CN108795852A - 一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于皮肤细胞损伤修护技术领域，更具体地，涉及一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用。通过在特定的温度以及分离条件下，采用多阶段递增离心的方式执行3次以上的离心去除沉淀，直至获得所需的人肌肉细胞外泌体产品，制备方法简单易行。本发明提供的人肌母细胞外泌体来源于人肌母细胞，含有脂质、蛋白质、mRNA及miRNA等多种生物活性物质，对皮肤日常维护和损伤具有明显促修复作用，肌母细胞外泌体制作成冻干粉，便于储存和运输，亦可制作成各种护肤品或药物制剂使用，为人肌母细胞外泌体对皮肤保养和皮肤损伤修复提供可能。

Description

一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用
技术领域
本发明属于皮肤细胞损伤修护技术领域，更具体地，涉及一种人肌母细胞外泌体的制备方法、产品及其应用。
背景技术
皮肤老化和皮肤粘膜损伤在日常生活极为常见，创面可大可小，可深可浅，损伤部位各不相同。目前大面积的皮肤损伤治疗主要通过全身支持治疗、创面的清理及结痂切除和外科植皮等方法，传统的治疗方法虽然有一定效果但存在皮源紧张、易感染和巨大疤痕形成等问题。
近年来，细胞治疗皮肤粘膜损伤的医学研究得到广泛关注，特别是干细胞可以通过分化为皮肤细胞、汗腺细胞和旁分泌促进皮肤创伤的修复，在皮肤粘膜损伤修复中具有临床应用前景。然而，干细胞植入体内后定向分化仍有许多问题需要解决，长期应用安全性(如癌变、骨化等)问题不容乐观，而且活细胞的使用存在储存和运输困难等问题，因此寻找能够替代干细胞在组织损伤修复中起作用的细胞制品或细胞因子显得十分迫切。
外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的直径在40-100nm，密度在1.10-1.18g/ml的囊泡小体。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，因此外泌体在多种疾病中扮演生物标志物的角色。目前将外泌体应用于损伤修复领域，主要来源为各种干细胞。例如通过体内外实验发现，在二级烧烫伤动物模型中，人脐带间充质干细胞外泌体(hucMSC-Ex)能够增强伤口处的血管再生和修复，这一效果是通过Wnt4/β-Catenin途径实现的(Stem Cells Transl Med.2015,4(5):513-522.)。随后该团队进一步报道，人类脐带间充质干细胞外泌体中14-3-3zeta可介导YAP和P-LATS结合形成一个复合物促进YAP的磷酸化，与皮肤再生过程中外泌体Wnt4信号通路相互协作，hucMSC-Ex不仅可作为Wnt/β-catenin信号的“加速器”以促进受损皮肤组织的再生修复，而且可通过调节YAP控制皮肤再生作为该信号的“刹车”(Stem Cells.2016,34(10):2485-2500)。然而，作为仅有的外泌体来源的干细胞外泌体产量很低，而大面积烧烫伤临床用药需求大，因此亟需寻找到新的外泌体细胞来源。
另一方面，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤和试剂盒等方法实现外泌体的提取分离。超速离心法是最常用的外泌体分离手段，使用低速离心和高速离心交替进行的方法，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超速离心法因操作简单，获得的囊泡数量较多且不会影响外泌体的粒径而广受欢迎。但是超速离心法耗时长，回收率不好控制，另外操作不当还会导致得到的外泌体纯度受到影响，离心条件控制不当，重复离心操作也会对囊泡造成一定程度的损伤，降低获得的囊泡质量。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种人肌母细胞外泌体的制备方法及其应用，其充分结合外泌体在皮肤损伤修护应用中的特点和需求，针对性对外泌体的提取源、提取方法进行重新设计，相应获得了一种提取纯度高、质量好的人肌母细胞外泌体提取方法，而且将该肌母细胞外泌体用于皮肤损伤修复时取得了良好的效果，由此解决了现有高速离心法提取外泌体时由于离心条件控制不当造成的外泌体纯度以及质量受到影响，以及现有的干细胞体外培养产量低，不能满足应用需求的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种人肌母细胞外泌体的制备方法，其特征在于，该方法采用人肌母细胞作为外泌体的来源，将人肌母细胞分化培养的上清液通过递增离心的方式执行3次以上的多步离心分离操作，直至获得所需的外泌体产品。
优选地，对于所述多步离心分离操作而言，其优选采用以下过程来实现：
S10、在0℃～4℃的温度下，将人肌母细胞分化培养的上清液在300g～3000g的离心力条件下离心10min～30min，去除沉淀并收集获得第一上清液A；
S20、在保持恒温的情况下，将该第一上清液A在10000g～12000g的离心力条件下继续离心60min～200min，去除沉淀并收集获得第二上清液B；
S30、在保持恒温的情况下，将该第二上清液B在100000g～120000g的离心力条件下继续离心120min以上，然后收集沉淀且将其作为最终制备的人肌母细胞外泌体产品。
优选地，所述的制备方法，还包括步骤：
