CN101225374A

CN101225374A - 红景天及红景天苷在干细胞定向分化为肝系细胞中的应用

Info

Publication number: CN101225374A
Application number: CNA2008100595168A
Authority: CN
Inventors: 李连达; 欧阳竞锋; 吴理茂; 乔洪翔
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Beijing Ruicaotang Sansheng Pharmaceutical Co ltd Tangyin; Henan Guangkang Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2008-07-23
Anticipated expiration: 2028-01-25
Also published as: CN101225374B

Abstract

本发明提供了红景天及红景天苷在诱导干细胞定向分化为肝系细胞中的应用，尤其是红景天苷与细胞生长因子FGF－4组合作为诱导剂用于诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝系细胞。本发明开拓了红景天苷的新用途，即体外诱导骨髓干细胞等干细胞定向分化为肝系细胞；提供了红景天及红景天苷在诱导成体干细胞定向分化为肝系细胞中的作用，有利于体内干细胞移植治疗急慢性肝损伤及中晚期肝脏疾病领域的深入研究，为新药开发提供了基础。

Description

红景天及红景天苷在干细胞定向分化为肝系细胞中的应用

(一)技术领域

本发明涉及红景天尤其是红景天苷在诱导干细胞定向分化为肝系细胞中的应用。

(二)背景技术

红景天系景天(Crassulaceae)科红景天属(Rhodiola L.)植物，为多年生草本或亚灌木植物，主要分布在北半球的喜马拉雅山区、亚洲西北部和北美洲海拔在1,600～4,000米的地区。红景天药用历史悠久，素有“黄金人参”“神仙草”之称。药典记载红景天为景天科植物大花红景天的干燥根及根茎，其性甘、苦、平，益气活血、通脉平喘，可用于气虚血瘀、胸痹心痛、中风偏瘫和倦怠气喘。现代药理研究表明，红景天的生物活性与其所含的多种化学成分密不可分。

红景天苷(salidroside)是从红景天中分离提纯的天然产物，为一种单体化合物，是红景天的有效成分之一，部分相关科属中药也含红景天苷，其化学结构式为：

红景天苷单体的分离纯化方法：红景天粉为原料，以水为溶剂用微波法提取红景天苷。最佳工艺参数为：液固比20∶1，浸泡时间1.5h，低功率微波处理60s，磁力搅拌15min，提取2次，提取率可达90％(参见：微波辅助提取红景天苷，赵武奇殷涌光梁歧等，食品与发酵工业，2004，30(2)，19～22)。

药理作用：

提高和改善抗各种高原反应能力。

抗缺氧、抗疲劳作用。研究表明它通过维持5-HT含量正常化起到了抗中枢疲劳的作用。

抗衰老。具有抗氧化作用及体外清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力。

抑制大鼠肾小管上皮细胞及间质细胞向肌成纤维细胞转化，有效缓解肾间质损伤，防治肾间质纤维化。

抗肝纤维化作用。红景天苷可明显抑制乙醛刺激的HSC增殖及胶原基因的表达，在体外有显著的抗肝纤维化作用。

对心脑血管的保护作用。红景天苷可抑制大鼠缺血再灌注引起的白细胞介素1β表达的增加，减少脑缺血再灌注后脑组织中TNF-α的表达起到保护脑血管的作用；通过抑制血管ACE的表达，在一定程度上可抗心肌缺血。

提高机体免疫能力、抗肿瘤、抗病毒。

抗辐射。红景天苷有防护X射线辐射损伤机体组织和细胞膜的作用。

提高记忆力和防治老年痴呆，保护神经细胞。红景天苷可抑制缺氧缺糖损伤所致的线粒体膜电位和活性的降低，从而具有稳定线粒体膜电位的作用，抑制神经细胞凋亡的发生；体外促进神经干细胞向神经元方向分化为红景天药物用于相关神经系统疾病的临床治疗提供了实验依据。

降血糖和改善蛋白质、脂肪代谢。

目前还未有红景天及红景天苷具有诱导成体干细胞定向分化为肝系细胞的作用报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供红景天及红景天苷的新用途，即红景天及红景天苷诱导干细胞定向分化为肝系细胞的应用。

