KR102666911B1 - 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법 - Google Patents
항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 유효성분으로 함유하고, 락토바실러스 플랜타럼 균주 접종을 통해 발효시켜 항노화, 미백활성 기능을 갖는 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 유효성분으로 함유하고, 락토바실러스 플랜타럼 균주 접종을 통해 발효시켜 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법에 관한 것이다.
최근 지구 환경변화로 인한 자외선 노출이 증가하면서 melanin 색소 침착과 관련된 피부 질환 환자의 수가 급증하고 있다. 미백 화장품 산업은 고부가 가치가 창출되는 산업으로 수요가 지속적으로 증가되고 있다. 효과적인 미백 화장품 개발을 위한 다양한 원료의 탐색 및 메커니즘 연구가 이루어졌으나 현재 대부분의 미백 성분들은 백반증, 알러지, 피부자극 및 피부암 유발 등의 부작용이 보고되면서 다양한 형태의 화장품에 사용되지 못하고 있다. 문제가 되었던 주요 미백 소재들로는 하이드로퀴논(Hydroquinone), 코직산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin), 로도데놀(rhododendrol) 등이 있으며 특히 이러한 소재들이 대부분 tyrosinase에 대한 직접 저해를 통한 미백활성을 가지고 있어 백반증의 부작용을 가지고 있다.
화장품은 인체에 직접 사용하는 제품이기 때문에 피부에 대한 안전성 문제가 필수적으로 고려되어야 한다. 따라서 이를 대체할 안전하고 효능이 증가된 천연물 유래 미백 화장품 소재의 개발이 절실하다. 또한 국내 화장품 산업 현실상 상당량의 소재를 수입하는 상황에서 국내 연구자에 의한 신규 미백 소재의 개발 및 적용은 산업적 측면에서도 매우 중요하다.
특히, 해삼의 일반 성분은 단백질 함량 2~5%, 지방 ~0.4%로 전형적인 저지방 식품이며 무기질은 Ca와 Na가 어류나 연체동물인 굴, 가리비 등에 비해 10배 이상 많은데 비해 K, Zn, Cu와 Fe는 상대적으로 훨씬 적으며 점질다당체의 주성분으로 동물 등의 세포간·조직, 신경조직 및 연골조직에서 발견되는 황산콘드로이친(Chondrotin sullfate)을 2.6~3.2%를 함유 하고있다. 해삼에 관한 연구를 살펴 보면 흰쥐에서 thioacetamide로 유도한 간섬유화 모델에서 간보호 효과와 항산화 효과를 보이며 해삼은 오랜 기간 전통적으로 사용 되어 왔던 음식이자 약재이며 그 안전성이 보장되어 있으며 연구 결과 항균 효과, 항산화효과, 항암효과, 항신경염 효과, 상처 치료효과 등을 갖고 있다.
또한, 다시마는 수용성 식이섬유 32.8%와 비수용성식이섬유 17.9%로 이루어져 총 식이섬유 함량은 50.5%로 해조류와 식물 중에서 가장 높은 식이섬유 함량을 가지고 있다. 특히, 대표적인 갈조류로서 알긴산과 후코이단 같은 다당류로 구성되어 있다. 알긴산의 구조는 - D-mannuronate (M)와α-L-guluronate (G)의 2 종류의 uronic acid가 α-1,4 결합 또는 β-1,4 결합으로 이루어져있고 hetero형 다당류로 한 종류의 단당으로 되어 있는 homopolymer (poly M or poly G)형태이거나 M과 G가 적절히 포함된 heteropolymer (poly MG)형태로 되어있다. 알긴산 같은 해조 다당류를 기능성 올리고당을 전환함으로서 올리고당은 Bifidobacteria의 활성촉진, 항콜레스테롤 등 많은 연구가 되고 있다.