S40、将所述人肌母细胞外泌体制成冻干粉，然后将所述冻干粉制成人肌母细胞外泌体制剂，所述制剂优选为片剂、颗粒剂、胶囊剂、喷雾剂、溶液剂、浸膏剂或软膏剂。
优选地，对于所述多步离心分离操作而言，其进一步优选采用以下过程来实现：
S101、在0℃～4℃的温度下，将人肌母细胞分化培养的上清液首先在300g～500g的第一离心力下离心5min～30min，去除沉淀并收集获得上清液A1；
S102、接着将该上清液A1在2000g～3000g的第二离心力下离心10min～40min，去除沉淀并收集获得所述第一上清液A；
S201、在保持恒温的情况下，将该上清液A在10000g～12000g的第三离心力条件下继续离心60min～100min，去除沉淀并收集获得上清液B1；
S202、接着在保持温度和第三离心力条件不变的情况下，对该上清液B1继续离心60min～100min，去除沉淀并收集获得所述第二上清液B；
S301、在保持恒温的情况下，首先将该第二上清液B采用孔径为0.22μm以下的无菌滤膜执行过滤；
S302、接着在保持恒温的条件下，将执行过滤后的所述第二上清液B继续在100000g～120000g的第四离心力条件下离心60min～120min，弃上清液，收集沉淀；
S303、向步骤S302所述沉淀加入PBS重混后，接着在保持温度和第四离心力条件不变的情况下，离心60min～120min，弃上清液，最后收集沉淀且将其作为最终制备的人肌母细胞外泌体产品。
按照本发明的另一个方面，提供了一种护肤产品，该护肤产品的主要组分为人肌母细胞外泌体，所述人肌母细胞外泌体通过对皮肤细胞促增值和抑凋亡，用于皮肤细胞的修复和/或更新。
按照本发明的另一个方面，提供了一种药品，其特征在于，该药品的主要组分为人肌母细胞外泌体，所述人肌母细胞外泌体用于优选烫伤创面之类的皮肤粘膜创面的抗菌消炎、促进创面愈合和/或疤痕修复。
优选地，所述人肌母细胞外泌体通过以下机理实现皮肤粘膜创面愈合和/或疤痕修复愈合：促进创面组织完成表皮再生，促进新生血管和细胞的再生，优化皮肤组织胶原的产生，从而而减少瘢痕的形成。
按照本发明的另一个方面，提供了一种人肌母细胞外泌体的制备方法，该制备方法包括下列步骤：
(1)肌母细胞培养
将人肌母细胞置于盛有37℃±1℃的温水的无菌离心管中，加入5mL-7mL完全培养基，混匀后1000rpm-1500rpm离心2-4min，离心结束后在底部细胞部分加入4mL-6mL完全培养基，将混匀好的细胞转移至37℃±1℃、4％-6％CO2培养箱中，第二天更换培养基；
(2)肌母细胞传代
待细胞密度达到75％时进行传代，加入PBS洗掉残存的完全培养基，随后加入0.4-0.6mL EDTA胰蛋白酶，将细胞转移至培养箱中消化2-3min，严格控制消化时间后迅速加入4-6mL完全培养基终止消化，将肌母细胞从壁上吹下来后转移到无菌离心管中，1000-1500rpm离心2-4min，结束后按十分之一的比例传代；
(3)肌母细胞诱导分化
细胞密度达到75％时，在1％-2％马血清或1％-2％马血清以及0.2％-0.4％胰岛素的DMEM高糖培养基中进行诱导分化，每1-2天换一次液，并收集分化培养后的培养基，7-9天后结束分化，获得人肌母细胞分化培养的上清液。
优选地，步骤(3)在1％马血清和0.3％胰岛素的高糖DMEM培养基中进行诱导分化
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的制备方法制备得到的人肌母细胞外泌体在制作护肤产品或在制备治疗皮肤粘膜损伤修复的药物中的应用。
优选地，所述护肤产品用于皮肤细胞的修复和/或更新。
优选地，所述护肤产品用于皮肤的美容、除皱、祛斑、美白、防皱和祛除皮肤细小疤痕中的至少一种。
优选地，用于皮肤粘膜创面抗菌消炎、促进创面愈合和/或疤痕修复。
优选地，用于动物或人烫伤皮肤粘膜创面抗菌消炎、促进创面愈合和/或疤痕修复。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明提供了一种可大规模生产人肌母细胞外泌体的制备方法，通过在特定的温度以及分离条件下，通过多级递增离心分离提取得到，制备方法简单易行。本发明的肌母细胞能在体外大规模培养，且在一定条件刺激下能大量产生外泌体，比干细胞外泌体更能满足临床应用需要。
(2)针对选定的大鼠深Ⅱ度烫伤模型开展动物实验，经过四周的给药和观察后，发现本发明提出的人肌母细胞外泌体在直观和组织结构上均能显著促进大鼠深Ⅱ度烫伤创面的愈合。对角质细胞的表面标记CK19、增殖核抗原PCNA和新生血管标记CD31进行分析发现，本发明提出的人肌母细胞外泌体能促进烫伤创面组织更快更完整地完成表皮再生的过程并能提前和促进新生血管和细胞的大量再生，对各组胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的mRNA表达的分析发现，该外泌体在烫伤创面愈合过程中，能优化皮肤组织胶原的产生，减少瘢痕的形成。
(3)研究本发明提出的人肌母细胞外泌体对于体外热激受损的成纤维细胞3T3-L1和L929的作用，细胞计数和蛋白免疫印迹结果显示该外泌体在该模型中对受损细胞具有明显的促增值和抑凋亡作用。
(4)本发明提供的人肌母细胞外泌体来源于人肌母细胞，含有脂质、蛋白质、mRNA及miRNA等多种生物活性物质，通过实验证实本发明提供的人肌母细胞外泌体对于皮肤的热激损伤、深度烫伤以及皮肤日常维护均具有明显促修复、促更新的作用。
(5)本发明提供的肌母细胞外泌体通过制作成冻干粉，便于储存和运输，亦可制作成各种护肤品或药物制剂使用，为人肌母细胞外泌体对皮肤保养和皮肤损伤修复提供可能。
