CN102988459A - 红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。本发明设计了以PDGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，发现10^-4mol/L～10^-7mol/L的红景天苷均可抑制PDGF诱导的肝星状细胞(HSC)的迁移。

Description

红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用

技术领域

本发明属中药领域，具体涉及红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。

背景技术

红景天苷是从红景天中分离提纯的天然产物，具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基、增强记忆、改善睡眠、消除忧郁感和保护心血管等多种药理作用。经年来研究发现红景天苷还有抗肝纤维、改善肝脏损伤的作用。王晓东等分别以CCl₄、D2半乳糖胺及卡介苗加脂多糖诱导小鼠肝脏损伤模型，以ALT、NO和MDA、甘油三酯(Triglyceride，TG)含量为指标，观察红景天苷对肝脏损伤的保护作用，结果表明红景天苷能明显降低肝损伤模型的血清ALT、NO和肝匀浆MDA、TG含量，从而证明了其具有明显的保肝作用。

各种肝脏疾病，如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎，酒精性或非酒精性脂肪性肝病，自身免疫性肝病，药物性肝病，慢性血吸虫病以及一些代谢性或先天性慢性肝病都可通过肝纤维化发展成肝硬化。

肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell，HSC)在肝纤维化的发生发展中起着关键作用。在肝脏炎症状态下，HSC经多种细胞因子如血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)的激活，活化为肌成纤维细胞并大量增殖，表达α-平滑肌肌动蛋白、合成分泌大量细胞外基质，细胞可以收缩，亦可从Disse腔内向肝细胞坏死区域迁移聚集。肝纤维化进程中，HSC所表现出的迁移特性，可导致炎症区域活化的HSC数目增多，而加重病灶局部的纤维化程度，促使疾病进展。所以，如能抑制HSC在肝损伤时向炎症区域迁移，就可能干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的目的。

而HSC的迁移受到多种细胞因子和细胞外基质成分的调控，如，PDGF、TGF-β1等；其中PDGF是最强的促进HSC增殖迁移的刺激因子。为此，本发明设计了以PDGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出红景天苷抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。目前，对红景天苷在抑制肝星状细胞迁移中的作用尚未见相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供红景天苷的新用途。

为解决上述技术问题，本发明提供红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。

所述红景天苷抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为10^-4mol/L～10^-7mol/L，优选为10^-5mol/L。

本发明设计了以PDGF诱导的人肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台，筛选出红景天苷抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。实验证明：10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L和10^-7mol/L 4个浓度梯度的红景天苷均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移；10^-5mol/L红景天苷抑制LX-2迁移的作用最强，且与10^-4mol/L无统计学差异，这2组与10^-6mol/L和10^-7mol/L之间有统计学差异。在迁移同等条件下培养细胞时，4个浓度红景天苷对细胞形态均无影响。遵从药物筛选原则，首先选择有统计学差异者，即抑制迁移效率最佳者；因此，选择红景天苷最佳药物浓度为10^-5mol/L。从而本发明验证了10^-4mol/L～10^-7mol/L的红景天苷均可抑制PDGF诱导的肝星状细胞(HSC)的迁移，从而可干扰或减轻肝纤维化的进程，达到抗肝纤维化的效果，即本发明验证了红景天苷可用于制备抑制肝星状细胞迁移的药物。同时通过对比实验发现10^-4mol/L～10^-7mol/L青蒿琥酯、10^-4mol/L～10^-7mol/L灯盏花素、10^-4mol/L～10^-7mol/L红景天甙、10^-5mol/L～10^-7mol/L丹参酚酸B盐、10^-6mol/L和10^-7mol/L粉防己碱、10^-5mol/L～10^-7mol/L黄芪总甙等6种中药组分均可抑制PDGF诱导的HSC的迁移；其中10^-5mol/L红景天苷抑制迁移作用最佳，与其它各浓度的各组分组比较均有显著性差异。

附图说明

图1是本发明试验例中细胞迁移杯(Transwell)的示意图；细胞迁移杯为一个可放置在孔板里的小杯子，其关键部分就是杯底层一张半透膜(一般是聚碳酸酯膜)此膜有密度均一的许多微孔，孔径为8.0μm。将Transwell放入24孔培养板中形成Transwell与培养板的双腔系统，Transwell  内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以半透膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，上层中的细胞亦可迁移至下层，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