미역(Undaria pinnatifida)은 다시마목 미역과에 속하는 갈조류로서, 우리나라 전 연안에 분포하며 연해주, 중국, 일본 등 극동지방 특산의 해조류이다. 미역은 Na, K, Ca, Mg, P, S 등의 무기질, 식이섬유소, 리놀산 및 비타민 등 생리활성 물질이 풍부하게 함유되어 있다. 특히, 미역에 들어 있는 점질 다당류인 알긴산은 중금속 및 방사능 물질의 체외배출, 콜레스테롤 저하, 비만 및 변비방지 효능과 더불어 혈압이나 당뇨 예방효과가 높다는 보고가 있다. 미역에 함유되어 있는 후코이단은 항암, 항콜레스테롤, 혈액응고 저해, 혈압조절 등의 혈류개선 작용이 우수하며, 지질대사 개선에도 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다.
감태(Ecklonia cava)는 다시마목(Laminariales) 미역과(Alariaceae)의 다년생 해초로서 우리나라에서는 남해안이나 제주도에 많이 분포하고 있다. 주로 전복이나 소라의 양식을 위해 공급되어 왔기 때문에 많이 소비되지 않았던 자원이었으나 최근에 감태가 가지고 있는 phlorotannin의 다양한 생리활성이 알려짐에 따라 관심이 증가되고 있다. 감태로부터 분리된 phlorotannin 화합물은 phlorotannin A, eckol, phlorofucofucoeckol A, 6,6’-bieckol phloroeckol 등 여러 가지가 알려져 있으며, 항산화, 항바이러스, tyrosinase 저해활성 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 밝혀졌다.
상기와 같은 원재료가 다양한 효과를 지니고 있으나 원재료 추출, 배양, 및 발효 기술, 발모에 유익한 비율로 추출하는 기술이 미약하여 상기와 같은 효과를 적극 구현하지 못하는 실정이다.
선행기술문헌 : KR 등록특허공보 제2313247호(2021.10.15 공고)
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 특히, 해삼, 다시마, 미역, 및 감태를 유효성분으로 함유하고, 락토바실러스 플랜타럼 균주 접종을 통해 배양하여 항산화 활성, 미백 활성을 갖는 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 안출된 본 발명에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법은 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 혼합하여 분쇄기에 투입하고, 분쇄하는 혼합분쇄단계; 혼합분쇄단계로 분쇄된 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 추출포에 넣어 추출하는 추출단계; 추출단계의 추출액을 여과하여 불순물을 제거하고, 농축하는 농축단계; 농축단계에서 농축된 농축액에 락토바실러스 플랜타럼 균주를 접종하여 배양하는 배양단계; 배양단계를 수행한 배양액에 이산화규소, 활성탄, 산성백토를 포함하는 여과조제를 혼합하여 지방질이나 중금속의 흡착을 수행하는 여과조제혼합단계; 여과조제혼합단계를 수행한 배양액에 여과를 진행하여 순수 추출물을 수득하는 여과단계; 여과단계를 수행한 순수 추출물을 가열하여 세균활성 및 추가 발효를 억제시키는 살균단계; 및 살균단계를 수행한 순수 추출물에 1,2-헥산다이올, 부틸렌글라이콜을 포함하는 보존제를 첨가하는 제형화단계를 포함할 수 있다.