附图说明
图1为本发明人肌母细胞外泌体提取方法流程图；
图2为本发明实施例1人肌母细胞随时间分化图(标尺：100μm)；
图3为本发明实施例1提取得到的人肌母细胞外泌体透射电镜图(标尺：100nm)；
图4为实施例8的人肌母细胞外泌体治疗热激损伤成纤维细胞3T3-L1时该细胞数量随时间的变化结果图；
图5为实施例8的人肌母细胞外泌体治疗热激损伤成纤维细胞L929时该细胞数量随时间的变化结果图；
图6为实施例8蛋白免疫印迹分析PCNA及Bcl-2在3T3-L1和L929细胞的表达水平；
图7是实施例9肌母细胞外泌体对深II度烫伤创面治疗效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
肌母细胞是肌肉组织的前体细胞，来源于中胚层，在胚胎发育过程中先由间充质细胞分化为肌母细胞，然后分裂、融合成多核肌纤维，形成肌小管，再进一步分化为成熟的骨骼肌细胞。本发明依托目前取得很大突破的人肌肉组织培养技术，在一定时间内获得纯度高，活力强，数量巨大的肌母细胞，在此基础上进行条件培养基处理，肌母细胞分泌大量的外泌体，提取分离后将其应用于制作护肤品取得良好的皮肤养护作用，且在皮肤粘膜损伤实验治疗中，取得了良好的疗效。
本发明提到的外泌体是由人肌母细胞分泌，并通过一定的步骤提取，制备成冻干粉后可以在低温下(0-4℃)长期保存，亦可制备成各种护肤制品或药物制剂，具有极佳市场前景的临床应用价值。本发明提供的人肌母细胞外泌体从人肌母细胞分化培养的培养上清液中提取，提取过程在温度为0～4℃下进行；人肌母细胞分化培养使用的人肌母细胞取自于健康人供体。本发明人肌母细胞外泌体提取步骤流程图如图1所示。本发明首先从人肌母细胞分化培养获得培养上清液，具体按照如下方法进行：
(1)肌母细胞复苏：取出冻存的肌母细胞，将其置于37℃热水中，融化后转移到无菌离心管中，加入5-7mL完全培养基，混匀后1000-1500rpm离心2-4min，离心结束后在底部细胞部分加入4-6mL完全培养基，将混匀好的细胞转移至37℃、5％CO2培养箱中，第二天更换培养基；
(2)肌母细胞传代：待细胞密度达到75％时进行传代，加入PBS洗掉残存的完全培养基，随后加入0.4-0.6mL EDTA胰蛋白酶，将细胞转移至培养箱中消化2-3min，严格控制消化时间后迅速加入4-6mL完全培养基终止消化，将肌母细胞从壁上吹下来后转移到无菌离心管中，1000-1500rpm离心2-4min，结束后按十分之一的比例传代；
(3)肌母细胞诱导分化：细胞密度达到75％时，在1％-2％马血清或1％-2％马血清以及0.2％-0.4％胰岛素的DMEM高糖培养基中进行诱导分化，每1-2天换一次液，并收集分化培养后的培养基，7-9天后结束分化。实验发现在1％马血清和0.3％胰岛素的高糖DMEM培养基中进行诱导分化能诱导人肌母细胞快速稳定分化。实验证明本发明使用的分化诱导条件可以成功诱导人肌母细胞分化，且人肌母细胞能在此条件下稳定分化。
本发明涉及的肌母细胞来源的外泌体获取的具体步骤如下：
S10、将人肌母细胞分化培养的培养上清液在300～3000g的离心力下离心去除沉淀，收集上清液A；300～3000g的离心力可以去除培养上清液中的细胞及较大的细胞碎片；此步骤可以重复多次以增强分离效果；作为较佳的方案，该步骤可以进一步分级进行，按照如下子步骤：
S101、所述培养上清液在300～500g的离心力下离心5～30min，收集上清液A1，弃沉淀；
S102、上清液A1在2000～3000g的离心力下离心10～40min，收集上清液A，弃沉淀。
S20、上清液A在10000～12000g的离心力下离心去除沉淀，收集上清液B；10000～12000g的离心力可以去除培养上清液中的微小细胞碎片、细胞器、分子量较大的蛋白质等；此步骤可以重复多次以增强分离效果；作为较佳的方案，该步骤可以进一步分级进行，按照如下子步骤：
S201、上清液A在10000～12000g的离心力下离心60～100min，收集上清液B1，弃沉淀；
S202、上清液B1在10000～12000g的离心力下离心60～100min，收集上清液B，弃沉淀。
S30、上清液B过0.22μm以下优选0.22μm的无菌滤膜后转移至超速离心管中，严格配平(±0.02g)，在100000～120000g的离心力下离心，收集沉淀获得人肌母细胞外泌体；此步骤可以重复多次以增强分离效果。作为较佳的方案，该步骤可以进一步分级进行，按照如下子步骤：
S301、上清液B在100000～120000g的离心力下离心60～120min，弃上清液，收集沉淀；
S302、沉淀加入PBS重混后，100000～120000g离心60～120min，弃上清液，收集沉淀得到人肌母细胞外泌体。
首先选择较低离心力300～3000g去掉细胞碎片，随后使用10000～12000g离心力进一步去除死亡细胞和大的细胞残骸。10000～12000g离心力低速离心之后，使用0.22μm的无菌滤膜过滤获得的上清，这一步骤非常重要，可以将细胞碎片和大的细胞外囊泡全部去掉，由于我们样品是非粘稠状液体，故这一步并不会造成外泌体的损失，获得的外泌体纯度高，质量好。结果表明经过上述分离方法得到的人肌母细胞细胞来源的囊泡符合外泌体的粒径及典型结构。使用WB对外泌体标记蛋白CD63和TSG101表达情况进行分析。结合透射电镜结果，证明本发明的超速离心法可以成功从分化肌母细胞条件培养基中分离出外泌体。