图2是本发明试验例中不同浓度青蒿琥酯对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图2A表示对PDGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，×200)；图2B表示对LX-2形态的影响，×200。

图3是本发明试验例中不同浓度灯盏花素对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图3A表示对PDGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，×200)；图3B表示对LX-2形态的影响，×200。

图4是本发明试验例中不同浓度红景天苷对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图4A表示对PDGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，×200)；图4B表示对LX-2形态的影响，×200。

图5是本发明试验例中不同浓度丹参酚酸B盐对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图5A表示对PDGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，×200)；图5B表示对LX-2形态的影响，×200。

图6是本发明试验例中不同浓度粉防己碱对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图6A表示对PDGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，×200)；图6B表示对LX-2形态的影响，×200。

图7是本发明试验例中不同浓度黄芪总甙对LX-2迁移和形态学的影响示意图；图7A表示对PDGF诱导的人LX-2迁移的抑制(苏木素染色，×200)；图7B表示对LX-2形态的影响，×200。

图8是本发明试验例中各最佳浓度的青蒿琥酯、灯盏花素、红景天苷、丹参酚酸B盐、粉防己碱、黄芪总甙抑制PDGF致LX-2迁移的比较示意图(苏木素染色，×200)。

具体实施方式

以下通过试验例对本发明红景天苷的药理活性试验及结果作进一步的阐述：

试验例

一、材料与方法

(一)材料

青蒿琥酯：Artesunatum，分子式(C₁₉H₂₈O₈)，分子量384，纯度≥95％(by HPLC)；灯盏花素：Breviscapi，分子式(C₄₁H₆₈O₅₁)，分子量785，纯度≥95％(by HPLC)；红景天苷：Salidroside，分子式(C₁₄H₂₀O₇)，分子量300.30，纯度≥95％(by HPLC)；丹参酚酸B盐：Salvianolic acid B-Mg²⁺，分子式(C₃₆H₃₀O₁₆Mg)，分子量742，纯度≥95％(by HPLC)；粉防己碱：Tetrandrine，分子式(C₃₈H₄₂N₂O₆)，分子量623，纯度≥95％(byHPLC)；黄芪总甙：Astragaloside，分子式(C₄₁H₆₈O₅₁)，分子量785，纯度≥95％(by HPLC)。

以上除丹参酚酸B盐由中国科学院上海药物研究所提供外，其它均购自于南京泽朗医药科技有限公司。

人肝星状细胞株LX-2，其制备方法为：约15g重正常人肝脏组织先后经链酶蛋白酶和胶原酶消化后，由8.2％Nycodenz离心分离得肝星状细胞(HSC)。细胞用含10％胎牛血清的M199培养液培养。当细胞长满培养皿后，用胰蛋白酶和EDTA消化传代，每7-10传代一次。当HSC培养传到4代，将SV40T-抗原DNA转染入HSC，获得细胞株LX-1。该细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养7代后，与原代细胞相比形态发生明显变化，增殖加快。LX-2是以含1％胎牛血清的DMEM培养液培养半年后筛选得到的耐低血清(2％胎牛血清)培养的细胞株(具体参见L Xu，A Y Hui，E Albanis，M J Arthur，S M O’Byrne，WS Blaner，P Mukherjee，S L Friedman，F J Eng.Human hepatic stellate cell lines，LX-1and LX-2：new tools for analysisof hepatic fibrosis  Gut 2005；54：142-151.)。

0.1％I型胶原溶液(Col I，lot 107K2331)(美国sigma公司)。

PDGF(血小板衍生生长因子)，分子量12.4kDa，Cat.No.220BB，纯度＞97％(SDS PAGE)购于R&D Systems，Inc。

(二)方法

1.各中药组分浓度配制：

各中药组分均取20mg。

青蒿琥酯溶于5.2ml DMSO(二甲基亚砜)中，成10^-2mol/L储存液；灯盏花素溶于4.3mlDMSO中，成10^-2mol/L储存液；红景天苷溶于6.7ml DMSO中，成10^-2mol/L储存液；丹参酚酸B盐溶于3.7ml DMSO中，成10^-2mol/L储存液；粉防己碱溶于3.2ml DMSO中，成10^-2mol/L储存液；黄芪总甙溶于2.5ml DMSO中，成10^-2mol/L储存液。