또한, 배양단계는 배양 배지 조성물에 중탄산나트륨을 첨가하여 pH 6 이상 pH 7 이하로 조정하고, 온도가 30℃ 이상 36℃ 이하에 도달하면, 락토바실러스 플랜타럼 균주를 접종하여 배양하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 배양단계는 락토바실러스 플랜타럼 배양 배지 조성을 프로테오스 펩톤(Proteose Peptone), 육류추출물(Meat Extract), 효모추출물(Yeast Extract), 글루코스(Glucose), 트윈 80(Tween 80)을 포함하는 계면활성제, 구연산삼나트륨(Triammonium Citrate), 아세트산나트륨(Sodium Acetate), 황산마그네슘(Magnesium Sulfate), 황산망간(Manganese Sulfate), 인산이포타슘(Dipotassium Phosphate), 및 정제수로 구성하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 유효성분으로 함유하여 락토바실러스 플랜타럼 균주 접종을 통해 발효시켜 항노화, 미백활성 기능을 갖는 데 그 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법의 순서도,
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 프리라디칼 소거율 기반의 항산화 활성을 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 기반의 항산화 활성을 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프, 및
도 5는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 멜라닌 함량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 프리라디칼 소거율 기반의 항산화 활성을 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 기반의 항산화 활성을 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프, 및
도 5는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 멜라닌 함량을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부된 도면들을 참조하여 상세히 설명한다. 우선 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법(S100)의 순서도이고, 도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법(S100)으로 제조된 조성물의 농도에 따른 프리라디칼 소거율 기반의 항산화 활성을 나타낸 그래프이며, 도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법(S100)으로 제조된 조성물의 농도에 따른 티로시나아제(tyrosinase) 저해활성 기반의 항산화 활성을 나타낸 그래프이고, 도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 그래프이며, 도 5는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물의 농도에 따른 멜라닌 함량을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 유효성분으로 함유하고, 락토바실러스 플랜타럼 균주 접종을 통해 발효시켜 항노화, 미백활성 기능을 갖는 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법(S100)에 관한 것이다.
도 1을 참조하면, 본 발명은 혼합분쇄단계(S10), 추출단계(S20), 농축단계(S30), 배양단계(S40), 여과조제혼합단계(S50), 여과단계(S60), 살균단계(S70), 및 제형화단계(S80)로 구성되고, 혼합분쇄단계(S10)부터 상세히 설명하기로 한다.
혼합분쇄단계(S10)는 건조된 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 혼합하여 분쇄기에 투입하고, 분쇄한다. 이는, 원물의 표면적을 크게 하여 추출 수율을 높이고자 함이다.
추출단계(S20)는 혼합분쇄단계(S10)로 분쇄된 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 추출포에 넣고, 추출기로 이송하여 정제수와 구연산을 투입하여, pH 2 이상 pH4 이하로 조절하고, 60℃ 이상 80℃ 이하의 온도에서 1시간 이상 2시간 이하 동안 추출한다.
또한, 추출단계(S20)에서 투입하는 해삼, 미역, 다시마, 및 감태의 중량은 정제수 중량 대비 1% 이상 5% 이하로 투입하며, 1% 미만으로 투입될 경우 생리활성물질을 추출하는데 있어 충분한 반응을 하지 못하거나 생리활성물질의 함유량이 적어지고, 5% 초과로 투입될 경우 생리활성물질을 추출하는 시간 및 농축하는 시간이 길어져서 공정시간이 늘어나게 되며, 추출기로 이송된 분쇄물에 정제수와 구연산을 투입한 산도가 pH 2 미만의 환경에서 추출을 할 경우, 생리활성물질이 파괴되어 수율이 낮아지고, pH 4 초과 환경에서 추출을 할 경우, 생리활성물질의 추출이 원활히 일어나지 않게 되며, 추출 온도가 60℃ 미만일 경우 원물에 함유된 다당류가 분해되지 않게 됨에 따라 흡수력이 저하되어 면역활성이 미비해지고, 80℃ 초과할 경우 생리활성물질의 파괴 및 냉각 시간의 증가로 전체적인 공정시간이 길어지며, 추출 시간이 1시간 미만일 경우 생리활성물질을 추출하는데 있어서 시간이 부족하고, 2시간 초과일 경우 생리활성물질의 변성 및 파괴가 진행되어 추출물의 생리활성이 낮아지기에 상기 범위로 추출하는 것이 바람직하다.
농축단계(S30)는 추출단계(S20)의 추출액을 여과하여 불순물을 제거하고, 600mmHg 이상 700mmHg 이하의 압력환경에서 10배 농축한다.