将上述外泌体在制成护肤品或用于治疗皮肤粘膜损伤的药品时，优选的方案，可以先将提取得到的外泌体加入赋形剂冷冻干燥制备成人肌母细胞外泌体冻干粉。比如按照如下方法将人肌母细胞外泌体制成冻干粉：取人肌母细胞外泌体，加入辅料混合，滤膜过滤，滤膜孔径优选为0.22μm，0.22微米孔径的滤膜过滤除掉细菌和大颗粒，先经低温预冷冻，然后在160～200μbar的真空度、-10℃～6℃的条件下升华干燥10～40h，在180～250μbar的真空度、30～35℃解析干燥6～8h。其中辅料可以为药用甘露醇、药用右旋糖酐、药用海藻糖、聚乙二醇和葡萄糖中的一种或几种的混合物。
本发明提取得到的人肌母细胞外泌体可以用于制作护肤品，用于皮肤细胞的修复、更新，包括用于皮肤的美容、除皱、祛斑、美白、防皱、祛除皮肤细小疤痕中的至少一种，可以制作成各种产品形态，包括注射剂、水剂、膏剂、栓剂、霜剂和面膜，也可以制成赋形剂、保湿剂、防腐剂、增白剂、增稠剂和乳化剂中的至少一种。实验发现本发明从人肌母细胞提取得到的外泌体包含细胞修复因子，其能够促进皮肤细胞的增殖和更新。该外泌体为纳米级尺寸，当涂抹至皮肤表面时，其能够迅速进入皮下组织，促进皮下细胞的增殖和更新，外层细胞脱落，新生细胞再生，从而达到美白、除皱、祛斑、防皱、祛除皮肤细小疤痕等目的。
本发明提取得到的人肌母细胞外泌体也可以用于制备治疗皮肤粘膜损伤的药品，包括抗生素、抗病毒、抗感染的药物，用于皮肤粘膜创面抗菌消炎，促进创面愈合和疤痕修复。对于热激损伤比如晒伤的皮肤，或者深度烫伤的皮肤，实验证明本发明提供的人肌母细胞外泌体具有良好的损伤修复效果，不留任何疤痕。
烧烫伤是皮肤损伤中最具毁灭性的形式之一，给病人也带来极大的生理和心理上的痛苦，而社会经济的发展使得人类对于皮肤也越来越重视，但是在临床上针对大面积烧烫伤的治疗还有其很大局限性。近年来，细胞治疗皮肤烧烫伤的医学研究得到广泛关注，特别是干细胞可以通过分化为皮肤细胞、汗腺细胞和旁分泌促进皮肤创伤的修复，在烧烫伤的修复中具有临床应用前景。然而，干细胞植入体内后定向分化仍有许多问题需要解决，长期应用安全性(如癌变、骨化等)问题不容乐观，而且活细胞的使用存在储存和运输困难等问题。后来研究者们发现在干细胞移植中，其分泌的外泌体发挥十分关键的作用。然而，大面积烧烫伤临床需求用药量大，而各种干细胞来源的外泌体产量都不理想，且干细胞体外大规模培养也较复杂，这限制了干细胞来源外泌体在烧烫伤领域的发展。本发明通过实验发现人肌母细胞外泌体对受损细胞具有明显的促增值和抑凋亡作用，且促进烫伤创面组织更快更完整地完成表皮再生的过程并能提前和促进新生血管和细胞的大量再生，该外泌体在烫伤创面愈合过程中，能优化皮肤组织胶原的产生，减少瘢痕的形成。本发明利用肌母细胞可以体外大规模培养的优势，在特定培养条件下可以产生大量的外泌体，该外泌体来源单一，质量可控，且解决现有技术中细胞治疗皮肤烧烫伤时存在的免疫排斥反应、活细胞的储存和运输困难等问题，并因此建立一种肌母细胞外泌体的制备方法，针对烧烫伤的治疗在大鼠上进行动物实验，初步探讨肌母细胞来源外泌体在烧烫伤中的作用，进而为肌母细胞外泌体应用于临床烧烫伤提供一种新思路和方案。
以下为实施例：
实施例1
肌母细胞诱导分化方法如下：
肌母细胞复苏：取出液氮中冻存的人肌母细胞，迅速将其置于37℃热水中。完全融化后转移到15mL无菌离心管中，加入6mL配制好的完全培养基，混匀后1200rpm常温离心3min，离心结束后在底部细胞部分加入5mL完全培养基，轻轻吹打混匀之后转至25cm2细胞培养瓶中。将混匀好的细胞转移至37℃、5％CO2培养箱中，第二天更换培养基。
肌母细胞传代：待细胞密度达到75％时进行传代。在超净工作台中倒掉培养瓶里的培养基，注意不要碰到瓶口。在培养瓶中加入5mL PBS洗掉残存的完全培养基，随后加入0.5mL EDTA胰蛋白酶，将细胞转移至培养箱中消化2-3min，严格控制消化时间后取出培养瓶迅速加入5mL完全培养基终止消化，将肌母细胞从壁上轻轻吹下来后转移到15mL无菌离心管中，1200rpm离心3min，结束后按十分之一的比例传代。
肌母细胞诱导分化：细胞密度达到75％时进行诱导分化(10cm细胞培养皿中肌母细胞密度达到75％时细胞数为2×106个)。取以下四种分化诱导条件进行比较：1％马血清、2％马血清、1％马血清和0.3％胰岛素以及2％马血清和0.3％胰岛素的DMEM高糖培养基。每两天换一次液，并收集分化培养后的培养基，8天后结束分化，获得从人肌母细胞分化培养的上清液。
实验发现分化的人肌母细胞可分泌大量外泌体。其中1％马血清和0.3％胰岛素的高糖DMEM培养基能诱导人肌母细胞快速稳定分化。人肌母细胞随时间分化结果如图2所示，未分化前，人肌母细胞呈标准的细胞系形态，人肌母细胞分化起始密度严格控制在80％左右，细胞密度过低，细胞无法核融合，无法分化；细胞密度过高，细胞之间相互接合后也会导致细胞去分化。在上述诱导条件中，人肌母细胞第2-4天开始出现细胞融合现象并开始形成肌管(图2中箭头所示)，至第8天，基本已经分化完全，后续细胞形态未见有明显改变。上述实验结果表明，本发明使用的分化诱导条件可以成功诱导人肌母细胞分化，且人肌母能在此条件下稳定分化。
从上述培养上清液中离心提取人肌母细胞外泌体，具体步骤如下：
1)、人肌母细胞分化培养的培养上清液，在500g的离心力下离心30min，收集上清液A1，弃沉淀；
2)、上清液A1在3000g的离心力下离心10min，收集上清液A，弃沉淀；
3)、上清液A在10000g的离心力下离心100min，收集上清液B1，弃沉淀；
4)、上清液B1在12000g的离心力下离心60min，收集上清液B，弃沉淀；