上述各组分储存液均分别经0.45μm滤膜过滤除菌，以含3％FBS的DMEM培养基依次稀释为10^-4mol/L，10^-5mol/L，10^-6mol/L，10^-7mol/L共4个浓度梯度。

2.细胞迁移筛选实验(采用如图1所示的细胞迁移杯)

(1)细胞培养与药物孵育：

将LX-2用含10％FBS DMEM在Φ100mm的培养皿中培养至细胞密度达到80％左右。于迁移实验开始前24h，将细胞按表1或表2分组，每组1皿并将培养液更换为3％FBSDMEM。于迁移实验开始12h前，按照分组情况加入培养液或相应药物的浓度进行孵育，药物孵育时间为12h。

表1.单一中药组分筛选实验细胞分组和孵育用药

表2.6个中药组分的最佳浓度统一筛选实验细胞分组和孵育用药

(2)以I型胶原包被细胞迁移杯半透膜：

将I型胶原用DMEM以1∶100稀释至10μg/ml(Col I溶液)。取24孔板，加入Col I溶液600μl/孔；用无菌镊子取细胞迁移杯放入加有Col I溶液的培养孔内，在每个细胞迁移杯内加入Col I溶液400μl。放入恒温箱，37℃，45min。

(3)接种细胞：

从恒温箱中取出孵育培养24h的LX-2，用胰蛋白酶传代细胞后，用含3％FBS的DMEM重悬细胞并调整细胞数为2～4×10⁵个/ml。取出已包被Col I溶液的细胞迁移杯，吸弃细胞迁移杯内液体并用DMEM清洗2次，移入另一24孔板(每孔预加0.5ml含3％FBS的DMEM)。每个细胞迁移杯内加入300μl细胞悬液，放入CO₂培养箱，37℃，1h。

(4)药物配制与添加：

①PDGF的添加：将接种有LX-2的细胞迁移杯取出，吸弃上层培养液后移入另一24孔板，并依照表1或表2加药(每组3孔)；含PDGF各组中加入PDGF并使其终浓度为10ng/ml。

②单一中药组分筛选：将各中药组分(青蒿琥酯、灯盏花素、红景天苷、丹参酚酸B盐、粉防己碱或黄芪总甙)，依照表3加药(每组3孔)。每一中药组分的筛选实验均重复3次。

表3单一中药组分筛选实验药物添加表

③6个中药组分的最佳浓度统一筛选：以含3％FBS的DMEM配制；筛选出的各单一中药组分的最佳浓度，依照表4加药(每组3孔)。本实验重复3次。

表46个中药组分的最佳浓度统一筛选实验药物添加表

(5)细胞培养：

将加入各相应药物的培养装置放入CO₂培养箱，37℃，6h。

(6)细胞固定与染色：

取出细胞迁移杯，PBS清洗2次；医用消毒棉签轻轻擦去细胞迁移杯底部半透膜内侧面未迁移的细胞，PBS清洗2次；将其放入盛有4％多聚甲醛的24孔板内固定10min，PBS清洗1次；放入盛有苏木素的24孔板染色10min，PBS清洗2次；放入盛有100％酒精24孔板中固定1min；室温自然晾干。用手术刀片小心将半透膜自细胞迁移杯底部取下，置于载玻片上，中性树胶封片。

(7)细胞计数：

200倍显微镜下观察细胞，由上至下取5个视野计数。

(8)统计学方法：

将每样本5个视野细胞数相加，求得均数。用SPSS13.0统计软件进行数据分析处理，结果以

表示，采用单因素方差分析，Q检验。

(9)药物筛选原则：

①选择对细胞生长和形态无影响的中药组分浓度。

②在满足上条规定的前提下，选择同一中药组分同批迁移试验中迁移细胞数量少而有统计学差异的浓度低者，即抑制迁移效率最佳者。如各浓度间迁移细胞数量无统计学差异，则选择抑制迁移效果最佳者，即迁移细胞数量绝对值最小者。