또한, 농축단계(S30)의 압력이 600mmHg 미만일 경우 여과속도가 느려져 공정시간이 길어지게 되고, 700mmHg 초과일 경우, 여과액의 거품 발생과 함께 끓어 넘쳐서 여과액이 진공펌프로 이동하여 진공펌프의 고장 및 추출물의 손실을 야기할 수 있으며, 10배 미만으로 농축할 경우, 고형분(생리활성성분) 양이 적어서 미백활성이 낮아지고, 10배를 초과하여 농축할 경우, 농축하는 과정에서 농축기의 벽면에 추출물이 들러붙거나 타기 때문에 최종적으로 농축액의 감소 및 타는 냄새까지 베이게 되므로 상기 압력 및 농축 범위로 진행함이 바람직하다.
배양단계(S40)는 농축단계(S30)에서 10배로 농축된 농축액을 배양 배지 조성물 중량 대비 5% 이상 10% 이하의 중량으로 투입하고, 배양 배지 조성물에 pH를 조정하기 위해 약알카리를 띄는 성분인 중탄산나트륨을 첨가하여 pH 6 이상 pH 7 이하로 조정하고, 온도가 30℃ 이상 36℃ 이하에 도달하면, 배지 중량의 1% 중량의 락토바실러스 플랜타럼 균주를 접종하여 35℃ 이상 37℃ 이하의 온도에서 18시간 이상 48시간 이하 동안 배양한다.
특히, 배양단계(S40)의 락토바실러스 플랜타럼 배양 배지 조성을 프로테오스 펩톤(Proteose Peptone), 육류추출물(Meat Extract), 효모추출물(Yeast Extract), 글루코스(Glucose), 트윈 80(Tween 80)을 포함하는 계면활성제, 구연산삼나트륨(Triammonium Citrate), 아세트산나트륨(Sodium Acetate), 황산마그네슘(Magnesium Sulfate), 황산망간(Manganese Sulfate), 인산이포타슘(Dipotassium Phosphate), 및 정제수로 구성하도록 한다.
배양단계(S40)의 실시예로, Proteose Peptone 15g, Meat Extract 15g, Yeast Extract 7.5g, Glucose 30g, Tween 80 1.5g, Triammonium Citrate 3g, Sodium Acetate 7.5g, Magnesium Sulfate 0.15g, Manganese Sulfate 0.075g, Dipotassium Phosphate 3g, 정제수 1.5L로 구성할 수 있으며, 상기 함유량 보다 적거나 많을 시 락토바실러스 플랜타럼 균의 성장속도 느려지거나 너무 빨라져서 핸들링 어렵고, 농축된 추출물을 정제수 중량 대비 5% 미만으로 첨가할 경우 생리활성물질의 함량이 적어지며, 10% 초과하여 첨가할 경우 유산균이 추출물을 분해하는 시간이 증가하여 전체적인 공정 시간이 길어지게 되기에 상기 범위로 진행함이 바람직하다. 여기서 정제수는 상수를 증류하거나 이온교환수지를 통하여 정제한 물이다.
또한, 배양단계(S40)는 중탄산나트륨을 첨가하여 산도를 pH 6 이상 pH 7 이하로 조정하는 것이 바람직하며, 상기 산도 범위를 벗어날 경우, 락토바실러스 플랜타럼이 증식하지 않고, 조성온도가 33℃ 이상 37℃이하의 범위에서 배양하지 않을 경우 락토바실러스 플랜타럼이 자라지 않거나 배양시간이 길어지기에 상기 범위에서 배양함이 바람직하다.
또한, 배양단계(S40)에서 락토바실러스 플랜타럼을 18시간 미만 배양할 경우 락토바실러스 플랜타럼이 충분히 자라지 않으며, 48시간을 초과하여 배양할 경우 과배양되어 배양액의 상층액 젤화로 인해 여과하기 어려지기에 상기 범위로 실시함이 바람직하다.
또한, 배양단계(S40)에서 락토바실러스 플랜타럼의 접종 비율을 배지 중량의 1% 중량으로 하는 것은 그 이상을 접종할 경우 공정시간이 유의미하게 증가하진 않으나 과비용이 발생하고, 그 미만으로 접종할 경우 공정시간이 길어지게 되기에 상기 중량으로 접종하는 것이 바람직하다.