5)、上清液B过0.22μm无菌滤膜后转移至超速离心管中，严格配平(±0.02g)在100000g的离心力下离心120min，弃上清液，收集沉淀；
6)、沉淀加入PBS重混后，120000g离心60min，弃上清液，收集沉淀；PBS混悬后的外泌体，少量-80℃保存，进行相应的指标检测，大部分进入低温冷冻干燥程序。
首先选择500g和3000g较低离心力去掉细胞碎片，随后使用10000g离心力进一步去除死亡细胞和大的细胞残骸。较低速离心之后，使用0.22μm的无菌滤膜过滤获得的上清，这一步骤非常重要，可以将细胞碎片和大的细胞外囊泡全部去掉，由于我们样品是非粘稠状液体，故这一步并不会造成外泌体的损失，获得的外泌体纯度高，质量好。通过采用透射电镜对获得的样品进行观察，电镜视野中有略小于100nm的圆形或椭圆形茶托样结构，可以较清楚地看到外泌体的双层膜结构，立体结构清晰，如图3所示。结果表明经过上述分离方法得到的人肌母细胞细胞来源的囊泡符合外泌体的粒径及典型结构。
使用WB(蛋白质免疫印迹方法)对外泌体标记蛋白CD63和TSG101表达情况进行分析。从分化的人肌母细胞条件培养基里提取出的外泌体高表达外泌体经典标记蛋白CD63和TSG101。细胞样品中这两个蛋白均有表达，其中CD63表达相对较弱，TSG101表达比外泌体中弱，而内质网标记蛋白Calnexin表达较强，肌母细胞外泌体不表达Calnexin内质网标记蛋白，证明其符合外泌体的生物学起源特征。结合透射电镜结果，得出结论：本发明的超速离心法可以成功从分化肌母细胞条件培养基中分离出外泌体。
通过BCA蛋白浓度检测方法测得该外泌体产量约为2mg外泌体蛋白/1000mL条件培养基，通过扩大细胞培养后能够获得足量的外泌体满足后续实验需求，证明该方法在人肌母细胞来源外泌体中的分离方案中是可行的。
冷冻干燥步骤具体如下：
1)、取提取的人肌母细胞外泌体，加入药用甘露醇至终浓度(质量分数)为10％，所述辅料为：药用右旋糖酐、药用海藻糖、聚乙二醇、葡萄糖中的一种或几种的混合物。
2)、混匀后，过孔径为0.22μm的滤膜，分装后置于冷冻干燥机低温仓，以1～2℃/min速度降温至-40℃，-40℃维持8h；
3)、开启真空，进入升华干燥阶段，使干燥箱获得维持在160μbar，冷凝器温度控制在-60℃；给搁板升温，搁板温度逐步上升至-10℃，升华干燥时间为24h；
4)、调整干燥箱内的真空度，进入解析干燥阶段；真空度维持在180μbar，搁板温度由-10℃升至30℃，解析干燥时间为6h，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到人肌母细胞外泌体冻干粉。
制得的人肌母细胞外泌体冻干粉的性状表征如下：外观疏松细腻洁白块状物，振摇后从瓶壁脱落而不散开，加水后复溶性好。
实施例2
取健康人供体、生长良好的人肌母细胞，用无血清培养基培养5天，每天收集培养上清液，更换新的无血清培养基，连续收集第3～5天的培养上清液用于外泌体的提取，此时肌母细胞由圆形变成梭形，肌小管形成，继而形成幼稚肌纤维。
在温度为0℃～4℃下，离心提取人肌母细胞外泌体，具体步骤如下：
1)、人肌母细胞分化培养的培养上清液，在300g的离心力下离心5min，收集上清液A1，弃沉淀；
2)、上清液A1在2000g的离心力下离心40min，收集上清液A，弃沉淀；
3)、上清液A在12000g的离心力下离心60min，收集上清液B1，弃沉淀；
4)、上清液B1在10000g的离心力下离心100min，收集上清液B，弃沉淀；
5)、上清液B过0.22μm无菌滤膜后转移至超速离心管中，严格配平(±0.02g)在120000g的离心力下离心60min，弃上清液，收集沉淀；
6)、沉淀加入PBS重混后，100000g离心120min，弃上清液，收集沉淀；PBS混悬后的外泌体，少量-80℃保存，进行相应的指标检测，大部分进入低温冷冻干燥程序。
冷冻干燥步骤具体如下：
1)、取提取的人肌母细胞外泌体，加入辅料至终浓度(质量分数)为12％，所述辅料为：药用右旋糖酐、药用海藻糖的质量1∶1混合物。
2)、混匀后，过孔径为0.22μm的滤膜，分装后置于冷冻干燥机低温仓，以1～2℃/min速度降温至-40℃，-40℃维持3h；
3)、开启真空，进入升华干燥阶段，使干燥箱获得维持在200μbar，冷凝器温度控制在-50℃；给搁板升温，搁板温度逐步上升至6℃，升华干燥时间为20h；
4)、调整干燥箱内的真空度，进入解析干燥阶段；真空度维持在250μbar，搁板温度由6℃上升至35℃，解析干燥时间为4h，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到人肌母细胞外泌体冻干粉。
制得的人肌母细胞外泌体冻干粉的性状表征如下：外观疏松细腻洁白块状物，振摇后从瓶壁脱落而不散开，加水后复溶性好。
实施例3
取健康人供体、生长良好的人肌母细胞，用无血清培养基培养5天，每天收集培养上清液，更换新的无血清培养基，连续收集第3～5天的培养上清液用于外泌体的提取，此时肌母细胞由圆形变成梭形，肌小管形成，继而形成幼稚肌纤维。
在温度为0℃～4℃下，离心提取人肌母细胞外泌体，具体步骤如下：
1)、人肌母细胞分化培养的培养上清液，在400g的离心力下离心15min，收集上清液A1，弃沉淀；
2)、上清液A1在2500g的离心力下离心30min，收集上清液A，弃沉淀；
3)、上清液A在11000g的离心力下离心80min，收集上清液B1，弃沉淀；
4)、上清液B1在11000g的离心力下离心80min，收集上清液B，弃沉淀；
5)、上清液B过0.22μm无菌滤膜后转移至超速离心管中，严格配平(±0.02g)在110000g的离心力下离心90min，弃上清液，收集沉淀；
6)、沉淀加入PBS重混后，110000g离心90min，弃上清液，收集沉淀；PBS混悬后的外泌体，少量-80℃保存，进行相应的指标检测，大部分进入低温冷冻干燥程序。
冷冻干燥步骤具体如下：
1)、取提取的人肌母细胞外泌体，加入辅料至终浓度(质量分数)为9％，所述辅料为：药用甘露醇、聚乙二醇、葡萄糖中的质量2∶1∶1混合物。
2)、混匀后，过孔径为0.22μm的滤膜，分装后置于冷冻干燥机低温仓，以1～2℃/min速度降温至-40℃，-40℃维持5h；
3)、开启真空，进入升华干燥阶段，使干燥箱获得维持在180μbar，冷凝器温度控制在-55℃；给搁板升温，搁板温度逐步上升至4℃，升华干燥时间为22h；
4)、调整干燥箱内的真空度，进入解析干燥阶段；真空度维持在240μbar，搁板温度由4℃上升至34℃，解析干燥时间为5h，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到人肌母细胞外泌体冻干粉。
制得的人肌母细胞外泌体冻干粉的性状表征如下：外观疏松细腻洁白块状物，振摇后从瓶壁脱落而不散开，加水后复溶性好。
实施例4
取健康供体肌肉，依据文献报道的肌母细胞培养方法进行培养，获得大量的高活力、高纯度肌母细胞，随后转入分化培养基中培养，每天收集上清液，共3-5天；
将收集的上清液在4℃情况下展开以下步骤：
(1)、上清液300g离心10min，收集上清液，弃沉淀；
(2)、上清液3000g离心30min，收集上清液，弃沉淀；
(3)、上清液10000g离心100min，收集上清液，弃沉淀；
(4)、上清液过0.22μm无菌滤膜后转移至超速离心管中，严格配平(±0.02g)100000g离心100min，弃上清液，收集沉淀；
(5)、沉淀加入PBS重混后，120000g离心120min，弃上清液，收集沉淀；沉淀用PBS混悬得到外泌体混悬液；分成2份，1份用于测定外泌体蛋白含量，另1份用于制备成冻干粉；
(6)步骤5的外泌体混悬液加入甘露醇至终浓度为10％，混匀后，过孔径为0.22μm的滤膜；
(7)分装后置于冷冻干燥机冷冻仓，以1-2℃/min速度降温至-40℃，-40℃维持2h；然后开启真空，使干燥箱获得必要的真空度，建立真空干燥的压力条件，给搁板升温，向产品提供冰晶升华需要的能量。本次试验干燥箱真空度维持在160-200μbar，冷凝器温度控制在-50℃--60℃，搁板温度由-40℃逐步上升至6℃，时间为20-24h，随后进入解析干燥阶段；搁板温度由6℃上升至35℃，真空度维持在220-250μbar，时间为4-6h，当制品温度与搁板温度相差1-2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到人肌母细胞外泌体冻干粉。
实施例5
含人肌母细胞外泌体的水剂形式护肤产品制备。
水剂形式护肤产品的主要组成成分(w/v)包括：1-5％甘油；1-10％丙二醇，作为增稠剂；1-2％吐温80；0.05-0.2％对羟基苯甲酸乙酯；0.001-0.1％人肌母细胞外泌体冻干粉。
例如，1-5g甘油；1-10g丙二醇；1-2g吐温80；0.1g对羟基苯甲酸乙酯与60ml纯净水溶合，再加入1-10μg人肌母细胞外泌体冻干粉，加入5ml0.01MPBS，混合后补水至100ml终体积。0.45μm滤膜过滤除菌和不溶物，完成水制剂形式的含人肌母细胞外泌体护肤产品的制备流程。
将制成的含人肌母细胞外泌体水剂，可以作为喷雾剂、洗发水、露；润肤水、柔肤水、爽肤水、化妆水等，可以喷、涂的方法，用于面部、颈部、皮肤外部或全身，使人肌母细胞外泌体与人体细胞接触，外泌体通过融合方式进入细胞，释放细胞因子，达到美容、美白、保湿作用，加速皮肤的营养更新和修复目的。
随着卡泊姆1342浓度逐渐增加，水剂慢慢转换成半透明的水凝胶形式，从而构成油乳剂、洗发露等。
实施例6
含人肌母细胞外泌体的膏、霜剂形式护肤产品制备。
类白色霜膏剂的制备，主要组成成分(w/v)包括：1-10％甘油；2-10％凡士林；1-2％羊毛脂；1-5％吐温80；1％-10％PEG400；1-5％甘油单硬脂酸酯；0.1-1％尼泊金乙酯；0.001-0.1％人肌母细胞外泌体冻干粉。
例如，5％甘油、10％凡士林、2％羊毛脂、1％吐温、5％PEG400、2％甘油单硬脂酸酯、0.2％尼泊金乙酯和60ml纯净水混合加热均质乳化，再加入1-10μg人肌母细胞外泌体冻干粉，加入5ml 0.01MPBS，混合后补水至100ml终体积，均质均匀后0.45μm滤膜过滤除菌和不溶物，完成一种乳剂制剂形式的含人肌母细胞外泌体的护肤产品制备流程。这一制剂可用于面霜、眼霜、防晒霜、雪花膏、面膏、眼膏、唇膏等的制备，加入曲酸、光果甘草定、Vc、Ve、熊果苷等物质可以增强美白效果。
实施例7
含人肌母细胞外泌体的乳剂形式治疗损伤的药品制备。
乳化形式的治疗损伤的药品制备可有水包油或油包水的不同的方法，如10％甘油、2％吐温80、2％胆固醇、5％卵磷脂，0.2％尼泊金乙酯，0.3％磺胺嘧啶银与70mlPBS缓冲液混合加热均质乳化，降温至37-45℃后加入10-50μg人肌母细胞外泌体冻干粉，加入5ml0.01M磷酸盐缓冲液，混合后补水至100ml终体积，均质均匀后0.45μm滤膜过滤除菌和不溶物，完成一种乳剂制剂形式的含人肌母细胞外泌体治疗损伤的药品的制备流程。
实施例8
人肌母细胞外泌体对热激损伤小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1和小鼠成纤维细胞L929的影响
细胞复苏：取出液氮中冻存的3T3-L1和L929细胞，分别迅速将其置于37℃热水中。完全融化后转移到15mL无菌离心管中，加入6mL配制好的完全培养基，混匀后1200rpm常温离心3min，离心结束后在底部细胞部分加入5mL完全培养基，轻轻吹打混匀之后转至25cm2细胞培养瓶中。将混匀好的细胞转移至37℃、5％CO2培养箱中，第二天更换培养基。
细胞传代：待细胞密度达到75％时进行传代。在超净工作台中倒掉培养瓶里的培养基，培养瓶中加入5mL PBS洗掉残存的完全培养基，随后加入0.5mL EDTA胰蛋白酶，将细胞转移至培养箱中消化2-3min，严格控制消化时间后取出培养瓶迅速加入5mL完全培养基终止消化，将细胞从壁上轻轻吹下来后转移到15mL无菌离心管中，1200rpm离心3min，结束后按十分之一的比例传代。
热激损伤体外模型建立：细胞处于对数生长期时传代，细胞悬液计数后铺12孔板，每孔2×104个细胞，3-4h待细胞贴壁后，分别于40℃、43℃、46℃下热激40min。热激完成后，细胞置于二氧化碳培养箱中继续正常培养，0h、24h、48h、72h后将细胞用胰蛋白酶消化下来计数。其中0h为热激完成后的计数结果。
造模后给药：根据上述模型建立，选定43℃作为细胞造模温度，造模后每孔加入实施例1得到的含20μg蛋白的肌母细胞外泌体。正常组不做热激损伤处理。
3T3-L1和L929细胞生长曲线测定：对两种细胞造模并给药后(20μg外泌体)后，每天同一时间24h计数一次，每次每组取3个复孔。根据细胞计数结果，绘制生长曲线。并测试该外泌体对热激损伤小鼠成纤维细胞的损伤修复效果，结构如图4、图5和图6所示。图中Normal组为正常组，即未受到热损伤的两种成纤维细胞对照组；43℃40min+PBS为PBS对照组，即采用PBS治疗43℃下40min热激两种成纤维细胞对照组；43℃40min+exo为本实施例的外泌体治疗43℃40min热激两种成纤维细胞实验组。
图4和图5分别为本实施例外泌体治疗热激损伤两种成纤维细胞3T3-L1和L929数量随时间的变化结果图，从图4和图5可以看出肌母细胞外泌体处理组较PBS对照组明显促进两种成纤维细胞3T3-L1和L929增殖，在72h，外泌体处理组细胞数显著多于PBS对照组，并且其细胞数与正常组无明显差异。表明肌母细胞外泌体对热激损伤的小鼠成纤维细胞有明显的修复效应。采用WB方法检测各组增殖蛋白PCNA和抑凋亡蛋白Bcl-2，结果如图6所示，在选定的热激损伤条件下，肌母细胞外泌体能上调3T3-L1细胞PCNA和Bcl-2的表达，上调L929细胞PCNA和Bcl-2的表达，但Bcl-2的上调无3T3-L1中上调明显。
实施例9
肌母细胞外泌体对深II度烫伤创面治疗效果研究
具体实验方法如下：
(1)选取200g-250g的健康SD大鼠，烫伤前24h使用8％的硫化钠将其背部毛发脱掉。按0.1mL/100g的3％戊巴比妥钠麻醉大鼠。麻醉后用80℃水浴锅预热的直径为2.5cm的砝码按在大鼠背部中后部两侧皮肤进行烫伤，烫伤时间8秒。
(2)烫伤动物随机分5组，每组6只。取实施例1得到的冻干粉，按40μg和200μg蛋白的外泌体混匀在医用凡士林中，制成外泌体高低剂量，市售的湿润烧伤膏为阳性对照组，医用凡士林为阴性对照组，自然愈合组为空白组。
(3)给药方法为创面外敷，每个伤口使用药膏量为1g，均匀涂抹，然后纱布固定，空白组不做任何处理。每天换药。每天拍摄伤口愈合照片。
图7为各实验组创面愈合随时间变化图，80℃砝码烫伤8s后的SD大鼠符合深Ⅱ度烫伤的临床表现，对各组创面组织的组织学分析和皮肤角质细胞的特异标记CK19表达分析均验证80℃砝码烫伤8s方法的有效性和稳定性。从图7可以看出，凡士林组对烫伤创面愈合基本无影响，外泌体高剂量组(200μg外泌体蛋白/天/创面)、低剂量组(40μg外泌体蛋白/天/创面)和阳性对照组(湿润烧伤膏)均能明显促进伤口愈合，高剂量组促进伤口愈合的效果最显著，到治疗终点第四周，伤口已完全愈合且毛发生长完好，其伤疤面积为0.02cm2，低剂量组伤疤面积为0.21cm2，阳性组伤疤面积为0.15cm2，而空白组伤疤面积为0.62cm2，凡士林组伤疤面积为0.59cm2，空白组和凡士林组无显著性差异。从伤口愈合直观图片和伤疤面积统计上来看，肌母细胞外泌体能明显促进深Ⅱ度烫伤大鼠的创面愈合，且在一定范围内具有剂量效应。
Ⅰ型(ColⅠ)和Ⅲ型(ColⅢ)胶原蛋白不仅在烫伤创面恢复过程很中起重要作用，而且它们的表达还会影响创面愈合后期组织结构重排和瘢痕的形成，实验过程中通过对各种创面皮肤组织的Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白进行定量PCR分析，发现在愈合前两周，外泌体组高剂量ColⅠmRNA表达分别为正常皮肤组织中的24倍和37倍，而在后两周，其表达水平迅速下降，分别为正常皮肤组织中的8倍和3倍。外泌体组高剂量ColⅢ mRNA表达在前两周为正常皮肤组织中的35倍和33倍。这表明在在伤口愈合前期，外泌体组能迅速增加ColⅠ和ColⅢ的表达，两种胶原蛋白的大量产生加速了创面愈合并提高新生组织的坚韧度，而在伤口愈合后期，外泌体组迅速降低两种胶原的表达，防止其过度表达导致形成瘢痕。外泌体组低剂量取得与外泌体组高剂量组类似效果，但在两种胶原mRNA加速和减速表达以及表达峰值上明显不如外泌体组高剂量。阳性组也能在愈合早期促进两种胶原mRNA的表达，但是根据Ⅲ型胶原蛋白的表达情况，在前一周左右的时间，其不如外泌体组两组对Ⅲ型胶原蛋白的促进效果。空白组在第二周左右ColⅠ和ColⅢ mRNA表达明显增加，但是在愈合后期，其胶原Ⅰ蛋白未见下降，而胶原Ⅲ表达迅速降低，导致其创面胶原蛋白Ⅰ过多沉积，这也是其会留下瘢痕的主要原因之一。