③在筛选出的各中药组分最佳浓度的同批迁移实验结果中，选择有统计学差异抑制率最高者。

3.细胞生长和形态观察实验

在24孔板中培养LX-2，培养条件、时间和药物添加均同上述各细胞迁移筛选实验。各实验均重复3次。

二、结果

1.青蒿琥酯抑制PDGF致细胞迁移的浓度筛选

与空白组相比，PDGF组可有效诱导LX-2迁移，其差异有统计学意义(P＜0.05)。10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L和10^-7mol/L 4个浓度梯度的青蒿琥酯均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移(P均＜0.05)；但各组比较无统计学差异(见表5，图2A)。在与迁移实验同等条件下培养细胞，4个浓度的青蒿琥酯对细胞形态均无影响，空白组与各药物组细胞生长状态良好，细胞多成梭形或多边形、细胞边缘清晰，包浆清晰，未见胞体回缩等现象(见图2B)。遵从药物筛选原则，如各浓度间无统计学差异，则选择抑制迁移效果最佳者(即迁移细胞绝对值最小者)，即10^-4mol/L青蒿琥酯。

表5青蒿琥脂抑制细胞迁移的数量比较

注：与空白组比较，*：P＜0.05；与PDGF组比较，#：P＜0.05

2.灯盏花素抑制PDGF致细胞迁移的浓度筛选

与空白组相比，PDGF组可有效诱导LX-2迁移，其差异有统计学意义(P＜0.05)。10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L和10^-7mol/L 4个浓度的灯盏花素均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移(P均＜0.05)；但10^-4mol/L灯盏花素抑制迁移效果最佳与其它3个浓度相比均有统计学差异(P均＜0.05)(见表6，图3A)。在与迁移实验同等条件下培养细胞时，4个浓度的灯盏花素对细胞形态均无影响(见图3B)。遵从药物筛选原则，应首先选择有统计学差异者，即抑制迁移效率最佳者；因此，灯盏花素最佳药物浓度为10^-4mol/L。

表6灯盏花素抑制细胞迁移的数量比较

注：与空白组比较，*：P＜0.05；与PDGF组比较，#：P＜0.05；与10^-4mol/L灯盏花素组比较，▲：P＜0.05

3.红景天苷抑制PDGF致细胞迁移的浓度筛选

与空白组相比，PDGF组可有效诱导LX-2迁移，其差异有统计学意义(P＜0.05)。10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L和10^-7mol/L 4个浓度的红景天苷均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移(P均＜0.05)；10^-5mol/L红景天苷抑制LX-2迁移的作用最强，且与10^-4mol/L无统计学差异，这2组与10^-6mol/L和10^-7mol/L组之间有统计学差异(见表7，图4A)。在迁移同等条件下培养细胞时，4个浓度红景天苷对细胞形态均无影响(见图4B)。遵从药物筛选原则，首先选择有统计学差异者，即抑制迁移效率最佳者；因此，选择红景天苷最佳药物浓度为10^-5mol/L。

表7红景天苷抑制细胞迁移的数量比较

与空白组比较，*：P＜0.05；与PDGF组比较，#：P＜0.05；与10^-5mol/L红景天苷组比较，▲：P＜0.05

4.丹参酚酸B盐抑制PDGF致细胞迁移的浓度筛选

与空白组相比，PDGF组可有效诱导LX-2迁移，其差异有统计学意义(P＜0.05)。10^-4mol/L，10^-5mol/L，10^-6mol/L，10^-7mol/L四个浓度的丹参酚酸B盐均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移(P均＜0.05)；10^-4mol/L与10^-5mol/L丹参酚酸B盐这2组抑制作用相似，这2组与抑制作用较差的10^-6mol/L与10^-7mol/L组之间则有统计学差异(见表8，图5A)。在与迁移同等条件下培养细胞时发现，10^-4mol/L丹参酚酸B盐对细胞形态有影响，表现为部分细胞胞体回缩成圆形或卵圆形，其余3者对细胞形态均无影响(见图5B)。遵从药物筛选原则，舍弃10^-4mol/L丹参酚酸B盐，而选择有统计学差异的10^-5mol/L丹参酚酸B盐。

