的苷元的酪醇（ρ-tyrosol，SH）。
图6a是红景天苷（S）及其苷元标准品（SH）的HPLC谱图，图6b是用酸性白土吸附处理之前的红景天提取物的图谱，图6c是用酸性白土吸附处理的红景天提取物滤液的图谱，图6d是将酸性白土吸附处理的红景天提取物滤液发酵48小时的发酵物的图谱。图谱只显示酸性白土处理的情况，用其他吸附剂处理时红景天苷和红景天苷苷元的含量在图7中示出。上述图7中，Con为红景天提取物，1B为酸性白土吸附滤液，1A为酸性白土吸附滤液的发酵物，2B为Dowex MWA-1吸附滤液，2A为Dowex MWA-1吸附滤液的发酵物，3B为Diaion HP-2MG吸附滤液，3A为Diaion HP-2MG酸性白土吸附滤液的发酵物，4B为膨润土吸附滤液，4A为膨润土吸附滤液发酵物。
观察上述TLC和HPLC的结果，可以确认就作为主要指标成分之一的红景天苷而言，酸性白土、Dowex MWA-1、膨润土处理时显示出与红景天提取物大体类似的含量，相反，Diaion HP-20M处理时，滤液的红景天苷含量减少。就作为红景天苷的苷元形态的酪醇而言，酸性白土、Dowex MWA-1、膨润土处理时，与发酵前相比，乳酸菌发酵时显示略有增加的趋势。特别是，酸性白土处理时显示与未进行吸附处理的红景天提取物大体类似的红景天苷（salidroside）含量，由吸附引起的指标成分的损失最低，同时发酵引起的酪醇（tyrosol）的转化趋势也是最明显的。
通常，进行利用了乳酸菌等的天然原料的发酵时，将配糖体形态的指标成分转化为苷元形态来提高体内吸收率和增强功能性，根据这一事实来看，这种结果可期待显示增加红景天功能性成分的功能性和吸收率的效果。
下面说明含有本发明的红景天发酵物的组合物的制剂例，但仅是为了具体说明本发明，本发明的范围并不由此来限定。
制剂例1.散剂的制造
实验例2的用酸性白土处理的红景天发酵物粉末 20mg
乳糖 100mg
滑石 10mg
混合上述成分并填充于气密包装中，从而制造散剂。
制剂例2.片剂的制造
混合上述成分后，按照通常的片剂制造方法进行打片而制造了片剂。
制剂例3.胶囊剂的制造
按照通常的胶囊剂制造方法混合上述成分并填充到明胶胶囊中，从而制造了胶囊剂。
制剂例5.液体制剂的制造
按照通常的液体制剂的制造方法，在精制水中加入各成分并进行溶解，加入适量柠檬香之后，将上述成分进行混合，然后加入精制水，从而将总体调节成加入精制水后总体为100，然后填充到棕色瓶中进行灭菌，从而制造了液体制剂。
制剂例6.健康功能食品的制造
上述维生素及矿物质混合物的组成比是将比较适合健康功能食品的成分作为优选实施例进行了混合组成，可以将其配比进行任意变形而实施，可按照通常的健康功能食品的制造方法将上述成分混合之后，制造颗粒，并按照通常的方法用于功能食品组合物的制造。
制剂例7.功能性饮料的制造
按照通常的健康饮料制造方法混合上述成分后，在85℃下搅拌加热约1小时后，将得到的溶液过滤，装在灭菌的2L容器中密封灭菌后，冷藏保管，用于本发明的功能性饮料组合物制造。
上述组成比为将比较适合喜欢的饮料的成分作为优选实施例进行混合而组成，也可以根据需要阶层、需要国家、使用用途等地域、民族的喜好度，任意变化其配比而实施。
Claims (10)
1.一种红景天发酵物的制造方法，其特征在于，包括：
用选自酸性白土、膨润土、硅藻土、活性炭及弱碱性阴离子交换树脂中的一种以上的吸附剂处理红景天提取物的步骤；以及
在未吸附于所述吸附剂的滤液中接种乳酸菌进行发酵的步骤。
2.根据权利要求1所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述吸附剂为酸性白土或膨润土。
3.根据权利要求1所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述弱碱性阴离子交换树脂为Dowex MWA-1。
4.根据权利要求1所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，相对于所述红景天提取物100重量份，混合5～60重量份的吸附剂。
5.根据权利要求1所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述红景天提取物的固体成分含量为0.1～10重量%。
6.根据权利要求1所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述乳酸菌为选自乳酸杆菌属乳酸菌、双歧杆菌属乳酸菌及片球菌属乳酸菌中的一种以上的乳酸菌。
7.根据权利要求6所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述乳酸菌为选自嗜酸乳杆菌KCTC 2182、长双歧杆菌ATCC 15707、短双歧杆菌ATCC 15700及戊糖片球菌KCCM 11088P中的一种以上的乳酸菌。
8.根据权利要求1所述的红景天发酵物的制造方法，其特征在于，所述进行发酵的步骤在25～40℃进行24～96小时。
9.一种红景天发酵物，其特征在于，是在用选自酸性白土、膨润土、硅藻土、活性炭及弱碱性阴离子交换树脂中的一种以上的吸附剂处理红景天提取物而得到的滤液中接种乳酸菌进行发酵的发酵物，在红景天苷配糖体和苷元的合计100重量份中，苷元的含量为30～100重量份。
10.含有权利要求9所述的红景天发酵物的食品组合物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |