CN108057038B - 一种治疗肝纤维化的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗肝纤维化的中药组分组合物，所述的中药成分组合物由以下中药成分组成：丹参酚酸B、红景天苷、青蒿琥酯。本发明还提供该中药成分组合物的应用。其优点表现在：本发明的组合物中各中药成分物质清楚，可有效治疗肝纤维化，具有良好的应用前景。

Description

一种治疗肝纤维化的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体地说，是一种治疗肝纤维化的组合物及其应用。
背景技术
肝纤维化是由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，是各种肝病引起的慢性损伤的修复结果，最终导致肝硬化。目前，肝硬化已经成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的重大疾病。
丹参(Salvia Miltiorrhiza Bge.)为唇形科鼠尾草属植物，药用部位为根和根茎，是具有活血化瘀活性的常用中药。丹参的水溶性成分以丹参酚酸为主，包括丹参素、紫草酸、丹参酚酸B和迷迭香酸等，其中丹参酚酸B(salvianolic acid B,SAB)的含量最高。丹参酚酸B的分子式为C36H30O16，由3分子的丹参素和1分子的咖啡酸缩合而成。
红景天(Rhodiola rosea L.)为景天科景天属多年生草本植物，主要以根和根茎入药，红景天苷(Salidroside,SDS)是红景天的主要有效成分，分子式为C14H20O7。
青蒿琥酯(artesunate,Art)，分子式为：C19H28O8，化学名为二氢青蒿素-1,2-α-琥珀酸单酯，是倍半萜内酯类化合物青蒿素(artemisinin)的水溶性衍生物，临床用于抢救和治疗脑型疟疾、恶性疟疾等。
《抑制人肝星状细胞株迁移的中药组分筛选》公开了青蒿琥酯、灯盏花素、红景天苷、丹参酚酸B、粉防已碱、黄芪总甙具有一定的改善肝纤维化的作用。但是关于本发明的组合物及其应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种治疗肝纤维化的组合物。
本发明的第二个目的是，提供一种组合物的应用。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗肝纤维化的组合物，所述的组合物由丹参酚酸B、红景天苷、青蒿琥酯组成。
优选的，所述的组合物由以下重量份的组分制成：丹参酚酸B 2-86份、红景天苷50-610份、青蒿琥酯2-79份。
更优选的，所述的组合物由以下重量份的组分制成：丹参酚酸B 14份、红景天苷610份、青蒿琥酯46份。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的组合物治疗肝纤维化的药物中的应用。
优选的，所述的药物剂型为口服制剂。
更优选的，所述的口服制剂包括颗粒剂、胶囊、片剂、口服液。
本发明优点在于：
1、本发明的组合物中各中药成分物质清楚，可有效治疗肝纤维化，具有良好的应用前景。
2、本发明的组合物较各中药成分单独使用，具有更好的疗效。
附图说明
附图1：各组小鼠肝组织HE染色观察，×200。
附图2：各组小鼠肝组织天狼猩红染色观察，×100。
附图3：各治疗组小鼠肝脏胶原面积的比较；与正常组比较：##P＜0.01，与模型组比较：**P＜0.01。
附图4：各组小鼠肝脏胶羟脯氨酸的变化；与正常组比较：##P＜0.01，与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
附图5：各组小鼠ALT活性的比较图；与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
附图6：各组小鼠AST活性的比较；与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1材料
1.1动物：
C57BL/6J雄性小鼠120只，SPF级，体重20g±4g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)：2016-0006。饲养于上海中医药大学实验动物中心，普通饲料，自由饮水。
1.2主要试剂：
四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)，批号：20151214；橄榄油，化学纯，批号：20170619；柠檬酸，优级纯，批号：20170209；无水乙酸钠，分析纯，批号：F20060725；柠檬酸三钠(Tri-sodium citrate)，分析纯，批号：20170605；对二甲基氨基苯甲醛(4-Dimethylamino benzaldehyde)，批号：20131011；氯氨-T(chloramines-T)，分析纯，批号：20170413；无水乙醇，分析纯，批号：20170716；二甲苯，分析纯，批号20100123；甲醛(Formaldehyde solution)，批号：20160919；异丙醇(Iso-propanol)，分析纯，批号：20170617；浓盐酸，分析纯，批号：20100426，高氯酸(Perchloric acid)，分析纯，批号：20170616。以上均购自中国医药集团上海化学试剂公司。中性树胶，批号：60090715，购自上海懿洋仪器有限公司。0.9％氯化钠注射液(Sodium Chloride Injection)，批号：H10983089，购自安徽双鹤药业有限责任公司。戊巴比妥钠(Pentobarbital Sodium，Lot.No.WS20090920)德国。羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)标准品，分析纯，Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Germany产品。购自上海桃浦化工厂。羧甲基纤维素(Carboxymethylcellulose,Lot.No.SLBB5684V)，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。血清谷丙转氨酶(alanine aminotransamine,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。
1.3药物：
丹参酚酸B，CAS No.115939-25-8，纯度≥98％，红景天苷，CAS No.10338-51-9，纯度≥98％，购自上海诗丹德生物技术有限公司。青蒿琥酯CAS No.88495-63-0，纯度≥98％，购自南通飞宇生物科技有限公司。
1.4主要仪器：
FIM20制冰机，荷兰菲利浦公司产品。上菱生化专用冰箱，购自上海上菱公司。低温冰箱(-70℃)，Forma scientific公司产品。台式离心机(microfuge lite)，Beckman公司产品。AA-200分析天平，倒置显微镜(37×B)美国Denver仪器公司产品。纯水系统(HPLC/UP),Labconco公司产品。CQX25-12超声波清洗器，上海必能超声有限公司产品。轮转切片机(RM2035)、HI1220烤片机、HI1210恒温水浴锅，LEICA ASP300自动脱水机、LEICA EG1160石蜡包埋机，均购自德国Leica公司。一次成像照相机，Polariod公司产品。XW-80A型旋涡混合器，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。ML-902定时恒温磁力搅拌器，上海浦江分析仪器厂生产。pH计
Figure BDA0001581834420000031
Beckman公司产品。1000μl、200μl、20μl加样器，法国Gilson公司制造。M5多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司生产。Precellys 24均质器，法国Bertin公司生产。
2方法
2.1模型制备
C57BL/6J雄性小鼠120只，适应环境一周后，用随机数字表的方法随机分为正常组10只和造模组110只。造模组用15％CCl4橄榄油溶液按2ml·kg-1体重腹腔注射，隔天1次，一周3次，共6周，正常组小鼠予相同部位腹腔注射等量的橄榄油。
2.2分组及给药
造模1周后，将造模组110只小鼠用随机数字表的方法分为模型组30只和8个治疗组，每组10只(A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组、H组)，各治疗成分别用对应的各中药单体按照表1配制剂量用0.5％羧甲基纤维素配制，以10ml·kg-1体重灌胃。正常组和模型组用以等剂量的0.5％羧甲基纤维素灌胃，每天1次，共5周。
表1各成分复方的单体成分配伍剂量
Figure BDA0001581834420000041
2.3标本留取
实验结束后小鼠禁食不禁水，12h后称取小鼠体重，用3％戊巴比妥钠按2ml·kg-1体重的剂量腹腔注射麻醉，1ml注射器经腹主静脉采血，4℃下静置2小时后，3000rpm，15min离心，取上清分装于1.5ml离心管，-80℃低温保存。动物取血处死后，取下肝脏和脾脏称其重量记录，然后取约0.8cm×0.5cm×0.3cm肝组织2块，于10％中性甲醛缓冲液中固定。
2.4血清生化学检测
ALT、AST检测参照试剂盒说明书进行。
2.5肝组织羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)含量测定
采用Jamall氏法测定
2.6肝组织学观察
2.6.1染色
10％中性甲醛固定的肝组织，48h后逐级酒精脱水，二甲苯透明，56℃石蜡包埋，4μm切片，行HE和天狼猩红染色，光镜观察。
2.6.2肝组织胶原纤维沉积程度的半定量标准
按照相关文献的半定量标准，观察肝脏纤维化程度。
表2肝组织胶原纤维沉积程度分期
Figure BDA0001581834420000051
2.6.3肝组织胶原纤维沉积面积图像处理半定量分析
每张天狼猩红染色片全视野拍摄图片，采用Aperio ImagScope软件计算出每张图片胶原沉积面积。
2.7统计学方法
采用SPSS 21.0软件进行统计处理。计量资料以
Figure BDA0001581834420000052
表示，采用ANOVA单因素方差分析，并用LSD-t检验进行两两比较；等级资料用Ridit法检验。(以α＝0.05为显著水准进行统计检验)。
3结果
3.1小鼠一般情况
造模6周末正常组小鼠、模型组小鼠无死亡，各治疗组除E组死亡小鼠2只，F组死亡1只，余无死亡。
3.2各组小鼠体重、肝体比、脾体比比较
与正常组比较，模型组小鼠体重降低，脾重明显增加，脾体比增大；与模型组比较，各组小鼠体重均有恢复，其中A组、B组的幅度较大，有统计学差异。其余各指标变化治疗组与模型组间无明显差异。(见表3)
表3各组小鼠肝重、脾重、肝体比、脾体比的比较
Figure BDA0001581834420000061
Figure BDA0001581834420000062
与正常组比较：#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05。
3.3小鼠肝脏病理学观察
3.3.1大体观察
正常组小鼠肝脏颜色鲜红，质嫩软，表面光滑，边缘锐利；脾脏色暗红，质中等。模型组小鼠肝脏质地较硬，色暗红，缘钝，表面粗糙，与正常组相比肝脏体积明显缩小，脾脏明显增大。治疗各组与模型组相比肝脏大小、色泽和质地都有改善，脾脏有不同程度的缩小。
3.3.2肝组织HE染色观察
正常组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞沿肝索由中央静脉向四周呈放射状排列，可见少许窦旁细胞，汇管区可见极少量纤维结缔组织。与正常组相比，模型组正常结构破坏，肝细胞排列紊乱，肝组织可见大量淋巴细胞、单核细胞等炎性细胞浸润，肝窦狭窄，汇管区明显增宽，广泛增生的纤维组织将肝小叶包绕成大小不等的假小叶；与模型组相比，治疗各组小鼠的肝细胞变性、坏死、出血、纤维增生等病理变化有不同程度的改善，其中尤以B组、D组、E组、F组减轻程度明显。(见图1)
3.3.3肝组织天狼猩红染色观察
观察结果显示，正常组小鼠肝脏仅在汇管区和中央静脉周围有少量胶原纤维沉积。模型组小鼠汇管区扩大肝脏胶原纤维沉积，纤维间隔明显形成，部分包绕形成假小叶。与模型组相比，各治疗组胶原纤维增生、沉积程度有所改善。(见图2)
3.4各组小鼠肝脏胶原沉积半定量分析
各组小鼠肝脏纤维化按标准半定量分级，并用Ridit进行分析显示，与正常组相比，模型组肝纤维化明显，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，治疗组A组、B组、C组、D组、E组、H组肝纤维化有不同程度的减轻，有显著统计学意义(P＜0.01)。(见表4)
表4各组小鼠肝脏胶原沉积半定量分析
Figure BDA0001581834420000071
与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。
3.5各组小鼠肝脏胶原沉积面积图像处理
模型组小鼠胶原沉积面积与正常组相比有明显的增加(P＜0.01)，B组有明显的减轻，(P＜0.05)(见表5，图3)。
表5各组小鼠肝脏胶原面积的比较
Figure BDA0001581834420000072
Figure BDA0001581834420000073
Figure BDA0001581834420000081
与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01。
3.6小鼠肝组织羟脯氨酸含量变化
与正常组相比，模型组小鼠肝组织的Hyp含量明显增高(P＜0.01)；与模型组相比，A组、B组、C组、E组、F组、G组、H组小鼠肝组织的Hyp含量明显降低(P＜0.01)；其中B组尤其明显。(见表6，图4)
表6各组小鼠Hyp含量的比较
Figure BDA0001581834420000082
Figure BDA0001581834420000083
与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
3.7小鼠肝功能检测
3.7.1不同成分配方对肝纤维化小鼠血清ALT、AST活性的影响
与同期正常组相比，模型组小鼠血清ALT活性显著升高，(P＜0.01)；药物治疗的各组与模型组相比，各治疗组ALT活性有不同程度的降低(P＜0.05，P＜0.01)。(见表7，图5)。与同期正常组相比，模型组小鼠血清AST活性显著升高，(P＜0.05)；与同期模型组相比，各治疗组小鼠血清AST活性有不同程度的下降。(见表7，图6)
表7各组小鼠ALT、AST活性的比较
Figure BDA0001581834420000091
Figure BDA0001581834420000092
与正常组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例2
丹参酚酸B、红景天苷、青蒿琥酯按照优选配比，通过常规制剂手段，添加药用辅料，制成颗粒剂、胶囊、片剂、口服液等口服制剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种治疗肝纤维化的组合物，其特征在于，所述的组合物由以下重量份的组分制成：丹参酚酸B14份、红景天苷610份、青蒿琥酯46份。
2.根据权利要求1所述的组合物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物剂型为口服制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的口服制剂包括颗粒剂、胶囊、片剂、口服液。
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