表8丹参酚酸B盐抑制细胞迁移的数量比较

与空白组比较，*：P＜0.05；与PDGF组比较，#：P＜0.05；与10^-5mol/L丹参酚酸B盐组比较，▲：P＜0.05

5.粉防己碱抑制PDGF致细胞迁移的浓度筛选

与空白组相比，PDGF组可有效诱导LX-2迁移，其差异有统计学意义(P＜0.05)。10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L和10^-7mol/L 4个浓度的粉防己碱均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移(P均＜0.05)；抑制迁移作用最强的10^-4mol/L组与其他3组之间有统计学差异，但10^-5mol/L组和10^-6mol/L组之间无统计学差异，抑制迁移作用最弱的10^-7mol/L组与其它3组比较均有统计学差异(见表9，图6A)。在与迁移同等条件下培养细胞时发现，10^-4mol/L组较正常培养的细胞包体回缩为小圆形且明显变小，胞浆内可见黑色颗粒状物质；10^-5mol/L组的部分细胞胞体亦明显回缩(见图6B)。遵从药物筛选原则，舍弃10^-4mol/L、10^-5mol/L粉防己碱，选择与10^-7mol/L组有统计学差异者即10^-6mol/L粉防己碱。

表9粉防己碱抑制细胞迁移的数量比较

与空白组比较，*：P＜0.05；与PDGF组比较，#：P＜0.05；与10^-6mol/L粉防己碱组比较，▲：P＜0.05

6.黄芪总甙抑制PDGF致细胞迁移的浓度筛选

与空白组相比，PDGF组可有效诱导LX-2迁移，其差异有统计学意义(P＜0.05)。10^-4mol/L、10^-5mol/L、10^-6mol/L和10^-7mol/L 4个浓度的黄芪总甙均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移(P均＜0.05)。10^-4mol/L组、10^-5mol/L组、10^-6mol/L组抑制作用相似无统计学差异，10^-7mol/L抑制作用较弱且与其它3组间有显著差异(P均＜0.05)(见表10，图7A)。在与迁移同等条件下培养细胞时发现，10^-4mol/L组部分胞体回缩成卵圆形，其余3组较正常组细胞形态无任何改变(见图7B)。遵从药物筛选原则，排除10^-4mol/L黄芪总甙，选择有统计学差异中的低浓度者，即抑制迁移效率最佳者；因此，选择黄芪总甙最佳药物浓度为10^-6mol/L。

表10黄芪总甙抑制细胞迁移的数量比较

与空白组比较，*：P＜0.05；与PDGF组比较，#：P＜0.05；与10^-6mol/L黄芪总甙组比较，▲：P＜0.05

7.各药物最佳浓度抑制PDGF致细胞迁移的筛选

基于药物筛选原则筛选出的各组分最佳浓度分别为：10^-4mol/L青蒿琥酯；10^-4mol/L灯盏花素；10^-5mol/L红景天苷；10^-5mol/L丹参酚酸B盐；10^-6mol/L粉防己碱；10^-6mol/L黄芪总甙。将各药物最佳浓度再统一筛选，比较结果显示：PDGF可有效诱导LX-2迁移，与空白组相比其差异有统计学意义(P＜0.05)；各药物组分均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移(P＜0.05)；其中10^-5mol/L红景天苷抑制迁移作用最佳，与其它各组比较均有显著性差异(P均＜0.05)，见表11和图8。

表11最佳药物及其浓度抑制细胞迁移的数量比较

与空白组比较，*：P＜0.05；与PDGF组比较，#：P＜0.05；与10^-5mol/L红景天苷比较，▲：P＜0.05

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述：

实施例1

按本领域技术人员公知的方法将本发明红景天苷制成片剂。红景天苷片剂，每片含红景天苷100mg，微晶纤维素100mg，微粉硅胶40mg，乳糖20mg，硬脂酸镁1.0mg用法：每次4-5片，每日2-3次，每周用药5-6天，每3-4周为一疗程。

实施例2

按本领域技术人员公知的方法将本发明红景天苷制成胶囊剂。红景天苷胶囊剂，每粒含红景天苷100mg。用法：每次4-5粒，每日2-3次，每周用药5-6天，每3-4周为一疗程。

实施例3

按本领域技术人员公知的方法将本发明红景天苷制成颗粒剂。红景天苷颗粒剂，每袋含红景天苷500mg，微晶纤维素100mg，微粉硅胶40mg，硬脂酸1.0mg，乳糖20mg。用法：每次1袋，每日2-3次，每周用药5-6天，每3-4周为一疗程。

实施例4

按本领域技术人员公知的方法将本发明红景天苷制成注射剂。红景天苷注射剂，每支含红景天苷500mg。用法：每次1支，每日1次，每周用药5-6天，每3-4周为一疗程。

Claims (3)

1.红景天苷在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红景天苷抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为10^-4mol/L～10^-7mol/L。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述红景天苷抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为10^-5mol/L。

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