本发明的技术方案是：

红景天在制备诱导干细胞定向分化为肝系细胞诱导剂中的应用，如利用红景天诱导干细胞定向分化为肝系细胞(如肝细胞，胆管细胞等)。

本发明推荐以红景天中的有效成份红景天苷作为诱导成体干细胞定向分化为肝系细胞的诱导剂。红景天苷具有拟肝细胞生长因子(Hepatocyte grow factor，HGF)样作用。

通常的，本发明所述的干细胞为成体干细胞，所述的成体干细胞包括除造血干细胞外的骨髓间充质干细胞以及多种祖细胞，优选为骨髓间充质干细胞。

本发明所述应用为：将红景天苷与细胞生长因子FGF-4组合作为诱导剂用于诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝系细胞。

具体的，所述应用为：取大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养，取稳定传代的骨髓间充质干细胞于诱导培养基中，进行诱导培养，获得成熟肝细胞样细胞；所述诱导培养基为添加有红景天苷与细胞生长因子FGF-4的基础培养基，所述基础培养基中红景天苷与细胞生长因子FGF-4添加量为：红景天苷终浓度为1～5μM(优选为2μM)，细胞生长因子FGF-4终浓度为5～20ng/mL(优选为10ng/mL)。

优选的，所述的应用为：取大鼠骨髓间充质干细胞，进行传代培养，取第3代的骨髓间充质干细胞，接种于MSC培养基，37℃、5％CO2条件下培养至细胞汇合率大于90％，将细胞培养基更换为添加有2μM红景天苷与10ng/mL细胞生长因子FGF-4的基础培养基，诱导培养14天，得到成熟肝细胞样细胞。

所述MSC培养基本领域常见适用于骨髓间充质干细胞培养的培养基，本发明中选用：含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM Hepes、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的低糖DMEM培养基。

所述基础培养基为本领域常见适用于骨髓间充质干细胞诱导培养的基础培养基，本发明中采用：含2％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸(Hepes)、1×胰岛素-转铁蛋白-硒、200μg/L地塞米松、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

一种诱导干细胞定向分化为肝系细胞的诱导剂，所述的诱导剂含有红景天，本发明所述的诱导剂特别是指诱导剂中含红景天苷，或者含有红景天苷的同分异构体，或基团被修饰的单体化合物；另外，经实验验证，红景天苷元(即红景天苷去掉糖基，结构式如式(II)所示)，也具有类似的作用，也可以作为诱导剂用于诱导干细胞定向分化为肝系细胞。进一步本发明所述的诱导剂为红景天苷或红景天苷元与细胞生长因子FGF-4的组合物，具体应用时在基础培养基中添加量为：红景天苷终浓度2μM，细胞生长因子FGF-4终浓度10ng/mL，或者在基础培养基中添加量为：红景天苷元终浓度2μM，细胞生长因子FGF-4终浓度10ng/mL。

红景天苷诱导分化的细胞可为肝脏组织工程和细胞移植治疗肝脏疾病提供种子细胞，也可用于生物人工肝。

利用红景天苷促细胞分化剂作用，可将红景天苷用于体内干细胞移植，以治疗急慢性肝损伤以及中晚期肝脏疾病；也可构建高效率的药理药效筛选模型和毒理学研究模型，进行药物药理、药效和毒理学的初步筛选和评价；含红景天苷的细胞保存液也可用于肝脏细胞、骨髓细胞等种子细胞的贮存。

本发明在细胞层面上对红景天苷的药效学进行了严格的论证，对其中所蕴含的生物学信息进行了初步探讨，具有以下特点：

1、本发明开拓了红景天苷的新用途，即体外诱导骨髓干细胞等干细胞定向分化为肝系细胞；

2、红景天苷及红景天苷元可以用于体内干细胞移植过程中的促细胞分化剂，用以治疗急慢性肝损伤以及中晚期肝脏疾病，目前此实验正处于实验阶段，预计促细胞分化剂红景天苷的介入将有利于该领域的深入研究；