여과조제혼합단계(S50)는 배양단계(S40)를 수행한 배양액에 이산화규소, 활성탄, 산성백토를 포함하는 여과조제를 혼합하되, 배양단계(S40)를 수행한 배양액 중량 대비 1% 중량의 여과조제를 혼합하여 20분 동안 반응시켜 지방질이나 중금속의 흡착을 수행한다.
또한, 여과조제혼합단계(S50)에서 투입되는 여과조제의 중량비가 1% 미만이면 반응량이 부족하여 지방질이나 중금속 흡착 등이 원활히 일어나지 않게 되고, 1% 초과 첨가 시 반응량이 많아져서 여과속도 및 추출 수율의 감소가 발생할 수 있으며, 반응시간을 20분 미만으로 하였을 경우 반응시간이 짧아져서 지방질이나 중금속 흡착 등이 원활히 일어나지 않으며, 20분을 초과하여 반응할 경우 반응시간이 길어져서 생리활성물질과의 흡착으로 인한 추출 수율의 감소를 가져올 수 있기 때문에 상기 범위로 실시하는 것이 바람직하다.
여과단계(S60)는 여과조제혼합단계(S50)를 수행한 배양액을 필터프레스를 이용하여 600mmHg 이상 700mmHg 이하의 압력조건에서 감압여과를 진행하여 순수 추출물을 수득한다.
특히, 여과단계(S60)에서 감압여과 시 압력의 범위는 600mmHg 이상 700mmHg 이하이며 600mmHg 미만의 압력에서는 여과속도가 느려져 공정시간이 길어지게 되고, 700mmHg 초과 압력에서는 여과액의 거품 발생과 함께 끓어 넘쳐서 여과액이 진공펌프로 이동하여 진공펌프의 고장 및 추출물의 손실을 야기할 수 있기에 상기 압력범위로 감압여과를 실시함이 바람직하다.
살균단계(S70)는 여과단계(S60)를 수행한 순수 추출물을 5분간 가열하여 세균활성 및 추가 발효를 억제시킨다.
특히, 살균단계(S70)에서 5분 미만의 시간동안 가열하게 되면 고온에서 생존하는 균이 잔존할 수 있고, 5분을 초과하여 가열할 경우 생리활성물질의 파괴 및 냉각시간이 길어져서 공정시간이 무의미하게 길어지게 되므로 상기 시간동안 가열하는 것이 바람직하다.
제형화단계(S80)는 살균단계(S70)를 수행한 순수 추출물에 1,2-헥산다이올, 부틸렌글라이콜을 포함하는 보존제를 첨가한다. 이는 보관을 용이하게 하고 유통기한을 길게 가져갈 수 있다.
<실시예 1>
본 실시예는 프리라디칼(ABTS) 소거작용효과를 관찰한 것이다. ABTS 시약을 0.142 g을 정확히 칭량하여 증류수 50 mL에 잘 녹여 두고 potassium persulfate 0.033 g을 정확히 칭량하여 녹여둔 ABTS 시약에 혼합하였다. 잘 혼합된 시약은 포일로 빛을 차단하고 상온에 두어 반응시켰다. 12시간 이후 해당 시약을 흡광도 측정하여 흡광도 값이 1이 되는 것을 확인한 다음 실험을 진행하였다. 시료는 각각 100 uL씩 96well에 분주하여 두고 ABTS 시약을 시료가 분주된 96well에 100 uL씩 분주하였다. 분주 한 후 잘 혼합한 다음 포일로 96well을 감싸서 빛의 영향을 최소화 하였고 30분간 상온에서 반응을 실시하였다. 측정은 micro-ELISA를 이용하였고 측정파장은 740nm로 고정하였다. 시료의 활성 비교 및 실험의 오류를 확인하기 위하여 positive control로 BHA를 이용하였고 blank에는 시료 대신 증류수를 이용하였다. 그 결과 프리라디칼 소거작용은 아래의 수학식과 같이 구하였다.