通过对角质细胞的表面标记CK19、增殖核抗原PCNA和新生血管标记CD31进行分析发现，人肌母细胞外泌体能促进烫伤创面组织更快更完整地完成表皮再生的过程，并能提前和促进新生血管和细胞的大量再生，对各组胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的mRNA表达的分析发现，C2C12-Ex在烫伤创面愈合过程中，能优化皮肤组织胶原的产生，减少瘢痕的形成。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种人肌母细胞外泌体的制备方法，其特征在于，该方法采用人肌母细胞作为外泌体的来源，将人肌母细胞分化培养的上清液通过递增离心的方式执行3次以上的多步离心分离操作，直至获得所需的外泌体产品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对于所述多步离心分离操作而言，其优选采用以下过程来实现：
S10、在0℃～4℃的温度下，将人肌母细胞分化培养的上清液在300g～3000g的离心力条件下离心10min～30min，去除沉淀并收集获得第一上清液A；
S20、在保持恒温的情况下，将该第一上清液A在10000g～12000g的离心力条件下继续离心60min～200min，去除沉淀并收集获得第二上清液B；
S30、在保持恒温的情况下，将该第二上清液B在100000g～120000g的离心力条件下继续离心120min以上，然后收集沉淀且将其作为最终制备的人肌母细胞外泌体产品。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，对于所述多步离心分离操作而言，其进一步优选采用以下过程来实现：
S101、在0℃～4℃的温度下，将人肌母细胞分化培养的上清液首先在300g～500g的第一离心力下离心5min～30min，去除沉淀并收集获得上清液A1；
S102、接着将该上清液A1在2000g～3000g的第二离心力下离心10min～40min，去除沉淀并收集获得所述第一上清液A；
S201、在保持恒温的情况下，将该上清液A在10000g～12000g的第三离心力条件下继续离心60min～100min，去除沉淀并收集获得上清液B1；
S202、接着在保持温度和第三离心力条件不变的情况下，对该上清液B1继续离心60min～100min，去除沉淀并收集获得所述第二上清液B；
S301、在保持恒温的情况下，首先将该第二上清液B采用孔径为0.22μm以下的无菌滤膜执行过滤；
S302、接着在保持恒温的条件下，将执行过滤后的所述第二上清液B继续在100000g～120000g的第四离心力条件下离心60min～120min，弃上清液，收集沉淀；
S303、向步骤S302所述沉淀加入PBS重混后，接着在保持温度和第四离心力条件不变的情况下，离心60min～120min，弃上清液，最后收集沉淀且将其作为最终制备的人肌母细胞外泌体产品。
4.一种护肤产品，其特征在于，该护肤产品的主要组分为人肌母细胞外泌体，所述人肌母细胞外泌体通过对皮肤细胞促增值和抑凋亡，用于皮肤细胞的修复和/或更新。
5.一种药品，其特征在于，该药品的主要组分为人肌母细胞外泌体，所述人肌母细胞外泌体用于优选烫伤创面之类的皮肤粘膜创面的抗菌消炎、促进创面愈合和/或疤痕修复。
6.如权利要求5所述的药品，其特征在于，所述人肌母细胞外泌体通过以下机理实现皮肤粘膜创面愈合和/或疤痕修复愈合：促进创面组织完成表皮再生，促进新生血管和细胞的再生，优化皮肤组织胶原的产生，从而而减少瘢痕的形成。
7.一种人肌母细胞外泌体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括下列步骤：
(1)肌母细胞培养
将人肌母细胞置于盛有37℃±1℃的温水的无菌离心管中，加入5mL-7mL完全培养基，混匀后1000rpm-1500rpm离心2-4min，离心结束后在底部细胞部分加入4mL-6mL完全培养基，将混匀好的细胞转移至37℃±1℃、4％-6％CO2培养箱中，第二天更换培养基；
(2)肌母细胞传代
待细胞密度达到75％时进行传代，加入PBS洗掉残存的完全培养基，随后加入0.4-0.6mL EDTA胰蛋白酶，将细胞转移至培养箱中消化2-3min，严格控制消化时间后迅速加入4-6mL完全培养基终止消化，将肌母细胞从壁上吹下来后转移到无菌离心管中，1000-1500rpm离心2-4min，结束后按十分之一的比例传代；
(3)肌母细胞诱导分化
细胞密度达到75％时，在1％-2％马血清或1％-2％马血清以及0.2％-0.4％胰岛素的DMEM高糖培养基中进行诱导分化，每1-2天换一次液，并收集分化培养后的培养基，7-9天后结束分化，获得人肌母细胞分化培养的上清液。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)在1％马血清和0.3％胰岛素的高糖DMEM培养基中进行诱导分化。
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