3、本发明明确了中药药理活性成分治疗疾病的物质基础；同时药效机制的阐明将为中药现代化开发拥有自主知识产权的新药提供借鉴。

本发明的有益效果主要体现在：提供了红景天及红景天苷在诱导成体干细胞定向分化为肝系细胞中的作用，有利于体内干细胞移植治疗急慢性肝损伤及中晚期肝脏疾病领域的深入研究，为新药开发提供了基础。

(四)附图说明

图1为呈梭形的骨髓间充质干细胞；

图2为呈漩涡状生长的骨髓间充质干细胞；

图3为不同诱导条件下甲胎蛋白(AFP)的表达；A：红景天苷+FGF-4联合诱导组；B：FGF-4单独诱导组；C：HGF+FGF-4联合诱导组；D：HepG 2阳性对照；

图4为不同诱导条件下CK18的表达；A：红景天苷+FGF-4联合诱导组；B：FGF-4单独诱导组；C：HGF+FGF-4联合诱导组；D：Hela细胞阳性对照组；

图5为不同诱导条件下糖原合成情况；A：FGF-4单独诱导组；B：HGF+FGF-4联合诱导组；C：红景天苷+FGF-4联合诱导组；

图6为不同诱导条件下谷丙转氨酶(ALT)分泌情况；

图7为不同诱导条件下谷草转氨酶(AST)分泌情况；

图8为不同诱导条件下尿素氮分泌情况。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

试剂及材料：

4周龄SD大鼠：浙江省医学科学院实验动物中心；

红景天苷及红景天苷元：中国药品生物制品检定所；

Percoll：Pharmacia公司；

低糖DMEM培养基：GIBCO公司；

高糖DMEM培养基：GIBCO公司；

胎牛血清：GIBCO公司；

Hepes(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸)：Amresco公司；

胰岛素/转铁蛋白/硒：Sigma公司；

地塞米松：Sigma公司；

HGF：Pepro Tech公司；

FGF-4：Pepro Tech公司。

实验步骤：

(1)骨髓干细胞的获取及其支持培养

乙醚麻醉后颈椎脱臼法处死SD大鼠(4周龄)，无菌取胫骨和股骨，剪开两端骨骺，不含血清的MSC培养液(即低糖DMEM培养基添加2mM谷氨酰胺、10mM Hepes和各100U/ml的青、链霉素)反复冲洗骨髓腔，400m筛网过滤，收集骨髓细胞。配制密度为1.073kg/L的Percoll溶液(先用9份密度为1.077kg/L的Percoll原液与1份8.5％NaCl或1.5M PBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15M PBS)稀释至Percoll浓度为60％，即可得密度为1.073kg/L的Percoll溶液)，密度梯度离心，收集中间的白膜层细胞即大鼠骨髓单个核细胞，以3×10⁵/cm²密度接种于培养瓶中，MSC培养液(为低糖DMEM培养基添加10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM Hepes、各100U/ml青、链霉素)，37℃饱和湿度、5％CO₂孵箱培养24h后换液，去除悬浮细胞。以后每3天换液1次，此时可见细胞呈梭型且呈漩涡状生长(图1、图2)。当细胞达60％～70％融合后采用不同的接种密度进行常规传代培养。

(2)红景天苷诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞

取培养第3代的MSCs，以5×10⁴/cm²密度接种于细胞培养皿(低糖DMEM培养基添加10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM Hepes、各100U/ml的青、链霉素)，37℃饱和湿度、5％CO₂孵箱培养；细胞汇合率大90％时，换成基础培养基(为高糖DMEM培养基添加2％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸(Hepes)、1×胰岛素-转铁蛋白-硒、200μg/L地塞米松、100U/ml青链霉素和100U/ml链霉素)；分为3个诱导组，在基础培养基中分别添加：

FGF-4单独诱导组：生长因子FGF-4 10ng/ml；

HGF+FGF-4联合诱导组：生长因子FGF-4 10ng/ml，HGF 20ng/ml；

红景天苷+FGF-4联合诱导组：生长因子FGF-4 10ng/ml，单体化合物红景天苷2μM；

每3天换液1次，并观察细胞形态的变化。于第7、14、21天分别收获细胞，提取蛋白检测甲胎蛋白(AFP)和CK18的表达情况(图3、图4)；于第14天后Periodic acid-Schiff法检测细胞内糖原合成(图5)。