프리라디칼 소거작용 (%) = 100 - [(실험군의 흡광도/대조군의 흡광도) × 100]
도 2를 참조하면, 농도에 따른 프리라디칼 소거율을 나타낸 것으로 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법(S100)으로 제조된 조성물인 발효 미백 펩타이드의 농도가 25%일 때 42.1%, 50%일 때 55.4%, 100%일 때 71.5% 가량의 항산화 활성을 나타내어 항노화 기능을 확인할 수 있다.
<실시예 2>
본 실시예는 tyrosinase 저해활성을 측정한 것이다. 실험군은 0.1M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 2.3 mL와 기질액 1.5 mM L-tyrosine 용액 0.4 mL 의 혼합액에 250 U/mL mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA) 0.1 mL와 50~200 μ/mL phenolic compounds 농도의 시료 0.2 mL를 넣고 대조군에는 시료 대신 증류수를 0.2 mL를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 다음, 흡광도 475 nm에서 측정하여 저해율(%)을 (1-실험군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100으로 계산하였다.
도 3을 참조하면, 농도에 따른 tyrosinase 저해율을 나타낸 것으로 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법으로 제조된 조성물인 발효 미백 펩타이드의 농도가 25%일 때 20.2%, 50%일 때 33.2%, 100%일 때 38.6%의 tyrosinase 저해 활성을 나타냈으며, 이로써 본 발명으로 제조된 조성물의 미백활성을 확인할 수 있다.
<실시예 3>
본 실험에 이용한 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/steptomycin (100 U/mL) 을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 계대 배양하였다. 세포 확인 시 inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan)를 사용하였다. B16F10 mouse melanoma cell에 시료용액 농도별로 1시간 전처리 후 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 1 μM을 48시간 처리하였다.
세포 독성 측정은 Carmichael 등의 방법에 따라 측정하였다. B16F10 mouse melanoma cell을 48 well plate에 1x104 cells/well이 되게 450μL 분주하고, 24시간 뒤 시료를 농도별로 조제하여 50μL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 처리하였다. 대조군은 시료와 동량의 DMEM(-) 배지를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 50μL를 첨가하여 4시간 배양하여 배양액을 제거하고 각 well에 dimethyl sulfoxide (DMSO) 300μL를 가하여 실온에서 10분간 반응 시킨 뒤 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 측정은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
Cell viability (%) = (1 실험군 흡광도 / 대조군 흡광도 ) ×100
도 4를 참조하면, 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법(S100)으로 제조된 조성물인 발효 미백 펩타이드의 농도에 따른 세포독성을 나타낸 것으로 미백 펩타이드의 B16F10 melanoma cell 에서 세포 생존율을 분석한 결과 농도에 따른 세포독성은 발견되지 않았으며 세포의 성장률이 약간 증가되는 것으로 나타났다.
<실시예 4>
멜라닌 양은 Hosoi 등의 방법을 준하여 사용하였다. B16F10 mouse melanoma cell를 6 well에 5x104 cells/well이 되도록 분주하여 24시간 뒤, DMEM(+) 배지를 제거한 다음 각각의 well에 DMEM(-) 배지를 분주하고 α-MSH 200μL는 Control군을 뺀 모든 well에 분주하여 자극시켰다. 이후 시료를 농도별로 200μL분주 후 48시간 동안 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양시켰다. 배양 후 상등액을 모두 제거하고 PBS로 세척한 후 deep-freezer에서 하루 보관 뒤, 상온에서 M-PER를 20μL 분주하여 세포들을 모아 13,000 rpm, 4℃, 15분간 원심 분리하여 세포 침전물을 만들었다. 상등액을 제거 후 10% DMSO/1N NaOH 200μL를 분주하여 heating block 70℃에서 1시간 용해시킨 다음 흡광도 405 nm에서 O.D 값을 측정하였다.