实验结果及结论：

从红景天苷诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞的特异性蛋白(AFP，CK18)表达情况来看，诱导时间和物质表达情况之间具有明显的时效关系。

在诱导的第4天，AFP开始表达，在诱导的第7天达到高峰，接近阳性对照，在14天白蛋白表达，AFP已成阴性；CK18在第10天开始表达，第14天达到高峰，红景天苷+FGF-4组已经接近阳性对照组；糖原染色显示，红景天苷+FGF-4组糖原阳性率明显已经超过FGF-4单独诱导组及HGF+FGF-4联合诱导组。

(3)红景天苷衍生物(以红景天苷元为代表)诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞

取培养第3代的MSCs，以5×10⁴/cm²密度接种于细胞培养皿，培养条件同上实施例2；分为3个诱导组，在基础培养基中分别添加：

FGF-4单独诱导组：生长因子FGF-4 10ng/ml；

HGF+FGF-4联合诱导组：生长因子FGF-4 10ng/ml，HGF 20ng/ml；

红景天苷元+FGF-4联合诱导组：生长因子FGF-4 10ng/ml，单体化合物红景天苷元2μM；

每3天换液1次，并观察细胞形态的变化。于第14、21及28天分别收获细胞，取上清检测肝细胞特异性生化指标——谷丙转氨酶(ALT)(图6)及谷草转氨酶(AST)(图7)及尿素氮(图8)的分泌情况。

实验结果及结论：

从红景天苷元诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞的生化指标(ALT、AST和BUN)情况来看，诱导时间和物质表达情况之间具有明显的时效关系。ALT、AST和BUN随着诱导时间的延长，在诱导的第3、4周达到正常肝细胞的分泌水平。由此推测红景天苷及其衍生物均具有诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞的作用。

利用红景天苷及其衍生物红景天苷元(或者其它同分异构体及其基团被修饰的红景天苷)可以诱导骨髓干细胞定向分化为肝细胞，如果将其成功引入急慢性肝损伤以及晚期肝脏疾病(如肝衰竭)，通过大量增殖逐步恢复肝脏的正常功能，这将为治疗难治性肝脏疾病提供组织细胞来源；同时通过此法大量扩增肝细胞，可以进一步进行组织工程学等方面的研究。

本发明所公开的内容，可以满足本研究领域技术人员的应用，同时，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作出各种改动或者修改，这些基于本发明的操作同样落于本发明所限定的范围。

Claims

1.红景天在制备诱导干细胞定向分化为肝系细胞诱导剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于红景天中提取的红景天苷在制备诱导干细胞定向分化为肝系细胞诱导剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的干细胞为成体干细胞。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述成体干细胞为骨髓间充质干细胞。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：红景天苷与细胞生长因子FGF-4组合作为诱导剂用于诱导骨髓间充质干细胞定向分化为肝系细胞。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：取大鼠骨髓间充质干细胞进行传代培养，取稳定传代的骨髓间充质干细胞于诱导培养基中，进行诱导培养，获得成熟肝细胞样细胞；所述诱导培养基为添加有红景天苷与细胞生长因子FGF-4的基础培养基，所述基础培养基中红景天苷与细胞生长因子FGF-4添加量为：红景天苷终浓度为1～5μM，细胞生长因子FGF-4终浓度为5～20ng/mL。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：取大鼠骨髓间充质干细胞，进行传代培养，取第3代的骨髓间充质干细胞，接种于MSC培养基，37℃、5％CO₂条件下培养至细胞汇合率大于90％，将细胞培养基更换为添加有2μM红景天苷与10ng/mL细胞生长因子FGF-4的基础培养基，诱导培养14天，得到成熟肝细胞样细胞。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述MSC培养基为：含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM Hepes、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的低糖DMEM培养基；

所述基础培养基为：含2％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10mM Hepes、1×胰岛素-转铁蛋白-硒、200μg/L地塞米松、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的高糖DMEM培养基。

9.一种诱导干细胞定向分化为肝系细胞的诱导剂，其特征在于所述的诱导剂含有红景天。

10.如权利要求10所述的诱导剂，其特征在于所述的诱导剂含红景天苷元或红景天苷。