멜라닌 함량 (%) = (1 실험군 흡광도 / 대조군 흡광도 ) ×100
도 5를 참조하면, 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법(S100)으로 제조된 조성물인 발효 미백 펩타이드의 농도에 따른 세포내 멜라닌 함량을 나타낸 것으로 미백 펩타이드를 처리하였을 때 농도가 높아질수록 농도 의존적으로 melanin 생성량이 감소하는 경향을 보였다. 25%의 농도에서는 약 8%의 melanin 생성 억제를 보였지만, 최고 농도인 100%의 농도에서는 약 24%의 melanin 생성 억제 효과를 보여주었다. 이로써, 본 발명으로 제조된 조성물이 미백 기능을 확인할 수 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도면에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
S10 - 혼합분쇄단계
S20 - 추출단계
S30 - 농축단계
S40 - 배양단계
S50 - 여과조제혼합단계
S60 - 여과단계
S70 - 살균단계
S80 - 제형화단계
S100 - 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법
S20 - 추출단계
S30 - 농축단계
S40 - 배양단계
S50 - 여과조제혼합단계
S60 - 여과단계
S70 - 살균단계
S80 - 제형화단계
S100 - 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법
Claims (3)
- 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 혼합하여 분쇄기에 투입하고, 분쇄하는 혼합분쇄단계;
혼합분쇄단계로 분쇄된 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 추출포에 넣어 추출하는 추출단계;
추출단계의 추출액을 여과하여 불순물을 제거하고, 농축하는 농축단계;
농축단계에서 농축된 농축액에 락토바실러스 플랜타럼 균주를 접종하여 배양하는 배양단계;
배양단계를 수행한 배양액에 이산화규소, 활성탄, 산성백토를 포함하는 여과조제를 혼합하여 지방질이나 중금속의 흡착을 수행하는 여과조제혼합단계;
여과조제혼합단계를 수행한 배양액에 여과를 진행하여 순수 추출물을 수득하는 여과단계;
여과단계를 수행한 순수 추출물을 가열하여 세균활성 및 추가 발효를 억제시키는 살균단계; 및
살균단계를 수행한 순수 추출물에 1,2-헥산다이올, 부틸렌글라이콜을 포함하는 보존제를 첨가하는 제형화단계
를 포함하고,
추출단계는
혼합분쇄단계로 분쇄된 해삼, 미역, 다시마, 및 감태를 추출포에 넣고, 추출기로 이송하여 정제수와 구연산을 투입하여, pH2 이상 pH4 이하로 조절하고, 60℃ 이상 80℃ 이하의 온도에서 1시간 이상 2시간 이하 동안 추출하고,
추출단계에서 투입하는 해삼, 미역, 다시마, 및 감태의 중량은 정제수 중량 대비 1% 이상 5% 이하로 투입하며,
을 포함하며,
배양단계는
농축단계에서 농축된 농축액을 배양 배지 조성물 중량 대비 5% 이상 10% 이하의 중량으로 투입하고,
배양 배지 조성물에 중탄산나트륨을 첨가하여 pH 6 이상 pH 7 이하로 조정하고, 온도가 30℃ 이상 36℃ 이하에 도달하면, 락토바실러스 플랜타럼 균주를 접종하여 배양하는 것
을 포함하고,
배양단계는
락토바실러스 플랜타럼 배양 배지 조성을 프로테오스 펩톤(ProteosePeptone), 육류추출물(Meat Extract), 효모추출물(Yeast Extract), 글루코스(Glucose), 트윈 80(Tween 80)을 포함하는 계면활성제, 구연산삼나트륨(Triammonium Citrate), 아세트산나트륨(Sodium Acetate), 황산마그네슘(Magnesium Sulfate), 황산망간(Manganese Sulfate), 인산이포타슘(Dipotassium Phosphate), 및 정제수를 포함하는 것
을 포함하고,
여과조제혼합단계는
배양단계를 수행한 배양액 중량 대비 1 중량%의 여과조제를 혼합하여 20분간 반응시키는 것
을 포함하며,
여과단계는
여과조제혼합단계를 수행한 배양액을 필터프레스를 이용하여 600mmHg 이상 700mmHg 이하의 압력조건에서 감압여과를 진행하는 것
을 포함하는 항노화 및 미백 활성을 지닌 발효 복합 추출물 제조방법.
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